專利名稱：基于結(jié)合egfr的工程化蛋白質(zhì)的靶向治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合的單域蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及涉及 供診斷、研究和治療應(yīng)用中使用的單域蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步涉及包含此類蛋白質(zhì)的細胞、 編碼此類蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸、及包含編碼該創(chuàng)新蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體。
背景技術(shù)：
受體酪氨酸激酶的HER家族是細胞生長、分化和存活的重要介導(dǎo)物。該受體家族 包括四個截然不同的成員，包括表皮生長因子受體(EGFR、ErbBl、或HER1)、HER2(ErbB2)、 HER3(ErbB3)和 HER4(ErbB4 或 tyro2)。人們認為HER家族與人惡性腫瘤具有因果關(guān)系。Her受體家族的異?；钚耘c乳腺 癌有關(guān)。EGFR、Her-3、和Her-4常常在卵巢顆粒細胞腫瘤中表達(Leibl, S.等，Gynecol Oncol 101:18-23(2005)。尤其是在乳腺、膀胱、肺、頭、頸和胃的癌癥以及成膠質(zhì)細胞瘤中 觀察到EGFR表達升高。EGFR受體表達升高可能與同一腫瘤細胞的EGFR配體即轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF- α ) 的產(chǎn)量升高有關(guān)，后者導(dǎo)致受體經(jīng)由自分泌刺激途徑被活化。Baselga和Mendelsohn， Pharmac. Ther. 64 127-154 (1994)。人們已經(jīng)對針對EGFR或其配體TGF-α和EGF的單克隆 抗體在此類惡性腫瘤的治療中作為治療劑進行了評估。參見例如Baselga和Mendelsohn.， 見上文；Masui 等，Cancer Research44 1002-1007 (1984)；及 Wu 等，J.Clin· Invest. 95 1897-1905(1995)。HER受體在細胞中通常以不同的組合形式存在。有人認為它們的異二聚化可增加 對各種HER配體的細胞應(yīng)答的多樣性(Earp等，Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132(1995))。EGFR受到至少6種不同配體的結(jié)合表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生 長因子α (TGF-α)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin)、肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)、β細胞 調(diào)節(jié)素(betacellulin)禾口上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin) (Groenen 等，Growth Factors 11 235-257(1994))。EGF結(jié)合與HER2形成異二聚體的EGFR，活化EGFR并導(dǎo)致HER轉(zhuǎn)磷酸化。異二聚 化和/或轉(zhuǎn)磷酸化作用活化HER2酪氨酸激酶。治療劑的潛在副作用是在確定治療方案時要考慮的一個重要問題。舉例而言， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cetuximab (Erbi tux )，一種抗EGFR抗體，與可能危及生命的輸液反應(yīng)有關(guān) (Thomas, Μ. , Clin J Oncol Nurs. 9 (3) :332_8 (2005))。吉非替尼(Gefitinib) (Iressa ) 和埃羅替尼(erlotinib) (Tarceva )(都是EGFR特異性小分子抑制劑)與間質(zhì)性肺病風險 有關(guān)(Sandler Α.，Oncology 20(5Suppl 2) 35-40(2006))。每個患者可能具有特定類型 并發(fā)癥的傾向，會影響藥物治療的選擇。通過提供更多的治療選項，醫(yī)師就可以為每個患者選擇具有最佳副作用譜的治療劑。本發(fā)明提供在治療方法中有用的新型多肽和蛋白質(zhì)治療 劑。鑒于EGFR信號傳導(dǎo)在病癥(包括癌癥和增殖性病癥)中發(fā)揮的作用，理想的是制 造能選擇性調(diào)控、抑制或阻斷EGFR的治療劑，諸如EGFR結(jié)合多肽。另外，理想的是，此類治療劑以成本經(jīng)濟的方式表達，擁有期望的生物物理特性 (例如Tm，基本上是單體，或適當折疊的)，尺寸小以便滲透組織，及具有合適的體內(nèi)半衰期。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面提供一種包含纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述 Fn3結(jié)構(gòu)域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG ;(ii)至少一個選自環(huán)BC、DE 和TO的環(huán)相對于人Fn3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列；且(iii)結(jié)合人 表皮生長因子受體(EGFR)。在一些實施方案中，所述多肽以小于10_4M、10_5M、10_6M、10_7M、 10_8M、10_9M、或10_9M的Kd結(jié)合EGFR。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的至少兩個環(huán)是改變 的。在一些實施方案中，環(huán)BC和環(huán)TO相對于人Fn3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序列具有改變的氨基 酸序列。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的至少三個環(huán)是改變的。在一些實施方案中，F(xiàn)n3 結(jié)構(gòu)域的至少兩個環(huán)結(jié)合EGFR。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的至少三個環(huán)結(jié)合EGFR。 在一些實施方案中，在選自環(huán)BC、DE、和TO的至少一個環(huán)中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10 個氨基酸被不同于野生型序列的氨基酸所替代。在一些實施方案中，在選自環(huán)BC、DE、和re 的至少一個環(huán)中刪除或添加了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個氨基酸。在一些實施方案 中，EGFR結(jié)合多肽以大于10-6Μ、10-5Μ、10-4Μ、1(Γ3Μ、或ICT2M的Kd與相關(guān)受體(諸如HER2或 HER3)結(jié)合。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR結(jié)合一種或多種EGFR配體。在 一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽是第十纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域C°Fn3)。在一些 實施方案中，1QFn3包含SEQ ID NO 207-231中的任一氨基酸序列。在一些實施方案中，1QFn3 包含氨基酸序列SEQ ID N0:215。在一些實施方案中，1QFn3包含與SEQ ID NO :207_231中 的任一至少序列75、80、85、90、95、或98%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽進一步包含一個或多個選自下述各項的藥動 學(PK)模塊聚氧化烯模塊、人血清白蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)、唾液酸、人血清白蛋白、運鐵蛋白、 IgG, IgG結(jié)合蛋白、和Fc片段。在一些實施方案中，PK模塊是聚氧化烯模塊且所述聚氧化 烯模塊是聚乙二醇(PEG)。在一些實施方案中，PEG模塊是經(jīng)Cys或Lys氨基酸共價連接于 EGFR結(jié)合多肽的。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽是Fn3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中， PEG介于約0. 5kDa和約IOOkDa之間。在一些實施方案中，PK模塊改進多 肽的一項或多項藥動學特性，例如生物利用度、 血清半衰期、體內(nèi)穩(wěn)定性、和藥物分布。在一些實施方案中，相對于單獨的EGFR結(jié)合多肽， PK模塊將EGFR結(jié)合多肽的血清半衰期延長至少20、30、40、50、70、90、100、120、150、200、 400、600、800 %或更多。在一些實施方案中，所述進一步包含PK模塊的EGFR結(jié)合多肽具有 至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14天的血清體內(nèi)半衰期。在一些實施方案中，PK模塊和Fn3結(jié)構(gòu)域是藉由至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚 合糖、或聚乙二醇模塊可操作連接的。在一些實施方案中，PK模塊和Fn3結(jié)構(gòu)域是藉由包含氨基酸序列SEQ ID NO 232-235的多肽可操作連接的。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽進一步包含第二結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中， EGFR結(jié)合多肽進一步包含抗體模塊。在一些實施方案中，抗體模塊小于50KDa。在一些實 施方案中，抗體模塊小于40KDa。在一些實施方案中，抗體模塊是單鏈Fv(ScFv) ,Fab片段、 Fab'片段、F(ab' )2、二硫化物連接的Fv(sdFv)、Fv、雙抗體、或完整抗體。在一些實施方 案中，抗體模塊是單域抗體。在一些實施方案中，抗體模塊結(jié)合人蛋白質(zhì)。在一些實施方案 中，抗體模塊結(jié)合IGF-IR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c_Kit、人pl85受體樣酪氨酸激酶、 HER2、HER3、c_Met、葉酸受體、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) A、VEGF C, VEGF D、人 CD20、人 CD18、人 CDlla、人凋亡受體-2 (Apo_2)、人 α 4β 7 整聯(lián)蛋白、 人GPIIb-IIIa整聯(lián)蛋白、干細胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽進一步包含脂籠蛋白衍生物、四連蛋白衍生物、 avimer、或錨蛋白衍生物。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽結(jié)合人蛋白質(zhì)。在一些實施方 案中，EGFR 結(jié)合多肽結(jié)合 IGF-IR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Kit、Apl85 受體樣酪氨 酸激酶、HER2、HER3、c_Met、葉酸受體、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管內(nèi)皮生長因 子(VEGF) A、VEGF C、VEGF D、人 CD20、人 CD18、人 CDlla、人凋亡受體-2 (Apo_2)、人 α 4β 7 整聯(lián)蛋白、人GPIIb-IIIa整聯(lián)蛋白、干細胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽是Fn3結(jié)構(gòu)域，且進一步包含第二 Fn3結(jié)構(gòu) 域。該第二 Fn3結(jié)構(gòu)域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)⑶、環(huán)DE、和環(huán)TO ;(ii)選自環(huán)BC、DE、和 FG中的至少一個環(huán)相對于人Fn3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列；且(iii) 結(jié)合人Fn3結(jié)構(gòu)域不結(jié)合的人蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，第二 Fn3結(jié)構(gòu)域結(jié)合IGF-IR、 FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c_Kit、人 pl85 受體樣酪氨酸激酶、HER2、HER3、c_Met、葉酸受 體、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A、VEGF C,VEGF D、人CD20、 人⑶18、人⑶11a、人凋亡受體-2(Apo-2)、人α 4 β 7整聯(lián)蛋白、人GPIIb-IIIa整聯(lián)蛋白、干 細胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些實施方案中，第二 Fn3結(jié)構(gòu)域以小于10-4Μ、1(Γ5Μ、 10_6Μ、10_7Μ、10_8Μ、10_9Μ、或10_9Μ的Kd結(jié)合人蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，選自第二 Fn3結(jié) 構(gòu)域環(huán)BC、DEJP TO的至少一個環(huán)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個氨基酸被不同于 野生型序列的氨基酸所替代。在一些實施方案中，在選自環(huán)BC、DE、和re中的至少一個環(huán) 中刪除或添加了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個氨基酸。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽是結(jié)合EGFR的kiFM結(jié)構(gòu)域，其進一步包含第 二 kiFM結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，第二 kiFM結(jié)構(gòu)域結(jié)合IGF-IR。在一些實施方案中， 第二 kiFM結(jié)構(gòu)域結(jié)合VEGFR2。在一些實施方案中，第二 kiFM結(jié)構(gòu)域結(jié)合EGFR。在一些 實施方案中，第二 1QFn3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :2_125、184-204、或236中的任一氨基酸序 列。在一些實施方案中，第二 1QFn3結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO :2_125、184-204、或236中的 任一氨基酸序列至少75、80、85、90、55、或98%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，第 二 1QFn3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO 126_183、205、或206中的任一氨基酸序列。在一些實施方 案中，第二 1QFn3結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO 126_183、205、或206中的任一氨基酸序列至少 75、80、85、90、55、或98%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，第二 1QFn3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID N0:207-231中的任一氨基酸序列。在一些實施方案中，第二 1QFn3結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO 207-231中的任一氨基酸序列至少75、80、85、90、55、或98%相同的氨基酸序列。
在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽進一步包含藉由至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、 聚合糖、或聚乙二醇模塊(PEG)可操作連接的第二結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，PEG介于約 0. 5kDa和約IOOkDa之間。在一些實施方案中，PEG是藉由Cys或Lys殘基綴合于多肽和第 二結(jié)構(gòu)域的。在一些實施方案中，至少EGFR結(jié)合多肽或第二結(jié)構(gòu)域具有不超過一個Cys或 Lys0在一些實施方案中，所述一個Cys或Lys位于氨基酸序列中的非野生型位置。在一些 實施方案中，EGFR結(jié)合多肽包含SEQ ID NO :235。在一個方面，本申請?zhí)峁┻@樣的EGFR結(jié)合多肽，其可抑制轉(zhuǎn)化生長因子 α (TGF-α)或表皮生長因子(EGF)結(jié)合EGFR，且在基于細胞的測定法中在亞IC5tl濃度不活 化人EGFR。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR結(jié)合一種或多種EGFR配體。在一個方面，本申請?zhí)峁┡c抗EGFR抗體競爭對EGFR的結(jié)合的EGFR結(jié)合多肽。在 一些實施方案中，抗 EGFR 抗體選自 panitumumab>nimotuzumab、zalutumumab、EMD72000、禾口 cetuximab。在一個方面，本申請?zhí)峁┮孕∮?0-5、10-6、10_7、10-8、或ICT9M的IC5tl抑制總EGF Mm EGFR iMMWiUMf^i^C (total EGF-stimulated phosphotyrosine activation of EGFR)的EGFR結(jié)合多肽。在一個方面，本申請?zhí)峁┮孕∮?0-5、10-6、10_7、10-8、或ICT9M的IC5tl抑制ERK磷酸 化的EGFR結(jié)合多肽。在一個方面，本申請?zhí)峁┮孕∮?0-5、10-6、10_7、10-8、或ICT9M的IC5tl抑制AKT磷酸 化的EGFR結(jié)合多肽。在一個方面，本申請?zhí)峁┰谝蕾嘐GFR活化的細胞系中在基于細胞的測定法中誘 導(dǎo)凋亡的EGFR結(jié)合多肽。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合物阻斷EGFR活性，如凋亡控制、磷
酸化或二聚化。在一個方面，本申請?zhí)峁┙?jīng)過去免疫化(deimmunized)以消除一個或多個T細胞 表位的EGFR結(jié)合多肽。在一個方面，本申請?zhí)峁┙?jīng)過去免疫化以消除一個或多個B細胞表 位的EGFR結(jié)合多肽。在一個方面，本申請?zhí)峁┩ㄟ^包括下述步驟的方法選擇的EGFR結(jié)合性Fn3結(jié)構(gòu) 域a)生成一群候選核酸分子，每個核酸分子包含與人Fn3結(jié)構(gòu)域編碼序列不同的候選纖 連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域序列，所述核酸分子各自包含可操作連接至所述候選Fn3結(jié)構(gòu) 域編碼序列的翻譯起始序列和起始密碼子且各自在3'末端可操作連接于核酸_嘌呤霉素 接頭；b)在體外翻譯所述候選Fn3結(jié)構(gòu)域編碼序列以生成一群候選核酸_Fn3融合物；c) 使所述一群候選核酸_Fn3融合物與EGFR接觸；并d)選擇這樣的核酸_Fn3融合物，其蛋 白質(zhì)部分對EGFR的結(jié)合親和力或特異性相對于所述人Fn3對EGFR的結(jié)合親和力或特異性 有所改變。在一些實施方案中，對于所選擇的核酸_Fn3融合物通過下述方式加以進一步 優(yōu)化改變一個或多個核酸殘基并再次用EGFR篩選融合物以選擇改良的結(jié)合物(improved binders) 0在一些實施方案中，候選核酸分子是RNA。在一些實施方案中，候選核酸分子是 DNA。在一些實施方案中，核酸-嘌呤霉素是DNA-嘌呤霉素。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu) 域是’113。在一個方面，本申請?zhí)峁┌珽GFR結(jié)合多肽的藥學可接受組合物。在一些實施方 案中，組合物基本上不含內(nèi)毒素。在一些實施方案中，組合物基本上沒有微生物污染，使之適合于體內(nèi)施用。組合物可配制成例如供IV、IP或皮下施用。在一些實施方案中，EGFR結(jié) 合多肽抑制EGFR結(jié)合一種或多種EGFR配體。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR 信號傳導(dǎo)。本申請的一個方面提供用于治療患有癌癥的受試者的方法，該方法是通過施用單 獨的EGFR結(jié)合多肽或EGFR結(jié)合多肽與其它細胞毒劑或治療劑的組合。癌癥可以是下述一 項或多項，例如乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、成膠質(zhì)細 胞瘤、胰腺癌、或其它與非致瘤細胞相比在生理學上EGFR水平升高、上調(diào)、突變或改變的待 確定的癌癥。本申請的一個方面提供通過施用單獨的EGFR結(jié)合多肽或與其它細胞毒劑或治療 劑組合的EGFR結(jié)合多肽來治療患有癌癥的受試者的方法。具體而言，優(yōu)選的細胞毒劑和 治療劑包括多西他塞(docetaxel)、帕利他塞(paclitaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表 柔比星(印irubicin)、環(huán)磷酉先胺(cyclophosphamide)、曲妥單抗(trastuzumab)、卡培他濱 (capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、來曲唑(Ietrozole)、 阿那曲唑(anastrozole)、氟維司群(fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、戈舍瑞 林(goserelin)、奧沙禾Ij 白(oxaliplatin)、卡 白(carboplatin)、Jl質(zhì) 白(cisplatin)、 地塞米松(dexamethasone)、安肽(antide)、貝伐單抗(bevacizumab)、5-氟尿嘧 唆(5-fluorouracil)> 亞葉酸(Ieucovorin)、左方寵咪唑(Ievamisole)、伊立替康 (irinotecan) > I^fttfiif (etoposide)、$泊(topotecan)、吉HKtki賓(gemcitabine) > 長春瑞濱(vinorelbine)、雌莫司汀(estramustine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、阿巴 瑞克(abarelix)、唑來膦酸鹽(zoledronate)、鏈佐星(streptozocin)、利妥昔單抗 (rituximab)、伊達比星(idarubicin)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、 氟達拉濱(fludarabine)、伊馬替尼(imatinib)、阿糖胞苷(cytarabine)、替伊莫單抗 (ibritumomab)、Ii;西莫單(tositumomab)、干 ；素 α -2b (interferon alpha-2b)、美夕去倉 (melphalam)、bortezomib、六甲蜜胺(altretamine)、天冬酉先胺酶(asparaginase)、吉非替 尼、埃羅替尼、抗EGF受體抗體(例如西妥昔單抗(cetuximab)或panitumumab)、伊沙匹隆 (ixab印ilone)、和埃博霉素(印othilone)或其衍生物。更優(yōu)選的是，治療劑是鉬劑(諸如 卡鉬、奧沙利鉬、順鉬)、紫杉烷(taxane)(諸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他濱、或喜樹堿 (camptothecin)0本申請的另一個方面提供包含一種或多種本文中所描述的要素及關(guān)于使用那些 要素的說明書的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包括單獨的EGFR結(jié)合多肽或EGFR結(jié) 合多肽與第二治療劑，及關(guān)于使用單獨的EGFR結(jié)合多肽或EGFR結(jié)合多肽與第二治療劑來 抑制癌細胞生長的說明書，和/或關(guān)于使用單獨的EGFR結(jié)合多肽或EGFR結(jié)合多肽與第二 治療劑來治療癌癥患者的方法的說明書。本申請的又一個方面提供包含編碼EGFR結(jié)合多肽的多核苷酸的細胞。還包括含 有編碼此類蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體。所述序列優(yōu)選經(jīng)過優(yōu)化以使在所使用的細胞類型中 的表達最大化。優(yōu)選的是在大腸桿菌中表達。也可以在例如真核微生物(包括酵母，例如 畢赤氏酵母(Pichia)或釀酒酵母(cervaisea))或藍綠藻中表達EGFR結(jié)合多肽?？梢愿?造酵母細胞以產(chǎn)生期望的糖基化。本發(fā)明的細胞可以是哺乳動物細胞。在一個方面，可以 改造哺乳動物細胞以產(chǎn)生期望的糖基化。在一個方面，細胞表達基于纖連蛋白的支架蛋白。在一個方面，編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的多核苷酸經(jīng)過密碼子優(yōu)化以便于在所選擇的 細胞中表達。附圖簡述

圖1。用于分離EGFR結(jié)合性克隆的選擇譜顯示了每一輪選擇后來自實施例1的文庫中結(jié)合于EGFR-Fc的百分比。經(jīng)過5輪 選擇后每種RNA-蛋白質(zhì)融合物文庫均結(jié)合靶物。圖2?；诩毎母偁幮耘潴w結(jié)合測定在基于細胞的競爭性配體結(jié)合測定系統(tǒng)(詳情見材料和方法部分)中測定在PBS 緩沖液或Tris緩沖液中稀釋的LA-I (抗EGFR單克隆抗體)和679F09 (EGFR結(jié)合克隆) Midscale 蛋白質(zhì)制備物。LA-I (圓圈)、679F09 MidscalePBS (正方形)和 679F09 Midscale Tris(三角形)都與Eu-EGF競爭對A431細胞上EGFR的結(jié)合。IC5tl為LA-1 (2. 254nM)、 679F09Midscale PBS(13. 018nM)和 679F09Midscale Tris(20. 002nM)。圖3。基于細胞的競爭性配體結(jié)合測定在基于細胞的競爭性配體結(jié)合測定系統(tǒng)中測定LA-I (抗EGFR單克隆抗體)、 679F09(EGFR結(jié)合克隆，Midscale制備物)和867A01(EGFR結(jié)合克隆，HTPP制備物)。 LA-I (圓圈)、679F09(正方形)和867A01 (三角形)都與Eu-EGF競爭對A431細胞上EGFR 的結(jié)合。IC5tl 為LA-1 (6. 64InM)、679F09 (14. 726nM)和 867A01 (258. 258nM)。圖4。基于細胞的競爭性配體結(jié)合測定在基于細胞的競爭性配體結(jié)合測定中測定LA-I (抗EGFR單克隆抗體)和 679F03(EGFR結(jié)合克隆，Midscale制備物)。LA-I (正方形)和679F03(三角形)與Eu-EGF 競爭對 A431 細胞上 EGFR 的結(jié)合。IC5tl 為LA_1 (6. 944nM)和 679F03 (26. 847nM)。圖5。EGFR特異性克隆的優(yōu)化如實施例4中所述用于進一步優(yōu)化EGFR結(jié)合克隆的過程的示意圖。圖6描繪本申請全文所述序列。發(fā)明詳述定義“多肽”指兩個或更多個氨基酸 的任何序列，無論長度、翻譯后修飾、或功能?！岸?肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用。多肽可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，諸 如美國專利No. 6，559，126 (通過述及收入本文)中披露的那些。還可以以多種標準化學方 式中任一方式修飾多肽(例如可以用保護基團修飾氨基酸；可以將羧基末端氨基酸變成末 端酰胺基團；可以用基團修飾氨基末端殘基以例如增強親脂性；或者，可以化學糖基化或 以其它方式修飾多肽以提高穩(wěn)定性或延長體內(nèi)半衰期)。多肽修飾可包括將另一結(jié)構(gòu)(諸 如環(huán)狀化合物或其它分子)搭接到多肽上，而且還可包括包含一個或多個構(gòu)型發(fā)生了改變 的(例如R或S ；或者L或D)的氨基酸的多肽。術(shù)語“單域多肽”(single domain polyp印tide)用來表示主題多肽的靶物結(jié)合 活性(例如EGFR結(jié)合活性)位于單一結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這不同于例如抗體和單鏈抗體，它們的抗 原結(jié)合活性一般是由重鏈可變域和輕鏈可變域二者貢獻的?？梢詫斡蚨嚯拇罱?例如作 為融合蛋白)至任何數(shù)目的其它多肽(諸如熒光多肽、靶向多肽和具有獨特治療效果的多 肽)。
術(shù)語“PK”與“藥動學”同義，涵蓋化合物包括例如下列在內(nèi)的特性受試者對它 的吸收、分布、代謝、和清除?！唉宝{(diào)控蛋白”或“ΡΚ模塊”指任何在與生物學活性分子融合 或一起施用時可影響生物學活性分子的藥動學特性的蛋白質(zhì)、肽、或模塊。PK調(diào)控蛋白或 PK模塊的例子包括PEG、人血清白蛋白(HSA)結(jié)合物(如美國公開文本No. 20050287153和 20070003549中所公開的)、人血清白蛋白、Fc或Fc片段、和糖(例如唾液酸)。
“功能性Fc區(qū)”擁有天然序列Fc區(qū)的至少一項“效應(yīng)器功能”。例示性的“效應(yīng)器 功能”包括Clq結(jié)合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結(jié)合、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細 胞毒性(ADCC)、吞噬、細胞表面受體(例如B細胞受體(BCR))的下調(diào)等。此類效應(yīng)器功能 一般要求Fc區(qū)與結(jié)合域(例如抗體可變域)組合，而且可以使用本領(lǐng)域已知的用于評估此 類抗體效應(yīng)器功能的各種測定法來加以評估?！疤烊恍蛄蠪c區(qū)”包含與在自然界中找到的Fc區(qū)的氨基酸序列同樣的氨基酸序 列?！白儺怓c區(qū)”包含由于至少一處氨基酸修飾而與天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列不 同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變異Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)相比具有至少 一處氨基酸替代，例如天然序列Fc區(qū)或區(qū)別多肽的Fc區(qū)中約1處至約10處氨基酸替代和 優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代。本文中的變異Fc區(qū)會優(yōu)選與天然序列Fc區(qū)和/或區(qū)別 多肽的Fc區(qū)具有至少約80%序列同一性和最優(yōu)選至少約90%序列同一性、更優(yōu)選至少約 95%序列同一性?！翱贵w依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”和“ADCC”指細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達Fc受 體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性細胞、和巨噬細胞) 識別靶細胞上所結(jié)合的抗體并隨后引起靶細胞的溶解。介導(dǎo)ADCC的主要細胞(NK細胞) 只表達Fc ￥肌11，而單核細胞表達？(^1 1、FcyRII和FcyRIII。為了評估感興趣分子 的ADCC活性，可實施體外ADCC測定，諸如美國專利No. 5，500，362或5，821，337中所記載 的。對于此類測定法有用的效應(yīng)細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細 胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes 等 PNAS (USA) 95 =652-656(1998)中所披露的。“百分比(％ )氨基酸序列同一性”在本文中定義為比對序列并在必要時引入缺口 以實現(xiàn)最大百分比序列同一性后，且在不將任何保守替代視為序列同一性的一部分的條件 下，候選序列中與所選擇序列中的氨基酸殘基同樣的氨基酸的百分比。用于測定百分比氨 基酸序列同一性的比對可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式來實現(xiàn)，例如使用公眾可獲得 的計算機軟件諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可決定用于測量比對的適宜參數(shù)，包括在所比較序列的全長上實現(xiàn)最大比對所需要 的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比較計 算機程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計算機程序是由Genentech公司創(chuàng)作的，已經(jīng) 與用戶文檔一起提交給美國版權(quán)局(U. S. Copyright Office, Washington D. C.，20559)，登 記為美國版權(quán)注冊號TXU510087，而且公眾可通過Genentech公司(South San Francisco, Calif.)獲得。ALIGN-2程序應(yīng)當編譯成在UNIX操作系統(tǒng)、優(yōu)選數(shù)字UNIX V4. OD上使用。 所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不再變化。就本文而言，給定氨基酸序列A對(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為給定氨基酸序列A具有或包含對、與、或針對 給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下計算100乘以分數(shù)X/Y，其中X是序 列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)目，且其中Y 是B中的氨基酸殘基總數(shù)。應(yīng)當理解的是，若氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的 長度，則A對B的％氨基酸序列同一性會不等于B對A的％氨基酸序列同一性?！胺蛛x的”多肽指已經(jīng)鑒定且與/自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的多肽。所 謂其天然環(huán)境的污染成分，是指會干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、 和其它蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，多肽會被純化(1)至超過 95% (以多肽的重量計，如通過Lowry法所測定的)和最優(yōu)選超過99% (以重量計)；(2) 至足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端氨基酸序列或內(nèi)部氨基酸序列 的程度，或(3)至通過還原性或非還原性條件下SDS-PAGE并使用Coomassie 藍或優(yōu)選銀染 色顯示均質(zhì)。分離的多肽包括重組細胞內(nèi)原位的多肽，這是因為其中不會存在多肽天然環(huán) 境的至少一種成分。然而，通常會通過至少一個純化步驟來制備分離的多肽。靶物還可以是所述靶物的片段。如此，靶物還是所述靶物的能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的 片段。靶物還是所述靶物的能夠結(jié)合針對全長靶物生成的單域抗體的片段。片段，在用于本文時，指序列的小于100% (例如99%、90%、80%、70%、60%、 50%,40%,30%,20%,10%^ )，但是包含 5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25或更多個氨基酸。片段的長度足以使感興趣的相互作用維持1χ10_6Μ或更 好的親和力。片段在用于本文時還指如下所述的一個或多個任選的氨基酸的插入、刪除和替 代，所述插入、刪除和替代基本上不改變該靶物與針對全長靶物生成的單域抗體結(jié)合的能 力。氨基酸插入、刪除或替代的數(shù)目優(yōu)選多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69或70個氨基酸?！罢T導(dǎo)細胞死亡”的本發(fā)明蛋白質(zhì)可導(dǎo)致有活力的細胞變成無活力。所述細胞一 般表達該蛋白質(zhì)所結(jié)合的抗原，尤其是過表達所述抗原。優(yōu)選的是，所述細胞是癌細胞，例 如乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰或膀胱細胞。在體外，所述細 胞可以是例如 SKBR3、BT474、Calu 3、MDA-MB453、MDA-MB-361 或 SK0V3 細胞?？稍跊]有補 體和免疫效應(yīng)細胞的條件下測定體外細胞死亡，以區(qū)分由抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒 性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)誘導(dǎo)的細胞死亡。如此，可以在使用熱滅活血清 (即沒有補體)以及在沒有免疫效應(yīng)細胞的條件下實施細胞死亡測定。為了確定本發(fā)明的 蛋白質(zhì)是否能夠誘導(dǎo)細胞死亡，可以通過碘化丙啶(PI)、臺盼藍(trypan blue) (Moore等 Cytotechnology 17 :1_11 (1995))或7AAD的攝取來評估可相對于未處理細胞評估膜完整 性的喪失?！罢T導(dǎo)凋亡”的本發(fā)明蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)程序性細胞死亡，如根據(jù)凋亡相關(guān)分子或事件 (諸如膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細胞破裂、和/或膜囊(稱作凋亡 小體)形成)等所確定的。所述細胞表達所述蛋白質(zhì)所結(jié)合的抗原，并且可以過表達所述 抗原。所述細胞可以是腫瘤細胞，例如乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰或膀胱細胞。在體外，所述細胞可以是例如SKBR3、BT474、Calu 3細胞、MDA-MB453、 MDA-MB-361或SK0V3細胞。有多種方法可用于評估與凋亡有關(guān)的細胞事件。例如，可通過 膜聯(lián)蛋白結(jié)合來測量磷脂酰絲氨酸(PS)易位；可通過DNA梯化(laddering)來評估DNA斷 裂，如本文中實施例中所公開的；可以依據(jù)亞二倍體細胞的任何增加來評估伴隨著DNA斷 裂的核/染色質(zhì)濃縮。優(yōu)選的是，在使用表達本發(fā)明蛋白質(zhì)所結(jié)合的抗原的細胞進行的膜 聯(lián)蛋白結(jié)合測定中，誘導(dǎo)凋亡的蛋白質(zhì)導(dǎo) 致對膜聯(lián)蛋白的結(jié)合相對于未處理細胞發(fā)生約2 至50倍、優(yōu)選約5至50倍、最優(yōu)選約10至50倍的誘導(dǎo)。術(shù)語“治療有效量”指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情 況中，藥物的治療有效量可減少癌細胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減 緩，優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn) 移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與病癥有關(guān)的癥狀。 以藥物可阻止生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞為限，藥物可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性 的。對于癌癥治療，可通過例如評估疾病進展前時間(time to disease progression, TTP) 和/或測定響應(yīng)率(response rate, RR)來測量體內(nèi)功效。氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定義為多肽的血清濃度在體內(nèi)降低 50% (例如由于序列或化合物的的降解和/或天然機制對序列或化合物清除或隔絕)所花 費的時間。可以以本身已知的任何方式來測定半衰期，諸如通過藥動學分析。合適的技術(shù)對 于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是清楚的，而且例如一般包括下述步驟對靈長類動物適當施用合適 劑量的要處理的氨基酸序列或化合物；以規(guī)則時間間隔自所述靈長類動物收集血液樣品或 其它樣品；測定本發(fā)明的氨基酸序列或化合物在所述血液樣品中的水平或濃度；并從如此 獲得的數(shù)據(jù)(圖)計算到本發(fā)明的氨基酸序列或化合物的水平或濃度與給藥后的初始水平 相比降低50%時的時間。參考例如標準手冊，諸如Kenneth，A等，Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists及Peters等，Pharmacokinete analysis A Practical Approach (1996)。還可參考"Pharmacokinetics" ,M Gibaldi 禾口 D Perron, Marcel Dekker 出版，第二修訂版(1982).半衰期可以使用諸如tl/2-α ,tl/2-β和曲線下面積(AUC)等參數(shù)來表述。在本 說明書中，“半衰期延長”指這些參數(shù)之任一項，如這些參數(shù)之任兩項，或?qū)嵸|(zhì)上所有這三項 參數(shù)的增大。“半衰期延長”尤其指tl/2-β的增大，同時有或無tl/2-α和/或AUC或二 者的增大。本文中所使用的術(shù)語“EGFR”等同于術(shù)語HER-1。術(shù)語“EGFR配體或EGFR配體” 指一種或多種EGFR配體，諸如天然存在的結(jié)合EGFR的蛋白質(zhì)。術(shù)語“HER”在本文中用于指Her受體家族的成員，包括EGFR、Her_2、HerUP Her-4。優(yōu)選的是，本發(fā)明中所使用的Her家族成員是EGFR。EGFR結(jié)合多肽在一個方面，本申請?zhí)峁┙Y(jié)合EGFR的單域多肽。在某些方面，單域多肽可包含分 布在至少兩個β片層間的至少五至七條β或β樣鏈，例如免疫球蛋白和免疫球蛋白樣結(jié) 構(gòu)域。β樣鏈指參與單域多肽的穩(wěn)定化但是并不一定采取β鏈構(gòu)象的一串氨基酸。單域 多肽可包含約80個至約150個氨基酸，其具有包含下述各項的結(jié)構(gòu)組織分布在至少兩個 β片層間的至少七個β鏈或β樣鏈，和至少一個連接兩個β鏈或β樣鏈的環(huán)部分，該環(huán)部分參與對EGFR的結(jié)合。換言之，環(huán)部分可連接兩個β鏈、兩個β樣鏈、或一個β鏈 和一個β樣鏈。通常，一個或多個環(huán)部分會參與EGFR結(jié)合，盡管有可能一個或多個β或 β樣鏈部分也會參與EGFR結(jié)合，特別是那些位置最接近環(huán)部分的β或β樣鏈部分。在一 些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR結(jié)合一種或多種EGFR配體。在一些實施方案中， EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR信號傳導(dǎo)。在一個方面，單域多肽包含免疫球蛋白(Ig)可變域。Ig可變域可以例如選自下 組人八結(jié)構(gòu)域、人Vh結(jié)構(gòu)域和駱駝(Camelid)Vra結(jié)構(gòu)域。Ig可變域的一個、兩個、三個 或更多個環(huán)可參與對EGFR的結(jié)合，而且通常稱作⑶R1、⑶R2或⑶R3的環(huán)中任一個會參與 EGFR結(jié)合。在一個方面，單域多肽是基于纖連蛋白的支架蛋白，即基于纖連蛋白III型結(jié) 構(gòu)域(Fn3)的多肽?；诶w連蛋白的支架蛋白的一個例子是AdnectinSTM(AdneXuS，一家 Bristol-Myers Squibb研發(fā)公司)。纖連蛋白是一種在胞外 基質(zhì)形成和細胞-細胞相互作 用中發(fā)揮至關(guān)重要作用的大型蛋白質(zhì)；它由許多重復(fù)的小型結(jié)構(gòu)域組成，這些小型結(jié)構(gòu)域 分為三種類型(I型、II型、和III型)(Baron等，1991)。Fn3自身是一個大型亞家族的范式， 該亞家族包括細胞粘附分子、細胞表面激素和細胞因子受體、伴侶、和碳水化合物結(jié)合域的 一部分。綜述參見 Bork 和 Doolittle，Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Oct 1 ；89 (19) 8990-4 ；Bork 等，J Mol Biol. 1994 Sep 30 ；242 (4) 309-20 ；Campbe11 和 Spitzfaden, Structure. 1994 May 15 ；2 (5) :333_7 ；Harpez&Chothia，J Mol Biol. 1994 May13 ；238(4) 528-39)。在一些實施方案中，本申請?zhí)峁┙Y(jié)合EGFR的纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域。此類 結(jié)構(gòu)域可包含(自N端至C端的次序)β或β樣鏈Α、環(huán)ΑΒ、β或β樣鏈B、環(huán)BC、β或 β樣鏈C、環(huán)CD、β或β樣鏈D、環(huán)DE、β或β樣鏈Ε、環(huán)EF、β或β樣鏈F、環(huán)TO、和β 或β樣鏈G。環(huán)AB、BC、⑶、DE、EF和TO中的任何或全部可參與EGFR結(jié)合。在一些實施方 案中，環(huán)BC和TO參與EGFR結(jié)合。在一些實施方案中，環(huán)BC、DE和TO參與EGFR結(jié)合。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容提供這樣的Fn3結(jié)構(gòu)域，其中至少一個選自環(huán)BC、 DEjnre的環(huán)相對于人Fn3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列?！案淖儭敝敢惶?或多處相對于模板序列(對應(yīng)的人纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列改變，包括氨基酸添加、 刪除、和替代。改變氨基酸序列可通過有意的、盲目的、或自發(fā)的序列(一般是核酸編碼序 列)變異來實現(xiàn)，而且可藉由任何技術(shù)來進行，例如PCR、易錯PCR、或化學DNA合成。在一 些實施方案中，可結(jié)合EGFR的Fn3結(jié)構(gòu)域抑制EGFR結(jié)合一種或多種EGFR配體。在一些實 施方案中，可結(jié)合EGFR的Fn3抑制EGFR信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域是自人纖連蛋白衍生的Fn3結(jié)構(gòu)域，特別是纖連蛋 白的第十Fn3結(jié)構(gòu)域(1QFn3)，如SEQ ID N0:1中所示。已經(jīng)報告了多種突變型1QFn3支架。 在一個方面，Asp 7, Glu 9、和Asp 23中的一個或多個被替換成另一種氨基酸，例如不帶負 電荷的氨基酸殘基(例如AsruLys、等)。已經(jīng)報告了這些突變具有與野生型相比促進突變 型1QFn3在中性pH的更大穩(wěn)定性的效果(參見PCT公開文本No. W002/04523)。已經(jīng)公開 了 1QFn3支架中其他多種有益或中性的改變。參見例如Batori等，Protein Eng. 2002Dec ； 15(12) 1015-20 ；Koide 等，Biochemistry 2001 Aug 28 ；40 (34) :10326_33。變體型和野生型kiFM蛋白都具有相同的結(jié)構(gòu)特征，即七個β鏈結(jié)構(gòu)域序列(稱作A-G)和連接前述七個β鏈結(jié)構(gòu)域序列的六個環(huán)區(qū)(AB環(huán)、BC環(huán)、CD環(huán)、DE環(huán)、EF環(huán)、和 TO環(huán))。位置與N-和C-末端最接近的β鏈在溶液中可采取β樣構(gòu)象。在SEQ ID NO 1 中，AB環(huán)對應(yīng)于殘基15-16，BC環(huán)對應(yīng)于殘基22-30，CD環(huán)對應(yīng)于殘基39-45，DE環(huán)對應(yīng)于 殘基51-55，EF環(huán)對應(yīng)于殘基60-66，而TO環(huán)對應(yīng)于殘基76-87。
在一些實施方案中，結(jié)合EGFR的wFM多肽可以與SEQ ID NO 1中所示人uiFr^結(jié) 構(gòu)域至少60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、或90 %相同。大部分變異性一般會存在于一 個或多個環(huán)中。uiFr^多肽的每個β或β樣鏈可以基本上由與SEQ ID NO 1的對應(yīng)β或 β樣鏈的序列至少80 %、85 %、90 %、95 %或100 %相同的氨基酸序列組成，只要這樣的變 異不破壞多肽在生理學條件中的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含第十纖連蛋白III型(kiFM)結(jié)構(gòu)域的 EGFR結(jié)合多肽，其中1QFn3結(jié)構(gòu)域包含環(huán)ΑΒ、環(huán)BC、環(huán)⑶、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)TO，且選自環(huán)BC、 DE和re中的至少一個環(huán)具有相對于人kiFM結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序列改變的氨基酸序列?！案?變”指一處或多處相對于模板序列(對應(yīng)的人纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列改變，而且包 括氨基酸添加、刪除、和替代。改變氨基酸序列可通過有意的、盲目的、或自發(fā)的序列(一般 是核酸編碼序列)變異來實現(xiàn)，而且可通過任何技術(shù)來實施，例如PCR、易錯PCR、或化學DNA 合成。在一些實施方案中，一個或多個選自BC、DEdP TO的環(huán)的長度可以相對于相應(yīng)的 人纖連蛋白環(huán)延長或縮短。在一些實施方案中，環(huán)的長度可以延長2-25個氨基酸。在一些 實施方案中，環(huán)的長度可以縮短1-11個氨基酸。具體而言，kiFM的re環(huán)長12個殘基，而 抗體重鏈中的相應(yīng)環(huán)范圍為4-28個殘基。因此，為了優(yōu)化抗原結(jié)合，kiFM的TO環(huán)的長度 優(yōu)選在長度以及序列方面改變以覆蓋4-28個殘基的CDR3范圍，以獲得最大可能的抗原結(jié) 合靈活性和親和力。在一些實施方案中，可以將整聯(lián)蛋白結(jié)合基序“精氨酸_甘氨酸_天冬 氨酸”(RGD)用極性氨基酸-中性氨基酸_酸性氨基酸序列(N端至C端方向)替換。在一些實施方案中，包含1QFn3結(jié)構(gòu)域的多肽包含SEQ ID NO :207_231中的任一氨 基酸序列?？梢栽贜端或C端添加別的序列。例如，可以在N端放置額外的MG序列。M通 常會被切掉，在N端剩下GVS...序列。在一些實施方案中，可以在kiFM域的C端放置接頭 序列，例如 SEQ ID NO 233 和 235。在某些方面，本公開內(nèi)容提供介導(dǎo)EGFR結(jié)合的短肽序列。此類序列可以以分離的 形式介導(dǎo)EGFR結(jié)合，或者在插入特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(諸如免疫球蛋白或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu) 域)時介導(dǎo)EGFR結(jié)合。此類序列的例子包括與來自SEQ ID NO =207-231的BC、DEjP TO 環(huán)對應(yīng)的氨基酸殘基。在一些實施方案中，肽以小于io_6M、IO_7M、IO_8M、IO_9M、IO_9M或更小 的的Kd結(jié)合EGFR?？梢砸勒掌胶獬?shù)(例如解離，Kd)和依照動力學常數(shù)(例如結(jié)合速率常數(shù)k。n和 解離速率常數(shù)k。ff)來評估多肽對EGFR的結(jié)合。通常會選擇以小于10_6M、IO-7M, 10_8M、ΙΟ,、 IO-9M或更小的Kd結(jié)合EGFR的單域多肽，盡管在k。ff足夠低或k。n足夠高的情況中可以耐受 更高的Kd值。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽以大于 ο—Μ ο-^、IO-4MUO-3MUO-2M或更 大的Kd結(jié)合相關(guān)受體，諸如HER2或HER3。在一個方面，本申請?zhí)峁┻M一步包含藥動學(PK)模塊的EGFR結(jié)合多肽。改善的 藥動學可依照所感受到的治療需要來評估。通常希望提高生物利用度和/或延長給藥的時間間隔，這可能是通過延長服藥后蛋白質(zhì)在血清中保持可利用狀態(tài)的時間。在有些情況下 希望改善蛋白質(zhì)的血清濃度隨時間的連貫性(例如縮小施藥后不久的蛋白質(zhì)血清濃度與 下次 施藥前不久的蛋白質(zhì)血清濃度的差異)?？梢詫GFR結(jié)合多肽連接于可使多肽在哺乳 動物(例如小鼠、大鼠、或人)中的清除速率相對于未修飾多肽降低超過3倍的模塊。改善 的藥動學的其它量度可包括血清半衰期，其常常分成α階段和β階段。兩個階段之一或 二者可通過添加適宜的模塊來顯著改善。有減緩蛋白質(zhì)從血液清除的傾向的模塊(在本文中稱作“ΡΚ模塊”)包括聚氧化 烯模塊(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)、和耐受良好的蛋白質(zhì)模塊(例如Fc、Fc片段、 運鐵蛋白、或血清白蛋白)。EGFR結(jié)合多肽可以與清蛋白或清蛋白的片段(部分)或變體 融合，如美國公開文本No. 20070048282中所記載的。在一些實施方案中，PK模塊是血清白蛋白結(jié)合蛋白，諸如美國公開文本 No. 2007/0178082 和 2007/0269422 中記載的那些。在一些實施方案中，PK模塊是血清免疫球蛋白結(jié)合蛋白，諸如美國公開文本 No. 2007/0178082中記載的那些。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽包含聚乙二醇(PEG)?？梢詫⒁粋€或多個PEG 分子連接于蛋白質(zhì)上的不同位置，而且這樣的連接可通過與胺、硫醇或其它合適的反應(yīng)性 基團的反應(yīng)來實現(xiàn)。胺模塊可以是例如存在于多肽N端的伯胺或存在于氨基酸(諸如賴氨 酸或精氨酸)中的氨基。在一些實施方案中，PEG模塊連接于多肽上選自下組的位置a)N 末端；b)N末端和最N端的β鏈或β樣鏈之間；c)位于EGFR結(jié)合位點對面的多肽面上的 環(huán)；d) C末端和最C端的β鏈或β樣鏈之間；和e)C末端。PEG化可通過定點PEG化來實現(xiàn)，其中將合適的反應(yīng)性基團引入蛋白質(zhì)中以創(chuàng)建 PEG化優(yōu)先發(fā)生的位點。在一些實施方案中，修飾蛋白質(zhì)以在期望的位置引入半胱氨酸殘 基，容許半胱氨酸上的定點PEG化。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽包含含有Cys的接 頭，諸如SEQ ID NO :235，其容許定點PEG化。PEG在分子量方面可以廣泛變化，而且可以是 分支的或線性的。 在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域和PK模塊。在一些實施方案中， Fn3結(jié)構(gòu)域是wFM結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，相對于單獨的Fn3結(jié)構(gòu)域，PK模塊將EGFR 結(jié)合多肽的血清半衰期延長超過 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、 600、800、1000% 或更多。在一些實施方案中，PK模塊是經(jīng)至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖、或聚乙二 醇模塊可操作連接于Fn3結(jié)構(gòu)域的。例示性多肽接頭包括PSTSTST(SEQ ID NO :232)、 EIDKPSQ (SEQ ID NO :233)、和 GS 接頭，諸如 GSGSGSGSGS (SEQ ID NO 234)及其多聚體。在 一些實施方案中，PK模塊是人血清白蛋白。在一些實施方案中，PK模塊是運鐵蛋白。在某些方面，本公開內(nèi)容提供結(jié)合來自第一哺乳動物的EGFR和來自第二哺乳動 物的EGFR類似物的EGFR結(jié)合多肽。此類多肽在第一哺乳動物是人且第二哺乳動物是進行 臨床前測試的期望哺乳動物(如小鼠、大鼠、豚鼠、犬、或非人靈長類)的情況中特別有用。 在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽會以小于10_6M、1(TM、ΙΟ—、、ΙΟ—、、ICT9M或更小的Kd結(jié)合 預(yù)先選擇的人靶蛋白質(zhì)及其同系物。EGFR結(jié)合多肽可結(jié)合EGFR的任何部分。在一些實施方案中，多肽結(jié)合EGFR的胞外域。在一些實施方案中，多肽結(jié)合EGFR的配體結(jié)合域且破壞EGFR與一種或多種配體 (包括TGF-α和EGF)的相互作用。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽與抗EGFR抗體競爭 對EGFR的結(jié)合。抗EGFR抗體可選自任何已知的抗EGFR抗體，包括panitumumab (Amgen)、 nimotuzumab (YM Biosciences)、zalutumumab (Genmab)、EMD72000 (Merck KGaA)、 禾口 cetuximab(ImClone Systems)。在一些實施方案中，多肽結(jié)合EGFR 并破壞受體二聚化。在一些實施方案中，EGFR 結(jié)合多肽抑制EGFR信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，結(jié)合EGFR的多肽在基于細胞的測定中在亞IC5tl濃度下不活化 EGFR0在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR的下游信號傳導(dǎo)。EGFR配體結(jié)合導(dǎo) 致與EGFR的同二聚體受體二聚化或與另一種HER家族成員的異二聚體受體二聚化。二聚 化促進受體自磷酸化，這繼而導(dǎo)致數(shù)個信號傳導(dǎo)途徑的激活。一種被激活的途徑是MAPK途 徑，包括MEK的磷酸化。另一種別激活的途徑是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑，包括AKT 的磷酸化。信號傳導(dǎo)被轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核，導(dǎo)致多種轉(zhuǎn)錄因子的活化。在一些實施方案中，EGFR 結(jié)合多肽以小于10-5、10-6、10_7、10-8、或ICT9M的IC5tl抑制EGFR配體介導(dǎo)的EGFR磷酸化、ERK 磷酸化、AKT磷酸化、或任何其它EGFR信號傳導(dǎo)途徑成員。多域?qū)嵤┓桨副旧暾埖囊粋€方面提供進一步包含第二結(jié)構(gòu)域的EGFR結(jié)合多肽。第二結(jié)構(gòu)域可 結(jié)合EGFR或不同的蛋白質(zhì)，優(yōu)選人蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域結(jié)合選自下述 各項的靶物FGFR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、c_Kit、人 pl85 受體樣酪氨酸激酶、 EGFR、HER2、HER3、HER4、c_Met、葉酸受體、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管內(nèi)皮生 長因子(VEGF)-A、VEGF-C, VEGF-D、人CD20、人CD18、人CDlla、人凋亡受體-2(Apo-2)、人 α 4β 7整聯(lián)蛋白、人GPIIb-IIIa整聯(lián)蛋白、干細胞因子(SCF)、人CD3、IGF_IR、Angl、Ang2、 成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、肝細胞生長因子、或Tie2. 3。在一些實施方案中，第 二結(jié)構(gòu)域以小于10_6M、10_7M、10_8M、10_9M、或10_9M的Kd結(jié)合人靶蛋白質(zhì)。在一些實施方案 中，第二結(jié)構(gòu)域以大于IO_6m、IO-5M,IO-4M,IO-3M,IO_2M或更大的Kd結(jié)合與靶蛋白質(zhì)有關(guān)的蛋 白質(zhì)。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域抑制結(jié)合靶物(binding target)。本申請的一個方面提供進一步包含第二結(jié)構(gòu)域的EGFR結(jié)合多肽，該第二結(jié)構(gòu)域 結(jié)合腫瘤相關(guān)靶物或抗原。在一些實施方案中，抗原靶向會有助于EGFR結(jié)合多肽的定位 (就組織分布或者提高在組織或期望細胞類型中的局部濃度效應(yīng)而言)?；蛘?，第二結(jié)構(gòu)域 可提供其他抗擊癌癥的作用機制來與EGFR結(jié)合多肽一起抗擊癌癥。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤相關(guān)靶物或抗原，例如碳酸酐酶IX、A3、 對于 A33 抗體特異性的抗原、BrE3 抗原、CDl、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、 CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA 95、NCA90, HCG 及其亞基、 CEA (CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp, EGFR、EGP-U EGP-2、Ep-CAM、Ba 733、HER2/neu、低氧誘 導(dǎo)因子(HIF)、KC4抗原、KS-I抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬細胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUCl、 MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4 抗原、PSA、PSMA、RS5、S100、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰 島素生長因子-I (IGF-I)、胰島素生長因子-II (IGF-II)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、腫瘤壞死抗原、胎盤生長因子(PlGF)、17-1A抗原、血管發(fā)生標志物(例如ED-B纖連蛋白)、癌基因標志物、癌基因產(chǎn)物、和其它腫瘤相關(guān)抗原。最近關(guān)于腫瘤相關(guān)抗原的報告 包括 Mizukami 等(2005，Nature Med. 11 :992_97) ；Hatfield 等(2005，Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48) ；Vallbohmer 等(2005, J. Clin. Oncol. 23 3536-44)；及 Ren 等(2005， Ann. Surg. 242 :55_63)，通過述及將每一篇收入本文?？梢杂弥委焺┑南鄳?yīng)生物學靶向任何類型的腫瘤和任何類型的腫瘤抗原。癌癥可 以是例如下述一項或多項乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜 癌、胰腺癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細胞瘤、和橫紋肌肉瘤、或其中與非致瘤細胞相 比在生理學上EGFR水平升高、上調(diào)、突變或改變的其它待確定的癌癥?？梢宰鳛榘袠说钠渌拘缘哪[瘤類型包括急性成淋巴細胞性白血病、急性髓性 白血病、膽癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮 內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、髓質(zhì)甲狀腺癌、非何杰金氏淋巴瘤、 多發(fā)性骨髓瘤、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌、和膀胱癌。
在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域選自抗體模塊?？贵w模塊指免疫球蛋白分子和免 疫球蛋白分子的免疫學活性部分，即包含抗原結(jié)合位點(其可免疫特異性地結(jié)合抗原)的 分子。因此，抗體模塊這一術(shù)語不僅涵蓋完整抗體分子，而且還涵蓋抗體多聚體和抗體片段 以及抗體、抗體多聚體和抗體片段的變體(包括衍生物)?？贵w模塊的例子包括但不限于單 鏈Fv(scFvs)、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2、二硫化物連接的Fv(sdFv)、和Fv0抗體模 塊可以是例如單克隆的、嵌合的、人的、或人源化的。在一些實施方案中，抗體模塊選自(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CHl結(jié)構(gòu) 域；(ii)Fab'片段，其是在CHl結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片 段；(iii)Fd片段，其具有Vh和CHl結(jié)構(gòu)域；(iv)Fd'片段，其具有Vh和CHl結(jié)構(gòu)域及CHl 結(jié)構(gòu)域C-末端的一個或多個半胱氨酸殘基；(v) Fv片段，其具有抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu) 域；(vi)dAb 片段(Ward 等，Nature 341，544-546 (1989))，其由 Vh 結(jié)構(gòu)域組成；(vii)分離 的⑶R區(qū)；(viii)F(ab' )2片段，包含通過鉸鏈區(qū)的二硫橋相連的兩個Fab'片段的二價 片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈 Fv ；scFv) (Bird 等，Science 242 =423-426(1988)； 及Huston等，PNAS(USA)85 =5879-5883(1988)) ； (χ) “雙抗體”，其具有兩個抗原結(jié)合位 點，包含在同一條多肽鏈中相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(參見例如EP專 利公開文本 No. 404，097 ；WO 93/11161 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 6444-6448(1993))；和(xi) “線性抗體”，其包含一對串聯(lián)的 Fd 區(qū)段(Vh-CHI-Vh-CHI), 與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等，Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 (1995)；及美國專利 No. 5，641，870)。在一些實施方案中，抗體模塊是單域抗體。例子包括但不限于重鏈抗體、天然不含 輕鏈的抗體、自常規(guī)的四鏈抗體衍生的單域抗體、工程化抗體和非衍生自抗體的單域支架 (single domain scaffolds)。單域抗體可以衍生自任何物種，包括但不限于小鼠、人、駱 駝、美洲駝(llama)、山羊、家兔、牛。在一些實施方案中，單域抗體是天然存在的單域抗體，諸如Vhh結(jié)構(gòu)域。Vhh指自 天然不含輕鏈的免疫球蛋白衍生的重鏈可變域，諸如那些自駱駝科(Camelidae)(包括 駱駝、單峰駝、美洲駝、小羊駝(vicuna)、羊駝(alpaca)和大羊駝(guanaco))衍生的，如 W094/04678中所記載的。Vra分子比IgG分子小約10倍。由于已知Vhh結(jié)合“非常”表位，諸如腔(cavities)或溝(grooves)，因此此類Vhh的親和力可能更適合于治療性處理，PCT 公開文本號W097/49805。在一些實施方案中，單域抗體是結(jié)合血清蛋白質(zhì)的Vhh，如美國公開文本 No. 20070178082中所記載的。血清蛋白質(zhì)可以是在受試者的血清中找到的任何合適蛋白質(zhì) 或其片段。在一些實施方案中，血清蛋白質(zhì)是血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結(jié)合 蛋白、運鐵蛋白、或纖連蛋白。已經(jīng)開發(fā)了多種抗體片段生產(chǎn)技術(shù)，它們可用于制備本發(fā)明中所使用的抗體片 段。傳統(tǒng)上，這些片段經(jīng)由完整抗體的蛋白水解消化來衍生(參見例如Morimoto等， Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 107-117 (1992)；及 Brerman 等， Science，229 :81 (1985))。然而，現(xiàn)在可以由重組宿主細胞直接生成這些片段。例如，可以 自上文所討論的抗體噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘?，可以自大腸桿菌直接回收Fab' -SH 片段并化學偶聯(lián)以形成 F (ab' )2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。 依照另一種方法，可以自重組宿主細胞培養(yǎng)物直接分離F(ab' )2片段。用于抗體片段生產(chǎn) 的其它技術(shù)對于熟練從業(yè)人員會是顯而易見的。在其它實施方案中，所選擇的抗體是單鏈 Fv 片段(scFv)。參見 W 93/16185 ；美國專利 No. 5，571，894 ；及美國專利 No. 5，587，458。 抗體片段也可以是“線性抗體”，例如如例如美國專利No. 5，641，870所述。此類線性抗體片 段可以是單特異性的或雙特異性的。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含一種或多種avimer序列。avimer是通 過體外外顯子改組和噬菌體展示而自人胞外受體域開發(fā)的(Silverman等，2005，Nat. Biotechnol. 23 1493-94 ；SiIverman 等，2006，Nat. Biotechnol. 24 220)。所得多域蛋白可 包含多個獨立的、與單表位結(jié)合蛋白相比可展現(xiàn)出改善的親和力(有些情況下是亞納摩爾 級)以及特異性的結(jié)合域。關(guān)于avimer的構(gòu)建和使用方法的更多細節(jié)披露于例如美國專 利公開文本 No. 20040175756，20050048512, 20050053973, 20050089932 和 20050221384,通 過述及將其完整收入本文。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含一種或多種脂籠蛋白相關(guān)序列，例如 anticalins或脂籠蛋白衍生物。anticalins或脂籠蛋白衍生物是一類對多種靶分子(包 括本文中所描述的那些)具有親和力和特異性的結(jié)合蛋白。此類蛋白質(zhì)在美國專利公開文 本No. 20060058510, 20060088908, 20050106660，和 PCT 公開文本No. W02006/056464 中有記載。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含一種或多種四連蛋白C型凝集素相關(guān)序列 或三連蛋白，例如四連蛋白C型凝集素或四連蛋白C型凝集素衍生物。四連蛋白C型凝 集素或四連蛋白C型凝集素衍生物是一類對多種靶分子(包括本文中所描述的那些)具 有親和力和特異性的結(jié)合蛋白。不同的四連蛋白C型凝集素和相關(guān)蛋白記載于PCT公開 文本 W02006/053568，W02005/080418, W02004/094478, W02004/039841, W02004/005335, W02002/048189, W098/056906，和美國專利公開文本 No. 20050202043。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含一種或多種天然錨蛋白重復(fù) 蛋白，例如 DARPins(Molecular Partners)。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含一種或多種Affibodies 。Affibodies 衍生 自葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合域。可通過改變位于蛋白A結(jié)構(gòu)域的結(jié)合表面附近的殘基來獲得新的結(jié)合特性。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含一種或多種基于半胱氨酸結(jié)的蛋白質(zhì)支架， 即微體(Selecore/NascaCell)。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含一種或多種Trans-bodies 。Trans-bodies 基于運鐵蛋白支架(BioResis/Pfizer)。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含基于伽馬晶體蛋白或遍在蛋白質(zhì)的結(jié)合蛋 白。這些所謂的AffilinTM(Scil Proteins)分子具有這樣的特征，即在蛋白質(zhì)的β片層結(jié) 構(gòu)中從頭設(shè)計了結(jié)合區(qū)。Affilin 分子已經(jīng)在美國公開文本No. 20070248536中有描述。在一些實施方案中，第二結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域 是自人纖連蛋白，特別是纖連蛋白的第十Fn3結(jié)構(gòu)域C°Fn3)衍生的Fn3結(jié)構(gòu)域。在一些實 施方案中，EGFR結(jié)合多肽是Fn3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域中一個或多個選自BC、DE、和TO的環(huán)的長度可以相 對于相應(yīng)的人纖連蛋白環(huán)延長或縮短。在一些實施方案中，環(huán)的長度可以延長2-25個氨基 酸。在一些實施方案中，可以將整聯(lián)蛋白結(jié)合基序“精氨酸_甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)用 極性氨基酸_中性氨基酸_酸性氨基酸序列(N端至C端方向)替換。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域結(jié)合人IGF-IR、EGFR、或VEGFR2。在一些實施方案 中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域結(jié)合人IGF-IR，包含SEQ ID NO :2-125、184_204、236中的任一氨基酸序列， 且抑制IGF-IR信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域結(jié)合人EGFR，包含SEQ ID NO 207-231中的任一氨基酸序列，且抑制EGFR信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域結(jié)合 人VEGFR2，包含SEQID NO 126-183,205,206中的任一氨基酸序列，且抑制VEGFR2信號傳 導(dǎo)。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域是包含SEQ ID NO :2_231或236中的任一氨基酸序列 的1QFn3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，1QFn3結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO :2_231或236中的任 一氨基酸序列至少75、80、85、90、95、或98%相同的氨基酸序列。綴合本申請的一個方面提供包含藉由至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖、或PEG模 塊可操作連接的EGFR結(jié)合多肽和第二結(jié)構(gòu)域的多肽。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽和第二結(jié)構(gòu)域是藉由多肽可操作連接的。在一 些實施方案中，多肽接頭是SEQ ID N0:233或235。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽和第二結(jié)構(gòu)域是藉由具有血液或靶組織中的蛋 白酶可切割的蛋白酶位點的多肽接頭可操作連接的?？衫么祟悓嵤┓桨羔尫艃煞N以上的 治療性蛋白質(zhì)，以實現(xiàn)與分別生成這些蛋白質(zhì)相比更好的投遞或或更高的產(chǎn)生效率。 在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽和第二結(jié)構(gòu)域是藉由生物相容性聚合物(諸如 聚合糖)可操作連接的。這樣的聚合糖可以包含能夠被血液或靶組織中的酶切割的酶切位 點?？衫么祟悓嵤┓桨羔尫艃煞N以上的治療性蛋白質(zhì)，以實現(xiàn)與分別生成這些蛋白質(zhì)相 比更好的投遞或治療性質(zhì)或更高的產(chǎn)生效率。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽和第二結(jié)構(gòu)域是藉由聚合物接頭可操作連接 的。最佳地，聚合物接頭可用于最合適地改變各蛋白質(zhì)模塊間的距離以創(chuàng)建具有下述一項 或多項特征的蛋白質(zhì)1) 一個或多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在結(jié)合感興趣蛋白質(zhì)時的結(jié)合空間位 阻降低或提高，2)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或溶解度提高，而無需搜索別的氨基酸替代來提高穩(wěn)定性或溶解度(例如溶解度為至少約20mg/ml，或至少約50mg/ml)，3)蛋白質(zhì)聚集降低，而無需 搜索別的氨基酸替代來降低穩(wěn)定性(例如如通過SEC所測量的)，及4)通過添加別的結(jié)合 域而使蛋白質(zhì)的整體親合力或親和力提高。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽是包含接頭SEQ ID NO 235的1QFn3結(jié)構(gòu)域。 PEG被綴合于接頭序列中的半胱氨酸模塊且將EGFR結(jié)合多肽可操作地連接于第二結(jié)構(gòu)域。PEG化的實施方案本申請的一個方面提供連接EGFR結(jié)合多肽與非蛋白質(zhì)性的聚合物。在一些實施 方案中，聚合物是聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇、或聚氧化烯，如美國專利No. 4, 640, 835 ； 4，496，689 ；4, 301，144 ；4, 670，417 ；4, 791，192 或 4，179，337 中所記載的。在一些實施方案 中，EGFR結(jié)合多肽包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，聚合物是PEG模塊。另外，本申請 提供與抗體模塊(例如駱駝抗體及其衍生物，以及單鏈和單域抗體；特別是那些由微生物 表達的)和抗體樣模塊(例如脂籠蛋白、錨蛋白、多重Cys-Cys結(jié)構(gòu)域、和四連蛋白的衍生 物；特別是那些由微生物表達的)的N或C端PEG綴合。PEG是眾所周知的水溶性聚合物，其可通過商業(yè)途徑獲得或者可依照本領(lǐng)域眾所 周知的方法通過乙二醇的開環(huán)聚合來制備(Sandler和Karo，Polymer Synthesis,Academic Press, New York，卷3，頁138-161)。術(shù)語“PEG”廣泛用于涵蓋任何聚乙二醇分子，無論 大小或PEG末端的修飾，而且可以由下式來表示X-O (CH2CH2O) ^1CH2CH2OH (1)，其中η為 20-2300，X為H或末端修飾，例如CV4烴基。在一個實施方案中，本發(fā)明的PEG的一端以氫 或甲氧基終止，即X是H或CH3 (“甲氧基PEG”)。PEG可進一步包含的結(jié)合反應(yīng)所必需的化 學基團；其源自分子的化學合成；或者其是為獲得分子各部分間的最佳距離的間隔物。另 夕卜，這樣的PEG可以由一個或多個連接到一起的PEG側(cè)鏈組成。具有超過一條PEG鏈的PEG 稱作多臂的或分支的PEG。分支的PEG可通過例如添加聚環(huán)氧乙烷至各種多元醇(包括甘 油、季戊四醇、和山梨醇)來制備。例如，可以自季戊四醇和環(huán)氧乙烷制備四臂分支PEG。分 支PEG記載于例如歐洲申請公布No. 473084A和美國專利No. 5，932，462。一種形式的PEG 包括兩條經(jīng)賴氨酸的伯氨基相連接的PEG側(cè)鏈(PEG2) (Monfardini, C.等，Bioconjugate Chem. 6(1995)62-69)。PEG對肽或蛋白質(zhì)的綴合一般包括活化PEG和將活化后的PEG中間體直接偶聯(lián)至 目標蛋白質(zhì)/肽或接頭，隨后將該接頭活化并偶聯(lián)至目標蛋白質(zhì)/肽(參見Abuchowski， Α.等，J. Biol. Chem. , 252, 3571 (1977)和 J. Biol. Chem.，252，3582 (1977)，Zalipsky 等， 禾口 Harris 等，-f' ((Poly (ethylene glycol) Chemistry :Biotechnical and Biomedical Applications》；(J. M.Harris 編)Plenum Press =NewYork, 1992 ；第 21 和 22 章)。注意，包 含PEG分子的結(jié)合多肽也稱作綴合蛋白質(zhì)，而沒有附著PEG分子的蛋白質(zhì)可稱作未綴合的。所利用的PEG的大小取決于數(shù)項因素，包括EGFR結(jié)合多肽的預(yù)期用途。為了延 長在身體、血液、非血液胞外流體和組織中的半衰期，優(yōu)選較大的PEG。對于體內(nèi)細胞活性， 優(yōu)選約10-60kDa范圍的PEG，以及小于約lOOkDa、更優(yōu)選小于約60kDa的PEG，但也可使用 大于約IOOkDa的大小。對于體內(nèi)成像應(yīng)用，可使用較小的PEG，一般小于約20kDa，它們增 加半衰期沒有大PEG那么多，從而容許更快地分布和更短的半衰期。為了綴合至本發(fā)明的 結(jié)合多肽，可以選擇多種分子量形式的PEG，例如約1，000道爾頓(Da)至100，OOODa (η為 20-2300)。PEG中重復(fù)單元的數(shù)目“η”是根據(jù)以道爾頓描述的分子量而估算的。優(yōu)選的是，活化后的接頭上的PEG的分子量的總和適合于藥用。如此，在一個實施方案中，PEG分子的 分子量不超過100，OOODa。例如，如果三個PEG分子連接于接頭，其中每個PEG分子具有相同 的分子量12，OOODa (每個的η為約270)，那么接頭上的PEG的聯(lián)合分子量為約36，OOODa (總 η為約820)。連接于接頭的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在接頭上的三個分子中，兩 個PEG分子可以是每個5，OOODa(每個η為約110)另一個PEG分子可以是12，OOODa(η為 約270)。在一些實施方案中，將一個PEG模塊綴合于EGFR結(jié)合多肽。在一些實施方案中， PEG 模塊是約 30、40、50、60、70、80、或 90KDa。在一些實施方案中，PEG化EGFR結(jié)合多肽含有一個、兩個或更多個PEG模塊。在 一個實施方案中，PEG模塊結(jié)合于這樣的氨基酸殘基其位于蛋白質(zhì)表面上和/或遠離與靶 物配體接觸的表面。在一個實施方案中，PEG-結(jié)合多肽中PEG的聯(lián)合分子量或總分子量為 約3，OOODa至60，OOODa,或約10，OOODa至36，OOODa0在一個實施方案中，PEG化結(jié)合多肽 中的PEG是基本上線性的直鏈PEG。本領(lǐng)域技術(shù)人員能為PEG選擇合適的分子量，例如根據(jù)PEG化的結(jié)合多肽會如何 用于治療、期望的劑量、循環(huán)時間、對蛋白水解的抗性、免疫原性、和其它考慮。關(guān)于PEG及 其用于增強蛋白質(zhì)性能的用途的討論參見N. V. Katre，Advanced Drug Delivery Reviews 10 91-114(1993)。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽與符合下式的一個聚乙二醇基團共價連 接-C0-(CH2)x-(0CH2CH2)m-0R，其中聚乙二醇基團的-CO(即羰基)與結(jié)合多肽的一個氨基 形成酰胺鍵；R是低級烴基；χ是2或3 ;m是約450至約950 ；并且選擇η和m使得綴合物減 去結(jié)合多肽的分子量為約10_40kDa。在一個實施方案中，結(jié)合多肽的賴氨酸氨基是可 利用的(游離的)氨基。在一個具體的實施方案中，使用PEG的碳酸酯來形成PEG-結(jié)合多肽綴合物?？梢?在與PEG的反應(yīng)中使用N，N’ - 二琥珀酰亞氨基碳酸酯(DSC)來形成有活性的混合PEG-琥 珀酰亞氨基碳酸酯，其隨后可以與接頭的親核基團或結(jié)合多肽的氨基起反應(yīng)(參見美國專 利No. 5，281，698和美國專利No. 5，932，462)。在一種類似類型的反應(yīng)中，可以使1，1，_(二 苯并三唑基)碳酸酯和二-(2-吡啶基)碳酸酯與PEG起反應(yīng)以分別形成PEG-苯并三唑基 和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美國專利No. 5，382，657)。EGFR結(jié)合多肽的PEG化可依照本領(lǐng)域已知方法來實施，例如通過結(jié)合多肽與親 電子活性 PEG 的反應(yīng)(供應(yīng)商Shearwater Corp. , USA, www. shearwatercorp. com)。本 發(fā)明的優(yōu)選PEG試劑是例如N-羥基琥珀酰亞氨基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、 PEG-琥珀酰亞氨基丙酸酯或分支的N-羥基琥珀酰亞胺諸如mPEG2-NHS(Monfardini，C.， 等，Biocon jugate Chem. 6(1995)62-69)。此類方法可用于對結(jié)合多肽賴氨酸的ε-氨基或 結(jié)合多肽N末端氨基的PEG化。在另一個實施方案中，PEG分子可以被偶聯(lián)于結(jié)合多肽上的硫氫基(sulfhydryl) (Sartore, L.,等，Appl. Biochem. Biotechnol. , 27,45 (1991) ；Morpurgo 等，Biocon. Chem., 7,363-368(1996) ；Goodson 等，Bio/Technology (1990) 8，343 ；美國專利 No. 5，766，897)。美 國專利No. 6，610，281和5，766，897記載了例示性的可偶聯(lián)于硫氫基的反應(yīng)性PEG種類。
在一些實施方案中，PEG化EGFR結(jié)合多肽是通過定點PEG化生成的，特別是通過 將PEG綴合至N或C末端處的半胱氨酸模塊。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽是共價結(jié)合于PEG模塊的Fn3結(jié)構(gòu)域，其中所述Fn3結(jié)構(gòu)域的至少一個環(huán)參與EGFR結(jié)合。PEG模塊可通過定點PEG化連接至Fn3多肽，諸如通過連接至Cys殘基，其中Cys殘基可以位于Fn3 多肽的N末端、或位于N末端和最靠N端的β或β樣鏈之間、或位于Fn3多肽的C末端、 或位于C末端和最靠C端的β或β樣鏈之間。Cys殘基也可以位于其它位置，特別是任何 不參與靶物結(jié)合的環(huán)。PEG模塊也可以通過其它化學來連接，包括通過綴合至胺。在某些PEG分子被綴合至結(jié)合多肽上半胱氨酸殘基的實施方案中，半胱氨酸殘基 對于結(jié)合多肽而言是天然的，而在其它實施方案中，一個或多個半胱氨酸殘基是通過工程 改造引入結(jié)合多肽的?？梢栽诮Y(jié)合多肽編碼序列中引入突變以產(chǎn)生半胱氨酸殘基。這可以 通過，例如，將一個或多個氨基酸殘基突變成半胱氨酸來實現(xiàn)。用于突變成半胱氨酸殘基的 優(yōu)選氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和其它親水性殘基。優(yōu)選的是，待突變成半胱氨酸 的殘基是表面暴露的殘基。根據(jù)蛋白質(zhì)一級序列預(yù)測殘基的表面可及性的算法在本領(lǐng)域是 眾所周知的。或者，由于結(jié)合多肽的設(shè)計和改進的基礎(chǔ)框架的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得以解析并且 由此鑒定了表面暴露的殘基，可以通過比較結(jié)合多肽的氨基酸序列來預(yù)測表面殘基(參見 Himanen 等，Nature. (2001)20-27 ；414 (6866) :933_8)。在一個實施方案中，將半胱氨酸殘 基弓I入結(jié)合多肽中的N和/或C末端或其附近，或者環(huán)區(qū)內(nèi)。半胱氨酸殘基的PEG化可以 使用例如PEG-馬來酰亞胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺、或PEG-正吡啶基二硫化物。在有些實施方案中，PEG化的結(jié)合多肽包含共價連接至N末端氨基酸的α氨基的 PEG分子。位點特異性N末端還原性氨化記載于P印insky等(2001) JPET，297，1059和美 國專利No. 5，824，784。利用其它可獲得的親核氨基用PEG-醛進行蛋白質(zhì)還原性氨化的用 途記載于美國專利 No. 4，002, 531 ；Wieder 等(1979) J. Biol. Chem. 254,12579 ；和 Chamow 等 (1994)Bioconjugate Chem. 5,133。在另一個實施方案中，PEG化的結(jié)合多肽包含一個或多個共價連接至接頭的PEG 分子，該接頭連接于結(jié)合多肽N末端處氨基酸殘基的α氨基。這樣的方法披露于美國公開 文本 No. 2002/0044921 和 PCT 公開文本 No. W094/01451。在一個實施方案中，結(jié)合多肽的C末端被PEG化。在一個具體的實施方案中， 通過引入C末端疊氮-甲硫氨酸，隨后借助Staudinger反應(yīng)來綴合甲基-PEG-三芳基 膦，將蛋白質(zhì)的C末端PEG化。這種C末端綴合方法記載于Cazal i s等，C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004 ； 15 (5) :1005_1009?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)分離和純化技術(shù)來純化PEG化結(jié)合多肽，諸如大小排 阻(例如凝膠過濾)和離子交換層析。也可以使用SDS-PAGE來分離產(chǎn)物?？梢苑蛛x的產(chǎn) 物包括單PEG化、二 PEG化、三PEG化、多PEG化和未PEG化的結(jié)合多肽，以及游離PEG?？?以通過合并洗脫峰周圍的更寬級分(broader fractions)，提高組合物中單PEG的百分比， 來控制單PEG綴合物的比例。約90%的單PEG綴合物代表了產(chǎn)量和活性的優(yōu)良平衡。如下 所述的組合物可能是理想的其中例如至少92%或至少96%的綴合物是單PEG種類。在本 發(fā)明的一個實施方案中，單PEG綴合物的百分比為約90 %至96 %。在本發(fā)明的一個實施方案中，PEG化EGFR結(jié)合多肽中的PEG在羥胺測定(例如 450mM羥胺pH6.5，室溫，8-16小時)中不會從PEG化氨基酸殘基水解，因此是穩(wěn)定的。在一 個實施方案中，組合物的超過80%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%是穩(wěn)定的單PEG-結(jié)合多肽。在另一個實施方案中，PEG化EGFR結(jié)合多肽優(yōu)選將保留與未修飾蛋白質(zhì)相關(guān)的生 物學活性的至少約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。在一個實施方 案中，生物學活性指其結(jié)合EGFR的能力，以KD、k。n或k。ff來評估。在一個具體的實施方案 中，相對于未PEG化的結(jié)合多肽，PEG化結(jié)合多肽蛋白顯示出升高的對EGFR的結(jié)合。相對于未修飾結(jié)合多肽的血清清除速率，PEG修飾多肽的清除速率可以降低約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或甚至90%。相對于未修飾蛋白質(zhì)的半衰 期，PEG修飾多肽的半衰期(t1/2)可以延長。PEG-結(jié)合多肽的半衰期可以相對于未修飾結(jié)合 多肽的半衰期延長至少 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90% ,100% ,125%, 150 %、175 %、200 %、250 %、300 %、400 % 或 500 %、或甚至 1000 %。在有些實施方案中，蛋 白質(zhì)半衰期是在體外測定的，諸如在緩沖 鹽水溶液中或在血清中。在其它實施方案中，蛋白 質(zhì)半衰期是體內(nèi)半衰期，諸如蛋白質(zhì)在動物的血清或其它體液中的半衰期。EGFR結(jié)合多肽的去免疫在一個方面，本申請?zhí)峁┤ッ庖?deimmunized)的EGFR結(jié)合多肽。在一些實施方 案中，EGFR結(jié)合多肽的序列經(jīng)過改變以消除一個或多個B或T細胞表位。在一些實施方案 中，EGFR結(jié)合多肽包含wFM結(jié)構(gòu)域。EGFR結(jié)合多肽可以去免疫以使得它對于給定物種無免疫原性或免疫原性降低。去 免疫可以藉由對多肽的結(jié)構(gòu)改變來實現(xiàn)?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何去免疫技術(shù)。 例如，WO 00/34317記載了一種合適的用于蛋白質(zhì)去免疫的技術(shù)，將其公開內(nèi)容完整收入本 文?？偟膩碚f，其中所述一般方法內(nèi)的典型方案包括下述步驟。1.測定多肽的氨基酸序列；2.通過任何方法來鑒定多肽的氨基酸序列內(nèi)的潛在T細胞表位，包括測定肽對 MHC分子的結(jié)合，測定肽HLA復(fù)合物對來自要接受治療性蛋白質(zhì)的物種的T細胞受體的結(jié) 合，使用具有要接受治療性蛋白質(zhì)的物種的HLA分子的轉(zhuǎn)基因動物測試多肽或其部分，或 測試用來自要接受治療性蛋白質(zhì)的物種的免疫系統(tǒng)細胞重建的此類轉(zhuǎn)基因動物；3.通過遺傳工程或其它生成修飾多肽的方法來改變多肽以消除一個或多個潛在 T細胞表位，并生成這樣的改變多肽供測試用。在一個實施方案中，可以分析多肽的序列以確定MHC II類結(jié)合基序的存在。例 如，可以與MHC結(jié)合基序的數(shù)據(jù)庫進行比較，例如通過搜索萬維網(wǎng)上sitewehil. wehi. edu. au的“基序”數(shù)據(jù)庫?；蛘?，可以使用計算穿線法(computational threading method)來 鑒定MHC II類結(jié)合肽，諸如由Altuvia等(J. Mol. Biol. 249 244-250(1995))設(shè)計的穿 線法，測試來自多肽的連續(xù)重疊肽對MHC II類蛋白質(zhì)的結(jié)合能。預(yù)測結(jié)合的計算機算法 (computational binding prediction algorithms)包括 iTope 、Tepitope、SYFPEITHI> EpiMatrix(EpiVax)、和MHCpred。為了幫助鑒定MHC II類結(jié)合肽，可搜索涉及被成功呈遞 的肽的有關(guān)序列特征，諸如兩親性和Rothbard基序，及組織蛋白酶B和其它加工酶的切割 位點。鑒定出潛在的(例如人)T細胞表位后，通過改變一個或多個氨基酸(視消除T細 胞表位的需要)來消除這些表位。通常，這會涉及T細胞表位自身內(nèi)的一個或多個氨基酸 的改變。這可能涉及改變這樣的氨基酸在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)上其鄰近于所述表位，或者在分子的一級結(jié)構(gòu)上不鄰近但在二級結(jié)構(gòu)中鄰近。所考慮的通常的改變是氨基酸替代，但 是在某些情況下有可能氨基酸添加或刪除是適宜的。所有改變均可通過重組DNA技術(shù)來實 現(xiàn)，這樣最終的分子可通過重組宿主表達來制備，例如借助已確立的方法，但是也可使用蛋 白質(zhì)化學或任何其它改變分子的手段。
一旦消除了鑒定出的T細胞表位，可再次分析去免疫序列以確保沒有產(chǎn)生新的T 細胞表位，并且，如果它們有新的T細胞表位，那么可刪除該表位。并非所有通過計算鑒定出的T細胞表位都需要消除。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解特定 表位的“強度”(或者更恰當?shù)恼f是潛在免疫原性)的重要性。各種計算方法為潛在表位生 成得分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，只有得分高的表位可能需要消除。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會 認識到，消除多肽的潛在表位與維持結(jié)合親和力之間有一種權(quán)衡。因此，一種策略是依次地 將替代引入多肽，然后測試抗原結(jié)合和免疫原性。在一個方面，去免疫的多肽在人受試者中的免疫原性比原始多肽要低(或者更恰 當?shù)恼f，引發(fā)更低的HAMA應(yīng)答)。用于測定免疫原性的測定法完全在熟練技術(shù)人員的知識 范圍內(nèi)?？蓪嵤┍绢I(lǐng)域公認的測定免疫應(yīng)答的方法來監(jiān)測特定受試者中的或臨床試驗中的 HAMA應(yīng)答。對施用了去免疫的多肽的受試者可在施用所述療法開始時和整個期間給予免 疫原性評估。HAMA應(yīng)答例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法通過測定來自受試者的血清 樣品中針對去免疫多肽的抗體來測量，包括表面等離振子共振技術(shù)(BIAC0RE)和/或固相 ELISA分析?；蛘?，設(shè)計用于測量T細胞活化事件的體外測定法也能指示免疫原性。其他修飾在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽是糖基化的。在一些實施方案中，多肽是Fn3結(jié) 構(gòu)域。Fn3結(jié)構(gòu)域在正常情況中不含有糖基化位點，然而，可以將此類糖基化通過工程化改 造引入蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的糖基化通常是N-連接或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊連接 于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中χ是 除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促連接于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列?？?以將這些通過工程化改造引入本發(fā)明的蛋白質(zhì)，特別是基于纖連蛋白的支架蛋白及其相應(yīng) 的多核苷酸中。如此，多肽中若存在這兩種三肽序列中任一種，則產(chǎn)生潛在的糖基化位點。 ο-連接的糖基化是指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖等糖類之一連接于羥基氨基酸，最 常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向蛋白質(zhì)中添加糖基化位點是通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述三 肽序列(用于N-連接的糖基化位點)而便利地完成的。也可通過向原始抗體的序列中添 加或替換入一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于0-連接的糖基化位點)來進行改變。在一些實施方案中，修飾EGFR結(jié)合多肽以增強抗原依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性 (ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(⑶C)。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽是進一步包 含F(xiàn)c區(qū)的Fn3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是增強ADCC或⑶C的變體。Fc區(qū)變體 可包含在一個或多個氨基酸位置處包含氨基酸修飾(例如替代)的人Fc區(qū)序列(例如人 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4Fc 區(qū))。在一個實施方案中，變異的Fc區(qū)可以比天然序列Fc區(qū)更有效地在人效應(yīng)細胞 存在下介導(dǎo)抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)，或以更好的親和力結(jié)合Fc伽馬受體(Fe y R)。此類 Fc 區(qū)變體可以在 Fc 區(qū)的第 256、290、298、312、326、330、333、334、360、378 或430位中的一個或多個處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中殘基的編號方式是如Kabat中的 EU索引的。核酸-蛋白質(zhì)融合技術(shù)在一個方面，本 申請?zhí)峁┙Y(jié)合人靶物例如EGFR、VEGFR2、IGF-IR和其它蛋白質(zhì)的 纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域。一種快速產(chǎn)生并測試具有特定結(jié)合特性的Fn3結(jié)構(gòu)域的方式是 Adnexus (—家Bristol-Myers Squibb研發(fā)公司)的核酸-蛋白質(zhì)融合物技術(shù)。本公開內(nèi)容 描述此類體外表達和標記技術(shù)的使用，該技術(shù)稱作PROfusion ，利用核酸_蛋白質(zhì)融合物 (RNA-蛋白質(zhì)融合物和DNA-蛋白質(zhì)融合物)來鑒定對于結(jié)合EGFR和其它蛋白質(zhì)(binding to EGFR and other proteins)重要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白質(zhì)融合物技 術(shù)是一種共價偶聯(lián)蛋白質(zhì)與其編碼遺傳信息的技術(shù)。關(guān)于RNA-蛋白質(zhì)融合技術(shù)和基于纖 連蛋白的支架蛋白文庫篩選方法的詳細描述參見Szostak等，美國專利No. 6, 258，558 ； 6，261，804 ；6，214，553 ；6，281，344 ；6，207，446 ；6，518，018 ；PCT 公開文本號 W000/34784 ； W001/64942 ；W002/032925 ；及 Roberts和 Szostak，Proc Natl. Acad. Sci. 94 12297-12302， 1997，通過述及收入本文。關(guān)于核酸-蛋白質(zhì)融合技術(shù)的進一步討論可見于本申請的實施 例及材料和方法部分。載體和多核苷酸實施方案編碼本文中所公開的各種蛋白質(zhì)或多肽之任一的核酸可以化學合成。可以選擇密 碼子用法以改善在細胞中的表達。此類密碼子用法會取決于所選擇的細胞類型。已經(jīng)開 發(fā)了用于大腸桿菌和其它細菌以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞專門的 密碼子用法。參見例如:Mayfield 等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 21 ；100(2) 438-42 ；Sinclair 等，Protein Expr Purif. 2002 Oct ；26(1) :96_105 ；Connell ND.，Curr Opin Biotechnol. 20010ct ； 12(5) 446-9 ；Makrides 等，Microbiol Rev. 1996 Sep ；60 (3) 512-38 ；及 Sharp 等，Yeast. 1991 Oct ；7 (7) :657_78。通用核酸操作技術(shù)記載于例如Sambrook等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual, ^ 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 片反，1989， 或 F. Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience =New York, 1987)和定期更新，通過述及收入本文。編碼多肽的DNA 與源自哺乳動物、病毒、或昆蟲基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件可操作連接。這樣的調(diào)節(jié)元件包 括轉(zhuǎn)錄啟動子、任選的操縱基因序列(用以控制轉(zhuǎn)錄)、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點 的序列、和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。還加入在宿主中復(fù)制的能力(通常由復(fù)制起點賦 予)和選擇基因(用以幫助轉(zhuǎn)化子的識別)。本文所述蛋白質(zhì)可以重組生產(chǎn)，不僅是直接的重組生產(chǎn)，還有作為與異源多肽的 融合蛋白，所述異源多肽優(yōu)選是信號序列或其它位于成熟蛋白或多肽的N末端、具有特異 性切割位點的多肽。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是受到宿主細胞識別和加工(即被信號肽 酶切割)的異源信號序列。對于不識別和加工天然信號序列的原核宿主細胞，用原核信號 序列替換信號序列，原核信號序列選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩(wěn)定腸毒素II 前導(dǎo)序列。對于酵母分泌，可以用例如下述序列替換天然信號序列酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、 α因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬(Saccharomyces)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces) α -因子前導(dǎo)序列)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母(C. albicans)葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列、 或PCT公開文本NO.W090/13646中記載的信號。在哺乳動物細胞表達中，有哺乳動物信號 序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列(例如單純皰疹gD信號)可供使用?？梢詫⑦@樣的前體區(qū)域 的DNA與編碼蛋白質(zhì)的DNA以符合讀碼框的方式相連接。
表達載體和克隆載體都包含使載體能夠在選定的一種或多種宿主細胞中復(fù)制的 核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列使載體能夠不依賴于宿主染色體DNA而復(fù)制，這 種序列包括復(fù)制起點或自主復(fù)制序列。多種細菌、酵母和病毒的此類序列是公知的。來自 質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2微米質(zhì)粒起點適合于酵母，而各 種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。通 常，哺乳動物表達載體不需要復(fù)制起點構(gòu)件(SV40起點的使用通?？赡苤皇且驗樗?期啟動子)。表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下 蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其它毒素，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素，的抗 性；(b)補足營養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的必需營養(yǎng)物，例如用 于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb等， Nature 282 :39(1979))。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株(例如ATCC No. 44076 或 PEP4-1)提供了選擇標志。Jones,Genetics 85:12(1977)。于是，酵母宿主細 胞基因組中trpl損傷的存在提供了用于通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán) 境。類似的，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)被攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒 所補足。表達載體和克隆載體通常包含被宿主生物體識別的、與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(例如 基于纖連蛋白的支架蛋白)的核酸可操作連接的啟動子。適用于原核宿主的啟動子包括 PhoA啟動子、β -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜 合啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統(tǒng)的 啟動子還將包含與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S. D.)序列。真核細胞的啟動子序列是已知的。事實上，所有真核基因在位于起始轉(zhuǎn)錄的位點 上游大約25至30個堿基處都具有富AT區(qū)。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點上游70至80個堿基 處還可找到另一種序列，即CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3' 端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加polyA尾的信號。所有這些序列合適 的插入真核表達載體。適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟 動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄 糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu) 酶和葡糖激酶。其它酵母啟動子(它們是誘導(dǎo)型啟動子，具有通過生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu) 點)有醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油 醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。適用于酵母表達的載體 和啟動子進一步記載于EP專利公開文本No. 73，657。酵母增強子也可以有利地與酵母啟動子一起使用。對于哺乳動物宿主細胞中載體的轉(zhuǎn)錄，可通過例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘 病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝 病毒和更優(yōu)選的猿猴病毒40 (SV40))基因組、異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子 或免疫球蛋白啟動子)、及熱休克啟動子獲得的啟動子來控制，條件是這樣的啟動子應(yīng)與宿 主細胞系統(tǒng)相容。方便地以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還 包含SV40病毒復(fù)制起點。方便地以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即 早期啟動子。美國專利No. 4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿 主中表達DNA的系統(tǒng)。美國專利No. 4，601，978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關(guān)于在小鼠 細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人β-干擾素cDNA還可參見 Reyes等，Nature 297:598-601(1982)?；蛘撸梢允褂脛谑先饬霾《鹃L末端重復(fù)序列作為 啟動子。常常通過在載體中插入增強子序列來增加高等真核細胞對編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的 DNA的轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)在知道許多來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和 胰島素)的增強子序列。然而，典型的是使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40 復(fù)制起點晚期一側(cè)的增強子(bpl00-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復(fù)制起 點晚期一側(cè)的增強子、和腺病毒增強子。關(guān)于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv， Nature 297:17-18(1982)?？梢詫⒃鰪娮蛹艚拥捷d體中多價抗體編碼序列的5'或3'方 向的位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5'方向的位置上。用于真核宿主細胞(例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物 體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通常 可以從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和(偶爾可從3'端)獲得。這些區(qū)域包 含這樣核苷酸區(qū)段，其被轉(zhuǎn)錄為編碼多價抗體的mRNA的非翻譯部分中的聚腺苷酸化片段。 一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)。參見WO 94/11026及其中披露的表 達載體。重組DNA還可包含任何類型的可能對蛋白質(zhì)純化有用的蛋白質(zhì)標簽序列。蛋白 質(zhì)標簽的例子包括但不限于組氨酸標簽、FLAG標簽、myc標簽、HA標簽、或GST標簽。與 細菌、真菌、酵母、和哺乳動物細胞宿主一起使用的適宜的克隆和表達載體可見于Cloning Vectors :A Laboratory Manual, (Elsevier, New York，1985)，以此通過述及收入其相關(guān)公 開內(nèi)容。使用對宿主細胞適宜的方法將表達構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細胞中，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言是顯而易見的。本領(lǐng)域已知多種用于將核酸導(dǎo)入宿主細胞中的方法，包括但不限于電 穿孔；采用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖酐、或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂轉(zhuǎn) 染；和感染(其中載體是傳染劑)。合適的宿主細胞包括 原核生物、酵母、哺乳動物細胞、或細菌細胞。合適的細菌包 括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(E. coli)或芽孢桿菌 屬(Bacilli spp)。酵母(優(yōu)選來自酵母屬物種，諸如釀酒酵母(S. cerevisiae))也可用 于生產(chǎn)多肽。也可采用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白。關(guān)于在昆蟲細胞中生產(chǎn)異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)的綜述見Luckow和Summers，Bio/Technology, 6 :47， 1988。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括內(nèi)皮細胞、C0S-7猴腎細胞、CV-U L細胞、 C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CH0)、人胚腎細胞、HeLa、293、293T、和BHK細胞系。為了制備純 化的多肽，培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)以表達重組蛋白。對于許多應(yīng)用，本文中所公開的許 多多肽的小尺寸會使得大腸桿菌表達成為優(yōu)選的表達方法。然后從培養(yǎng)液或細胞提取物純 化蛋白質(zhì)。適于表達本發(fā)明的糖基化蛋白質(zhì)的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動 物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的允許 昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)等宿主。有多種轉(zhuǎn)染用病毒株是公眾可獲得 的，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-I變體和家蠶NPV的Bm_5株，而且 此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細胞。在有些情況下會希望在脊椎動物細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)，諸如為了糖基化，而且培養(yǎng) (組織培養(yǎng))中脊椎動物細胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細胞系的例 子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎系(293或為了在懸浮 培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細胞，Graham等，J. Gen Virol. 36 :59 (1977))；幼倉鼠腎細 胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵 巢細胞 /-DHFR(CHO, Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77 4216(1980))；小鼠塞托利(Sertoli)細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 243-251 (1980))；猴腎細胞(CVl, ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠 (buffalorat)肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝細 胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51) ；TRI 細胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 44-68 (1982) ；MRC5 細胞；FS4 細胞；人肝瘤系(Hep G2)；和骨髓瘤或淋 巴瘤細胞(例如Y0、J558L、P3和NSO細胞)(參見美國專利No. 5，807，715)。還可利用棉、 玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培養(yǎng)物作為宿主。蛋白質(zhì)生產(chǎn)用本文所述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并在為了誘導(dǎo)啟動 子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的宿主細胞。商品化培養(yǎng)基諸 如 Ham 氏 FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏 改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記 載的任何培養(yǎng)基作為宿主細胞的培養(yǎng)基Ham等，Meth. Enz. 58 44(1979) ；Barnes等，Anal. Biochem. 102 255(1980)；美國專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090/03430 ；WO 87/00195 ；或美國專利No. Re. 30, 985。任何這些培養(yǎng)基可以根 據(jù)需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如 氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如 GENTAMYCIN 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和 葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補充物。培養(yǎng)條件(諸如溫度、PH等)為先前表達選用的宿主細胞所用的培養(yǎng)條件，這對于普通技 術(shù)人員而言是顯而易見的。本文中所公開的蛋白質(zhì)也可 以使用無細胞翻譯系統(tǒng)來生產(chǎn)。為了該目的，必須修 飾編碼多肽的核酸以容許體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，并容許mRNA在所利用的特定無細胞系統(tǒng)(真 核型如哺乳動物或酵母無細胞翻譯系統(tǒng)；或原核型如細菌無細胞翻譯系統(tǒng))中進行無細胞 翻譯。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以通過化學合成來生產(chǎn)(例如使用Solid Phase Peptide Synthesis，第 2 版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford, IL 中記載的方法)。對蛋 白質(zhì)的修飾也可以通過化學合成來產(chǎn)生。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過蛋白質(zhì)化學領(lǐng)域普遍知道的蛋白質(zhì)分離/純化方法來 純化。非限制性的例子包括抽提、再結(jié)晶、鹽析(例如用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超 濾、吸附層析、離子交換層析、疏水層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親 和層析、電泳、逆流分配或這些的任意組合。純化后，可以通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)(包 括但不限于過濾和透析)將多肽更換到不同的緩沖液中和/或濃縮。純化后的多肽優(yōu)選是至少85%純、更優(yōu)選至少95%純、最優(yōu)選至少98%純。無論 純度的確切數(shù)值如何，多肽對于用作藥品是足夠純的。成像、診斷和其它應(yīng)用在一個方面，本申請?zhí)峁┯每蓹z測模塊標記的EGFR結(jié)合多肽。該多肽可用于各種 診斷應(yīng)用?？蓹z測模塊可以是任何能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的模塊。例如，可檢測 模塊可以是放射性同位素，諸如H3、C14或13、P32、S35、或1131 ；熒光或化學發(fā)光化合物， 諸如異硫氰酸熒光素、羅丹明、或螢光素；或酶，諸如堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或辣根過 氧化物酶。任何本領(lǐng)域已知的將蛋白質(zhì)綴合至可檢測模塊的方法均可以采用，這樣的方法包 括 Hunter 等，Nature 144:945(1962) ；David 等，Biochemistry 13:1014(1974) ；Pain 等， J. Immunol. Meth. 40 219 (1981)；及 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30 407 (1982)所 記載的方法。體外方法包括本領(lǐng)域眾所周知的綴合化學，包括與蛋白質(zhì)相容的化學，諸如對 特定氨基酸(諸如Cys和Lys)的化學。為了將模塊(諸如PEG)連接至本發(fā)明的蛋白質(zhì)， 使用連接基團或反應(yīng)性基團。合適的連接基團是本領(lǐng)域眾所周知的，而且包括二硫化物基 團、硫醚基團、酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團和酯酶不穩(wěn)定基團。取決于應(yīng) 用，優(yōu)選的連接基團是二硫化物基團和硫醚基團。對于不含Cys半胱氨酸的多肽，可以通過 工程化在某個位置引入Cys，以便在創(chuàng)建綴合位置的同時容許蛋白質(zhì)的活性存在。連有可檢測模塊的EGFR結(jié)合多肽也可用于體內(nèi)成像?？蓪⒍嚯呐c不透射線 (radio-opaque)的藥劑或放射性同位素連接，施用給受試者(優(yōu)選進入血流)，并測定經(jīng)標 記蛋白質(zhì)在受試者中的存在和位置。這種成像技術(shù)在惡性腫瘤的分期和治療中是有用的。 可以用任何在受試者中可檢測(通過核磁共振、放射學、或本領(lǐng)域已知的其它檢測手段)的 模塊來標記蛋白質(zhì)。EGFR結(jié)合多肽也可以用作親和純化劑。在這種方法中，使用本領(lǐng)域眾所周知的方 法將多肽固定化在合適的支持物上，諸如Si^phadex樹脂或濾紙。EGFR結(jié)合多肽可用于任何已知的測定法，諸如競爭性結(jié)合測定、直接和間接夾心測定、禾口免疫沉淀測定(Zola, Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques,頁 147-158(CRC Press, Inc.，1987))。在某些方面，本公開內(nèi)容提供了用于檢測樣品中的EGFR的方法。該方法可包括使 樣品接觸本文中所描述的EGFR結(jié)合多肽，其中所述接觸在容許多肽-EGFR復(fù)合物形成的條 件下進行，并檢測所述復(fù)合物，由此檢測所述樣品中的所述EGFR。檢測可使用本領(lǐng)域已知的 任何技術(shù)來進行，如放射線照相術(shù)、免疫學測定法、熒光檢測、質(zhì)譜、或表面等離子共振。樣 品常常會是生物學樣品，諸如活檢，特別是腫瘤、疑似腫瘤的活檢。樣品可以來自人或其它 哺乳類動物。EGFR結(jié)合多肽可以用標記模塊標記，諸如放射性模塊、熒光模塊、生色模塊、化 學發(fā)光模塊、或半抗原模塊。EGFR結(jié)合多肽可以固定化在固體支持物上。治療/體內(nèi)用途 在一個方面，本申請?zhí)峁┰贓GFR相關(guān)病癥的治療中有用的EGFR結(jié)合多肽。本申 請還提供用于對受試者施用EGFR結(jié)合多肽的方法。在一些實施方案中，受試者是人。在一 些實施方案中，受試者具有EGFR相關(guān)病癥，諸如癌癥。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑 制EGFR信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR結(jié)合一種或多種EGFR配 體。在一些實施方案中，對動物施用EGFR結(jié)合多肽引起表達EGFR的腫瘤中EGFR水平 降低。在一些實施方案中，與未處理動物相比，多肽引起受體水平降低至少20、30、40、50、 60、70、80% 或更多。在一些實施方案中，施用EGFR結(jié)合多肽在體內(nèi)抑制腫瘤細胞生長。腫瘤細胞可衍 生自任何細胞類型，包括但不限于表皮、上皮、內(nèi)皮、白血病、肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、或中胚層 細胞。異種移植物腫瘤研究中使用的常用腫瘤細胞系的例子包括A549(非小細胞肺癌)細 胞、DU-145(前列腺)細胞、MCF^Gy7I)細胞、Colo 205 (結(jié)腸)細胞、3T3/]GF_IR(小鼠成 纖維細胞)細胞、NCI H441細胞、HEP G2 (肝癌)細胞、MDA MB 231 (乳腺)細胞、HT_29(結(jié) 腸)細胞、MDA-MB-435s (乳腺)細胞、U266 細胞、SH-SY5Y 細胞、Sk_Mel_2 細胞、NCI-H929、 RPM18226、和A431細胞。在一些實施方案中，相對于未處理動物中腫瘤的生長，多肽抑制腫 瘤細胞生長。在一些實施方案中，相對于未處理動物中腫瘤的生長，多肽將腫瘤細胞生長抑 制50、60、70、80%或更多。在一些實施方案中，對腫瘤細胞生長的抑制是在動物開始多肽處 理后至少7天或至少14天測量的。在一些實施方案中，與多肽一起給動物施用另一種抗腫 瘤劑。在某些方面，本公開內(nèi)容提供用于治療具有對抑制EGFR有響應(yīng)的狀況(即“EGFR 相關(guān)疾病”)的受試者的方法。此類方法可包括對所述受試者施用有效量的本文所述任何 EGFR抑制性多肽。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR信號傳導(dǎo)。在一些實施方 案中，EGFR結(jié)合多肽抑制EGFR結(jié)合一種或多種EGFR配體。術(shù)語“EGFR相關(guān)疾病”涉及依賴于EGFR活性的病理狀態(tài)。EGFR直接地或間接地 參與多種細胞活動(包括增殖、粘附和遷移，以及分化)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。與EGFR活性有 關(guān)的疾病包括腫瘤細胞增殖、病理性新血管形成(其促進實體瘤生長)、眼中的新血管形成 (糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡誘發(fā)的黃斑變性等等)和炎癥(銀屑病、類風濕性關(guān)節(jié)炎等等)。在某些方面，本公開內(nèi)容提供施用EGFR結(jié)合多肽以治療和/或預(yù)防腫瘤和/或 腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其中腫瘤特別優(yōu)選選自下組腦瘤、泌尿生殖道腫瘤、淋巴系統(tǒng)腫瘤、胃腫瘤、喉腫瘤、單核細胞白血病、肺腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤和乳腺癌，不限于 這些。在某些方面，本公開內(nèi)容提供施用EGFR結(jié)合多肽以治療選自下組癌性疾病的疾 病的方法鱗狀細胞癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、頭癌、頸癌、食管癌、 婦科癌癥、甲狀腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病。
在某些方面，本公開內(nèi)容提供施用EGFR結(jié)合多肽以治療和/或預(yù)防由血管發(fā)生引 起、介導(dǎo)和/或傳播的疾病的方法。此類涉及血管發(fā)生的類型的疾病之一是眼病，諸如視網(wǎng) 膜血管化、糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡誘發(fā)的黃斑變性等等。在某些方面，本公開內(nèi)容提供施用EGFR結(jié)合多肽以治療和/或預(yù)防選自下組的疾 病的方法視網(wǎng)膜血管化、糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡誘發(fā)的黃斑變性和/或炎性疾病。在某些方面，本公開內(nèi)容提供施用EGFR結(jié)合多肽以治療和/或預(yù)防選自下組的疾 病的方法銀屑病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、接觸性皮炎、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、炎癥、子宮內(nèi)膜異位癥、 瘢痕形成、良性前列腺增生、免疫學疾病、自身免疫性疾病和免疫缺陷性疾病。在某些方面，本公開內(nèi)容提供為了選自下組的骨病理的治療和/或預(yù)防而施用 EGFR結(jié)合多肽的方法骨肉瘤、骨關(guān)節(jié)炎和佝僂病。本申請的一個方面提供在體內(nèi)抑制EGFR酪氨酸磷酸化和/或受體水平的EGFR結(jié) 合多肽。在一個實施方案中，對動物施用EGFR結(jié)合物引起表達EGFR的腫瘤中EGFR磷酸酪 氨酸信號降低。在一些實施方案中，EGFR結(jié)合物引起磷酸酪氨酸信號降低至少20%。在一 些實施方案中，EGFR結(jié)合物引起磷酸酪氨酸信號降低至少50、60、70、80、90%或更多。可以與本發(fā)明的適宜實施方案一起使用的其他藥劑本發(fā)明的一個方面提供與細胞毒劑相連的EGFR結(jié)合多肽。此類實施方案可視情 況通過體外或體內(nèi)方法來制備。體外方法包括本領(lǐng)域眾所周知的綴合方法，包括與蛋白質(zhì) 相容的化學，諸如對特定氨基酸(諸如Cys和Lys)的化學。為了將細胞毒劑與多肽相連， 使用連接基團或反應(yīng)性基團。合適的連接基團是本領(lǐng)域眾所周知的，包括二硫化物基團、硫 醚基團、酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團和酯酶不穩(wěn)定基團。優(yōu)選的連接基 團是二硫化物基團和硫醚基團。例如，可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過在抗體和細胞毒 劑之間形成硫醚鍵來構(gòu)建綴合物。優(yōu)選的細胞毒劑是美登木素生物堿、紫杉烷和CC-1065 類似物。在一些實施方案中，將EGFR結(jié)合多肽與細菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆 毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、蛋白酶、葡萄球菌腸毒素-A、商陸(pokeweed)抗病 毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、Ranpimase (Rap)、Rap (N69Q)、酶、或熒光蛋 白相連。在一些實施方案中，將EGFR結(jié)合多肽與美登木素生物堿或美登木素生物堿類似 物相連。合適的美登木素生物堿的例子包括美登醇和美登醇類似物。合適的美登木素 生物堿披露于美國專利 No. 4，424，219 ；4，256，746 ；4，294，757 ；4，307,016 ；4，313，946 ； 4，315，929 ；4，331，598 ；4，361，650 ；4，362，663 ；4，364，866 ；4，450，254 ；4，322，348 ； 4，371，533 ；6，333，410 ；5，475，092 ；5，585，499 ；和 5，846，545。在一些實施方案中，將EGFR結(jié)合多肽與紫杉烷相連。美國專利No. 6，372，738和 6，340，701披露了適合用于本發(fā)明的紫杉烷。
在一些實施方案中，將EGFR結(jié)合多肽與CC-1065或其類似物相連。美國專利 No. 6，372，738 ；6，340, 701 ；5，846，545 和 5，585，499 披露了 CC-1065 及其類似物。用于制備此類細胞毒性綴合物的一種令人感興趣的候選物是CC-1065，其是一種從澤耳鏈霉菌(Str印tomyces zelensis)培養(yǎng)液中分離得到的強有力的抗腫瘤抗生 素。CC-1065在體外比常用的抗癌藥(諸如多柔比星、甲氨蝶呤和長春新堿)強約1000倍 (B. K. Bhuyan 等，Cancer Res.，42，3532-3537 (1982))。細胞毒性藥物(諸如甲氨蝶呤、柔紅霉素、多柔比星、長春新堿、長春堿、美法侖、 絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、和加利車霉素)也適合于制備本發(fā)明的綴合物，而且，也可以通過 中間載體分子(諸如血清白蛋白)將藥物分子與EGFR結(jié)合多肽連接。在其它治療性處理或組合物中，將EGFR結(jié)合蛋白與一種或多種其他的治療劑共 同施用或順序施用。合適的治療劑包括但不限于靶向治療劑、其它靶向生物制品、和細胞毒 性或細胞抑制性藥劑。在有些情況下，優(yōu)選在同一個或各別的、裝有液體配制劑的治療可接 受管形瓶、注射器或其它施用裝置中施用藥劑。癌癥治療劑指那些旨在殺死癌細胞或限制癌細胞生長同時對患者具有最低限度 影響的藥劑。如此，此類藥劑可利用與癌細胞的性質(zhì)(例如代謝、血管化或表面抗原呈遞) 與健康宿主細胞相比的任何差異。腫瘤形態(tài)學差異是潛在的干預(yù)位點例如，第二治療劑可 以是抗體，如可以用來阻礙實體瘤內(nèi)部血管化由此減緩其生長速率的抗VEGF。其它治療劑 包括但不限于輔助劑諸如鹽酸格拉司瓊(granisetron HCl)、雄激素抑制劑諸如醋酸亮丙 瑞林(leuprolide acetate)、抗生素諸如多柔比星、抗雌激素諸如他莫昔芬、抗代謝物諸如 干擾素α _2a、細胞毒劑諸如紫杉醇、酶抑制劑諸如ras法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、免疫調(diào)控劑 諸如阿地白介素(aldesleukin)、和氮芥衍生物諸如鹽酸美法侖、諸如此類?？梢詾榱烁纳频目拱┬ЧcEGFR結(jié)合蛋白組合的治療劑包括腫瘤學實踐中所 使用的多種藥劑(參考文獻:Cancer, Principles&Practice of Oncology, DeVita, V. Τ.， HelIman, S. , Rosenberg, S. A.,第 6 版，Lippincott-Raven, Philadelphia, 2001),諸如多西 他塞、帕利他塞、多柔比星、表柔比星、環(huán)磷酰胺、曲妥單抗、卡培他濱、他莫昔芬、托瑞米芬、 來曲唑、阿那曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉬、卡鉬、順鉬、地塞米松、安肽、 貝伐單抗、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、伊立替康、依托泊苷、托泊替康、吉西他濱、長春 瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來膦酸鹽、鏈佐星、利妥昔單抗、伊達比星、白消安、 苯丁酸氮芥、氟達拉濱、伊馬替尼、阿糖胞苷、ibritumomab、托西莫單抗、干擾素α _2b、美法 侖、bortezomib、六甲蜜胺、天冬酰胺酶、吉非替尼、埃羅替尼、抗EGF受體抗體(例如西妥昔 單抗或panitumab)、ixabepilone, epothilones或其衍生物、和細胞毒性藥物與針對細胞 表面受體的抗體的綴合物。優(yōu)選的治療劑是鉬劑(諸如卡鉬、奧沙利鉬、順鉬)、紫杉烷(諸 如帕利他塞、多西他塞)、吉西他濱、和喜樹堿?？梢栽谑┯肊GFR結(jié)合多肽之前、同時、或之后施用一種或多種其他的治療劑。熟 練技術(shù)人員會理解，對于每種治療劑，特定施用次序可能是有利的。類似的，熟練技術(shù)人員 會理解，對于每種治療劑，施用藥劑與本發(fā)明的抗體、抗體片段或綴合物之間的時間長度會變化。配制和施用通過將具有期望純度的所述蛋白質(zhì)與任選的生理學可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol, Α.編(1980))混合， 以水溶液、凍干或其它干燥配制劑的形式制備包含EGFR結(jié)合多肽的治療用配制劑。可 接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，包括緩沖劑， 諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸 如氯化十八燒基二甲基節(jié)基銨(octadecyidimethylbenzyl ammonium chloride)；氯化 己燒雙胺(hexamethonium chloride)；苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、苯索氯銨 (benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)， 諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚(catechol)；間苯二酚；環(huán)己醇；3_戊醇；和間 甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋 白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨 酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合 齊U，諸如EDTA ；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子(salt-forming counter-ions)，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑， 諸如 TTOEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制劑還可含有多于一種治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選活 性互補且彼此沒有不利影響的化合物。本文中提供了活性化合物組合的例子。這樣的分子 以對預(yù)定目的有效的量合適的組合存在?；钚猿煞诌€可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如 分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物投遞系統(tǒng) 中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)，或在粗滴乳狀液中。此類 技術(shù)披露于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol，A.編(1980)。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易地通過使用無菌濾膜過濾來實 現(xiàn)。 可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的固體疏 水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例 子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國 專利No. 3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、 可降解的乳酸_乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(_)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙 醇酸等聚合物能夠釋放分子達100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間較短。當膠 囊化抗體或免疫偶聯(lián)物在體內(nèi)長時間維持時，它們可能因為暴露于37°C的潮濕環(huán)境而變性 或聚集，導(dǎo)致生物學活性的損失和可能的免疫原性改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機制來設(shè)計合理的 穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是經(jīng)由硫醇_ 二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，那 么可通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控 制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定聚合物基 質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定化。雖然熟練技術(shù)人員會理解每種治療劑的劑量會取決于藥劑本身，但是優(yōu)選的劑量 范圍可以是約IOmg/平方米至約2000mg/平方米、更優(yōu)選約50mg/平方米至約IOOOmg/平 方米。為了治療性應(yīng)用，以藥學可接受劑量形式將EGFR結(jié)合多肽施用于受試者。它們可以靜脈內(nèi)(作為推注或持續(xù)一段時間的連續(xù)輸注)、肌肉內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口 月艮、表面、或吸入路徑施用。蛋白質(zhì)也可以通過腫瘤內(nèi)、腫瘤周圍、病變內(nèi)、或病變周圍路徑 施用，以發(fā)揮全部以及全身治療效果。合適的藥學可接受載體、稀釋劑、和賦形劑是眾所周 知的，而且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)臨床情況來決定。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑 的例子包括(I)Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水，pH約7. 4，含有約lmg/ml至25mg/ml人血清 白蛋白；⑵O. 9%鹽水(0.9% w/v NaCl)；和(3)5% (w/v)右旋糖。本發(fā)明的方法可以在 體外、在體內(nèi)、或回體實施。以治療應(yīng)用為目的，可以如上所述地進行EGFR結(jié)合多肽與一種或多種其他治療 劑的施用(無論是共同施用或者是順序施用)。根據(jù)共同施用的具體治療劑的身份，熟練技 術(shù)人員會了解適合于共同施用的藥學可接受載體、稀釋劑和賦形劑。在以水性劑型而非凍干劑型存在時，蛋白質(zhì)通常配制成約0. lmg/ml至100mg/ml 的濃度，但也容許在這些范圍以外廣泛變化。就疾病治療而言，EGFR結(jié)合多肽的適宜劑量 將取決于待治療疾病的類型(如上文所定義的)、疾病的嚴重程度和進程、施用抗體是出于 預(yù)防目的還是治療目的、先前療法的過程、患者的臨床史和對抗體的響應(yīng)、及主治醫(yī)師的判 斷等。合適地以一次性 處理或一系列處理的方式施用蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括試劑盒，其包括一種或多種本文中所描述的成分和關(guān)于那些成分的 使用說明書。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括EGFR結(jié)合多肽，及治療劑。關(guān) 于此優(yōu)選實施方案的說明書包括使用EGFR結(jié)合多肽及治療劑抑制癌細胞生長的說明書， 和/或施用EGFR結(jié)合多肽及治療劑治療患有癌癥的患者的方法的說明書。優(yōu)選的是，試劑盒中所使用的治療劑選自下組多西他塞、帕利他塞、多柔比星、表 柔比星、環(huán)磷酰胺、曲妥單抗、卡培他濱、他莫昔芬、托瑞米芬、來曲唑、阿那曲唑、氟維司群、 依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉬、卡鉬、順鉬、地塞米松、安肽、貝伐單抗、5-氟尿嘧啶、亞葉 酸、左旋咪唑、依托泊苷、拓撲替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑 來膦酸鹽、鏈佐星、利妥昔單抗、伊達比星、白消安、苯丁酸氮芥、氟達拉濱、伊馬替尼、阿糖 胞苷、ibritumomab、托西莫單抗、干擾素α-2b、美法侖、bortezomib、六甲蜜胺、天冬酰胺 酶、吉非替尼、埃羅替尼、抗EGF受體抗體(例如西妥昔單抗或panitumumab)、ixab印ilone、 和epothilone或其衍生物。更優(yōu)選的是，治療劑是鉬劑(諸如卡鉬、奧沙利鉬、順鉬)、紫杉 烷(諸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他濱、或喜樹堿。本發(fā)明試劑盒的成分處于適合于試劑盒的形式，諸如溶液或凍干粉。熟練技術(shù)人 員會了解，試劑盒的成分的濃度或量因試劑盒的每種成分的身份和預(yù)定用途而變化。試劑盒的說明書中提到的癌癥及其細胞包括乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮 頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細胞瘤、和橫紋肌肉 瘤。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定在本文所述方法中施用的細胞毒劑或治療劑的劑 量。在確定適當?shù)膭┝繒r，也可以參考藥物包裝插頁。其他專利參考文獻以下別的專利申請和專利中所記載的方法和組合物也包括在本公開內(nèi)容中美 國公開文本 No. 20050186203 ；20050084906 ；20050008642 ；20040202655 ；20040132028 ； 20030211078 ；20060083683 ；20060099205 ；20060228355 ；20040081648 ；20040081647 ；20050074865 ；20040259155 ；20050038229 ；20050255548 ；20060246059 ；和美國專利 No. 5，707，632 ；6，818，418 ；和 7，115，396 ；及 PCT 國際申請公開文本 No. W02005/085430 ； W02004/019878 ；W02004/029224 ；W02005/056764 ；W02001/064942 ；和 W02002/032925。通過提述的引證本文以提述方式將所記載的所有文件和參考文獻(包括專利文件和網(wǎng)站)個別地 引證到本文件中，如同它們完整地或部分地書面記載在本文件中一樣。
實施例現(xiàn)在參考以下實施例來描述本發(fā)明，實施例只是例示性的，并非意圖限制本發(fā)明。 雖然上文中已經(jīng)結(jié)合具體實施方案詳細地地描述了本發(fā)明，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然能夠 想到可以進行各種變化和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實施例1 :EGFR結(jié)合分子的初始鑒定以人纖連蛋白第十個3型結(jié)構(gòu)域的支架為基礎(chǔ)構(gòu)建了具有大約IO13個RNA-蛋 白質(zhì)融合物變體的文庫，所述變體在第23-29、52-55和77-86位處具有三個隨機化區(qū)(氨 基酸編號方式依照 SEQ ID NO 1) ( “NNS” 文庫)(Xu 等，Chemistry&Biology 9 =933-942, 2002)。構(gòu)建了相似的文庫，其中使用亞磷酰胺三聚物的混合物代替兼并密碼子，以產(chǎn)生缺 少色氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸的隨機化區(qū)(“-WFC”文庫)或缺少色氨酸、苯丙氨酸、半胱 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸的隨機化區(qū)(“附?。　蔽膸?。轉(zhuǎn)變成mRNA/cDNA 異雙鏈體后，將多個文庫(每個包括一萬億個或更多個mRNA/cDNA-蛋白質(zhì)融合物)在溶液 中與IOOnM EGFR-Fc—起溫育，并在蛋白G包被的磁珠上捕捉存在的復(fù)合物。通過高pH處 理洗脫cDNA，經(jīng)PCR擴增后，用于生成聚焦度更高的新mRNA/cDNA-蛋白質(zhì)融合物文庫，其中 富集了 EGFR結(jié)合物。以這種方式實施五輪擴增和選擇，并通過定量PCR來監(jiān)測靶物結(jié)合。 使用EGFR-Fc的s525變體(EGFR的氨基酸1-525與Fc的融合物)，或者在EGFR存在下使 用EGFR-Fc實施了類似實驗。在兩種情況下，RNA-蛋白質(zhì)融合物文庫均在5輪選擇后結(jié)合 靶物。實施例2 =EGFR結(jié)合克隆的鑒定對由獨立克隆編碼的蛋白質(zhì)進行單點直接結(jié)合測定，分析它們對EGFR全長胞外 域以及含有EGFR胞外域前525個氨基酸的截短型(EGFR 525)的結(jié)合情況。使用抗His抗 體以定向方式捕捉蛋白質(zhì)克隆，接著與全長EGFR或EGFR 525Fc融合蛋白一起溫育。藉由 抗人Fc HRP偶聯(lián)物利用生色讀取(即A450)來檢測結(jié)合的受體-Fe。篩選的代表性結(jié)果 (部分)呈現(xiàn)于表1，其中顯示了 24個克隆對全長和截短EGFR的相對結(jié)合強度。與對照 (SGE)相比，所有克隆均展現(xiàn)出顯著的EGFR結(jié)合。所述SGE對照是如SEQ ID NO=I中所示 的kiFM結(jié)構(gòu)域，其中用氨基酸SGE取代整聯(lián)蛋白結(jié)合域(RGD)。表 權(quán)利要求
1.一種包含纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述Fn3結(jié)構(gòu)域(i)包含環(huán)AB、 環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG ； (ii)選自環(huán)BC、DE和FG中的至少一個環(huán)相對于人Fn3 結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列；且(iii)以小于IO-4M的解離常數(shù)結(jié)合人表 皮生長因子受體(EGFR)。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述Fn3結(jié)構(gòu)域以小于10_6M的解離常數(shù)結(jié)合人EGFR。
3.權(quán)利要求1或2的多肽，其中環(huán)BC和環(huán)TO相對于人Fn3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序列具 有改變的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1-3任一項的多肽，其中所述Fn3結(jié)構(gòu)域是第十纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域 (10Fn3)。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中所述kiFM結(jié)構(gòu)域包含選自下列的多肽 ⑴包含SEQ ID NO 207-231中任一氨基酸序列的多肽；和(ii)包含與SEQ ID NO :207-231中任一氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列的多肽。
6.權(quán)利要求1-5任一項的多肽，進一步包含一個或多個選自下述的藥動學(PK)模塊 聚氧化烯模塊、人血清白蛋白結(jié)合蛋白、唾液酸、人血清白蛋白、IgG、IgG結(jié)合蛋白、運鐵蛋 白、和Fc片段。
7.權(quán)利要求6的多肽，其中所述PK模塊是聚氧化烯模塊，且所述聚氧化烯模塊是聚乙
8.權(quán)利要求6的多肽，其中所述PK模塊和所述Fn3結(jié)構(gòu)域是藉由至少一個二硫鍵、肽 鍵、多肽、聚合糖、或聚乙二醇模塊可操作連接的。
9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述PK模塊和所述Fn3結(jié)構(gòu)域是藉由包含氨基酸序列SEQ ID NO 232-235的多肽可操作連接的。
10.權(quán)利要求1-9任一項的多肽，還包含選自抗體模塊、脂籠蛋白衍生物、四連蛋白衍 生物、avimer、錨蛋白衍生物、以及第二纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域的第二結(jié)構(gòu)域，其中所 述第二結(jié)構(gòu)域與人蛋白質(zhì)結(jié)合，且其中所述第二 Fn3結(jié)構(gòu)域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán) DE、和環(huán)TO ； (ii)選自環(huán)BC、DEJP TO中的至少一個環(huán)相對于人Fn3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序 列具有隨機化的氨基酸序列；且(iii)結(jié)合不被人Fn3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的多肽，其中所述第二結(jié)構(gòu)域是第二Fn3結(jié)構(gòu)域，且其中所述第二 Fn3 結(jié)構(gòu)域以小于IiT4M的解離常數(shù)結(jié)合所述人蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求10或11的多肽，其中所述第二結(jié)構(gòu)域是第二Fn3結(jié)構(gòu)域，且其中所述第 二 Fn3結(jié)構(gòu)域是第十纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域C°Fn3)。
13.權(quán)利要求10-12中任一項的多肽，其中所述第二結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的人蛋白質(zhì)選自 IGF-IR、EGFR、或VEGFR2。
14.權(quán)利要求12的多肽，其中所述第二kiFM結(jié)構(gòu)域包含選自下述的多肽⑴包含SEQ ID NO 2-231和236中任一氨基酸序列的多肽；和(ii)包含與SEQ ID NO :2_231和236中任一氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列 的多肽。
15.權(quán)利要求10-14任一項的多肽，其中所述Fn3結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域是藉由至少 一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖、或聚乙二醇模塊可操作連接的。
16.權(quán)利要求10-15任一項的多肽，其中所述多肽抑制轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)或皮 生長因子(EGF)結(jié)合EGFR，且在基于細胞的測定中在亞IC5tl濃度不活化人EGFR。
17.權(quán)利要求10-16任一項的多肽，其中所述多肽與抗EGFR抗體競爭對EGFR的結(jié)合。
18.權(quán)利要求10-17任一項的多肽，其中所述多肽以小于ΙΟμΜ的IC5tl抑制總EGF刺 激的EGFR磷酸酪氨酸活化。
19.權(quán)利要求10-18任一項的多肽，其中所述多肽以小于ΙΟμΜ的IC5tl抑制ERK磷酸化。
20.權(quán)利要求10-19任一項的多肽，其中所述多肽以小于ΙΟμΜ的IC5tl抑制AKT磷酸化。
21.權(quán)利要求10-20任一項的多肽，其中所述多肽已經(jīng)過去免疫而消除了一個或多個T 細胞表位。
22.權(quán)利要求1-21任一項的多肽，其中所述Fn3結(jié)構(gòu)域是通過包括下述步驟的方法選 擇的a)生成一群候選RNA分子，它們各自包含與人Fn3結(jié)構(gòu)域編碼序列不同的候選第十 纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域序列，所述RNA分子各自包含可操作連接于所述候選Fn3結(jié) 構(gòu)域編碼序列的翻譯起始序列和起始密碼子且各自可操作連接于3'末端的核酸-嘌呤霉 素接頭；b)在體外翻譯所述候選Fn3結(jié)構(gòu)域編碼序列以生成一群候選RNA-Fn3融合物；c) 使所述一群候選RNA-Fn3融合物與EGFR接觸；并d)選擇這樣的RNA_Fn3融合物，其蛋白質(zhì) 部分對EGFR的結(jié)合親和力或特異性相對于所述人Fn3對EGFR的結(jié)合親和力或特異性有所 改變。
23.一種包含權(quán)利要求1-22任一項的多肽的藥學可接受組合物，其中所述組合物基本 上不含內(nèi)毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及與表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合的單域蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及供診斷、研究和治療應(yīng)用中使用的單域蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步涉及包含此類蛋白質(zhì)的細胞、編碼此類蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸、及包含編碼該新蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體。
文檔編號C07K14/78GK102007145SQ200980113198
公開日2011年4月6日 申請日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日
發(fā)明者布倫特·莫斯, 戴維·法布里齊奧, 斯圖爾特·伊曼紐爾, 雷·坎普豪森 申請人:百時美施貴寶公司