專(zhuān)利名稱(chēng)：表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能化磁性復(fù)合微粒的實(shí)際應(yīng)用和制備方法，具體涉及表面修飾 有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法以及由該制備方法得出的功能化磁性復(fù)合 微粒的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
表面修飾有氨基或巰基的功能化磁性微粒已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，這種粒 子在偶聯(lián)生物分子時(shí)，通常需要以戊二醛作為偶聯(lián)劑，[Liu，X. ；Xing, J. ；Guan, Y. ；Shan, G. ；Liu, H. Colloids Surf. , Α. 2004,238,127-131. Li, Y. ；Xu, Χ. ；Deng, C. ；Yang, P.； Zhang, X. J Proteome Res. 2007,6(9) 3849-3855. Li, GY. ；Huang, KL. Jiang, YR. ；Yang, DL. ；Ding, P. Int J Biol Macromol. 2008，42，405-412. 49-54.]，但是使用戊二酸作為交聯(lián) 劑，不僅具有較大的毒性，而且還需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間(2-10h)。p-phenylene di isothiocyanate (DITC) /1，4-phenylene diisothiocyanate (PDC)是異硫氰酸鹽(isothiocyanates，ITCS)的一種，來(lái)源于芥末粉， 有文獻(xiàn)報(bào)道其有抗腫瘤的作用，并且其也是一種在臨床上廣泛應(yīng)用的治療非洲和東南亞地 區(qū)寄生蟲(chóng)病的藥物。Ahmed, SH. ；Vaishnava, S. Prog Drug Res. 1975,19,2-5. Sugie, S.； Vinh, PQ. ；Rahman, KM. ；Ushida, J. Int. J. Cancer. 2005，117，524-530.因此，相對(duì)于戊二 醛來(lái)說(shuō)，采用異硫氰酸根作為交聯(lián)劑具有沒(méi)有毒性的優(yōu)勢(shì)。目前，尚沒(méi)有關(guān)于表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒的報(bào)道，也沒(méi)有規(guī) 范的在含有氨基或巰基功能基團(tuán)的膠體納米或微米級(jí)微粒表面修飾形成異硫氰酸根的制 備方法。PDC作為一種同基雙功能交聯(lián)劑，最早用來(lái)活化固相基質(zhì)用于進(jìn)行蛋白的微測(cè)序 反應(yīng)Machleidt，W. ；ffachter, E. ；Scheulen, M. ；Otto J. Febs Lett. 1973，37，217—220. Walker, JE. ；Fearnley, IM. ；Blows, RA.Biochem. J. 1986，237 73-84. Aebersold, RH.； Pipes, G. ；Hood, LE. ；Kent, SBH. Electrophoresis. 1988，9，520-530，但并沒(méi)有關(guān)于將其 與含有氨基或巰基功能基團(tuán)的膠體納米或微米級(jí)微粒合成功能化磁性微粒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法，依照 該方法制得的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒實(shí)現(xiàn)了將普通功能化磁性微粒 快速偶聯(lián)生物分子，避免了常規(guī)操作中采用戊二醛作為交聯(lián)劑帶來(lái)的毒副作用。根據(jù)氨基或巰基(-NH2)或巰基可以與異硫氰酸酯基(-N = C = S)形成苯氨(巰) 基硫甲酰(phenylthiocarbamoyl)衍生物的原理，本研究以表面氨基或巰基功能化修飾的 固相磁粒為基礎(chǔ)，通過(guò)磁粒表面的氨基基團(tuán)或巰基基團(tuán)與苯二異硫氰酸酯的一個(gè)異硫氰酸 酯基(-N = C = S)反應(yīng)形成苯氨(巰)基硫甲酰(phenylthiocarbamoyl)衍生物，從而將 另一個(gè)異硫氰酸酯基團(tuán)修飾在磁性微粒表面制備得到異硫氰酸酯活化的功能化磁性復(fù)合
3微粒?；罨拇判詮?fù)合微?？梢耘c蛋白質(zhì)、核酸等生物分子或非生物材料中的氨基或巰基 發(fā)生作用，從而形成交聯(lián)橋達(dá)到固定生物分子或非生物材料的目的。本發(fā)明所提出的功能化磁性復(fù)合微粒的制備總體上講是通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)的1、制備表面修飾有氨基或巰基活性基團(tuán)的納、微米級(jí)固相磁粒；2、將處理過(guò)的表面修飾有氨基或巰基活性基團(tuán)的納、微米級(jí)固相顆粒分散到有機(jī) 溶劑中，與苯二異硫氰酸酯(PDC)混合反應(yīng)，得到表面所修飾的功能基團(tuán)為異硫氰酸酯(-N = C = S)活性基團(tuán)的功能化磁性復(fù)合微粒。本發(fā)明提出的制備方法包括如下步驟(1)將苯二異硫氰酸酯(PDC)溶解于有機(jī)溶劑中，得到濃度(m/V)為0. 02 1 % 的PDC溶液；(2)將表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒按照0. (m/V)的配比分散于上述PDC溶液中，常溫下振蕩反應(yīng)0.5 10小時(shí)后得到混合均勻的懸 浮液；(3)將步驟(2)得到的混合均勻的懸浮液置于外加磁場(chǎng)中進(jìn)行磁性分離，然后傾 去上層清液，得到初級(jí)的功能化磁性復(fù)合微粒；(4)將初級(jí)的功能化磁性復(fù)合微粒用另外的有機(jī)溶劑洗滌2 3次，從而去除混 在異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性復(fù)合微粒表面多余的PDC，最終得到表面修飾有異硫氰酸酯 活性基團(tuán)的磁性微粒。步驟(1)所述的有機(jī)溶劑選自甲醇，丙酮，吡啶，N，N_ 二甲基甲酰胺或者其任意混 合液；步驟(4)所述的另外的有機(jī)溶劑選自甲醇、丙酮或無(wú)水乙醇。步驟(1)所述有機(jī)溶劑具體為DMF和吡啶的混合液，且DMF 吡啶為10 1 5 1，步驟(1)是將苯二異硫氰酸酯固體粉末溶解于該混合液?？紤]到最終制成產(chǎn)品的交聯(lián)效果，步驟(2)所述的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán) 的納米、微米級(jí)固相磁粒的表面氨基或巰基的含量在100 500ymoL · g—1之間；步驟(2) 所述振蕩反應(yīng)是在常溫下恒溫?fù)u床中以120轉(zhuǎn)/分振蕩反應(yīng)0. 5 10小時(shí)。步驟(4)所述的初級(jí)的功能化磁性復(fù)合微粒經(jīng)過(guò)另外的有機(jī)溶劑洗滌后，最好再 用去離子水洗滌2 3次，最終得到表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性復(fù)合微粒。步驟⑴所述的有機(jī)溶劑與步驟⑷所述的另外的有機(jī)溶劑不同；如果是混合式 的溶劑，最好是兩者無(wú)相同成分。步驟(2)所述的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒的固相磁 粒本體是Fe、Co、Ni等磁性金屬單體粉末或其所對(duì)應(yīng)氧化物粉末；或者是磁性生物大分子 微球；或者是磁性聚合物微球；或者是磁性無(wú)機(jī)物微球；或者是金磁復(fù)合微粒；所述固相磁 粒本體由磁核和高分子層構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)為核殼式，即高分子包埋金屬或金屬氧化物，或者高 分子為核、金屬或金屬氧化物為殼，或者為夾心式；上述高分子為合成高分子或者生物高分 子。步驟(2)所述的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒的制備方 法是有機(jī)硅烷化的方法，或者是在制備納米、微米級(jí)固相載體時(shí)，合成高分子或生物大分子 或聚合物單體本身帶有的氨基或巰基。采用本發(fā)明提出的制備方法獲得的表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒，可廣泛應(yīng)用于生物分子的固定化、純化和核酸、蛋白檢測(cè)領(lǐng)域。根據(jù)本發(fā)明提供的制備方法制得的表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒 具體可應(yīng)用于偶聯(lián)含有氨基或巰基基團(tuán)生物分子或非生物材料，還可將其應(yīng)用于相關(guān)生 物活性物質(zhì)或其它物質(zhì)的分離、純化、雜交及檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明提供的制備方法制得的表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒 還可實(shí)現(xiàn)在偶聯(lián)含有氨基或巰基的生物分子或非生物材料方面的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒在包括寡核苷酸的 固定化，oligo dT的固定化，核酸的雜交，RNA的純化，mRNA的純化領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒在蛋白質(zhì)的分離，純 化及免疫沉淀反應(yīng)，高豐度蛋白的去處，固定化酶及免疫分析，細(xì)胞分選，靶向載藥領(lǐng)域的 應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.相對(duì)戊二醛等其它交聯(lián)劑，本發(fā)明所用交聯(lián)劑PDC具有無(wú)生物毒性的優(yōu)勢(shì)。2.以PDC作為交聯(lián)劑，對(duì)氨基或巰基修飾的功能磁性微粒進(jìn)行活化，具有所需活 化時(shí)間短(半小時(shí)即可完成活化)，經(jīng)活化的功能磁性微?？砷L(zhǎng)期保存，便于對(duì)不同的含有 氨基或巰基基團(tuán)的生物或非生物材料進(jìn)行偶聯(lián)和固定的優(yōu)勢(shì)。3.以PDC活化后的功能磁性微粒對(duì)含有氨基或巰基基團(tuán)的生物或非生物材料進(jìn) 行偶聯(lián)時(shí)具有偶聯(lián)方便，偶聯(lián)時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)(20分鐘即可完成偶聯(lián))。


圖1為功能化磁性復(fù)合微粒偶聯(lián)氨基或巰基標(biāo)記寡核苷酸前后寡核苷酸的紫外 吸收曲線(xiàn)；其中a為偶聯(lián)前探針的吸收，b為與200 μ g磁粒偶聯(lián)后上清的吸收；圖2為功能化磁性復(fù)合微粒偶聯(lián)氨基或巰基標(biāo)記oligo (dT) 20前后oligo (dT) 20的 紫外吸收曲線(xiàn)；其中曲線(xiàn)1為偶聯(lián)前Oligo(ClT)2ci的吸收，記為OD1,曲線(xiàn)2為偶聯(lián)后上清的 吸收記為OD2 ；圖3為偶聯(lián)有0lig0(dT)2Q功能化磁性復(fù)合微粒提取mRNA示意圖；圖4為偶聯(lián)有oligo (dT)20功能化磁性復(fù)合微粒提取mRNA前后的熒光掃描結(jié)果 示意圖；i是摻有Cy5標(biāo)記mRNA的總RNA的熒光掃描圖片，ii是偶聯(lián)有mRNA的磁粒的熒光 掃描圖片，iii是提取得到的mRNA的熒光掃描圖片，iv是洗脫mRNA后的空磁球的熒光掃描 圖片；圖5為人血清抗體的純化洗脫液的紫外吸收?qǐng)D；圖6為純化血清所得抗體的SDS-PAGE電泳圖；其中圖片底部的下標(biāo)1_4 分別為 血清純化所得抗體；5為30倍稀釋血清上樣；6為Marker ；圖7為核酸突變檢測(cè)瓊脂糖電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式制備過(guò)程具體如下步驟(1)表面修飾有氨基或巰基活性基團(tuán)的納、微米級(jí)固相磁粒的制備方法包括在 Fe、Co、Ni等磁性金屬單體及其所對(duì)應(yīng)氧化物固相磁粒表面、磁性無(wú)機(jī)物微球表面以及金磁
5復(fù)合微粒表面進(jìn)行有機(jī)硅烷化的方法；包括在制備納米、微米級(jí)生物大分子固相磁粒時(shí)摻 入氨基或巰基標(biāo)記的生物分子的方法以及由本身帶有氨基或巰基的聚合物單體制備聚合 物固相磁粒的方法。制備好的表面修飾有氨基或巰基活性基團(tuán)的納、微米級(jí)固相磁粒一般 保存在有機(jī)液相環(huán)境(例如無(wú)水乙醇)中，在后需要進(jìn)行功能化磁性復(fù)合微粒制備時(shí)，對(duì)其 進(jìn)行磁性分離，棄上清即可得到高純度的表面修飾有氨基或巰基活性基團(tuán)的納、微米級(jí)固 相磁粒。(2)PDC溶液的配制將苯二異硫氰酸酯(簡(jiǎn)稱(chēng)PDC)溶解于兩種或兩種以上有機(jī) 溶劑中，配制PDC溶液。(3)功能化磁性復(fù)合微粒的制備將置于液相中的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán) 的納米、微米級(jí)固相磁粒磁性分離，棄上清；在其中加入上述配制好的PDC溶液，常溫振蕩 反應(yīng)10小時(shí)，磁性分離，棄上清后，用有機(jī)溶劑反復(fù)清洗，即可得到表面修飾有異硫氰酸酯 (-N = C = S)活性基團(tuán)的功能化磁性復(fù)合微粒。上述制備方法中所用到的有機(jī)溶劑3_氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基 硅烷、3-氨基或巰基丙烷、3-氨基或巰基己烷、甲醇、丙酮、乙醇、吡啶、N, N- 二甲基甲酰胺 (DMF)及二甲亞砜。以下各實(shí)施例僅作為制備方法或產(chǎn)品應(yīng)用的具體實(shí)例，用以進(jìn)一步闡明本發(fā)明， 并非限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例旨在闡明本發(fā)明的功能化磁性復(fù)合微粒制備的可實(shí)施性。1、PDC溶液的配制稱(chēng)取0. Ig苯二異硫氰酸酯固體粉末，將其溶解于50mL DMF和吡啶的混合溶液中 (DMF 吡啶=9:1)。2、功能化磁性復(fù)合微粒的制備將分散于無(wú)水乙醇相中的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒 (該固相微粒本體為Fe氧化物粉末)進(jìn)行磁性分離，棄上清。取其105 200mg表面氨基 或巰基修飾的固相磁粒(磁粒表面氨基或巰基的含量為100 SOOymoI^g-1)，在其中加入 15 25mL上述配制好的PDC溶液，常溫下恒溫?fù)u床中120轉(zhuǎn)/分振蕩反應(yīng)0. 5 10小時(shí)。 反應(yīng)完畢后，磁性分離，傾去上清液，先用無(wú)水乙醇洗滌2 5次，再用去離子水洗滌2 5 次，最后定容，稱(chēng)取固形物含量備用。實(shí)施例2本實(shí)施例旨在闡明本發(fā)明的功能化磁性復(fù)合微粒制備的可實(shí)施性。1、PDC溶液的配制稱(chēng)取0. Ig苯二異硫氰酸酯固體粉末，將其溶解于50mL DMF和吡啶的混合溶液中 (DMF 吡啶=9:1)。2、功能化磁性復(fù)合微粒的制備將分散于無(wú)水乙醇相中的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒 (該固相微粒本體為Fe氧化物粉末)進(jìn)行磁性分離，棄上清。取300mg表面氨基或巰基修 飾的固相磁粒(磁粒表面氨基或巰基的含量為300 μ moL · g—1)，在其中加入50mL上述配制 好的PDC溶液，常溫下恒溫?fù)u床中120轉(zhuǎn)/分振蕩反應(yīng)0.5 10小時(shí)。反應(yīng)完畢后，磁性分離，傾去上清液，先用有機(jī)溶劑洗滌2 3次，再用去離子水洗滌2 3次，最后定容，稱(chēng) 取固形物含量備用。實(shí)施例3本實(shí)施例旨在闡明本發(fā)明的功能化磁性復(fù)合微粒制備的可實(shí)施性。1、PDC溶液的配制稱(chēng)取0. Olg苯二異硫氰酸酯固體粉末，將其溶解于50mL DMF和吡啶的混合溶液中 (DMF 吡啶=9:1)。2、功能化磁性復(fù)合微粒的制備將分散于丙酮相中的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒(該 固相微粒本體為Co氧化物粉末)進(jìn)行磁性分離，棄上清。取50mg表面氨基或巰基修飾的 固相磁粒(磁粒表面氨基或巰基的含量為100 μ moL · g—1)，在其中加入50mL上述配制好的 PDC溶液，常溫下恒溫?fù)u床中120轉(zhuǎn)/分振蕩反應(yīng)0.5 10小時(shí)。反應(yīng)完畢后，磁性分離， 傾去上清液，先用有機(jī)溶劑洗滌2 3次，再用去離子水洗滌2 3次，最后定容，稱(chēng)取固形 物含量備用。實(shí)施例4本實(shí)施例旨在闡明本發(fā)明的功能化磁性復(fù)合微粒制備的可實(shí)施性。1、PDC溶液的配制稱(chēng)取Ig苯二異硫氰酸酯固體粉末，將其溶解于50mLDMF和吡啶的混合溶液中 (DMF 吡啶=9:1)。2、功能化磁性復(fù)合微粒的制備將分散于無(wú)水乙醇相中的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒 (該固相微粒本體為Fe氧化物粉末)進(jìn)行磁性分離，棄上清。取500mg表面氨基或巰基修 飾的固相磁粒(磁粒表面氨基或巰基的含量為300 μ moL · g—1)，在其中加入50mL上述配制 好的PDC溶液，常溫下恒溫?fù)u床中120轉(zhuǎn)/分振蕩反應(yīng)0.5 10小時(shí)。反應(yīng)完畢后，磁性 分離，傾去上清液，先用有機(jī)溶劑洗滌2 3次，再用去離子水洗滌2 3次，最后定容，稱(chēng) 取固形物含量備用。實(shí)施例5本實(shí)施例旨在證明本發(fā)明功能化磁性復(fù)合微粒可用常規(guī)方法偶聯(lián)寡核苷酸。2mL離心管取200 μ g功能化磁性復(fù)合微粒，磁性分離棄上清，磷酸鹽緩沖液 PBS (0. ImoL · Λ ρΗ = 7. 4)洗三遍，加入 2. 5 μ L PNM-L(80ymoL · Γ1)寡核苷酸探針、 PBS (0. ImoL · L-1，ρΗ = 7. 4) 97. 5 μ L，磁性分離，上清液進(jìn)行紫外檢測(cè)，記錄OD260nm的值，計(jì) 算Img功能化磁性復(fù)合微?？膳悸?lián)1. 2nmol的寡核苷酸探針。紫外吸收曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。實(shí)施例6本實(shí)施例旨在證明本發(fā)明功能化磁性復(fù)合微粒對(duì)氨基或巰基標(biāo)記0lig0(dT)2(l的 偶聯(lián)。用PBS緩沖液溶解0lig0(dT)2Q，配制一定濃度的oligo (dT)2Q溶液；取磁粒Img 放于2mL離心管中，先用甲醇清洗，再用PBS緩沖液(0. ImoL · L—1，ρΗ = 7. 4)清洗，磁性分 離，棄上清，加入配制好的0lig0(dT)2(l溶液，在恒溫振蕩器中37°C下振蕩lh，取出后，磁性 分離，對(duì)上清進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)。經(jīng)計(jì)算可得偶聯(lián)效率為50. 12%?？偟膐ligo (dT)2Q的量乘以偶聯(lián)效率，可計(jì)算出Img功能化磁性復(fù)合微粒約可偶聯(lián)0lig0(dT)2(l的量為1. 1 1. 4nmoL0紫外吸收曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。實(shí)施例7本實(shí)施例旨在證明本發(fā)明偶聯(lián)有氨基或巰基標(biāo)記0lig0(dT)2(l的功能化磁性復(fù)合 微粒在mRNA純化中的應(yīng)用。功能化磁粒表面偶聯(lián)有序列為T(mén)TTTTTTTT的寡核苷酸分子(即oligo (dT) 20)，當(dāng)總 RNA與磁粒作用時(shí)，oligo (dT)20會(huì)與mRNA分子中的polyA尾巴(AAAAAAA)序列雜交，從而 將mRNA從總RNA中提取出來(lái)，最后加入洗脫液，將mRNA從磁球上洗脫下來(lái)，如圖3所示。取一定量磁粒(oligo (dT) 2Q)置于2mL離心管中，磁性分離，棄上清，用Tris緩沖 液(0. 02moL · ΙΛ ρΗ = 8. 0)清洗數(shù)次，最后將磁球分散到Tris緩沖液中，備用。取100 μ g總RNA用0. 01 % DEPC處理水稀釋至90 μ L，溫浴5min后，加入一定量 5moL .L-1NaCl溶液，將此溶液加入到磁粒(oligo (dT) 2(1)中，室溫雜交后，磁性分離，棄上清， 用Tris緩沖液(0. 007moL · ΛρΗ = 8. 0)清洗，最后加入一定體積的0. 01% DEPC處理水， 再溫浴，最后磁性分離，保留上清。其過(guò)程可用熒光掃描儀監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖4所示。其中1為摻有Cy5熒光分子標(biāo) 記mRNA的總RNA的熒光掃描圖片，其中紅色的亮點(diǎn)為Cy5分子的特征熒光。當(dāng)用磁粒提取 mRNA分子后，用熒光掃描儀檢測(cè)磁粒，結(jié)果顯示為2，其中紅色的亮點(diǎn)仍為Cy5分子的特征 熒光，這一結(jié)果可說(shuō)明磁粒已將mRNA從總RNA中提取出來(lái)。用0. 01 % DEPC處理水清洗磁 粒，上清用熒光掃描儀檢測(cè)，結(jié)果為3，可見(jiàn)0. 01 % DEPC處理水可將mRNA從磁粒表面洗脫 下來(lái)。結(jié)果4為洗脫后的空球，熒光掃描儀檢測(cè)已無(wú)紅色熒光，說(shuō)明0. 01% DEPC處理水從 磁粒上洗脫mRNA這一過(guò)程進(jìn)行得較完全。綜合以上結(jié)果，可說(shuō)明偶聯(lián)有0lig0(dT)2(l的磁 粒可較完全地將mRNA從總RNA中提取出來(lái)，且洗脫后磁粒上不再連有mRNA。實(shí)施例8本實(shí)施例旨在證明本發(fā)明功能化磁性復(fù)合微粒對(duì)親和配體蛋白A的偶聯(lián)，及在抗 體純化中的應(yīng)用。用PBS緩沖液溶解蛋白A，配制一定濃度的蛋白A溶液，并測(cè)定紫外吸收；取磁粒 Img放于2mL離心管中，用PBS緩沖液(0. ImoL · L-1，ρΗ = 7. 4)清洗兩次，磁性分離，棄上 清，加入配制好的蛋白A溶液，在恒溫振蕩器中37°C下振蕩30min，取出后，磁性分離，對(duì)上 清進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)。經(jīng)計(jì)算可得偶聯(lián)效率為60%。可計(jì)算出Img功能化磁性復(fù)合微 粒約可偶聯(lián)蛋白A的量為120 μ g。取Img的Protein A-磁性微粒置于2ml離心管中，磁性分離，棄上清，用結(jié)合緩沖 液清洗磁粒2次。取50 μ 1人血清，用結(jié)合緩沖液(0. lmol/L PBBuffer, ρΗ 7. 5)稀釋至 500 μ L·加入偶聯(lián)蛋白A的磁性微粒中，37°C，180rpm恒溫振蕩器中反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢， 磁性分離，用Iml清洗緩沖液(1XPBS，含0. 05% Tween-20)對(duì)結(jié)合有Protein A-IgG復(fù)合 物的磁性微粒清洗3次。然后用200 μ 1洗脫緩沖液(0. lmol/L Gly-HCl+0. 15mol/L NaCl, PH 2.8)洗脫兩次，分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各管洗脫液在280nm處的吸光度值，如圖5 所示，并計(jì)算抗體的洗脫量為175 μ g。用12%分離膠，3. 5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)法染色，檢測(cè)純化所 得抗體的純度如圖6所示，抗體洗脫液泳道有兩條明顯的條帶，分別是抗體分子的重鏈和輕鏈，證明純化抗體具有較高純度。實(shí)施例9本實(shí)施例旨在證明本發(fā)明功能化磁性復(fù)合微粒對(duì)鏈親和素的偶聯(lián)，及在核酸突變 檢測(cè)中的應(yīng)用。用PBS緩沖液溶解鏈親和素，配制一定濃度的鏈親和素溶液，并測(cè)定紫外吸收；取 磁粒Img放于2mL離心管中，用PBS緩沖液(0. ImoL · pH = 7. 4)清洗兩次，磁性分離， 棄上清，加入配制好的鏈親和素溶液，在恒溫振蕩器中37°C下振蕩30min，取出后，磁性分 離，對(duì)上清進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)。經(jīng)計(jì)算可得偶聯(lián)效率為80%。可計(jì)算出Img功能化磁 性復(fù)合微粒約可偶聯(lián)鏈親和素的量為160 μ g。如圖7所示，生物素標(biāo)記的核酸突變檢測(cè)探針對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè)用三條檢測(cè)探 針對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，Pl, ΡΓ為針對(duì)兩種不同等位基因(野生型和突變型)的探針，P2 為公用探針，Pl, ΡΓ 5’端為生物素標(biāo)記。把Pl，P2和ΡΓ P2在兩個(gè)反應(yīng)體系中與檢測(cè)模 板退火雜交，經(jīng)Taq Ligase接酶連接后，Pl，P2或ΡΓ P2完成連接。用鏈親和素偶聯(lián)磁性復(fù)合微粒對(duì)上述生物素標(biāo)記的檢測(cè)探針進(jìn)行純化和PCR擴(kuò) 增(擴(kuò)增引物為CCAGA CGACA CCGAG ATAGC AGCC 禾口 GGG TTCGTG GTA GAG CGT CGG AGT)。 經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳驗(yàn)證基因型。Ρ1，ΡΓ分別為5，biotin-TTTTTTT TGCG ATCG CAGC GGTA ACCT GACC CA CCC AGCAGT TTG GCC A5' biotin-TTTTTTTTGCG ATCG CAGC GGTA ACCT GACC CA CCC AGCAGT TTG GCC CP2 為:GCC CM AAT CTG TGA TCT TG TGC AGT GTA AGC MC TAT TGT CT TGCGGGTA CAGC ACCT ACCT TGCG檢測(cè)結(jié)果如下只有對(duì)應(yīng)野生型等位基因的探針組Pl，P2有條帶出現(xiàn)，證明模板 為野生型模板。
序列表
<110>陜西北美基因股份有限公司
<120>表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法
<140>200910254487. 5
<141>2009-12-24
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc difference <222>⑴
<223>n =氨基修飾胸苷 <400>1
nttttttttttttttttttt 20 <210>2
9<211>24 <212>DNA <213>人工序列 <400>2
CCAGACGACA CCGAGATAGC AGCC 24
<210>3 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <400>3
GGGTTCGTGG TAGAGCGTCG GAGT 24
<210>4 <211>49 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc difference <222>⑴
<223>n =生物素修飾胸苷 <400>4
TTTTTTTTGC GATCGCAGCG GTAACCTGAC CCACCCAGCA
GTTTGGCCA49
<210>5
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc difference <222>⑴
<223>n =生物素修飾胸苷 <400>5
TTTTTTTTGC GATCGCAGCG GTAACCTGAC CCACCCAGCA GTTTGGCCC49
<210>6 <211>66 <212>DNA <213>人工序列<220>
<221>misc difference <222>⑴
<223>n =磷酸化修飾鳥(niǎo)苷 <400>6
GCCCAAAATC TGTGATCTTG TGCAGTGTAA GCAACTATTG
TCTTGCGGGT ACAGCACCTA 60
CCTTGCG
1權(quán)利要求
一種表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟(1)將苯二異硫氰酸酯(PDC)溶解于有機(jī)溶劑中，得到濃度(m/V)為0.02～1％的PDC溶液；(2)將表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒按照0.1％～1％(m/V)的配比分散于上述PDC溶液中，常溫下振蕩反應(yīng)0.5～10小時(shí)后得到混合均勻的懸浮液；(3)將步驟(2)得到的混合均勻的懸浮液置于外加磁場(chǎng)中進(jìn)行磁性分離，然后傾去上層清液，得到初級(jí)的功能化磁性復(fù)合微粒；(4)將初級(jí)的功能化磁性復(fù)合微粒用另外的有機(jī)溶劑洗滌2～3次，得到表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法，其 特征在于步驟⑴所述的有機(jī)溶劑選自甲醇，丙酮，吡唳，N, N-二甲基甲酰胺或者其任意 混合液；步驟⑷所述另外的有機(jī)溶劑為甲醇、丙酮或無(wú)水乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法，其 特征在于步驟(1)所述有機(jī)溶劑為DMF和吡啶的混合液，且DMF 吡啶的比值在10 1 5 1，步驟(1)是將苯二異硫氰酸酯固體粉末溶解于該混合液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方 法，其特征在于步驟(2)所述的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒的 表面氨基或巰基的含量在100 500 μ moL 之間；步驟(2)所述振蕩反應(yīng)是在常溫下恒 溫?fù)u床中以120轉(zhuǎn)/分振蕩反應(yīng)0. 5 10小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法，其 特征在于步驟(4)所述的功能化磁性復(fù)合微粒經(jīng)過(guò)所述另外的有機(jī)溶劑洗滌后，再用去 離子水洗滌2 3次，最終得到表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法，其 特征在于步驟(1)所述有機(jī)溶劑與步驟(4)所述另外的有機(jī)溶劑不同。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法，其 特征在于步驟(2)所述的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒的固相 磁粒本體是Fe、Co、Ni等磁性金屬單體粉末或其所對(duì)應(yīng)氧化物粉末；或者是磁性生物大分 子微球；或者是磁性聚合物微球；或者是磁性無(wú)機(jī)物微球；或者是金磁復(fù)合微粒；所述固相 磁粒本體由磁核和高分子層構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)為核殼式，即高分子包埋金屬或金屬氧化物，或者 高分子為核、金屬或金屬氧化物為殼，或者為夾心式；上述高分子為合成高分子或者生物高 分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法，其 特征在于步驟(2)所述的表面修飾有氨基或巰基官能團(tuán)的納米、微米級(jí)固相磁粒的制備 方法是有機(jī)硅烷化的方法，或者是在制備納米、微米級(jí)固相載體時(shí)，合成高分子或生物大分 子或聚合物單體本身帶有的氨基或巰基。
9.表面修飾有異硫氰酸酯活性基團(tuán)的磁性微粒，其特征在于采用權(quán)利要求1至8任 一所述的制備方法獲得的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒，應(yīng)用于生物分子的 固定化、純化和核酸、蛋白檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒的制備方法及其具體應(yīng)用方式。本發(fā)明提出的制備方法是將處理過(guò)的表面修飾有氨基或巰基活性基團(tuán)的納、微米級(jí)固相顆粒分散到有機(jī)溶劑中，與苯二異硫氰酸酯(PDC)混合反應(yīng)，得到表面所修飾的功能基團(tuán)為異硫氰酸根(-N＝C＝S)活性基團(tuán)的功能化磁性復(fù)合微粒。依照該方法制得的表面修飾有異硫氰酸根活性基團(tuán)的磁性微粒實(shí)現(xiàn)了將普通功能化磁性微?？焖倥悸?lián)生物分子，避免了常規(guī)操作中采用戊二醛作為交聯(lián)劑帶來(lái)的毒副作用。
文檔編號(hào)C07K1/22GK101901656SQ20091025448
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者唐一通, 崔亞麗, 耿婷婷, 陳超 申請(qǐng)人:陜西北美基因股份有限公司