專利名稱：一種抗人血清/漿中高豐度蛋白卵黃抗體IgY的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗人血清/漿中高豐度蛋白卵黃抗體IgY的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類血清/漿等生物樣品中含有機(jī)體組織細(xì)胞分泌、脫落至血中的多種低豐度蛋 白質(zhì)，它們可能是一些信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控的關(guān)鍵蛋白。例如，壞死、凋亡或溶血過(guò)程中，都會(huì)有 一些細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放到血中。開(kāi)展疾病的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究，尋找低豐度蛋白質(zhì)，將有 利于闡明發(fā)病機(jī)理，并有可能發(fā)現(xiàn)一些與疾病特定狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，從而為疾病 的診斷提供新方法。然而一些高豐度蛋白質(zhì)的存在，尤其是白蛋白和抗體，嚴(yán)重影響了低豐 度蛋白質(zhì)的鑒定和檢測(cè)。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常利用抗體親和層析法去除樣品中的高豐度蛋白質(zhì)，以提高對(duì) 低豐度蛋白檢測(cè)的靈敏度和分辨率。利用抗體親和層析去除技術(shù)的關(guān)鍵是得到特異性高 且廉價(jià)易得的抗體，而現(xiàn)在抗體親和層析法多采用哺乳動(dòng)物來(lái)源的重組單克隆或多克隆抗 體。 一般使用兔，鼠等哺乳動(dòng)物作為產(chǎn)生抗血清/血漿中高豐度蛋白抗體的動(dòng)物來(lái)源。哺 乳動(dòng)物的單克隆抗體制備較復(fù)雜，產(chǎn)量小，成本高；其來(lái)源于血漿的多克隆抗體同樣存在上 述問(wèn)題，且會(huì)存在非特異性結(jié)合的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗人血清/漿中高豐度蛋白抗體的制備方法及其應(yīng) 用，其解決了現(xiàn)有技術(shù)中使用兔，鼠等哺乳動(dòng)物作為產(chǎn)生抗血清/血漿中高豐度蛋白抗體 的動(dòng)物來(lái)源，使用哺乳動(dòng)物血清作為提取抗體來(lái)源，致使抗體的制備步驟復(fù)雜，產(chǎn)量小，成 本高，抗體有非特異性結(jié)合，效價(jià)低且不穩(wěn)定等問(wèn)題；并且解決了哺乳動(dòng)物來(lái)源抗體在蛋白 分離，提取中引起的非特異性分離問(wèn)題。解決了哺乳動(dòng)物來(lái)源抗體在免疫學(xué)檢測(cè)中非特異 性吸附而導(dǎo)致的雜信號(hào)影響問(wèn)題。 本發(fā)明解決上述問(wèn)題的思路是禽類在種系發(fā)生上具有和哺乳動(dòng)物更遠(yuǎn)的親緣關(guān) 系，可針對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)化中大量保守蛋白抗原產(chǎn)生具有更高特異性的抗體，且產(chǎn)生有效免 疫反應(yīng)所需抗原量小。使用經(jīng)免疫后母雞的蛋，取代動(dòng)物血清，作為提取抗體的來(lái)源。近 年來(lái)，卵黃免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk，簡(jiǎn)稱IgY)，因產(chǎn)量大、特異性強(qiáng)、獲取方 便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的應(yīng)用于疾病的診斷、預(yù)防和治療，成為一種穩(wěn)定可靠的抗體 來(lái)源?？谷搜獫{高豐度蛋白的特異性IgY可共價(jià)結(jié)合于固體支持物，去除血漿中的高豐度 蛋白，如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白(IgA、 IgM、 IgG)等。
本發(fā)明解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案是所提供的一種抗人血清/漿中高豐度蛋白抗 體IgY的制備方法包括以下步驟 1 、收集經(jīng)過(guò)高豐度蛋白免疫后母雞所產(chǎn)的含高效價(jià)抗體的雞蛋。所述含高效價(jià)抗 體的雞蛋是這樣確定的用間接ELISA法檢測(cè)經(jīng)過(guò)高豐度蛋白免疫后母雞血清的效價(jià)，效價(jià)達(dá)標(biāo)后即為高效價(jià)抗體雞蛋； 2、從高效價(jià)抗體雞蛋中分離提取高豐度蛋白卵黃抗體IgY :將所述的高效價(jià)抗體雞蛋的卵黃液經(jīng)酸性水溶解，凍融，過(guò)濾，硫酸銨沉淀和DEAE陰離子交換層析即可分離得到純化的高豐度蛋白卵黃抗體IgY。 步驟2高豐度蛋白卵黃抗體的分離提取，其步驟是 (1)去除高效價(jià)雞蛋的蛋白和卵黃膜得到卵黃液，用超純水稀釋卵黃液，按超純水與卵黃液l : 2-1 : 15的體積比，調(diào)整稀釋液的pH在4. 5-6.0范圍，4t:攪拌9h至過(guò)夜。將卵黃稀釋液凍存后，置于4t:緩慢溶解，過(guò)濾。濾液經(jīng)11000rpm離心20min，收集上清。
(2)上述上清液用飽和硫酸銨沉淀2次，最終濃度分別為50%和35% 。 11000rpm離心25min，棄上清，沉淀用PBS溶解。4t:透析24h，中間換液4次。透析得卵黃抗體粗品。
(3)用DEAE陰離子交換柱在6. 8 7. 0的近中性環(huán)境下對(duì)卵黃抗體進(jìn)行純化，lmol/L NaCl梯度洗脫，流速lmL/min。收集洗脫液，即為卵黃抗體溶液。
步驟1對(duì)經(jīng)過(guò)免疫后母雞的血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，獲取含高效價(jià)抗體的雞蛋，其步驟是 (1. 1)用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的光吸收值，以陽(yáng)性血清450nm的光吸收值大于陰性對(duì)照平均值2. 1倍時(shí)的血清最低稀釋度為ELISA效價(jià)。
(1. 2)用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)，ELISA效價(jià)達(dá)1 : 10000后收取雞蛋，
4t:保存。 本發(fā)明中所述高豐度蛋白為白蛋白，IgG，轉(zhuǎn)鐵蛋白，C3補(bǔ)體，IgA， IgM，胰蛋白，珠蛋白，脂蛋白，F(xiàn)因子，C9補(bǔ)體，C4補(bǔ)體，銅藍(lán)蛋白，載脂蛋白B，載脂蛋白A-l， ci-l-酸性糖蛋白，H因子，補(bǔ)體因子B，前白蛋白，Clq補(bǔ)體等濃度高于10iig/ml的高豐度蛋白。
本發(fā)明中抗人血清/漿中高豐度蛋白卵黃抗體IgY應(yīng)用包括高豐度蛋白的免疫親和提取、高豐度蛋白的免疫親和分離，高豐度蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是 1、制備高豐度蛋白卵黃抗體IgY時(shí)，收集蛋方便，無(wú)需采血，無(wú)損傷，符合現(xiàn)代動(dòng)物保護(hù)規(guī)則。 2、抗體產(chǎn)量高，維持在高效價(jià)的時(shí)間長(zhǎng)，成本低廉。產(chǎn)蛋禽類經(jīng)免疫后，很快就可在蛋中產(chǎn)生較高效價(jià)，且維持時(shí)間長(zhǎng)。卵黃抗體產(chǎn)量大，每個(gè)蛋大約含100mg以上的IgY，一個(gè)月可達(dá)3g，相當(dāng)于兔子的10-12倍。由于禽類的飼養(yǎng)費(fèi)用低廉，并可長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生高效價(jià)抗體，其成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于從哺乳動(dòng)物血漿中提取到相應(yīng)抗體。 3、抗體分離提取方便且純度高。卵黃中沒(méi)有其他的Ig，易于提純。利用硫酸銨沉淀法分離到的IgY粗品純度就達(dá)90%以上。 4、 IgY更穩(wěn)定，易于儲(chǔ)存。由于受到卵黃的保護(hù)，蛋貯存在fC條件下6個(gè)月，IgY活性只有很小損失。而且，IgY較哺乳動(dòng)物抗體更耐酸，耐堿，耐熱。 5、卵黃抗體對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白抗原產(chǎn)生的效價(jià)高，特異性強(qiáng)，且產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量小。 6、抗高豐度蛋白的卵黃抗體應(yīng)用于高豐度蛋白的免疫親和提取、高豐度蛋白的免疫親和分離，高豐度蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)。解決了高豐度蛋白的免疫親和提取、高豐度蛋白的免疫親和分離，高豐度蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)中的非特異性問(wèn)題。


圖1為卵黃抗體IgY分離提取SDS-PAGE電泳圖，泳道1為純化得到的高豐度蛋白IgY，泳道2為高豐度蛋白IgY標(biāo)品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1為抗轉(zhuǎn)鐵蛋白雞的IgY制備過(guò)程 1、對(duì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫后母雞的蛋進(jìn)行檢測(cè)，獲取含高效價(jià)抗體的雞蛋。具體步驟是 (1)用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的光吸收值，以陽(yáng)性血清450nm的光吸收值大于陰性對(duì)照平均值2. 1倍時(shí)的血清最低稀釋度為ELISA效價(jià)。
(2)用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)，ELISA效價(jià)達(dá)l : 10000后收取雞蛋，4°C保存。 2、從高效價(jià)抗體雞蛋中分離提取高豐度蛋白卵黃抗體IgY :將所述的高效價(jià)抗體雞蛋的卵黃液經(jīng)酸性水溶解，凍融，過(guò)濾，硫酸銨沉淀和DEAE-fast-flow離子交換層析即可分離得到純化的高豐度蛋白卵黃抗體IgY。具體步驟是 (l)去除高效價(jià)雞蛋的蛋白和卵黃膜得到卵黃液，用超純水與卵黃液l : 9的體積比稀釋卵黃液，將稀釋液調(diào)整到ra = 5. 5左右，4t:攪拌9h至過(guò)夜。將卵黃稀釋液凍存后，置于4t:緩慢溶解，過(guò)濾。濾液經(jīng)llOOOrpm離心20min，收集上清。 (2)上述上清液用飽和硫酸銨沉淀2次，最終濃度分別為50%和35% 。 11000rpm
離心25min，棄上清，沉淀用PBS溶解。4t:透析24h，中間換液4次。透析得卵黃抗體粗品。 (3)用DEAE陰離子交換柱在6. 8 7. 0的近中性環(huán)境下對(duì)卵黃抗體進(jìn)行純化，
lmol/L NaCl梯度洗脫，流速lmL/min。收集洗脫液，即為卵黃抗體溶液。 (4)從圖1可以看出，泳道1和泳道2中，在相同位置出現(xiàn)相同條帶，說(shuō)明提取得到
了卵黃抗體IgY。 實(shí)施例2為抗白蛋白雞的IgY制備過(guò)程 1、對(duì)經(jīng)過(guò)白蛋白免疫后母雞的血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，獲取含高效價(jià)抗體的雞蛋。具體步驟是 (1)用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的光吸收值，以陽(yáng)性血清450nm的光吸收值大于陰性對(duì)照平均值2. 1倍時(shí)的血清最低稀釋度為ELISA效價(jià)。
(2)用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)，ELISA效價(jià)達(dá)l : 10000后收取雞蛋，4°C保存。 2、從高效價(jià)抗體雞蛋中分離提取高豐度蛋白卵黃抗體IgY :將所述的高效價(jià)抗體雞蛋的卵黃液經(jīng)酸性水溶解，凍融，過(guò)濾，硫酸銨沉淀和DEAE離子交換層析即可分離得到純化的高豐度蛋白卵黃抗體IgY。 (l)去除高效價(jià)雞蛋的蛋白和卵黃膜得到卵黃液，用超純水與卵黃液l : 9的體積比稀釋卵黃液，將稀釋液調(diào)整到ra = 5. 5左右，4t:攪拌9h至過(guò)夜。將卵黃稀釋液凍存后，置于4t:緩慢溶解，過(guò)濾。濾液經(jīng)llOOOrpm離心20min，收集上清。 (2)上述上清液用飽和硫酸銨沉淀2次，最終濃度分別為50%和35% 。 11000rpm
5離心25min，棄上清，沉淀用PBS溶解。4t:透析24h，中間換液4次。透析得卵黃抗體粗品。 (3)用DEAE陰離子交換柱在6. 8 7. 0的近中性環(huán)境下對(duì)卵黃抗體進(jìn)行純化，
lmol/L NaCl梯度洗脫，流速lmL/min。收集洗脫液，即為卵黃抗體溶液。 (4)從圖1可以看出，泳道1和泳道2中，在相同位置出現(xiàn)相同條帶，說(shuō)明提取得到
了高純度的卵黃抗體IgY。
權(quán)利要求
一種抗人血清/漿中高豐度蛋白卵黃抗體IgY的制備方法，其特征在于所述制備過(guò)程包括以下步驟(1)收集經(jīng)過(guò)高豐度蛋白免疫后母雞所產(chǎn)的含高效價(jià)抗體的雞蛋。所述含高效價(jià)抗體的雞蛋是這樣確定的用間接ELISA法檢測(cè)經(jīng)過(guò)高豐度蛋白免疫后母雞血清的效價(jià)，效價(jià)達(dá)標(biāo)后即為高效價(jià)抗體雞蛋；(2)從高價(jià)效抗體雞蛋中分離提取抗高豐度蛋白卵黃抗體IgY將所述高效價(jià)抗體雞蛋的卵黃液經(jīng)酸性水稀釋，經(jīng)凍融，過(guò)濾得到含卵黃抗體IgY的水溶液，硫酸銨沉淀粗純，DEAE離子交換層析即可分離得到純化的高豐度蛋白卵黃抗體IgY。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人血清/漿中高豐度蛋白卵黃抗體IgY的制備方法，其特 征在于步驟(2)所述高豐度蛋白卵黃抗體IgY的分離提取，其步驟是(2. 1)去除高效價(jià)雞蛋的蛋白和卵黃膜得到卵黃液，用超純水稀釋卵黃液，按卵黃液與 超純水l : 2-1 : 15的體積比，并將稀釋液調(diào)整pH在4. 5-6.0范圍，4t:攪拌9h至過(guò)夜。 將卵黃稀釋液凍存后，置于4t:緩慢溶解，過(guò)濾。濾液經(jīng)11000rpm離心20min，收集上清即 為含卵黃抗體IgY的水溶液。(2. 2)含卵黃抗體IgY的水溶液上清用飽和硫酸銨沉淀2次，終濃度分別為50%和 35%。 11000rpm離心25min，棄上清，沉淀用PBS溶解。4"透析24h，中間換液4次。透析 得到卵黃抗體粗品。(2. 3)用DEAE陰離子交換柱在pH 6. 8 7. 0的近中性環(huán)境下對(duì)卵黃抗體進(jìn)行純化， lmol/L NaCl梯度洗脫，流速lmL/min。收集洗脫液，得到卵黃抗體溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人血清/漿中高豐度蛋白卵黃抗體IgY的制備方法，其特 征在于步驟(1)對(duì)經(jīng)過(guò)高豐度蛋白免疫后母雞血清效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，獲取含高效價(jià)抗體的 雞蛋，其步驟是(1. 1)用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的光吸收值，以陽(yáng)性血 清450nm的光吸收值大于陰性對(duì)照平均值2. 1倍時(shí)的血清最低稀釋度為ELISA效價(jià)。(1.2)用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)，ELISA效價(jià)達(dá)1 : 10000后收取雞蛋，4t:保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的抗人血清/漿中高豐度蛋白卵黃抗體IgY的制備方 法，其特征在于制備出的抗人血清/漿中高豐度蛋白卵黃抗體IgY用于高豐度蛋白的提 取，分離，免疫學(xué)檢測(cè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的抗人血清/漿中高豐度蛋白抗體IgY的制備方法，其 特征在于所述高豐度蛋白為白蛋白，IgG，轉(zhuǎn)鐵蛋白，C3補(bǔ)體，IgA， IgM，胰蛋白，珠蛋白，脂 蛋白，F(xiàn)因子，C9補(bǔ)體，C4補(bǔ)體，銅藍(lán)蛋白，載脂蛋白B，載脂蛋白A-l， a -1-酸性糖蛋白，H 因子，補(bǔ)體因子B，前白蛋白，Clq補(bǔ)體等濃度高于10iig/ml的高豐度蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗人血清/漿高豐度蛋白卵黃抗體IgY的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明用經(jīng)過(guò)高豐度蛋白免疫后母雞的蛋作為提取抗體的來(lái)源。制備步驟是對(duì)經(jīng)過(guò)免疫后的母雞以間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)，效價(jià)達(dá)標(biāo)后，獲取含高效價(jià)抗體的雞蛋。將雞蛋卵黃液經(jīng)酸性水解，凍融，過(guò)濾后，硫酸銨沉淀。最后再經(jīng)過(guò)DEAE離子交換層析進(jìn)一步純化得到卵黃抗體IgY。人血清/漿高豐度蛋白是指白蛋白，IgG，轉(zhuǎn)鐵蛋白，C3補(bǔ)體，IgA，IgM，胰蛋白，珠蛋白，脂蛋白，F(xiàn)因子，C9補(bǔ)體，C4補(bǔ)體，銅藍(lán)蛋白，載脂蛋白B，載脂蛋白A-1，α-1-酸性糖蛋白，H因子，補(bǔ)體因子B，前白蛋白，C1q補(bǔ)體等濃度高于10μg/ml的高豐度蛋白。
文檔編號(hào)C07K1/22GK101724069SQ20091025443
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者崔亞麗, 胡佳, 陳超 申請(qǐng)人:陜西北美基因股份有限公司