專利名稱：高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，及其構(gòu)建和增殖的方法。
惡性腫瘤嚴(yán)重危及人類的生命健康。目前對(duì)惡性腫瘤的常規(guī)治療仍為手術(shù)及放、化療，這種常規(guī)治療對(duì)極大多數(shù)腫瘤的療效仍不十分理想，對(duì)于極大多數(shù)化療藥物而言，其治療指數(shù)仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故這種治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的方法對(duì)腫瘤治療非常重要，這種選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的方法主要依賴于腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記，其療效也決定于該腫瘤標(biāo)記是否嚴(yán)格限制于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
干擾素可分為I及II型兩類干擾素。
I型干擾素包括干擾素-α及干擾素-β。干擾素-α主要由單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，此外，B淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也能合成干擾素-α；干擾素-β則主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。人干擾素-α和干擾素-β基因連鎖位于9號(hào)染色體。干擾素-α家族的基因至少有20個(gè)，約1-2kb長(zhǎng)，無(wú)內(nèi)含子，可編碼約20個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的、分子量約18-26kDa不等的多肽，含189-195個(gè)氨基酸殘基，包括23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。干擾素-β基因只有一個(gè)，約777bp，無(wú)內(nèi)含子，編碼187個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，包括21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。I型干擾素可抑制部分腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)組織相容性復(fù)合體(MHC)-I類分子表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)及巨噬細(xì)胞殺傷活性。抑制腫瘤新生血管生成。
II型干擾素即干擾素-γ。主要由活化的T細(xì)胞(包括TH0、TH1細(xì)胞)和NK細(xì)胞。人干擾素-γ基因位于12號(hào)染色體，6kb長(zhǎng)，含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，編碼166個(gè)氨基酸組成的蛋白，包括23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。干擾素-γ干擾素促進(jìn)組織相容性復(fù)合體(MHC)-I類及MHC-II分子表達(dá)，激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，促進(jìn)靜止的CD4+T細(xì)胞分化為TH1細(xì)胞，并抑制TH2細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞的成熟及殺傷活性，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，抑制腫瘤新生血管生成。
腫瘤特異性增殖的病毒的根據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞某些生物學(xué)特性的差異，經(jīng)過改造的病毒只能特異性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖、裂解腫瘤細(xì)胞，然后釋放出病毒顆粒，再次感染其它腫瘤細(xì)胞，再次增殖、裂解，如此產(chǎn)生放大效應(yīng)，由于病毒能夠彌散到全身各個(gè)組織及臟器，因而能感染所有腫瘤細(xì)胞，從而殺滅局部及轉(zhuǎn)移的腫瘤，而不影響正常細(xì)胞。
但迄今為止，尚未見到應(yīng)用腫瘤特異性增殖的病毒系統(tǒng)高效表達(dá)干擾素的報(bào)告。
本發(fā)明的目的在于提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的在于提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒的復(fù)合物。
本發(fā)明的目的在于研究上述能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，將編碼干擾素的核苷酸序列插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域，該腺病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)基本不增殖，通過腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，導(dǎo)致編碼干擾素的核苷酸序列拷貝數(shù)增加，從而干擾素基因表達(dá)量增加，該腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒可以是以下任何一種(1)腺病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件；(2)腺病毒可以是下述任何一種蛋白功能缺失腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失。
上述重組病毒可以是腺病毒中任何一種型，編碼干擾素的核苷酸序列可以是編碼干擾素-α的核苷酸序列等。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒的構(gòu)建方法，(1)將編碼干擾素的核苷酸序列直接插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域；(2)腺病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件；順式作用元件可以是下述任何一種(a).甲胎蛋白(AFP)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(b).癌胚抗原(CEA)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(c).酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(d).ErbB2增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(e).ErbB3增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(f).ErbB4增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(g).DF3乳腺癌相關(guān)抗原(MUC1)增強(qiáng)子；(h).前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(i).腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(j).EB病毒愛潑斯坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，按常規(guī)簡(jiǎn)稱為EB病毒)中的Orip；(k).EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(按常規(guī)簡(jiǎn)稱為FR)；(1)EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子；(m).EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子；(n).EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子；(3)腺病毒的蛋白功能缺失可以是下述任何一種腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失。
腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖及復(fù)制，而在正常細(xì)胞不增殖及復(fù)制，主要通過以下方法實(shí)現(xiàn)(1)選擇性對(duì)腺病毒增殖必需基因的控制基因轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)受反式作用因子(如轉(zhuǎn)錄因子)與順式作用元件相互作用的影響。當(dāng)缺乏或出現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。應(yīng)用腫瘤組織特異性激活順式作用元件(包括啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)控制目的基因，使該目的基因特異性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在正常的細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或低水平表達(dá)。本發(fā)明應(yīng)用腫瘤組織特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子來控制腺病毒增殖及復(fù)制的必需基因，從而使腺病毒增殖必需基因只能在腫瘤的細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致腺病毒只能在腫瘤的細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)基本不增殖。
本發(fā)明采用細(xì)胞專一的反應(yīng)元件是由腫瘤細(xì)胞特異性激活順式作用元件組成，其順式作用元件可以是下述任何一種甲胎蛋白(AFP)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為肝癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
癌胚抗原(CEA)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為黑色素瘤細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
ErbB2增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為乳腺癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)于。
ErbB3增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為乳腺癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
ErbB4增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為乳腺癌及胃癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
DF3乳腺癌相關(guān)抗原(MUC1)增強(qiáng)子為乳腺癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，該前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子位于前列腺素特異性抗原起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的nt-5322～nt-3739，啟動(dòng)子位于前列腺素特異性抗原起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的nt-540～nt+12，該增強(qiáng)子與啟動(dòng)子特異性激活于前列腺細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞。
腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動(dòng)子特異性激活于前列腺細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞。
愛潑斯坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，按常規(guī)簡(jiǎn)稱為EB病毒)中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子、在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。
本發(fā)明提出的在于提供一類能特異性殺滅腫瘤細(xì)胞的增殖型重組腺病毒，它至少有一個(gè)腺病毒增殖所必需的基因的腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件制。它由在腺病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種順式作用元件而構(gòu)成。該順式作用元件特異性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)激活，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，而在正常細(xì)胞內(nèi)不激活，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。該順式作用元件可以是下述順序之一甲胎蛋白(AFP)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，癌胚抗原(CEA)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB2增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB3增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB4增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，DF3乳腺癌相關(guān)抗原(MUC1)增強(qiáng)子，前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子、在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。
本發(fā)明中，采用腺病毒增殖必需基因至少含有以下一個(gè)腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
(2).腺病毒在正常細(xì)胞復(fù)制必需而在腫瘤細(xì)胞中非必需的基因編碼的蛋白功能選擇性地缺失正常細(xì)胞與腫瘤存在著某些基因表達(dá)上的差異，某些腺病毒在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所必需的基因，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)并不需要，因此，去除這些基因編碼的蛋白功能有望使在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制，而不能在正常細(xì)胞中復(fù)制。
腺病毒蛋白功能缺失可以是以下任何一種腺病毒E1B 55kDa的基因點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變導(dǎo)致E1B 55kDa蛋白質(zhì)功能異常。腺病毒E1B 19kDa的基因點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變導(dǎo)致E1B 19kDa蛋白質(zhì)功能異常。腺病毒E1A的基因點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變導(dǎo)致E1A蛋白質(zhì)功能異常。
(3).依賴于腫瘤細(xì)胞某個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常而產(chǎn)生的病毒復(fù)制，呼吸道腸道過濾性病毒(Reovirus)感染后其早期病毒基因轉(zhuǎn)錄可激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶(PKR)，而該激酶可抑制該病毒的其它基因的轉(zhuǎn)錄，從而使病毒不能有效復(fù)制，而當(dāng)細(xì)胞中Ras處于激活狀態(tài)則可抑制該激酶，從而使該病毒活躍復(fù)制。Ras基因是一個(gè)癌基因，當(dāng)它被不正常激活時(shí)，即可能發(fā)生癌變。呼吸道腸道過濾性病毒復(fù)制及增殖依賴于Ras異常激活的信號(hào)途徑，即在Ras高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖。
(4).選擇性進(jìn)入腫瘤細(xì)胞改變它們表面的結(jié)合蛋白可使其與某些特定的腫瘤組織結(jié)合，從而使病毒只能感染特定的腫瘤組織。目前這方面改造主要集中于腺病毒外殼蛋白--纖維蛋白(Fiber)、五鄰體(penton)及六鄰體蛋白(hexon)，尤其在纖維蛋白中頭部HI環(huán)中或C末端最常見，包括插入腫瘤膜表面具有高親和力的某種配體、短肽及抗體Fab區(qū)域。
干擾素廣泛應(yīng)用于抗病毒治療，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及抑制腫瘤新生血管形成，激活多種抗腫瘤免疫機(jī)制。研究表明干擾素在體內(nèi)有明顯抑制腫瘤的作用。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其編碼干擾素的核苷酸序列為編碼干擾素-α的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其編碼干擾素的核苷酸序列為編碼干擾素-β的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其編碼干擾素的核苷酸序列為編碼干擾素-γ的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其編碼干擾素的核苷酸序列受啟動(dòng)子控制。該啟動(dòng)子可以為以下啟動(dòng)子之一猴病毒40(Simian virus40，按常規(guī)簡(jiǎn)稱為SV40)啟動(dòng)子、勞斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，按常規(guī)簡(jiǎn)稱為RSV)LTR啟動(dòng)子及人巨細(xì)胞病毒(按常規(guī)簡(jiǎn)稱為HCMV)IE啟動(dòng)子等。
本發(fā)明在上述這種修飾病毒基因組中非增殖必需區(qū)域插入編碼干擾素的核苷酸序列，本發(fā)明所述的編碼干擾素的核苷酸序列為干擾素-α(interferon-α，簡(jiǎn)記為IFN-α)、干擾素-β(interferon-β，簡(jiǎn)記為IFN-β)及干擾素-γ(interferon-γ，簡(jiǎn)記為IFN-γ)基因。隨著病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，使編碼干擾素的核苷酸序列拷貝數(shù)增加，使腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)干擾素，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及血管形成，激發(fā)免疫反應(yīng)，從而抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)，這種修飾后的病毒載體可被用于在某些細(xì)胞混合物中殺滅某種特殊靶細(xì)胞，通過給予修飾后的病毒能選擇性地在該種靶細(xì)胞中增殖，從而使這種靶細(xì)胞被增殖的病毒選擇性的殺滅；在體外培養(yǎng)或在動(dòng)物體內(nèi)通過將修飾后的病毒與細(xì)胞復(fù)合物混合，病毒只能在靶細(xì)胞增殖，也就是說除了靶細(xì)胞，其它細(xì)胞不能被這種病毒殺死。由于病毒在靶細(xì)胞內(nèi)增殖及擴(kuò)增，從而使混合細(xì)胞中的該靶細(xì)胞被殺滅，一旦靶細(xì)胞被破壞，病毒不能夠再增殖。
本發(fā)明提出的高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒與化學(xué)治療藥物(如順鉑、5-氟脲嘧啶絲裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、單克隆抗體一起可以組成復(fù)合物，其作為抗腫瘤藥物效果更好。與X-線聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生更為有效的抗腫瘤效應(yīng)。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，用于體外感染腫瘤細(xì)胞，病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，導(dǎo)致編碼干擾素的核苷酸序列拷貝數(shù)增加及干擾素表達(dá)量增加。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，可用于體內(nèi)選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，導(dǎo)致編碼干擾素的核苷酸序列拷貝數(shù)增加及其表達(dá)量增加，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及血管形成，激發(fā)免疫反應(yīng)，從而抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)該病毒能在而且僅限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，也能特異性直接殺滅腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明提供一類治療腫瘤的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，這種重組腺病毒可用于治療腫瘤。
2.本發(fā)明提供一類高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒的構(gòu)建方法。該方法通常易行可用于構(gòu)建高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒。
3.本發(fā)明提供一種在體內(nèi)及體外殺滅腫瘤細(xì)胞、而不影響正常細(xì)胞，并在體內(nèi)及體外腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)干擾素，與化學(xué)抗腫瘤藥物結(jié)合，更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞，達(dá)到高效低毒應(yīng)用于治療腫瘤的目的。
人類腺病毒有6個(gè)不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對(duì)宿主細(xì)胞的親嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本發(fā)明以腺病毒C亞屬中的5型(Ad5)作為例證對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步具體說明，本發(fā)明構(gòu)建手段均是現(xiàn)有技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)。
例一、攜帶人干擾素-α(hIFN-α)、小鼠干擾素-α(mIFN-α)、人干擾素-β(hIFN-β)、小鼠干擾素-β(mIFN-β)、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建pCA13及pCA14載體購(gòu)于加拿大Microbix BiosystemInc.(Toronto)，pCA13及pCA14含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1區(qū)342至3523bp片段，在E1缺失區(qū)插入了人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信號(hào)。人與小鼠的干擾素-α(IFN-α)基因、人與小鼠的干擾素-β(IFN-β)基因、人與小鼠的干擾素-γ(IFN-γ)基因購(gòu)于美國(guó)InvivoGen公司，人干擾素-α(hIFN-α)基因來源于美國(guó)InvivoGen公司質(zhì)粒pORF-hIFN-α、小鼠的干擾素-α(mIFN-α)基因來源于美國(guó)InvivoGen公司質(zhì)粒pORF-mIFN-α、人干擾素-β(hIFN-β)基因來源于美國(guó)InvivoGen公司質(zhì)粒pORF-hIFN-β、小鼠的干擾素-β(mIFN-β)基因來源于美國(guó)InvivoGen公司質(zhì)粒pORF-mIFN-β、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因來源于美國(guó)InvivoGen公司質(zhì)粒pORF-hIFN-γ及小鼠的干擾素-γ(mIFN-γ)基因來源于美國(guó)InvivoGen公司質(zhì)粒pORF-mIFN-γ。
攜帶人干擾素-α(hIFN-α)及小鼠干擾素-α(mIFN-α)、的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建。
將pORF-hIFN-α質(zhì)粒用Age I+Nhe I雙酶切，得含有人IFN-α基因的588bp片段，將其定向插入pUC19質(zhì)粒(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)的Xma I及Xba I位點(diǎn)，命名為pUC19-hIFN-α。應(yīng)用EcoR I+Sal I雙酶切pUC19-hIFN-α，獲得含有人IFN-α基因的602bp片段，將其定向插入pCA14質(zhì)粒EcoR I+SalI酶切位點(diǎn)中，命名pCA14-hIFN-α。
應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增小鼠IFN-α基因，以pORF-mIFN-α質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，
引物1(含EcoR I酶切位點(diǎn)5’-mIFN-α引物)TTG GAA TTC ACC ATGGCT AGG CTC TGT GC引物2(含BamH I酶切位點(diǎn)3’-mIFN-α引物)GCG GGA TCC TTA TCACTC CTC CTT GCT CAPrimer1與primer2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收5 70bp片段，應(yīng)用EcoRI+BamH I酶切，將該基因插入pUC19載體(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)中進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果表明小鼠IFN-α基因正確，命名為pUC19-mIFN-α。應(yīng)用EcoR I+BamH I雙酶切，獲得含有mIFN-α基因的570bp片段，將其定向插入pCA13質(zhì)粒EcoR I+BamH I酶切位點(diǎn)中，命名pCA13-mIFN-α。
攜帶人干擾素-β3(hIFN-β)及小鼠干擾素-β(mIFN-β)的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建。
應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增人IFN-β基因，以pORF-hIFN-β質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，引物3(含EcoR I酶切位點(diǎn)5’-hIFN-β引物)CCG GAA TTC CGG ATGACC AAC AAG TGT CTC引物4(含BamH I酶切位點(diǎn)3’-hIFN-β引物)CGC GGA TCC GCG TCAGTT TCG GAG GTA ACCPrimer3與primer4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收570bp片段，應(yīng)用EcoRI+BamH I酶切，將該基因插入pUC19載體(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)中進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果表明人IFN-β基因正確，命名為pUC19-hIFN-β。應(yīng)用EcoR I+BamH I雙酶切，獲得含有hIFN-β基因的574bp片段，將其定向插入pCA13質(zhì)粒EcoR I+BamH I酶切位點(diǎn)中，命名pCA13-hIFN-β。
將pORF-mIFN-β質(zhì)粒用SgrAI+Nhe I雙酶切，得含小鼠IFN-β基因的601bp片段，將其定向插入pUC19質(zhì)粒(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)的Xma I及Xba I位點(diǎn)，命名為pUC19-mIFN-β。應(yīng)用EcoR I+SalI雙酶切pUC19-mIFN-β，獲得含有小鼠IFN-β基因的615bp片段，將其定向插入pCA14質(zhì)粒EcoR I+Sal I酶切位點(diǎn)中，命名pCA14-mIFN-β。
攜帶人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建。
將pORF-hIFN-γ質(zhì)粒用SgrAI+Nhe I雙酶切，得含人IFN-γ基因的522bp片段，將其定向插入pUC19質(zhì)粒(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)的Xma I及Xba I位點(diǎn)，命名為pUC19-hIFN-γ。應(yīng)用EcoR I+Sal I雙酶切pUC19-hIFN-γ，獲得含有人IFN-γ基因的537bp片段，將其定向插入pCA14質(zhì)粒EcoR I+Sal I酶切位點(diǎn)中，命名pCA14-hIFN-γ。
應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增人鼠IFN-γ基因，以pORF-mIFN-γ質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，引物5(含EcoR I酶切位點(diǎn)5’-mIFN-γ引物)CCG GAA TTC ATG GCTGTT TCT GGC TGT TAC TGC C引物6(含BamH I酶切位點(diǎn)3’-mIFN-γ引物)AAT GGA TCC TCA GCAGCG ACT CCT TTT CCG CTT CPrimer5與primer6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收4 50bp片段，應(yīng)用EcoRI+BamH I酶切，將該基因插入pUC19載體(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)中進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果表明小鼠IFN-γ基因正確，命名為pUC19-mIFN-γ。應(yīng)用EcoR I+BamH I雙酶切，獲得含有mIFN-γ基因的450bp片段，將其定向插入pCA13質(zhì)粒EcoR I+BamH I酶切位點(diǎn)中，命名pCA13-mIFN-γ。例二、腺病毒E1b 55Kda蛋白基因部分缺失及在缺失區(qū)插入終止密碼子載體的構(gòu)建pXC.1載體購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。應(yīng)用內(nèi)切酶Bgl II將該載體在3329bp中切開，然后用內(nèi)切酶Hind III再作部分酶切，回收9372bp DNA片段，應(yīng)用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段對(duì)3’凹端補(bǔ)平，即為pXC.1載體中缺失2809bp-3329bp區(qū)域(具體方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)。
合成兩個(gè)DNA寡核苷酸片段做一個(gè)連接頭，其DNA寡核苷酸序列為primer7 TAATGAGTAACTAAprimer8 TTAGTTACTCATTA將兩個(gè)DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復(fù)性，復(fù)性后應(yīng)用T4噬菌體多核苷酸激酸進(jìn)行磷酸化。將該磷酸化后的連接頭與缺失2809-3329bp區(qū)域的pXC.1載體片段進(jìn)行連接，命名為pXC-del Elb(方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社1992出版)。在插入連接頭兩端附近位置中合成引物，分別為primer 9 CTG GCC AAT ACC AAC CTT Aprimer10 ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC對(duì)pXC-del Elb進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行體外擴(kuò)增(方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社1992出版)，其PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示CTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTAATGAGTAACTAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACTATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATAT，這表明pXC-del E1b為pXC.1載體中缺失了2809-3329區(qū)域并在該區(qū)域中插入TAATGAGTAACTAA，并在兩個(gè)終止密碼子后保留了Bgl II酶切位點(diǎn)。例三、攜帶人干擾素-α(hIFN-α)、小鼠干擾素-α(mIFN-α)、人干擾素-β(hIFN-β)、小鼠干擾素-β(mIFN-β)、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒載體的構(gòu)建應(yīng)用Bgl II分別酶切pCA14-hIFN-α、pCA13-mIFN-α、pCA13-hIFN-β、pCA14-mIFN-β、pCA14-hIFN-γ及pCA13-mIFN-γ，分別回收1188bp(含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有人干擾素-α及SV40 poly A加尾信號(hào))、1139bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、小鼠干擾素-α及SV40 poly A加尾信號(hào))，1143bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人干擾素-β及SV40 poly A加尾信號(hào))，1201bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、小鼠干擾素-β及SV40 poly A加尾信號(hào))，1123bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人干擾素-γ及SV40 poly A加尾信號(hào))及1019bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、小鼠干擾素-γ及SV40 poly A加尾信號(hào))，將其插入pXC-del Elb Bgl II酶切位點(diǎn)。
應(yīng)用PCR技術(shù)分別驗(yàn)證其插入的正方向其Bgl II上游引物primer9CTG GCC AAT ACC AAC CTT A，分別與人干擾素-α(hIFN-α)、小鼠干擾素-α(mIFN-α)、人干擾素-β(hIFN-β)、小鼠干擾素-β(mIFN-β)、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)3’-primer進(jìn)行擴(kuò)增引物11(3’-hIFN-α引物)TCA AGA TGA GCC CAG GTC引物12(3’-mIFN-α引物)TTA TCA CTC CTC CTT GCT CA引物13(3’-hIFN-β引物)GCG TCA GTT TCG GAG GTA ACC引物14(3’-mIFN-β引物)GCT CAG TTT TGG AAG TTT C引物15(3’-hIFN-γ引物)TTA CTG GGA TGC TCT TCG引物16(3’-mIFN-γ引物)GCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT C其PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為1080bp、1031bp、1035bp、1123bp、1015bp及1001bp。表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子+人干擾素-α+SV40 poly A加尾信號(hào)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子+小鼠干擾素-α+SV40 poly A加尾信號(hào)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子+人干擾素-β+SV40 poly A加尾信號(hào)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子+小鼠干擾素-β+SV40 poly A加尾信號(hào)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子+人干擾素-γ+SV40 poly A加尾信號(hào)及人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子+小鼠干擾素-γ+SV40 poly A加尾信號(hào)，正向插入pXC-delElb Bgl II酶切位點(diǎn)，分別命名為pXC-del Elb-hIFN-α、pXC-delElb-mIFN-α、pXC-del Elb-hIFN-β、pXC-del Elb-mIFN-β、pXC-del Elb-hIFN-γ及pXC-del Elb-mIFN-γ。例四、攜帶人干擾素-α(hIFN-α)、小鼠干擾素-α(mIFN-α)、人干擾素-β(hIFN-β)、小鼠干擾素-β(mIFN-β)、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒載體的重組E1轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞株293細(xì)胞株購(gòu)于加拿大MicrobixBiosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對(duì)其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-del Elb-hIFN-α、pXC-del Elb-mIFN-α、pXC-delElb-hIFN-β、pXC-del Elb-mIFN-β、pXC-del Elb-hIFN-γ及pXC-delElb-mIFN-γ分別與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見GIBCO BRL公司的操作說明。pBHGE3 購(gòu)于加拿大Microbix BiosystemsInc.(Ontario)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，該腺病毒命名為CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ，具體方法參見Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主編，Humana Press 1991出版。
病毒的產(chǎn)生及基因組結(jié)構(gòu)重組腺病毒方法參見例一內(nèi)容。其名稱見下病毒名稱 含Ad5左臂質(zhì)粒含Ad5右臂質(zhì)粒Ad5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-hIFN-αPBHGE3hIFN-α hIFN-αAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-mIFN-αPBHGE3mIFN-α mIFN-αAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-hIFN-β PBHGE3hIFN-β hIFN-βAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-mIFN-β PBHGE3mIFN-β mIFN-βAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-hIFN-γ PBHGE3hIFN-γ hIFN-γAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-mIFN-γ PBHGE3mIFN-γ mIFN-γ腺病毒在293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主編，Humana Press 1991出版)。Ad5-del Elb-hIFN-α(CNHK200-hIFN-α)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglI I酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有人干擾素-α及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-mIFN-α(CNHK200-mIFN-α)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有小鼠干擾素-α及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb -hIFN-β(CNHK200-hIFN-β)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有人干擾素-β及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-mIFN-β(CNHK200-mIFN-β)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有小鼠干擾素β及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-hIFN-γ(CNHK200-hIFN-γ)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有人干擾素-γ及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-mIFN-γ(CNHK200-mIFN-γ)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有小鼠干擾素γ及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。例五、攜帶人干擾素-α(hIFN-α)、小鼠干擾素-α(mIFN-α)、人干擾素-β(hIFN-β)、小鼠干擾素-β(mIFN-β)、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒體外腫瘤細(xì)胞復(fù)制、增殖并高效表達(dá)人干擾素-α(hIFN-α)、小鼠干擾素-α(mIFN-α)、人干擾素-β(hIFN-β)、小鼠干擾素-β(mIFN-β)、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)，并在體外特異性殺滅腫瘤細(xì)胞將CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ分別感染肝癌細(xì)胞株Hep 3B、293及正常人成纖維細(xì)胞，細(xì)胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ、CNHK200-mIFN-γ及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時(shí)后應(yīng)用293細(xì)胞株測(cè)定其病毒滴度，具體方法參見前述文獻(xiàn)2，結(jié)果為正常成纖維細(xì)293 Hep3B胞野生型5型腺病毒1×1057×1045×104CNHK200-hIFN-α1×1058×1041×10CNHK200-mIFN-α1×1057.5×1041.5×10CNHK200-hIFN-β1×1056.0×1041.5×10CNHK200-mIFN-β1×1057.8×1042×10CNHK200-hIFN-γ1×1054.9×1042×10CNHK200-mIFN-γ1×1059×1042×10將肝癌細(xì)胞株Hep3B及正常人成纖維細(xì)胞分別感染重組腺病毒CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ，MOI為1，37℃孵育1小時(shí)，感染后7天收集細(xì)胞，應(yīng)用QIAamp DNA Blood mini kit(德國(guó)QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法參見QIAGEN公司操作說明。應(yīng)用Nhe I和Xho I雙酶切，用0.8％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P標(biāo)記人5型腺病毒1178bp BstXI加Xho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，進(jìn)行souther blot雜交，以pXC.1作為病毒拷貝數(shù)對(duì)照(方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ在肝癌細(xì)胞株Hep3B及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為2×104、2×104、2×104、3×104、3×104、2×104及＜10、＜10、＜10、＜10、＜10、＜10。
將上述CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人干擾素-α(hIFN-α)、小鼠干擾素-α(mIFN-α)、人干擾素-β(hIFN-β)、小鼠干擾素-β(mIFN-β)、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)的cDNA片段作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA14-hIFN-α、pCA13-mIFN-α、pCA13-hIFN-β、pCA14-mIFN-β、pCA14-hIFN-γ或pCA13-mIFN-γ作為病毒拷貝數(shù)對(duì)照(方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ在肝癌細(xì)胞株Hep3B及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為2×104、2×104、2×104、3×104、2×104、3×104及＜10、＜10、＜10、＜10、＜10、＜10。例七、攜帶人干擾素-α(hIFN-α)、小鼠干擾素-α(mIFN-α)、人干擾素-β(hIFN-β)、小鼠干擾素-β(mIFN-β)、人干擾素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干擾素-γ(mIFN-γ)的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒載體在裸鼠體內(nèi)治療移植腫瘤的任用.將4-5周齡的SCID小鼠皮下接種肝癌細(xì)胞株Hep 3B細(xì)胞1×107，兩周后給予1×109pfu CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ或用相同劑量的對(duì)照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治療組及對(duì)照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加4倍以上，而治療組則腫瘤明顯縮小，部分腫瘤完全消失。
權(quán)利要求
1.一種能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于將編碼干擾素的核苷酸序列插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域，該病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)基本不增殖，通過病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，導(dǎo)致編碼干擾素的核苷酸序列拷貝數(shù)增加，從而干擾素基因表達(dá)量增加，該腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒可以是以下任何一種(1)腺病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件；(2)腺病毒可以是下述任何一種蛋白功能缺失腺病毒E1B55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于(1)將編碼干擾素的核苷酸序列直接插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域；(2)腺病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件；順式作用元件可以是下述任何一種(a).甲胎蛋白增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(b).癌胚抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(c).酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(d).ErbB2增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(e).ErbB3增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(f).ErbB4增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(g).DF3乳腺癌相關(guān)抗原增強(qiáng)子；(h).前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(i).腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(j).EB病毒中的Orip；(k).EB病毒Orip中的FR增強(qiáng)子；(1).EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子；(m).EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子；(n).EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子；(3)腺病毒的蛋白功能缺失可以是下述任何一種腺病毒E1B55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于它由要腺病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件構(gòu)成，該種順式作用元件可以是下述任何一種甲胎蛋白增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，癌胚抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB2增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB3增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB4增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，DF3乳腺癌相關(guān)抗原增強(qiáng)子，前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增強(qiáng)子，EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子，EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子，EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子，在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件，腺病毒增殖必需基因?yàn)橄俨《驹缙诨颉?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于所述腺病毒增殖必需基因至少含有以下一個(gè)腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于所述腺病毒E1B55Kda通過基因點(diǎn)突變、缺失突變及插入突變導(dǎo)致E1B 55Kda蛋白功能缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于所述腺病毒E1B19Kda通過基因點(diǎn)突變、缺失突變及插入突變導(dǎo)致E1B 19Kda蛋白功能缺失。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于所述腺病毒E1A通過基因點(diǎn)突變、缺失突變及插入突變導(dǎo)致E1A蛋白功能缺失。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于所述編碼干擾素的核苷酸序列為編碼干擾素-α的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于所述編碼干擾素的核苷酸序列為編碼干擾素-β的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于所述編碼干擾素的核苷酸序列為編碼干擾素-γ的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于所述編碼干擾素的核苷酸序列受啟動(dòng)子控制。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為SV40啟動(dòng)子。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為RSVLTR啟動(dòng)子。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為人巨細(xì)胞病毒IE啟動(dòng)子。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于該病毒與化學(xué)抗腫瘤藥物組成復(fù)合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于將該重組病毒用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體外感染腫瘤細(xì)胞，病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，導(dǎo)致編碼干擾素的核苷酸序列拷貝數(shù)增加及干擾素表達(dá)量增加。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒，其特征在于將該重組病毒用于體內(nèi)選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，導(dǎo)致編碼干擾素的核苷酸序列拷貝數(shù)增加及其表達(dá)量增加，抑制腫瘤血管的形成，抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，同時(shí)該病毒能在而且基本上限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，也能特異性直接殺滅腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一類高效表達(dá)干擾素的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的腺病毒及其構(gòu)建方法。該腺病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖,而在正常細(xì)胞內(nèi)基本不增殖,通過將編碼干擾素的核苷酸序列插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖的腺病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域,隨著腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,使編碼干擾素的核苷酸序列拷貝數(shù)增加,在腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)干擾素,抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及血管形成,激發(fā)免疫反應(yīng),從而抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)該病毒能在而且基本上限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖,也能特異性直接殺滅腫瘤細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1388248SQ0111300
公開日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者錢其軍, 車小燕, 岑信棠, 吳孟超 申請(qǐng)人:錢其軍