国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      真核細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):3566525閱讀:235來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:真核細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及永生化細(xì)胞,及其在實(shí)驗(yàn)研究、治療及檢測(cè)方面的用途。本發(fā)明提供了 一種采用蛋白而非核酸的永生化細(xì)胞的新方法。
      背景技術(shù)
      制備轉(zhuǎn)化細(xì)胞的傳統(tǒng)方法是利用E6/E7病毒致癌基因的DNA或RNA。此后,可將所 述基因轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞?;蛘?,將所述基因克隆進(jìn)入病毒載體,所述雜交載體通過(guò)病毒感染轉(zhuǎn) 移到靶細(xì)胞內(nèi)。多數(shù)情況下,為了使其后的工作步驟及篩選更加便捷,所述基因轉(zhuǎn)移載體上 有一個(gè)耐藥基因作為標(biāo)記。一般地,使用耐藥基因標(biāo)記后,細(xì)胞能在基因轉(zhuǎn)移后立即被篩選 出來(lái)?;蛘?,可允許正常細(xì)胞死亡,分析存活細(xì)胞,確定特性以供后用。目前迫切需要一種大量制備細(xì)胞的方法,此方法不含有或最低程度含有的癌細(xì)胞 和轉(zhuǎn)化細(xì)胞不必要的特性。而且也明確地需要一種細(xì)胞系,其能夠很容易地繁衍、維持培 養(yǎng)、并有能力分化、基因變異、穩(wěn)定代謝,以及對(duì)細(xì)胞外的試劑有一致反應(yīng)。對(duì)于諸如細(xì)胞治 療和組織工程等臨床應(yīng)用,能夠?qū)⒃醋愿鞣N器官的細(xì)胞無(wú)需基因修飾而大量增殖是非常重 要的。

      發(fā)明內(nèi)容
      為了實(shí)施本發(fā)明,本發(fā)明提供了一種永生化蛋白復(fù)合體,其包括內(nèi)化分子、轉(zhuǎn)化多 肽,及核內(nèi)體釋放分子;在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所有的分子和/或多肽可以被有效連接到 一個(gè)或多個(gè)其它多肽上。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,內(nèi)化作用是核內(nèi)體介導(dǎo)的。在另一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中,所述永生化蛋白復(fù)合體進(jìn)一步包括核內(nèi)化分子和端粒延長(zhǎng)分子。在進(jìn)一 步實(shí)施方案中,內(nèi)化功能和核內(nèi)體釋放功能由同一分子完成,因此內(nèi)化分子和核內(nèi)體釋放 分子是相同的,例如使用病毒顆粒和病毒衣殼蛋白的情況下。本發(fā)明同樣包括編碼永生化蛋白復(fù)合體的永生化多核苷酸;攜帶表達(dá)載體和永生 化蛋白復(fù)合體的多核苷酸的雜交載體;通過(guò)雜交載體被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞;表達(dá)永生化蛋白復(fù)合 體的細(xì)胞;含有永生化蛋白復(fù)合體的組合物;和細(xì)胞永生化試劑盒,其包括永生化蛋白復(fù) 合體,和/或編碼蛋白復(fù)合體的多核苷酸,和/或攜帶多核苷酸的雜交表達(dá)載體,及如何實(shí) 施永生化細(xì)胞方法的說(shuō)明書。另外,本發(fā)明的另一方面涉及一種制備永生化細(xì)胞或延長(zhǎng)原代細(xì)胞存活期的方 法,其包括將本發(fā)明所述的永生化蛋白復(fù)合體與靶細(xì)胞在一定條件下接觸,經(jīng)過(guò)一段有效 時(shí)間,蛋白復(fù)合體被內(nèi)化,轉(zhuǎn)化多肽被釋放;并允許轉(zhuǎn)化多肽延長(zhǎng)細(xì)胞的存活期,和/或克 服細(xì)胞增長(zhǎng)停滯,和/或克服細(xì)胞衰老,和/或阻止細(xì)胞分化。在一個(gè)優(yōu)選執(zhí)行方案中,此 方法進(jìn)一步包括從細(xì)胞培養(yǎng)基中移除永生化蛋白復(fù)合體,以逆轉(zhuǎn)永生化效果,獲得具有正 常表型及能夠經(jīng)歷完全分化的細(xì)胞。本發(fā)明也涉及根據(jù)以上方法處理過(guò)的細(xì)胞和組織。


      圖1表示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所進(jìn)行的E6融合蛋白復(fù)合體誘導(dǎo)表達(dá)的聚 丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。泳道M是低分子量標(biāo)記;泳道1包含樣本未采用IPTG誘 導(dǎo),37°C培養(yǎng)8小時(shí);泳道2包含樣本采用0. 5mM IPTG誘導(dǎo),37°C培養(yǎng)4小時(shí)。圖2表示根據(jù)本發(fā)明的同一實(shí)施方案所進(jìn)行的E6融合蛋白復(fù)合體的SDSD-PAGE 和蛋白免疫印跡。泳道1是考馬斯藍(lán)染色的E6融合蛋白復(fù)合體;泳道2是用抗E6抗體標(biāo) 記的所述融合蛋白復(fù)合體的蛋白免疫印跡;泳道M是低分子量標(biāo)記。圖3表示根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案所誘導(dǎo)的E7融合蛋白復(fù)合體的SDS-PAGE。 泳道M是低分子量標(biāo)記;泳道1是采用0. 5mMIPTG誘導(dǎo),37°C培養(yǎng)4小時(shí)后的上清;泳道2 是采用0. 5mM IPTG誘導(dǎo),25°C培養(yǎng)5小時(shí)后的上清;泳道3是未采用IPTG誘導(dǎo),37°C培養(yǎng) 4小時(shí)后的上清。圖4表示根據(jù)本發(fā)明的同一個(gè)實(shí)施方案從M-IDA柱洗脫后的E7融合蛋白復(fù)合 體。泳道1是洗脫部分;泳道M是蛋白標(biāo)記。圖5表示根據(jù)本發(fā)明的同一實(shí)施方案采用Ni樹脂分離E7和標(biāo)記。泳道M是分子 量標(biāo)記;泳道1是純化柱洗脫部分;泳道2是采用HPV 16E7特異性抗體標(biāo)記后的蛋白免疫 印跡。圖6表示根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,角化細(xì)胞對(duì)E6和E7融合蛋白中的HPV 16 的應(yīng)答。(a) 0. 75 μ g/mL E6 融合蛋白 +0. 25 μ g/mL E7 融合蛋白;(b) 1 μ g/mL E6 融合 蛋白 +0. 33 μ g/mL E7 融合蛋白;(c) 0. 67 至 2 μ g/mL E7 融合蛋白;(d) > 2 μ g/mL E7 融合 蛋白;(e) 2至6 μ g/mL E6融合蛋白;(f) > 6μ g/mL E6融合蛋白;(g)對(duì)照。從以下的討論中可知,本發(fā)明的其它目標(biāo),優(yōu)勢(shì)及特征對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō) 是顯而易見(jiàn)的。
      具體實(shí)施例方式本發(fā)明產(chǎn)生于發(fā)明人的一個(gè)愿望,期望改善現(xiàn)有技術(shù)中涉及原代細(xì)胞和惡性轉(zhuǎn)化 細(xì)胞系在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。在發(fā)明人本人的研究中,他們遇到了關(guān)于使用非永生化 的原代細(xì)胞的問(wèn)題,原代細(xì)胞必須要從新鮮的尸體中重新獲得并很難維持培養(yǎng)。發(fā)明人也 非常熟悉在實(shí)驗(yàn)室里采用惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的缺點(diǎn),即它們?nèi)狈Ψ只芰Γ胰菀谆蛲?變,異常代謝,而且經(jīng)常表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞外試劑不正常的應(yīng)答。在嘗試克服上述缺點(diǎn)的過(guò)程中,發(fā)明人發(fā)現(xiàn),能夠利用用于細(xì)胞永生化過(guò)程的蛋 白大量并重復(fù)繁殖具有所需要特性的細(xì)胞。本方法適用于體內(nèi)、體外及原位應(yīng)用。示例性應(yīng)用包括,但不限于,生產(chǎn)培養(yǎng)中被 延長(zhǎng)生存期的細(xì)胞,擴(kuò)展干細(xì)胞和祖細(xì)胞的培養(yǎng)和移植,擴(kuò)展皮膚或其它上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 和移植,擴(kuò)展間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和移植,擴(kuò)展軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的培養(yǎng)和移植。被本發(fā)明方法 延長(zhǎng)生存期的示例性干細(xì)胞和祖細(xì)胞包括神經(jīng)元細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝 細(xì)胞、軟骨細(xì)胞,骨細(xì)胞以及其它細(xì)胞性干細(xì)胞和祖細(xì)胞。本方法也適用于創(chuàng)傷和燒傷治 療,而且一般更多用于組織修復(fù)應(yīng)用和整容應(yīng)用。本發(fā)明同樣適用于延長(zhǎng)通常用于研究目 的正常細(xì)胞或組織的培養(yǎng)存活期,而且一方面也適用于用來(lái)分泌有治療效果和其它有商業(yè) 意義的蛋白和產(chǎn)品的正常細(xì)胞。
      基于蛋白的細(xì)胞永?;椒òl(fā)明人正在提供一個(gè)用于生產(chǎn)細(xì)胞系過(guò)程,此細(xì)胞系適用于生物研究及檢測(cè)從他 們的實(shí)驗(yàn)工作中產(chǎn)生的外源和內(nèi)源試劑。在本發(fā)明所述過(guò)程中,基因可以用重組方法被表 達(dá)成融合蛋白。以此獲得的融合蛋白以蛋白復(fù)合體的形式存在,其包括,永生化或轉(zhuǎn)化多 肽、內(nèi)化或易位的多肽以及核內(nèi)體釋放信號(hào)。蛋白復(fù)合體中可以選擇性地加入細(xì)胞表面受 體結(jié)合區(qū)域,以輔助細(xì)胞內(nèi)化所述蛋白復(fù)合體。蛋白復(fù)合體也可以被生產(chǎn)為融合蛋白。融 合蛋白可以在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生,例如,通過(guò)向永生化蛋白體中化學(xué)添加核內(nèi)體釋放信號(hào),以及有 選擇性地添加受體結(jié)合區(qū)域。一旦獲得,蛋白復(fù)合體或融合蛋白即可自發(fā)的被內(nèi)化入細(xì)胞, 所述內(nèi)化是通過(guò)受體內(nèi)吞作用選擇性的與細(xì)胞表面受體結(jié)合進(jìn)行的。所述內(nèi)化作用也可選 擇性的為核內(nèi)體介導(dǎo)的。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,蛋白復(fù)合體或融合蛋白就進(jìn)入核內(nèi)體,在核內(nèi) 體中,永生化多肽與蛋白的其余部分分離或者繼續(xù)與蛋白結(jié)合。由于核內(nèi)體釋放信號(hào)分解 了核內(nèi)體,其釋放出永生化蛋白,然后所述永生化蛋白可以在宿主細(xì)胞上自由發(fā)揮其永生 化或促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。本發(fā)明是一個(gè)對(duì)延長(zhǎng)細(xì)胞的存活期,及獲得永生化細(xì)胞系的有效過(guò)程,所述過(guò)程 是利用蛋白或蛋白復(fù)合體而不是DNA或RNA編碼永生化基因,以在培養(yǎng)中或在體內(nèi)來(lái)永生 化或延長(zhǎng)細(xì)胞的存活期。盡管提供了一個(gè)特定例,所述方法同樣適用于其它永生化多肽及 其它類型的細(xì)胞。采用所述新方法獲得的細(xì)胞系的優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明的永生化細(xì) 胞不含有永久性的基因改變,而且因此最類似最初的原代細(xì)胞。無(wú)論在培養(yǎng)中或在體內(nèi), 作為外源因子的蛋白復(fù)合體被加入到細(xì)胞中,以將細(xì)胞存活期延長(zhǎng)一段時(shí)間或者永久性延 長(zhǎng)。應(yīng)該注意的是,如若從細(xì)胞培養(yǎng)基中移除蛋白復(fù)合體時(shí),永生化效果可能會(huì)被逆轉(zhuǎn)。此 時(shí),所述細(xì)胞恢復(fù)到其正常的表型,并可以經(jīng)歷完全分化。傳統(tǒng)的細(xì)胞系是通過(guò)用不具有復(fù) 合體所提供的核內(nèi)體釋放因子的永生化/易位蛋白來(lái)進(jìn)行刺激所得到的,用本發(fā)明的方法 增殖的細(xì)胞是傳統(tǒng)的細(xì)胞系更高級(jí)的替代物。而且,當(dāng)在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的環(huán)境下 增殖細(xì)胞時(shí),所述細(xì)胞適合于人類細(xì)胞治療及移植應(yīng)用。這種能力使得本技術(shù)對(duì)于治療代 謝疾病、自身免疫疾病、先天性疾病、神經(jīng)元和肌肉的退行性疾病、血液病、慢性創(chuàng)傷,胃潰 瘍,以及其它疾病極其的重要??捎盟黾?xì)胞治療疾病的實(shí)例有糖尿病、自閉癥、紅斑狼瘡、 老年癡呆癥、亨廷頓病、血友病、白血病、淋巴瘤、燒傷,慢性創(chuàng)傷及其它疾病。本發(fā)明將描述一個(gè)或多個(gè)實(shí)例,但是本發(fā)明全面地適用于許多靶細(xì)胞,及適合的 永生化、轉(zhuǎn)化或內(nèi)化多肽或蛋白。HPV16E6和E7致癌基因作為轉(zhuǎn)化蛋白的實(shí)例,已經(jīng)在基 于蛋白的角化細(xì)胞的永生化或延長(zhǎng)角化細(xì)胞的存活期中被應(yīng)用。人類乳頭病毒的各種亞型 的E6/E7致癌基因的基因產(chǎn)物,SV 40T抗原,腺病毒Ela,和各種生長(zhǎng)促進(jìn)/永生化的基因, 例如人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT),ras, myc和其結(jié)合,也適合使用本發(fā)明的方法達(dá)到相似的 結(jié)果。在融合蛋白形成中,本發(fā)明也采用了細(xì)胞內(nèi)化多肽,例如EGF受體識(shí)別區(qū)域。其它合 適的受體識(shí)別區(qū)域應(yīng)該用于永生化或者延長(zhǎng)其它細(xì)胞的存活期。受體和細(xì)胞結(jié)合的實(shí)例 有適合于內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的VEGF受體識(shí)別區(qū)域;適合于心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的 IGF I和IGF II受體識(shí)別區(qū)域;適合于造血干細(xì)胞的c-kit受體識(shí)別區(qū)域;適合于神經(jīng)細(xì) 胞和星細(xì)胞的NFG受體識(shí)別區(qū)域,現(xiàn)有技術(shù)中還有很多其它已知的受體識(shí)別區(qū)域與細(xì)胞的 結(jié)合。本發(fā)明的融合蛋白同樣包括核內(nèi)體釋放信號(hào)區(qū)域,所述核內(nèi)體釋放信號(hào)可以是流感 病毒的血球凝集素肽,整個(gè)的病毒衣殼蛋白,或者甚至是整個(gè)病毒。
      簡(jiǎn)單地說(shuō),HPV E6蛋白是已知的可以結(jié)合抑癌基因p53,并通過(guò)遍在蛋白通路快 速降解抑癌基因P53。以此處理的細(xì)胞將由于缺少p53蛋白,存活期被延長(zhǎng),從而無(wú)限地增 長(zhǎng)。另一方面,HPV E7蛋白結(jié)合抑癌基因pRB,并使其不能夠隔離E2F生長(zhǎng)促進(jìn)因子。自由 的E2F生長(zhǎng)促進(jìn)因子促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng),及避免衰老。在E6和E7腫瘤蛋白的影響下,所述細(xì)胞 自發(fā)地獲得端粒酶活性。值得注意的是,各種HPV亞型的E6和E7腫瘤蛋白有能力分別結(jié) 合p53和pRb。然而,相比于其它,HPV 16和HPV 18的E6和E7腫瘤蛋白可以以更高的親 和力結(jié)合它們各自的抑癌基因,所以正如J Dermatol. 2002Feb;27 (2) :73-86所描述的,所 述蛋白在培養(yǎng)中有更大的能力永生化細(xì)胞或延長(zhǎng)細(xì)胞存活期。以相似的方式,SV40T抗原 和腺病毒Ela抗原分別通過(guò)介入p53和pRB通路,對(duì)永生化它們的靶細(xì)胞也是極其地有效 的?,F(xiàn)在將根據(jù)權(quán)利要求來(lái)描述本發(fā)明。第一方面,本發(fā)明提供了一種永生化蛋白復(fù) 合體,其包含內(nèi)化分子,所述內(nèi)化分子可選擇性地為蛋白或多肽的形式;轉(zhuǎn)化多肽和核內(nèi)體 釋放多肽分子,它們可以有效地彼此連接,可選擇的以融合蛋白的形式彼此連接。在另一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中,蛋白復(fù)合體進(jìn)一步包括核內(nèi)化分子和端粒延長(zhǎng)分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,內(nèi)化分子協(xié)助轉(zhuǎn)移或內(nèi)化蛋白復(fù)合體進(jìn)入靶細(xì)胞。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,內(nèi)化分子是核內(nèi)體介導(dǎo)的;在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,核內(nèi)體介導(dǎo) 的內(nèi)化分子是受體介導(dǎo)的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,內(nèi)化分子包括細(xì)胞表面受體結(jié)合分 子,細(xì)胞表面內(nèi)化分子,和/或病毒結(jié)合受體分子。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中,內(nèi)化分 子進(jìn)一步包括EGF受體識(shí)別分子或配體,IGF受體識(shí)別分子或配體,VEGF受體識(shí)別分子或配 體,F(xiàn)GF受體識(shí)別分子或配體,PDGF受體識(shí)別分子或配體,胰島素受體識(shí)別分子或配體,生 長(zhǎng)激素受體識(shí)別分子或配體,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子識(shí)別分子或配體,趨化因子受體識(shí)別分子或 配體,促紅細(xì)胞生成素受體識(shí)別分子或配體,細(xì)胞因子受體識(shí)別分子或配體,cKit多肽,HSV 病毒蛋白VP22,和/或脂質(zhì)體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,轉(zhuǎn)化多肽能夠克服細(xì)胞分化,和/或細(xì)胞周期停 滯,和/或細(xì)胞衰老。在一個(gè)優(yōu)選方案中,轉(zhuǎn)化多肽包括一個(gè)或多個(gè)致癌基因表達(dá)產(chǎn)物,和 /或一個(gè)或多個(gè)端粒延長(zhǎng)分子。在一個(gè)尤其優(yōu)化的實(shí)施方案中,所采用的致癌基因表達(dá)產(chǎn) 物可能是病毒的致癌基因表達(dá)產(chǎn)物,其包括一個(gè)或多個(gè)HPV E6,HPV E7,SV40T抗原,腺病 毒Ela和腺病毒Elb,EB(Epstein Barr)病毒,EBNA2蛋白和LMP-I蛋白,和/或細(xì)胞致癌 基因表達(dá)產(chǎn)物其包括一個(gè)或多個(gè)raS,myc和src致癌基因表達(dá)產(chǎn)物。在另一個(gè)優(yōu)化的實(shí)施 方案中,端粒延長(zhǎng)分子包括hTERT,以及其它現(xiàn)有技術(shù)中已知的端粒延長(zhǎng)分子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,核內(nèi)體釋放多肽促進(jìn)和/或推進(jìn)從核內(nèi)體釋放轉(zhuǎn) 化或永生化多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,核內(nèi)體釋放分子包括核內(nèi)體釋放信號(hào)多肽。在 一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中,核內(nèi)體釋放分子的實(shí)例包括流感病毒包膜HA20,腺病毒衣殼, 腺病毒群病毒衣殼,反轉(zhuǎn)錄病毒衣殼,和其它病毒的及合成的核內(nèi)體釋放分子。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,核內(nèi)化分子包括核受體結(jié)合分子,和/或核 受體分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,核內(nèi)化分子的實(shí)例包括類固醇,脂溶性部分,視黃酸, 維生素D,類固醇受體超家族的成員,視黃酸受體,及維生素D受體,或其結(jié)合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,端粒延長(zhǎng)分子包括hTERT。在另一個(gè)實(shí)施方案中, 端粒延長(zhǎng)分子包括hTERT端粒酶亞單位,其中hTR和hTAP-Ι的其它兩個(gè)亞單位一般在所有細(xì)胞類型中都有所表達(dá)。另一方面,對(duì)于那些沒(méi)有表達(dá)hTR和hTAP-Ι的細(xì)胞類型,這兩個(gè) 亞單位能額外地被引入細(xì)胞內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述端粒酶延長(zhǎng)分子包括端粒酶 催化亞單位,hTERT, hTR, hTR, hTP-A或人源或其它哺乳動(dòng)物同源染色體TERT。本發(fā)明的一種特定永生化蛋白復(fù)合體可以有每一多肽/分子與至少一個(gè)其它多 肽/分子融合形成融合蛋白。本發(fā)明的另一方面是編碼上述的蛋白復(fù)合體的永生化多核苷酸。而且本發(fā)明也提 供了雜交載體形式的表達(dá)載體,所述雜交載體與所述多糖核酸有效連接。發(fā)明人也提供了 采用雜交載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。另一方面,本發(fā)明提供了一種表達(dá)永生化蛋白復(fù)合體的細(xì)胞。另一方面,上述的產(chǎn)物可以以細(xì)胞永生化試劑盒的方式包裝,可選擇性地包括或 者全包括,適合預(yù)定應(yīng)用的永生化蛋白復(fù)合體或融合蛋白,和/或編碼蛋白復(fù)合體每一區(qū) 域的DNA或RNA片段,和/或編碼整個(gè)蛋白復(fù)合體的多核苷酸,和/或雜交表達(dá)載體,每一 攜帶有編碼一個(gè)多肽的核酸片段,和/或攜帶多核苷酸的雜交表達(dá)載體;以及如何使用試 劑盒永生化細(xì)胞的說(shuō)明書。另一方面,本發(fā)明也提供了一種組合物,包括本發(fā)明所述的永生化蛋白復(fù)合體或 融合蛋白,其中不同的多肽可以取代每一不同的區(qū)域。本發(fā)明的另一方面公開并聲稱本發(fā)明是永生化或生產(chǎn)永生化細(xì)胞或延長(zhǎng)原代細(xì) 胞存活期的一種方法,該方法的過(guò)程包括本發(fā)明的永生化蛋白復(fù)合體與靶細(xì)胞在一定條件 下接觸,經(jīng)過(guò)一段有效時(shí)間,蛋白復(fù)合體被內(nèi)化,轉(zhuǎn)化多肽被釋放;及允許永生化或轉(zhuǎn)化多 肽延長(zhǎng)細(xì)胞存活期,和/或克服細(xì)胞增長(zhǎng)停滯,和/或克服細(xì)胞衰老,和/或阻止細(xì)胞分化。 在一個(gè)優(yōu)選執(zhí)行方案中,該方法包括獲得兩種不同的永生化蛋白復(fù)合體,一種包括有效連 接至少一個(gè)核內(nèi)體釋放分子的HPVE6,另一種包括有效連接至少一個(gè)核內(nèi)體釋放分子的HPV E7,并且在一定條件下結(jié)合所述兩種復(fù)合體進(jìn)入靶細(xì)胞,并經(jīng)過(guò)一段有效的時(shí)間,兩種蛋白 復(fù)合體被內(nèi)化,借此,永生化或轉(zhuǎn)化多肽HPV E6和HPV E7可以被釋放進(jìn)入靶細(xì)胞,并延長(zhǎng) 細(xì)胞的存活期,和/或克服或阻止細(xì)胞停滯,和/或克服細(xì)胞衰老,和/或阻止細(xì)胞分化。在另一個(gè)執(zhí)行方案中,這個(gè)方法進(jìn)一步包括從細(xì)胞培養(yǎng)基中移除永生化蛋白復(fù)合 體來(lái)逆轉(zhuǎn)永生化的效果,從而獲得具有正常表型的,并能夠經(jīng)歷完全分化的細(xì)胞。用于永生化作用的靶細(xì)胞可以是很多不同類型,本發(fā)明的方法對(duì)于延長(zhǎng)各種細(xì)胞 的存活期的是效的,而且這個(gè)方法可以用來(lái)治療作為靶細(xì)胞的任何所有原代細(xì)胞。在一個(gè) 執(zhí)行方案中,細(xì)胞的類型包括胰島細(xì)胞,肝細(xì)胞,角化細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞,骨骼肌 細(xì)胞和心肌細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞,星細(xì)胞,和臍帶血造血干細(xì)胞。當(dāng)然,很多其它的細(xì)胞也適合于 用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。在另一個(gè)優(yōu)選執(zhí)行方案中,永生化蛋白復(fù)合體是以脂質(zhì)體或任 何一個(gè)其它很多已知的封裝實(shí)體的形式被提供。在本發(fā)明所公開的方法的一個(gè)執(zhí)行方案中,永生化蛋白復(fù)合體的任何一個(gè)元素或 任何組合的融合蛋白或多肽片段可以通過(guò)培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞,然后使雜交載體和靶細(xì)胞相接觸 而獲得,所述飼養(yǎng)細(xì)胞攜帶有表達(dá)永生化蛋白復(fù)合體或永生化或轉(zhuǎn)化多肽中任何一種的雜 交載體。在一個(gè)替代的執(zhí)行方案中,永生化蛋白復(fù)合體進(jìn)一步被改造為具有分泌信號(hào),以至 于它們可被從飼養(yǎng)細(xì)胞中分泌到培養(yǎng)基中,并且允許蛋白復(fù)合體通過(guò)各種蛋白內(nèi)化方式進(jìn) 入到靶細(xì)胞。正如現(xiàn)有技術(shù)所知,飼養(yǎng)細(xì)胞可以與靶細(xì)胞分開進(jìn)行培養(yǎng),由此飼養(yǎng)細(xì)胞可以從培養(yǎng)基中移除。所采用的飼養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)例包括3T3,或基質(zhì)細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)那闆r下,飼養(yǎng) 細(xì)胞本身可以與靶細(xì)胞置放在同一培養(yǎng)基中,例如所述兩種類型的細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí),從培 養(yǎng)基中移除飼養(yǎng)細(xì)胞可能是必須的。另一方面,當(dāng)靶細(xì)胞要被逆轉(zhuǎn)成正常表型的時(shí)候,永生 化蛋白復(fù)合體也可以被要求與靶細(xì)胞分離,并從培養(yǎng)基中移除。因此,在一個(gè)執(zhí)行方案中,飼養(yǎng)細(xì)胞可以與靶細(xì)胞共同培養(yǎng)。在另一個(gè)執(zhí)行方案 中,飼養(yǎng)細(xì)胞與靶細(xì)胞分開進(jìn)行培養(yǎng),由此飼養(yǎng)細(xì)胞可以從培養(yǎng)基中移除。在本方法的一個(gè) 優(yōu)選執(zhí)行方案中,永生化蛋白進(jìn)入靶細(xì)胞的內(nèi)化作用可能需要輔助以電穿孔,顯微注射,轉(zhuǎn) 染,和/或納米顆粒轟擊,和/或其它現(xiàn)有已知技術(shù)。具體地,在納米顆粒轟擊中,納米顆粒 采用永生化蛋白復(fù)合體的必要成分預(yù)先涂覆或與其連接。然后納米顆粒通過(guò)機(jī)械力轟擊進(jìn) 入細(xì)胞,例如使用BioRad生產(chǎn)的Helio槍。用上述的方法獲得的細(xì)胞適合于很多用途,無(wú)論用于實(shí)驗(yàn)研究,作為臨床檢測(cè)的 替代手段,擴(kuò)大新獲得的原代細(xì)胞,還是細(xì)胞和組織治療都是適用的。通過(guò)細(xì)胞本身或儀器 或移植物,這些細(xì)胞可保持細(xì)胞分離及無(wú)菌。本發(fā)明的一個(gè)方面是通過(guò)獲得所需要的器官 或特定功能的靶細(xì)胞,來(lái)再生器官或特定功能細(xì)胞的方法;通過(guò)本發(fā)明的方法,永生化器官 或特定功能細(xì)胞;增長(zhǎng)和擴(kuò)張以此永生化的細(xì)胞;及通過(guò)從培養(yǎng)基中移除永生化蛋白復(fù)合 體或融合蛋白,來(lái)逆轉(zhuǎn)永生化已擴(kuò)增細(xì)胞。在一個(gè)執(zhí)行方案中,器官或特定功能細(xì)胞可以是多能干細(xì)胞。在另一個(gè)執(zhí)行方案 中,器官或特定功能細(xì)胞可以包括骨髓間葉基質(zhì)細(xì)胞,心肌細(xì)胞,胰島細(xì)胞,肝細(xì)胞,腦細(xì) 胞,肌細(xì)胞,皮膚細(xì)胞,腎細(xì)胞,骨細(xì)胞,干細(xì)胞,造血干細(xì)胞,胰臟細(xì)胞,甲狀腺細(xì)胞,聽(tīng)覺(jué)相 關(guān)細(xì)胞,視覺(jué)相關(guān)細(xì)胞,嗅覺(jué)細(xì)胞和其它細(xì)胞。在另一個(gè)執(zhí)行方案中,靶細(xì)胞可以包括分裂 細(xì)胞或靜止細(xì)胞,末期分化始于器官細(xì)胞,或者靶細(xì)胞在被永生化時(shí)可以被轉(zhuǎn)化。器官或特 定功能細(xì)胞可以包括自體細(xì)胞和異基因細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面也提供了通過(guò)本發(fā)明的方法所得到的細(xì)胞,無(wú)論所述方法是 終止在細(xì)胞永生化的最后一步,還是在永生化細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)增,或者是在所擴(kuò)增細(xì)胞的 逆轉(zhuǎn)永生化一步。一方面,本發(fā)明也提供了一種為器官再生移植細(xì)胞的方法,其包括在有利于其繼 續(xù)生長(zhǎng)的條件下,將通過(guò)本發(fā)明的方法所獲得的正常功能器官或特定功能細(xì)胞移植到對(duì)象 的器官位置;并允許細(xì)胞增長(zhǎng)和器官再生。另一方面,這里提供了一種治療與器官或特定功能細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病或病 癥的方法。該方法可以包括從特定器官或功能細(xì)胞中獲得靶向正常細(xì)胞,通過(guò)本發(fā)明的方 法采用合適的永生化蛋白區(qū)域永生化所述正常細(xì)胞,并移植所述細(xì)胞,所述細(xì)胞可采用或 不采用上述的在先逆轉(zhuǎn)永生化。本發(fā)明的方法可以被實(shí)施用于治療許多疾病或病癥。在一 個(gè)執(zhí)行方案中,實(shí)例包括代謝疾病或代謝相關(guān)疾病,例如糖尿病,心臟病,燒傷,創(chuàng)傷,失明, 一些聽(tīng)力障礙類型疾病,肝病,自身免疫疾病,血液病癥包括血友病及腫瘤,及其它很疾病。本專利在另一方面提供了一個(gè)細(xì)胞組織移植物,其包括通過(guò)本發(fā)明的過(guò)程所獲得 的細(xì)胞。組織細(xì)胞可以來(lái)自不同類型的靶細(xì)胞,如上所述。在這方面,本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)在本專利中找到簡(jiǎn)單以及全面的指導(dǎo),從而獲得 包括適合于很多特定應(yīng)用的細(xì)胞和組織移植物。本發(fā)明的另一方面提供了一種再生器官的 方法,其是在有利于其繼續(xù)生長(zhǎng)的條件下,將通過(guò)上述方法所獲得的正常的功能性器官或特定功能細(xì)胞或細(xì)胞組織,移植到對(duì)象內(nèi);并允許細(xì)胞增長(zhǎng)和再生,或產(chǎn)生功能性器官。實(shí)施例中采用的融合蛋白1.E6融合蛋白氨基酸序列(序列ID NO. 1)(EGFR結(jié)合區(qū)域)(人類乳頭瘤病毒16E6腫瘤蛋白)NPVVGYIGERPQYRDL-MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDF AFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKK QRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL-GLFEAIAEFIEGGWEELIEG(核內(nèi)體釋放信號(hào))2.E7融合蛋白氨基酸序列(序列ID NO. 2)(EGFR結(jié)合區(qū)域)(人類乳頭瘤病毒16E7腫瘤蛋白)NPVVGYIGERPQYRDL-MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHY NIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP-GLFEAIAEFIEGGWEELIEG(核內(nèi)體釋放信號(hào))參考文獻(xiàn)MoI Cells. 2002 ;13 (3) :351-61.J. Dermatol. 2000 ;27 (2) :73-86.US Patent No. 6,339,139 to Gu, et al.US Patent No. 5,635,383 to Wu, et al.PCT Publication No. WO 00/031238US Patent Application No. US 2005/0244969J. Biol. Chem. (1988) 15 :263 (29) 14621-4現(xiàn)在已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明,以適當(dāng)?shù)奶囟▽?shí)例可以更好的理解本發(fā)明,除 非特定地指出,這里所包括的實(shí)例只是用于舉例說(shuō)明,并不是限制本發(fā)明或限制其任何實(shí) 施方案。實(shí)施例實(shí)施例1亞克隆E6融合基因進(jìn)入pETMb載體E6融合多核苷酸(序列ID NO. 1)被合成,并于Nco I和)(h0 I位點(diǎn)被克隆插入 pET15b載體中(Novagen,Cat. No. :70755),所述E6融合多核苷酸包括從5,端到3,端編碼 包括EGF受體識(shí)別區(qū)域的多肽的DNA片段,HPV16E6致癌基因,以及編碼核內(nèi)體釋放信號(hào)多 肽的DNA。所述融合多核苷酸在5’端有組氨酸標(biāo)簽。以此所獲得攜帶有E6融合多核苷酸的雜交pETMb可以進(jìn)行DNA測(cè)序來(lái)鑒定它的 序列。實(shí)施例2大腸桿菌(E. coli)BL21的轉(zhuǎn)化5納克(ng)攜帶有E6融合多核苷酸的雜交質(zhì)粒pETMb被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21, 并允許其生長(zhǎng)。此后,篩選一個(gè)克隆,在4mL LB液體培養(yǎng)基(100yg/mL Amp)中進(jìn)行培養(yǎng), 并加入0. 5mmol/mL的異丙基- β _D_硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用聚 丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè),如15% SDS-PAGE。結(jié)果如本專利所提供的圖1所示。
      實(shí)施例3蛋白表達(dá)一個(gè)例子是大腸桿菌BL21菌株在IOL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí),然后用0. 5mmol/ mL的IPTG進(jìn)行4小時(shí)誘導(dǎo)。細(xì)胞離心后被收集,所得的細(xì)胞糊重懸于IOOOmL的裂解緩沖 液中,然后在冰上進(jìn)行超聲以獲得細(xì)胞裂解物。實(shí)施例4蛋白純化超聲后,裂解物高速離心10分鐘,收集沉淀。所述沉淀用凝膠電泳液溶解,用5X 上樣SDS緩沖液在15%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行上樣,然后膠被負(fù)染色。切下目標(biāo)條帶并進(jìn)行 電洗脫,如本專利所提供的圖2所示。采用蛋白免疫印跡法對(duì)條帶進(jìn)行鑒定,同樣如圖2所
      7J\ ο用于最后溶解的緩沖液是20mM Tris-HCl (pH8. 0),靶蛋白的濃度是0. 633mg/mL0 裂解物的總體積是100mL。實(shí)施例5亞克隆E7融合多核苷酸進(jìn)入pET3h質(zhì)粒合成E7融合多核苷酸(序列ID NO. 2) (5’ -EGF受體識(shí)別區(qū)域_E7致癌基因-核 內(nèi)體釋放信號(hào)_3’),并利用Kpn I和Not I酶識(shí)別位點(diǎn)克隆插入pET3h質(zhì)粒(Novagen, Cat. No :69015)。所產(chǎn)生的雜交pET3h_E7融合質(zhì)粒的序列用DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定。實(shí)施例6大腸桿菌BL21的轉(zhuǎn)化5ng雜交pET32-E7融合多核苷酸質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21細(xì)胞。篩選一個(gè)細(xì) 胞克隆,在4mL LB液體培養(yǎng)基(lOOyg/mL Amp)中培養(yǎng),并用0. 5mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。 用15% SDS-PAGE凝膠電泳分離后,可觀察到表達(dá)結(jié)果。參見(jiàn)本專利提供的圖3。實(shí)施例7蛋白表達(dá)一個(gè)例子是大腸桿菌BL21菌株在10L LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí),然后用0. 5mmol/ mL的IPTG進(jìn)行4小時(shí)誘導(dǎo)。細(xì)胞離心后被收集,所得細(xì)胞糊重懸于IOOOmL的裂解緩沖液 中,然后在冰上進(jìn)行超聲。實(shí)施例8蛋白純化超聲的裂解物高速離心10分鐘,收集上清,并上樣于Ni-IDA柱進(jìn)行純化。洗脫部 分的樣本進(jìn)行15%的SDS-PAGE凝膠電泳。參見(jiàn)圖4。含有靶蛋白的部分被收集并對(duì)20mM Tris-HCl (pH8. 0)透析。實(shí)施例9蛋白消化和分離200mg蛋白用6000單位的EK消化10小時(shí),然后用NI-IDA柱進(jìn)行分離,收集洗脫 液,然后用漂洗緩沖液漂洗分離柱,并用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。在漂洗緩沖液中收集到的 靶蛋白用蛋白免疫印跡法進(jìn)行鑒定(參見(jiàn)本專利的圖5。最終蛋白濃度是大約lmg/mL(于 20mMTris 中,pH8. 0),終體積是 50mL。實(shí)施例10永生化細(xì)胞的培養(yǎng)正常人類角化細(xì)胞購(gòu)買于Gibco (Gaithersburg,USA,Cat#12568-010)。所述細(xì) 胞是從一些男性新生兒的包皮中分離出來(lái)。這所述細(xì)胞在完全的角化細(xì)胞SFM培養(yǎng)基 (Gibco,Gaithersburg,USA, Cat#17005-042)中增殖,并補(bǔ)充 1 100 稀釋的青霉素-鏈霉 素溶液(Gibco,Gaithersburg, USA, Cat#15140-122)于所述培養(yǎng)基。凍干細(xì)胞被快速解凍,并在25cm2透氣培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)角化細(xì)胞已經(jīng)生 長(zhǎng)到80%聚滿時(shí),用溫和的胰蛋白酶-EDTA消化進(jìn)行傳代。簡(jiǎn)單地,用4mL漢克斯平衡鹽溶液(HBSS) (Gibco,Gaithersburg,USA, Cat#14170-112)洗單層細(xì)胞,然后用 4mL 胰蛋白 酶-EDTA(Gibco,Gaithersburg, USA, Cat#25300-054)室溫培養(yǎng),所述胰蛋白酶-EDTA 用維 爾烯(Gibco,Gaithersburg,USA,Cat#15040-066) 1 10 稀釋。一旦細(xì)胞從培養(yǎng)瓶脫落下來(lái),用2mL含有10%小牛血清(Gibco,Gaithersburg, USA,Cat#26170-035)的HBSS中和細(xì)胞,然后以10Xg離心5分鐘。棄去上清,細(xì)胞沉淀以 1 4分束比重懸于全培養(yǎng)基中。一般而言,大約10天細(xì)胞能再次達(dá)到80%聚滿,細(xì)胞倍 增時(shí)間大約是5天。實(shí)施例11用E6融合蛋白培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果以20%聚滿接種細(xì)胞,并在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用5mL角化細(xì)胞SFM培養(yǎng)基,于 37°C進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)兩個(gè)月后,角化細(xì)胞呈現(xiàn)出對(duì)每一融合蛋白的劑量應(yīng)答曲線。令人驚 奇的是,E6融合蛋白被證明在高濃度下對(duì)細(xì)胞是致命的。盡管只是假設(shè),但是這種效果可 能是由于細(xì)胞與EGF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGF受體。如果E6融合蛋的濃度是大約6 μ g/mL或者更高,第二天立即可以看到細(xì)胞死亡。 在較低的濃度,例如大約2 μ g/ml至大約6 μ g/mL,大約5天后才看到細(xì)胞死亡。E6融合蛋 白濃度為1. 5 μ g/mL或者更低的,觀察細(xì)胞超過(guò)4個(gè)月,沒(méi)有看到細(xì)胞死亡。實(shí)施例12用E7融合蛋白培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果以20%聚滿接種細(xì)胞,并在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用5mL角化細(xì)胞SFM培養(yǎng)基,于 37°C進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)兩個(gè)月后,角化細(xì)胞呈現(xiàn)出對(duì)融合蛋白的劑量應(yīng)答曲線。令人驚奇的 是,E7融合蛋白也被證明在高濃度下對(duì)細(xì)胞是致命的。正如以上已經(jīng)表明的,這可能是由 于細(xì)胞與EGF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGF受體的事實(shí)。在大約含有2μ g/mL E7融合蛋白時(shí),可以觀察到E7融合蛋白的急性細(xì)胞毒性。E7 融合蛋白濃度在0. 6 μ g/mL到小于2 μ g/mL時(shí),可以觀察到中期毒性。E7融合蛋白濃度在 0. 67 μ g/mL或者更低時(shí),觀察細(xì)胞4個(gè)月,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。實(shí)施例13用E6融合蛋白長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中以下濃度的融合蛋白被測(cè)試1 μ g/mL和0. 75 μ g/mL的E6融合蛋 白分別結(jié)合0. 33 μ g/mL和0. 25 μ g/mL的E7融合蛋白。結(jié)果總結(jié)于本專利的圖6中??偨Y(jié),沒(méi)有處理的角化細(xì)胞4個(gè)月后開始衰老,而以非致死劑量的HPV E6和E7進(jìn) 行處理的角化細(xì)胞繼續(xù)增殖,直到7個(gè)月。7個(gè)月后,它們的增長(zhǎng)顯著性變慢;即使細(xì)胞能 夠繼續(xù)存活,但其倍增時(shí)間延長(zhǎng)到15天或者更長(zhǎng),此實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)施例14脂溶性核內(nèi)化分子在本發(fā)明的另一方面,永生化多肽適合與脂溶性核受體配體或脂溶性部分連接或 結(jié)合。核受體配體的選擇是基于靶細(xì)胞中它的相應(yīng)核受體的表達(dá)。本申請(qǐng)中,脂溶性核受體配體或脂溶性部分將分布在細(xì)胞表面膜,攜帶著永生化 多肽進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。具體地,當(dāng)使用核受體配體時(shí),它將在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與相應(yīng)的核受體 結(jié)合,形成二聚物,然后轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)?;蛘?,當(dāng)使用脂溶性部分時(shí),它將通過(guò)細(xì)胞膜滲 透從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核,因此永生化多肽就跟隨著進(jìn)入了細(xì)胞核內(nèi)。本發(fā)明和一些優(yōu)選實(shí)施方案和實(shí)例現(xiàn)在已經(jīng)完全被公開了,很明顯,本領(lǐng)域的技 術(shù)人員不用拋開在這里已經(jīng)詳細(xì)闡明的本發(fā)明的精神或范圍,就可以對(duì)其進(jìn)行改造和修 飾。盡管以上的描述指的是特定的實(shí)施方案,但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員很清楚本發(fā)明可以用這些特定的細(xì)節(jié)的變化來(lái)實(shí)施。因此本發(fā)明不應(yīng)被理解為僅局限于上述具體實(shí)施例。
      例如,如同使用HPV E6和HPV E7多肽的例子,可以同時(shí)使用多個(gè)分子作為轉(zhuǎn)化多 肽。因此,很清楚地,可以采用多個(gè)表達(dá)載體來(lái)分別表達(dá)用于產(chǎn)生永生化蛋白復(fù)合體的轉(zhuǎn)化 多肽。
      權(quán)利要求
      1.一種永生化蛋白復(fù)合體,包括 至少一種內(nèi)化分子;至少一種轉(zhuǎn)化多肽; 至少一種核內(nèi)體釋放分子;并且其中所述至少一種分子或多肽被有效連接到至少一種所述分子或多肽上。
      2.如權(quán)利要求1所述的永生化蛋白復(fù)合體,進(jìn)一步包括至少一種核內(nèi)化分子以及至少 一種端粒延長(zhǎng)分子。
      3.如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中 所述轉(zhuǎn)化多肽能夠克服細(xì)胞衰老;和/或所述核內(nèi)體釋放分子可增進(jìn)所述轉(zhuǎn)化多肽從核內(nèi)體中釋放;和/或 所述內(nèi)化分子可促進(jìn)將所述永生化蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)移入靶細(xì)胞中。
      4.如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述內(nèi)化分子是核內(nèi)體介導(dǎo)。
      5.如權(quán)利要求4所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述內(nèi)化分子是受體介導(dǎo)。
      6.如權(quán)利要求5所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述內(nèi)化分子包括細(xì)胞表面受體結(jié)合 分子,細(xì)胞表面內(nèi)化分子和/或病毒結(jié)合受體分子。
      7.如權(quán)利要求6所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述內(nèi)化分子包括EGF受體識(shí)別分子 或配體,IGF受體識(shí)別分子或配體,VEGF受體識(shí)別分子或配體,F(xiàn)GF受體識(shí)別分子或配體, PDGF受體識(shí)別分子或配體,胰島素受體識(shí)別分子或配體,生長(zhǎng)激素受體識(shí)別分子或配體,肝 細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體識(shí)別分子或配體,趨化因子受體識(shí)別分子或配體,促紅細(xì)胞生成素受體 識(shí)別分子或配體,細(xì)胞因子受體識(shí)別分子或配體,c-kit多肽,HSV病毒蛋白VP22和/或脂 質(zhì)體。
      8.如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述轉(zhuǎn)化多肽包括一個(gè)或 多個(gè)致癌基因表達(dá)產(chǎn)物和/或一個(gè)或多個(gè)人類端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)。
      9.如權(quán)利要求8所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述致癌基因表達(dá)產(chǎn)物包括 病毒致癌基因表達(dá)產(chǎn)物,包括一個(gè)或多個(gè)HPV E6,HPV E7,SV40T抗原,腺病毒Ela,腺病毒E1B,EB病毒,EBNA2蛋白以及LMP-I蛋白;和/或細(xì)胞致癌基因表達(dá)產(chǎn)物,包括一個(gè)或多個(gè)ras,myc以及src致癌基因表達(dá)產(chǎn)物。
      10.如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述核內(nèi)體釋放分子包括 核內(nèi)體釋放信號(hào)多肽。
      11.如權(quán)利要求10所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述核內(nèi)體釋放分子包括病毒或合 成核內(nèi)體釋放分子。
      12.如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述核內(nèi)化分子包括核受 體結(jié)合分子和/或核受體分子。
      13.如權(quán)利要求12所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述核內(nèi)化分子進(jìn)一步包括類固 醇,脂溶性分子,視黃酸,維生素D,類固醇受體超家族成員,視黃酸受體家族成員和維生素 D受體或其結(jié)合物。
      14.如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述端粒延長(zhǎng)分子包括 hTERT。
      15.如權(quán)利要求14所述的永生化蛋白復(fù)合體,其中所述端粒延長(zhǎng)分子進(jìn)一步包括端粒 酶催化亞單位hTERT,或hTR,hTP-A,人源或其它哺乳動(dòng)物同源染色體TERT。
      16.一種用于永生化細(xì)胞的方法,包括將權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的永生化蛋白復(fù)合體與靶細(xì)胞在一定條件下接觸,經(jīng)過(guò) 一段有效時(shí)間,所述永生化蛋白復(fù)合體被內(nèi)化,所述轉(zhuǎn)化多肽被釋放;并且允許所述轉(zhuǎn)化多肽延長(zhǎng)細(xì)胞存活期和/或克服細(xì)胞停滯,和/或克服細(xì)胞衰老和/或 阻止細(xì)胞分化。
      17.如權(quán)利要求16所述的方法,進(jìn)一步包括將所述永生化蛋白復(fù)合體從細(xì)胞培養(yǎng)基中 移除,以逆轉(zhuǎn)永生化效果,獲得具有正常表型及能夠經(jīng)歷完全分化的細(xì)胞。
      18.如權(quán)利要求16所述的方法,其中所述靶細(xì)胞包括角質(zhì)細(xì)胞,肝細(xì)胞,胰島細(xì)胞,心 肌細(xì)胞,骨細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞和星狀細(xì)胞。
      19.如權(quán)利要求16所述的方法,其中所述永生化蛋白復(fù)合體以脂質(zhì)體形式與所述靶細(xì) 胞接觸。
      20.一種再生器官或特定功能細(xì)胞的方法,包括獲得所需器官或特定功能靶細(xì)胞;采用如權(quán)利要求16所述的方法,將器官或有特定功能細(xì)胞永生化;使被永生化的細(xì)胞生長(zhǎng)并擴(kuò)張;并且從培養(yǎng)基中取出所述永生化蛋白復(fù)合物,使得已擴(kuò)張細(xì)胞逆轉(zhuǎn)永生化。
      21.一種用于器官再生或生長(zhǎng)的移植細(xì)胞或細(xì)胞組織的方法,包括將經(jīng)由權(quán)利要求20所述的方法獲得的正常功能器官或特定功能細(xì)胞在有利于其繼續(xù) 生長(zhǎng)的條件下移植入對(duì)象,并且允許所述細(xì)胞生長(zhǎng)并再生或生長(zhǎng)成器官。
      22.一種用于治療與器官或特定功能細(xì)胞障礙有關(guān)的疾病或病癥的方法,包括將經(jīng)由 經(jīng)由權(quán)利要求20所述的方法獲得的細(xì)胞移植入有需要的對(duì)象。
      23.—種組織移植,包括經(jīng)由權(quán)利要求20所述的方法獲得的細(xì)胞。
      全文摘要
      一個(gè)永生化蛋白復(fù)合體,其包括內(nèi)化分子,轉(zhuǎn)化多肽,和核內(nèi)體釋放分子;所有分子和/或多肽被有效連接到一個(gè)或多個(gè)其它多肽上,并選擇性地連接到一個(gè)或多個(gè)核內(nèi)化分子和端粒延長(zhǎng)分子上。一種生產(chǎn)永生化細(xì)胞或延長(zhǎng)原代細(xì)胞的生存期的方法,其包括在一定條件下,將本發(fā)明的永生化蛋白復(fù)合體與靶細(xì)胞接觸,并經(jīng)過(guò)一段有效時(shí)間,蛋白復(fù)合體被內(nèi)化,轉(zhuǎn)化多肽被釋放,并允許轉(zhuǎn)化多肽延長(zhǎng)細(xì)胞的生存期,和/或克服細(xì)胞停滯。而且本發(fā)明也提供了編碼蛋白復(fù)合體的永生化多核苷酸,攜帶表達(dá)載體和多核苷酸的雜交載體,用雜交載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,表達(dá)蛋白復(fù)合體的細(xì)胞,以及細(xì)胞永生化試劑盒,其包括蛋白復(fù)合體,和/或編碼蛋白的多核苷酸,和/或攜帶多核苷酸的雜交表達(dá)載體,以及如何實(shí)施永生化細(xì)胞的說(shuō)明書。本發(fā)明也提供了細(xì)胞和組織移植物,其包括細(xì)胞,永生化細(xì)胞和組織的各種相應(yīng)用途。
      文檔編號(hào)C07K14/00GK102105488SQ200980128164
      公開日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
      發(fā)明者朱志強(qiáng) 申請(qǐng)人:朱志強(qiáng)
      網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
      • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1