專利名稱：包含抗體的溶液制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的包含抗體的溶液制劑。

背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，使用抗體例如免疫球蛋白、單克隆抗體和人源化抗體作為藥物產(chǎn)品成為可能。為了以穩(wěn)定的數(shù)量提供抗體藥物產(chǎn)品，有必要確定制劑條件和儲存條件，在該條件下，抗體的結(jié)構(gòu)和活性能被保持。
當?shù)鞍踪|(zhì)以高濃度溶液的形式儲存時，它們通常會變質(zhì)，例如不溶性凝集物的形成，這是必須避免的。特別地，抗體制劑有一個缺點，那就是它們會傾向于形成多聚物，從而在溶液儲存期間導(dǎo)致不溶性凝集物。
例如，我們發(fā)現(xiàn)抗-IL-6受體抗體對于不成熟骨髓瘤細胞有治療效果(JPA HEI 8-99902)，并能成功的大量生產(chǎn)重構(gòu)人源化抗體——作為抗-IL-6受體抗體的hPM-1抗體，我們已經(jīng)試圖將這種純化的抗-IL-6受體抗體制備成藥物產(chǎn)品。人源化抗-IL-6受體抗體是一種不穩(wěn)定的易受物理或化學(xué)改變的蛋白質(zhì)，例如在純化操作過程中為了除去病毒和其他微生物而在過濾、濃縮、加熱和光照的壓力下發(fā)生交聯(lián)或凝集。
當抗體是通過基因工程技術(shù)獲得的時候，生產(chǎn)抗體的細胞被大量培養(yǎng)并純化以產(chǎn)生包含抗體的溶液，然后該溶液被冷凍保存，在制劑之前被解凍。然而，由于在反復(fù)的冷凍/解凍循環(huán)期間形成了抗體二聚物或不溶性微粒，或在長期儲存過程中抗體降解形成了降解產(chǎn)物，溶液中剩余抗體的含量會減少。
已經(jīng)做了很多努力想提供一種在溶液中儲存蛋白質(zhì)的方法，通過添加作為穩(wěn)定劑的聚合物包括蛋白質(zhì)如人血清白蛋白或純化的明膠，或低聚物如多元醇、氨基酸和表面活性劑來防止化學(xué)或物理改變，獲得了穩(wěn)定的效果。然而，添加作為穩(wěn)定劑的生物聚合物如蛋白質(zhì)是不方便的，例如，它需要非常復(fù)雜的去除污染物如病毒和朊病毒的步驟。如果要添加低聚物，最好應(yīng)當減少到最少。
用糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑穩(wěn)定的凍干抗體制劑也已經(jīng)被報道了(JPA HEI 2001-503781)。
然而，由于對方便使用的溶液制劑(它可能沒有被溶解，使用以前被還原)有巨大需求，已經(jīng)在探尋穩(wěn)定的包含抗體的溶液制劑。
發(fā)明的公開 本發(fā)明的目的是提供包含抗體的溶液制劑，其中抗體的含量很高，通過在包含抗體的溶液制劑的制備或儲存期間抑制不溶性微粒和多聚物的形成，并進一步抑制降解產(chǎn)物的形成，即使經(jīng)過長期儲存它也是穩(wěn)定的。
為了實現(xiàn)上述目的而進行的仔細研究的結(jié)果是，我們發(fā)現(xiàn)可以通過添加糖來抑制冷凍/解凍循環(huán)期間二聚物的形成或長期儲存過程中多聚物和降解產(chǎn)物的形成，可以通過添加表面活性劑來顯著地抑制冷凍/解凍循環(huán)期間不溶性微粒的形成，并在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供 (1)一種包含抗體的溶液制劑，其中包含糖作為穩(wěn)定劑； (2)如(1)中定義的溶液制劑，其中還包含表面活性劑作為穩(wěn)定劑； (3)如(1)或(2)中定義的溶液制劑，其中，糖是糖醇或非還原性寡糖； (4)如(1)或(2)中定義的溶液制劑，其中，糖是非還原性寡糖； (5)如(1)或(2)中定義的溶液制劑，其中，糖是甘露糖、蔗糖、海藻糖或棉子糖； (6)如(1)或(2)中定義的溶液制劑，其中，糖是蔗糖、海藻糖或棉子糖； (7)如(1)或(2)中定義的溶液制劑，其中，糖是蔗糖或海藻糖； (8)如(1)或(2)中定義的溶液制劑，其中，糖是蔗糖； (9)如(2)到(8)中任何一項定義的溶液制劑，其中，表面活性劑是聚山梨醇80或20； (10)如(1)到(9)中任何一項定義的溶液制劑，其中，抗體是重組抗體； (11)如(10)中定義的溶液制劑，其中，抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體； (12)如(1)到(11)中任何一項定義的溶液制劑，其中，抗體是IgG類抗體； (13)如(12)中定義的溶液制劑，其中，IgG類抗體是IgG1類抗體； (14)如(1)到(13)中任何一項定義的溶液制劑，其中，抗體是抗-白介素-6受體抗體或抗-HM1.24抗體； (15)一種在包含抗體的溶液制劑中抑制抗體多聚物分子形成的方法，包括將糖添加到溶液中； (16)一種在包含抗體的溶液的冷凍/解凍循環(huán)期間抑制抗體多聚物分子形成的方法，包括將非還原性寡糖添加到溶液中； (17)一種在包含抗體的溶液的冷凍/解凍循環(huán)期間抑制抗體多聚物分子形成的方法，包括將非還原性二糖或非還原性三糖添加到溶液中； (18)一種在包含抗體的溶液的冷凍/解凍循環(huán)期間抑制不溶性微粒形成的方法，包括加入表面活性劑； (19)一種在包含抗體的溶液的冷凍/解凍循環(huán)期間穩(wěn)定抗體的方法，包括加入非還原性糖和表面活性劑。
本發(fā)明最優(yōu)選的實例 此處所用的“包含抗體的溶液制劑”指的是包含抗體作為活性成分的溶液制劑，用于對動物如人給藥，優(yōu)選在制備過程中不包含凍干步驟的溶液制劑。
此處所用的“包含抗體的溶液”可以是包含任何抗體(無論是生物衍生的或是重組的)的溶液，優(yōu)選培養(yǎng)基，其中，包含抗體的哺乳動物細胞如CHO細胞已經(jīng)過培養(yǎng)，或是將這種培養(yǎng)基經(jīng)過例如局部純化(本體溶液)處理而獲得的溶液，或是用于對動物如人給藥的如上定義的溶液制劑。
此處所用的術(shù)語“不溶性微粒”指的是如日本藥局方中“一般試驗、方法和儀器”部分中的“注射液中不溶性微粒物質(zhì)試驗”章中所定義的10μm或更大的不溶性的顆粒物質(zhì)。不溶性微?？梢杂蔑@微鏡、不溶性微粒收集濾器、分析膜濾器或方便地使用自動光阻塞顆粒計數(shù)器來測量。
此處所用的“不溶性物質(zhì)”指的是容易發(fā)覺的不溶性的物質(zhì)，如日本藥局方中“一般試驗、方法和儀器”部分中的“注射液的異質(zhì)不溶性物質(zhì)試驗”章中所定義的，當在白熾燈光強度大約1000勒克斯下用裸眼檢查容器時，注射液必須澄明、不含不溶物。
此處所用的“多聚物”和“降解產(chǎn)物”分別指的是構(gòu)成制劑活性成分的抗體分子的多聚物和降解產(chǎn)物，它們的含量可以用隨后描述的基于凝膠滲透色譜的峰面積百分數(shù)法(peak area percentage method)來測量。
用在本發(fā)明溶液制劑中的抗體不受特殊限制，只要它們能和特定抗原結(jié)合，小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、羊抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等都是合適的抗體?？贵w可以是多克隆的或單克隆的，但優(yōu)選單克隆的，因為能穩(wěn)定地生產(chǎn)均一的抗體。多克隆抗體和單克隆抗體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來制備。
生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤可以用下列已知技術(shù)基本地構(gòu)造。特定抗原或表達特定抗原的細胞被用作免疫抗原來免疫宿主細胞(根據(jù)標準免疫技術(shù))，產(chǎn)生的免疫細胞和已知母細胞融合(用標準細胞融合技術(shù))，然后用標準篩選法篩選融合細胞來尋找生產(chǎn)單克隆抗體的細胞(雜交瘤)?？梢杂美鏜ilstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)733-46)來進行雜交瘤的構(gòu)建。如果抗原具有低的免疫原性，它可以和免疫原性大分子如白蛋白結(jié)合，用于免疫接種。
也可以使用重組抗體，它是用基因工程技術(shù)，通過用包含了克隆自雜交瘤的抗體基因的合適載體轉(zhuǎn)染宿主生產(chǎn)的(參見例如Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，MACMILLAN PUBLISHERS LTD在英國出版，1990)。特別地，抗體可變區(qū)(V區(qū))的cDNA序列是用逆轉(zhuǎn)錄酶合成自雜交瘤的mRNA的。一旦獲得編碼感興趣抗體V區(qū)的DNA序列，它們就被連接到編碼感興趣抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA序列上，并被整合進表達載體。擇一地，編碼抗體V區(qū)的DNA序列可以被整合到包含抗體C區(qū)DNA序列的表達載體中。通過在調(diào)節(jié)區(qū)如增強子和啟動子的控制下表達的方式將它們整合到表達載體中。然后用這種表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞以表達抗體。
在本發(fā)明中，可以使用重組抗體，也就是人工修飾以減少對人的抗原性或?qū)崿F(xiàn)其它目的的抗體，例如嵌合抗體和人源化抗體。這些經(jīng)修飾的抗體可以用已知方法制備。嵌合抗體由來自非人動物如小鼠的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)和人抗體的重鏈和輕鏈恒定區(qū)組成，可以通過將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA序列連接到人抗體恒定區(qū)的DNA序列上、并用包含連接序列的表達載體轉(zhuǎn)染宿主使其產(chǎn)生嵌合抗體來獲得。
人源化抗體也稱為重構(gòu)人抗體，通過將來自非人動物如小鼠的抗體的互補決定區(qū)(CDRs)移植到人抗體的互補決定區(qū)上而獲得，制備它們的典型的基因重組技術(shù)是已知的。特別地，企圖將小鼠抗體的CDRs連接到人抗體的框架區(qū)(FRs)的DNA序列可以用數(shù)種制備好的具有末端重疊區(qū)的寡核苷酸通過PCR來合成。得到的DNA序列被連接到編碼人抗體恒定區(qū)的DNA序列上，然后被整合到表達載體種，其被轉(zhuǎn)染給宿主以生產(chǎn)重構(gòu)抗體(參見歐洲專利公開號EP 239400，國際公開號WO 96/02576)。與CDRs相連的人抗體的FRs是用互補決定區(qū)形成適當?shù)目乖Y(jié)合部位的方法進行選擇的。如果需要的話，重構(gòu)人源化抗體可以在可變區(qū)的框架區(qū)有一些氨基酸的改變，以使互補決定區(qū)形成適當?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
獲得人抗體的方法也是已知的。例如，和特定抗原具有結(jié)合活性的特定的人抗體可以用特定抗原或用表達特定抗原的細胞體外免疫人淋巴細胞并將免疫淋巴細胞與人骨髓瘤細胞如U266相融合來獲得(參見JPB No.HEI 1-59878)。特定人抗體也可以用抗原免疫具有所有人抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動物來獲得(參見國際公開號WO 93/12227、WO92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。使用人抗體基因庫通過淘選獲得人抗體的方法也是已知的。例如，用噬菌體表面展示技術(shù)在噬菌體表面將人抗體的可變區(qū)表達成單鏈抗體片斷(scFv)來選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。編碼與抗原結(jié)合的人抗體可變區(qū)的DNA序列可以通過分析所選噬菌體的基因來確定。完整的人抗體可以在確定了的與抗原結(jié)合的scFv片斷的DNA序列的基礎(chǔ)上，通過制備適當?shù)谋磉_載體來獲得。這些方法相對于WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388都是已知的。
當一個抗體是通過將預(yù)先分離的抗體基因轉(zhuǎn)染到適當?shù)乃拗髦衼碇苽鋾r，適當?shù)乃拗骺梢院捅磉_載體聯(lián)合使用。用作宿主的合適的真核細胞包括動物細胞、植物細胞和真菌細胞。已知的動物細胞包括(1)哺乳動物細胞如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(小倉鼠腎)、HeLa和Vero細胞；(2)兩棲動物細胞如非洲蟾蜍卵母細胞；或(3)昆蟲細胞如sf9、sf21和Tn5。已知的植物細胞包括煙草如Nicotiana tabacum的細胞，它可以用于骨痂培養(yǎng)。已知的真菌細胞包括酵母如Saccharomyces spp.，如Saccharomyces serevisiae和絲狀真菌如Aspergillus spp.，如Aspergillus niger。原核細胞可以被用作使用細菌細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。已知的細菌細胞包括E.Coli和Bacillus subtilis。可以用感興趣的抗體基因轉(zhuǎn)染這些細胞并在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞來獲得抗體。
本發(fā)明的穩(wěn)定化制劑中包含的抗體包括，但并不限于，抗-IL-6受體抗體、抗-HM1.24抗原單克隆抗體、抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗-PTHrP抗體)等等。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的重構(gòu)人源化抗體包括人源化抗-IL-6受體抗體(hPM-1)(參見國際公開號WO 92-19759)、人源化抗-HM1.24抗原單克隆抗體(參見國際公開號WO 98-14580)和人源化抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗-PTHrP抗體)(參見國際公開號WO 98-13388)。
包含在本發(fā)明溶液制劑中的抗體可能屬于任何免疫球蛋白類，優(yōu)選IgG如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更優(yōu)選IgG1。
本發(fā)明的包含抗體的溶液制劑優(yōu)選地多聚物沒有增加，經(jīng)過冷凍/解凍循環(huán)以后，每毫升包含50個或小于50個不溶性微粒。
在本發(fā)明的包含抗體的溶液或溶液制劑中，在冷凍/解凍循環(huán)期間二聚物的形成可以通過添加糖來抑制?？梢允褂玫奶前ǚ沁€原性寡糖，如非還原性二糖如蔗糖和海藻糖，或非還原性三糖如棉子糖，尤其優(yōu)選的是非還原性寡糖。優(yōu)選的非還原性寡糖是非還原性二糖，更優(yōu)選蔗糖和海藻糖。
在本發(fā)明的包含抗體的溶液或溶液制劑中，在長期儲存過程中多聚物和降解產(chǎn)物的形成可以通過添加糖來抑制。可以使用的糖包括糖醇如甘露醇和山梨糖醇、非還原性寡糖如非還原性二糖如蔗糖和海藻糖或非還原性三糖如棉子糖，其中非還原性寡糖尤其優(yōu)選。優(yōu)選的非還原性寡糖是非還原性二糖，更優(yōu)選蔗糖和海藻糖。
糖應(yīng)當以0.1-500mg/mL、優(yōu)選10-300mg/mL、更優(yōu)選25-100mg/mL的濃度添加。
在本發(fā)明中，包含抗體的溶液制劑在冷凍/解凍循環(huán)期間不溶性微粒的形成可以通過加入表面活性劑顯著地抑制。表面活性劑的典型例子包括 非離子表面活性劑，如脫水山梨糖醇脂肪酸酯，如脫水山梨糖醇單辛酸酯、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯；甘油脂肪酸酯，如甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯；聚甘油脂肪酸酯，如十甘油單硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、十甘油單亞油酸酯；聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯；聚氧乙烯甘油脂肪酸酯，如聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯；聚氧乙烯乙二醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯乙二醇二硬脂酸酯；聚氧乙烯烷基醚，如聚氧乙烯月桂基醚；聚氧乙烯聚氧丙稀烷基醚，如聚氧乙烯聚氧丙稀乙二醇醚、聚氧乙烯聚氧丙稀丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙稀鯨蠟基醚；聚氧乙烯烷基苯基醚，如聚氧乙烯壬基苯基醚；聚氧乙烯氫化蓖麻油，如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油(聚氧乙烯氫化蓖麻油)；聚氧乙烯蜂蠟衍生物，如聚氧乙烯山梨糖醇蜂蠟；聚氧乙烯羊毛脂衍生物，如聚氧乙烯羊毛脂；聚氧乙烯脂肪酸酰胺，如HLB 6-18的聚氧乙烯硬脂酸酰胺。
陰離子表面活性劑，如具有C10-18烷基的烷基硫酸鹽如十六烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、油基硫酸鈉；具有平均EO摩爾數(shù)2-4和C10-18烷基的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽，如聚氧乙烯月桂基硫酸鈉；具有C8-18烷基的烷基硫代琥珀酸酯鹽，如月桂基硫代琥珀酸鈉；以及 天然表面活性劑，如卵磷脂；甘油磷脂；神經(jīng)鞘氨醇磷脂，如神經(jīng)鞘磷脂；C12-18脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯。本發(fā)明的制劑可以同時包含一種或多種這樣的表面活性劑。優(yōu)選用在本發(fā)明溶液制劑中的表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，如聚山梨醇20、40、60或80，優(yōu)選聚山梨醇20和80。聚氧乙烯聚氧丙稀乙二醇，如泊洛沙姆(如

F-68)也是優(yōu)選的。
所添加的表面活性劑的量隨著所用的特定表面活性劑的類型而改變，在聚山梨醇20或聚山梨醇80的情況下，代表性地是0.001-100mg/mL，優(yōu)選0.003-50mg/mL，更優(yōu)選0.005-2mg/mL。
優(yōu)選地，本發(fā)明包含抗體的溶液制劑基本上不包含蛋白質(zhì)作為穩(wěn)定劑，如人血清白蛋白或純化的明膠。
本發(fā)明抗體制劑優(yōu)選pH 4-8，更優(yōu)選5-7，最優(yōu)選6-6.5。然而pH取決于所包含的抗體，并不限于這些值。
本發(fā)明制劑可能還包含等張劑，如聚乙二醇；和糖，如葡聚糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖。
如果需要的話，本發(fā)明包含抗體的溶液制劑還可以包含稀釋劑、增溶劑、賦形劑、pH調(diào)節(jié)劑、鎮(zhèn)定劑、緩沖劑、含硫的還原劑和抗氧化劑等。例如，含硫的還原劑包括N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、硫代乙醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽，以及含巰基的化合物，如具有1-7個碳原子的硫代烷醇酸?？寡趸瘎┌ó惪箟难?、二丁羥甲苯、丁基羥基苯甲醚、α-生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸鹽、L-抗壞血酸硬脂酸鹽、二亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙基酯，或鰲合劑，如乙二胺四乙醇酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉和偏磷酸鈉。也可以包含其它通常的添加劑，如無機鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀和重碳酸鈉，和有機鹽如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀和乙酸鈉。
本發(fā)明的制劑可以通過將這些組分溶解于溶液制劑領(lǐng)域已知的水性緩沖液，如磷酸鹽緩沖液(優(yōu)選磷酸一氫鈉-磷酸二氫鈉體系)和/或檸檬酸鹽緩沖液(優(yōu)選檸檬酸鈉緩沖液)和/或醋酸鹽緩沖液中來制備溶液制劑。緩沖液的濃度典型地是1-500mM，優(yōu)選5-100mM，更優(yōu)選10-20mM。
本發(fā)明包含抗體的溶液制劑通常是通過胃腸外途徑給藥，例如注射(如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)或經(jīng)皮、粘膜、鼻腔或肺部給藥，但也可以口服給藥。
本發(fā)明包含抗體的溶液制劑通常裝在固定的密封滅菌的塑料或玻璃容器內(nèi)，如小瓶、安瓿或注射器或大體積的容器如瓶子中。習慣優(yōu)選預(yù)先充滿的瓶子。
包含在本發(fā)明制劑中的抗體的量典型地是0.1-200mg/mL，優(yōu)選1-120mg/mL，更優(yōu)選2-22.5mg/mL，這取決于所要治療的疾病的類型，疾病的嚴重程度，患者的年齡和其它因素。
在本發(fā)明的溶液制劑中，不溶性微粒的形成尤其是在冷凍/解凍循環(huán)期間的形成可以通過添加表面活性劑被顯著地抑制，在長期儲存期間不溶性物質(zhì)的形成也能通過添加表面活性劑被顯著地抑制，如下列實施例中所示。還發(fā)現(xiàn)通過添加糖，多聚物例如二聚物的形成以及降解產(chǎn)物的形成能被顯著地抑制，同時剩余抗體單體的含量能增加。
下列實施例進一步解釋了本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍?；诒景l(fā)明的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進行各種改變和變型，這些改變和變型也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例 抗體樣品 hPM-1抗體被用作人源化抗-IL-6受體抗體。hPM-1抗體是人源化hPM-1抗體，它是按照JPA HEI 8-99902的對比實施例2中描述的方法、用國際專利公開號WO 92/19759的實施例10中描述的人延伸因子Iα啟動子來制備的。
按照國際專利公開號WO98-35698的對比實施例2中描述的方法制備的抗體(以下稱為抗-HM1.24抗體)被用作人源化抗-HM1.24抗原單克隆抗體。
用在下列實施例中的hPM-1抗體和抗-HM1.24抗體都是IgG1類抗體。
試驗方法 (A)有關(guān)hPM-1抗體的試驗 (1)凝膠滲透色譜(GPC) 每一樣品都用流動相稀釋至hPM-1的含量大約是每1mL含1mg，取30-60μL在下列HPLC條件下進行試驗。
柱TSK凝膠G3000 SWXL(TOSOH) 預(yù)柱TSK預(yù)柱SWXL(TOSOH) 柱溫恒定在大約25℃ 流動相50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)-300mM氯化鈉 流速大約1.0mL/分鐘 檢測波長280nm。
用自動積分儀測量峰面積，從標準hPM-1產(chǎn)品的峰面積計算hPM-1的含量，使用下列方程式從最初計算結(jié)果來計算剩余hPM-1的百分數(shù) hPM-1含量(mg/mL)＝(標準hPM-1產(chǎn)品的濃度×試驗樣品的峰面積)÷標準hPM-1產(chǎn)品的峰面積 剩余hPM-1的百分數(shù)(％)＝(熱加速和冷凍/解凍循環(huán)以后hPM-1的含量÷最初的hPM-1含量)×100。
使用下列方程式通過面積百分數(shù)法計算二聚物、其它多聚物和降解產(chǎn)物的百分數(shù) 二聚物(或其它多聚物或降解產(chǎn)物)(％)＝[二聚物(或其它多聚物或降解產(chǎn)物)的峰面積÷總的峰面積]×100 (2)用光阻塞自動顆粒計數(shù)器(HIAC)估計不溶性微粒的數(shù)量 根據(jù)日本藥局方中“一般試驗、方法和儀器”部分中的“注射液中不溶性微粒物質(zhì)試驗”章中描述的自動光阻塞顆粒計數(shù)器的方法來進行估計。
(3)自動視覺檢查(automated visual inspection) 根據(jù)日本藥局方中“一般試驗、方法和儀器”部分中的“注射液中異質(zhì)不溶性物質(zhì)試驗”章中描述的方法進行自動視覺檢查。
視覺檢查系統(tǒng)E422型(Eisai)。
(B)有關(guān)抗-HM1.24抗體的試驗 (1)凝膠滲透色譜(GPC)；以N＝3來測量以評價相對于最初含量的剩余百分數(shù)(％)，并評價多聚物和降解產(chǎn)物的百分數(shù)。
柱TSK凝膠G3000 SWXL(TOSOH) 預(yù)柱TSK預(yù)柱SWXL(TOSOH) 柱溫恒定在大約25℃ 流動相50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)-300mM氯化鈉 流速大約0.5mL/分鐘 檢測波長280nm。
計算濃度的方法 抗-HM1.24抗體含量(mg/mL)＝(標準濃度×抗-HM1.24抗體峰面積×所用的標準的量)÷(總的標準峰面積×所用試驗樣品的量) 剩余抗-HM1.24抗體的百分數(shù)(％)＝(熱加速以后抗-HM1.24抗體的含量÷最初抗-HM1.24抗體的含量)×100 用面積百分數(shù)法計算多聚物和降解產(chǎn)物的百分數(shù)。
多聚物(或降解產(chǎn)物)(％)＝(多聚物(或降解產(chǎn)物)的峰面積÷總的峰面積)×100 實施例1添加表面活性劑的影響(1) 測試表面活性劑(聚山梨醇80)對熱穩(wěn)定性和冷凍/解凍穩(wěn)定性的影響。制備表1中所示的包含各種濃度聚山梨醇80的樣品并進行如下試驗。
(1)用凝膠滲透色譜(GPC)測得的剩余hPM-1百分數(shù)和多聚物和降解產(chǎn)物的形成來評價對熱加速(50℃-2W)的穩(wěn)定性。用自動光阻塞顆粒計數(shù)器(HIAC)測量每毫升不溶性微粒的數(shù)量。
(2)用凝膠滲透色譜(GPC)測得的剩余hPM-1百分數(shù)和多聚物和降解產(chǎn)物的形成來評價對冷凍/解凍循環(huán)(在-20℃保存三天，然后5℃保存一天，重復(fù)3個循環(huán))的穩(wěn)定性。用自動光阻塞顆粒計數(shù)器(HIAC)測量每毫升不溶性微粒的數(shù)量。
得到的結(jié)果示于表1中。
表1
已發(fā)現(xiàn)，在冷凍/解凍循環(huán)期間通過添加聚山梨醇80能顯著地抑制不溶性微粒的形成。隨著聚山梨醇80濃度的改變，穩(wěn)定性沒有顯著的變化。
實施例2添加表面活性劑的影響(2) 測試表面活性劑(聚山梨醇80)對冷凍/解凍循環(huán)和振動的穩(wěn)定性的影響。制備表2中所示的包含各種濃度聚山梨醇80的樣品并進行如下試驗。
用自動光阻塞顆粒計數(shù)器(HIAC)測得的每毫升不溶性微粒的數(shù)量來評價對冷凍/解凍循環(huán)(在-20℃儲存8小時，然后5℃8小時，2個循環(huán))的穩(wěn)定性。不溶性物質(zhì)的存在與否用自動視覺檢查來評價。
得到的結(jié)果示于表2中。
表2 (試驗樣品和結(jié)果)
已發(fā)現(xiàn)，在冷凍/解凍循環(huán)期間通過添加聚山梨醇80能顯著地抑制不溶性微粒和不溶性物質(zhì)的形成。對不溶性物質(zhì)形成的影響取決于聚山梨醇80的濃度。
實施例3添加糖的影響 測試添加糖對冷凍/解凍循環(huán)的影響。制備表3中所示的包含各種糖(蔗糖、甘露糖、海藻糖)的樣品并用從凝膠滲透色譜(GPC)測得的所形成的二聚體的量來評價對冷凍/解凍循環(huán)(在-20℃儲存2小時，然后5℃儲存2小時，重復(fù)22個循環(huán))的穩(wěn)定性。
表3 (試驗樣品和結(jié)果)
已發(fā)現(xiàn)，可以通過添加蔗糖和海藻糖抑制二聚體的形成。
實施例4蔗糖對熱穩(wěn)定性和冷凍/解凍穩(wěn)定性的影響 測試蔗糖對熱穩(wěn)定性和冷凍/解凍穩(wěn)定性的影響。制備表4中所示的包含各種濃度蔗糖的樣品并進行如下試驗。
(1)用凝膠滲透色譜(GPC)測得的剩余hPM-1百分數(shù)和多聚物和降解產(chǎn)物的形成來評價對熱加速(50℃-2W)的穩(wěn)定性。用自動光阻塞顆粒計數(shù)器(HIAC)測量每毫升不溶性微粒的數(shù)量。
(2)用凝膠滲透色譜(GPC)測得的剩余hPM-1百分數(shù)和多聚物和降解產(chǎn)物的形成來評價對冷凍/解凍循環(huán)(在-20℃保存三天，然后5℃保存一天，重復(fù)3個循環(huán))的穩(wěn)定性。用自動光阻塞顆粒計數(shù)器(HIAC)測量每毫升不溶性微粒的數(shù)量。
得到的結(jié)果示于表4中。
表4 (試驗樣品和結(jié)果)
已發(fā)現(xiàn)，通過添加蔗糖可以顯著地抑制冷凍/解凍循環(huán)期間二聚物的形成。隨著蔗糖濃度的改變，穩(wěn)定性沒有顯著的變化。
實施例5抗體濃度的影響 測試hPM-1濃度對熱穩(wěn)定性的影響。制備表5中所示的包含各種濃度hPM-1的樣品并進行下列試驗。
用凝膠滲透色譜(GPC)測得的剩余hPM-1百分數(shù)和多聚物和降解產(chǎn)物的形成來評價對熱加速(50℃-2W)的穩(wěn)定性。用自動光阻塞顆粒計數(shù)器(HIAC)測量每毫升不溶性微粒的數(shù)量。
測得的結(jié)果示于表5中。
表5 (試驗樣品和結(jié)果)
發(fā)現(xiàn)hPM-1濃度對穩(wěn)定性沒有改變。
實施例6磷酸鹽緩沖液濃度的影響 測試磷酸鹽緩沖液的濃度對熱穩(wěn)定性的影響。制備表6中所示的包含各種濃度磷酸鹽緩沖液的樣品并進行如下試驗。
用凝膠滲透色譜(GPC)測得的剩余hPM-1百分數(shù)和多聚物和降解產(chǎn)物的形成來評價對熱加速(50℃-2W)的穩(wěn)定性。用自動光阻塞顆粒計數(shù)器(HIAC)測量每毫升不溶性微粒的數(shù)量。
測得的結(jié)果示于表6中。
表6 (試驗樣品和結(jié)果)
發(fā)現(xiàn)磷酸鹽濃度對穩(wěn)定性沒有改變。
實施例7添加糖的影響 進行熱穩(wěn)定性試驗以評價當抗-HM1.24抗體的濃度為2.5-10mg/mL時添加糖(蔗糖或甘露醇)的影響。在各種儲存條件下(60℃-1W、50℃-3M、5℃-6M，開始)測量小容量和大容量抗-HM1.24抗體制劑(1mL/5mL安瓿)中包含各種濃度的糖的樣品的剩余百分數(shù)(％)、多聚物(％)和降解產(chǎn)物(％)。
測試低濃度制劑，結(jié)果示于表7和8中，同時測試高濃度制劑，結(jié)果示于表9和10中。
表7 表8 50℃-3M熱加速以后，樣品顯示剩余抗體單體百分數(shù)增加，多聚物和降解產(chǎn)物的形成減少，這取決于所加蔗糖的濃度。60℃-1W加速以后，樣品也顯示形成的多聚物的量減少。在50℃-3M熱加速條件下，糖添加劑對剩余抗體百分數(shù)的影響是蔗糖比甘露醇更顯著。還發(fā)現(xiàn)了甘露醇這種糖添加劑對抑制交聯(lián)的影響。
表9 表10 比較熱加速后形成的多聚物的量顯示，當抗-HM1.24抗體的濃度相同時，所添加的蔗糖的濃度增大，交聯(lián)被抑制得越顯著。還發(fā)現(xiàn)蔗糖對高濃度的抗-HM1.24抗體制劑的交聯(lián)也有抑制作用。
實施例8糖添加劑的影響 進一步測試各種含量的蔗糖添加劑的影響。制備表11中所示的樣品并在50℃-1M下儲存，之后用GPC測量剩余單體抗體的百分數(shù)和多聚物的量。測得的結(jié)果示于表12中。
表11 表12
已發(fā)現(xiàn)，蔗糖對于抑制抗-HM1.24抗體多聚物的形成是有效的。
實施例9添加糖的影響(冷凍/解凍試驗) 測試添加糖(非還原性二糖和非還原性三糖)對冷凍/解凍穩(wěn)定性的影響。制備表13中所示的含糖樣品，并在下列條件下進行冷凍/解凍試驗。
用凝膠滲透色譜(GPC)測得的二聚物(多聚物)的形成來評價對冷凍/解凍循環(huán)的穩(wěn)定性。
(試驗條件) 解凍-20℃→5℃(1小時)保持5℃(6小時) 冷凍5℃→-20℃(1小時)-20℃(16小時) 上述溫度循環(huán)重復(fù)3、7和21次。
表13 (試驗樣品和結(jié)果)
這些結(jié)果顯示，冷凍/解凍循環(huán)期間hPM-1抗體二聚物的形成能通過添加非還原性二糖(蔗糖、海藻糖)顯著地被抑制。
實施例10添加糖的影響(熱應(yīng)力試驗) 測試在熱負荷過程中添加糖(非還原性二糖和非還原性三糖)對穩(wěn)定性的影響。制備表14和15中所示的含糖樣品，并在下列條件下進行熱應(yīng)力試驗。
用凝膠滲透色譜(GPC)測得的二聚物和多聚物的形成來評價熱負荷過程中的穩(wěn)定性。
表14 (試驗樣品和結(jié)果)
這些結(jié)果顯示，hPM-1抗體制劑中二聚物的總量和其它多聚物的形成能通過添加非還原性二糖(蔗糖、海藻糖)顯著地被抑制。
表15
已顯示，抗-HM1.24抗體制劑和hPM-1抗體制劑類似，其中的多聚物總量和其它多聚物的形成能通過添加非還原性二糖(蔗糖、海藻糖)顯著地被抑制。
實施例11添加糖的影響(光加速試驗) 測試在光加速期間添加糖(非還原性二糖和非還原性三糖)對穩(wěn)定性的影響。制備表16和17中所示的含糖樣品，并在下列條件下進行光加速試驗。
用凝膠滲透色譜(GPC)測得的二聚物和多聚物的形成來評價光加速過程中的穩(wěn)定性。
表16 (試驗樣品和結(jié)果)
已顯示，光誘導(dǎo)的hPM-1抗體的二聚作用能通過添加蔗糖顯著地被抑制。
表17
已顯示，光誘導(dǎo)的抗-HM1.24抗體的交聯(lián)能通過添加蔗糖顯著地被抑制。
實施例12添加表面活性劑種類的影響 測試表面活性劑種類對冷凍/解凍穩(wěn)定性的影響。制備表18中所示的包含表面活性劑的樣品并進行下列試驗。
用自動光阻塞顆粒計數(shù)器(HIAC)測得的每毫升微粒的數(shù)量來評價對冷凍/解凍循環(huán)(在-25℃冷凍/4℃解凍，共3個循環(huán))的穩(wěn)定性。
表18 (試驗樣品和結(jié)果)
已發(fā)現(xiàn)，在冷凍/解凍循環(huán)期間不溶性微粒的形成可以通過添加表面活性劑種類被顯著地抑制(聚山梨醇80、聚山梨醇20、泊洛沙姆188)。
權(quán)利要求
1.一種包含抗體的溶液制劑，其中包含糖作為穩(wěn)定劑。
2.權(quán)利要求1的溶液制劑，其中還包含表面活性劑作為穩(wěn)定劑。
3.權(quán)利要求1或2的溶液制劑，其中，糖是糖醇或非還原性寡糖。
4.權(quán)利要求1或2的溶液制劑，其中，糖是非還原性寡糖。
5.權(quán)利要求1或2的溶液制劑，其中，糖是甘露糖、蔗糖、海藻糖或棉子糖。
6.權(quán)利要求1或2的溶液制劑，其中，糖是蔗糖、海藻糖或棉子糖。
7.權(quán)利要求1或2的溶液制劑，其中，糖是蔗糖或海藻糖。
8.權(quán)利要求1或2的溶液制劑，其中，糖是蔗糖。
9.權(quán)利要求2到8的任一溶液制劑，其中，表面活性劑是聚山梨醇80或20。
10.權(quán)利要求1到9的任一溶液制劑，其中，抗體是重組抗體。
11.權(quán)利要求10溶液制劑，其中，抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
12.權(quán)利要求1到11的任一溶液制劑，其中，抗體是IgG類抗體。
13.權(quán)利要求12的溶液制劑，其中，IgG類抗體是IgG1類抗體。
14.權(quán)利要求1到13的任一溶液制劑，其中，抗體是抗白介素6受體抗體或抗HM1.24抗體。
15.一種在包含抗體的溶液制劑中抑制抗體多聚物分子形成的方法，包括將糖添加到溶液中。
16.一種在包含抗體的溶液的冷凍/解凍循環(huán)期間抑制抗體多聚物分子形成的方法，包括將非還原性寡糖添加到溶液中。
17.一種在包含抗體的溶液的冷凍/解凍循環(huán)期間抑制抗體多聚物分子形成的方法，包括將非還原性二糖或非還原性三糖添加到溶液中。
18.一種在包含抗體的溶液的冷凍/解凍循環(huán)期間抑制不溶性微粒形成的方法，包括加入表面活性劑。
19.一種在包含抗體的溶液的冷凍/解凍循環(huán)期間穩(wěn)定抗體的方法，包括加入非還原性糖和表面活性劑。
全文摘要
包含糖作為穩(wěn)定劑的包含抗體的溶液制劑。所述的溶液制劑還能包含表面活性劑作為穩(wěn)定劑。
文檔編號C07K16/30GK101721362SQ200910253760
公開日2010年6月9日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月14日
發(fā)明者角田正也, 菊池淳, 水島秀文, 今枝好美 申請人:中外制藥株式會社