專利名稱：利用白介素-21受體結(jié)合蛋白的治療方法
利用白介素-21受體結(jié)合蛋白的治療方法相關(guān)申請本申請要求2008年5月28日提交的美國臨時(shí)專利申請No. 61/055，543和2008 年9月23日提交的美國臨時(shí)專利申請No. 61/099, 476的優(yōu)先權(quán),通過述及將其內(nèi)容完整收 入本文。本發(fā)明涉及結(jié)合白介素-21受體(IL-21R),特別是人IL-21R的結(jié)合蛋白及其抗 原結(jié)合片段，及其在調(diào)節(jié)IL-21R相關(guān)活性(例如IL-21對IL-21響應(yīng)性基因表達(dá)水平的影 響)中的用途。本文中公開的結(jié)合蛋白在治療和/或診斷IL-21R相關(guān)病癥例如炎性病癥、 自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)(al lergies)、移植排斥、高增殖性血液病癥、和其它免疫系統(tǒng)病 癥中有用。本發(fā)明進(jìn)--步提供用于測定本發(fā)明抗體的藥效學(xué)和藥動學(xué)特性的方法。
背景技術(shù)：
抗原激起免疫應(yīng)答并激活最大的兩群淋巴細(xì)胞T細(xì)胞和B細(xì)胞。遭遇抗原后，T 細(xì)胞增殖并分化成效應(yīng)器細(xì)胞,而B細(xì)胞增殖并分化成抗體分泌漿細(xì)胞。這些效應(yīng)器細(xì)胞 分泌和/或響應(yīng)細(xì)胞因子,細(xì)胞因子是由淋巴細(xì)胞和其它細(xì)胞類型分泌的小蛋白質(zhì)(小于 約 30kDa)。人IL-21是與IL-2、IL-4和IL-15顯示序列同源性的細(xì)胞因子(Parrish-Novak 等Q0(K))NatUre 408 :57-63)。盡管白介素細(xì)胞因子間序列同源性低，但是細(xì)胞因子分享 共同的折疊，折疊成該家族代表性的“四螺旋束”結(jié)構(gòu)。大多數(shù)細(xì)胞因子結(jié)合I類或II類 細(xì)胞因子受體。II類細(xì)胞因子受體包括IL-10和千擾素的受體，而I受細(xì)胞因子受體包括 IL-2至IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、和IL-15以及造血生長因子、瘦蛋白、和生長激素 的受體(Cosraan (1993) Cytokine 5 :95-106)。人IL-21R是I類細(xì)胞因子受體。編碼人IL-21及其受體(IL-21R)的核苷酸和氨基 酸序列記載于國際申請公幵號WO 00/053761和WO 01/085792 ；Parrish-Novak等(2000) 出處同上；及 Ozaki 等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :11439-44。IL-21R 與 IL-2 受 體β鏈和IL-4受體α鏈具有最高的序列同源性(Ozaki等(2000)出處同上)。在配體結(jié) 合時(shí)，IL-21R與IL-2、IL-3、IL_4、IL_7、IL_9、IL-13和IL-15的受體復(fù)合物分享的共同伽 馬細(xì)胞因子受體鏈(Y c)聯(lián)合(Ozaki等(2000)出處同上；Asao等(2001) .J. Immunol. 167 IL-21R在淋巴樣組織中，特別是在T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、樹突細(xì) 胞(DC)和巨噬細(xì)胞上表達(dá)(Parrish-Novak等(2000)出處同上)，這容許這些細(xì)胞響應(yīng) IL-21 (Leonard and Spolski (2005) Nat. Rev. Immunol. 5 :688-98)。IL-21R 的廣泛淋巴樣 分布指示IL 21在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。體外研究顯示了 IL-21顯著調(diào)控B細(xì)胞、 CIM+和CDS+T細(xì)胞、及NK細(xì)胞的功能(Parri sh-Novak等(2000)出處同上；Kasaian等 (2002) Immunity 16 =559-69) 最新的證據(jù)提示IL-21介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可具有抗腫瘤活性 (Sivakumar等Q004) Immunology 112 :177-82)，而且IL-21能在小鼠中預(yù)防抗原誘導(dǎo)的消除(Shang 等(2006)Cell. Immunol. 241 :66-74)。在自身免疫中,破壞IL-21基因和注射重組IL-21顯示出分別調(diào)控實(shí)驗(yàn)性自身免 疫性重癥肌無力(EAMG)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)展(King等Q004)Cell 117 :265-77 ；Ozaki 等(2004) J. Immunol. 173 :5361-71 ；Vollmer 等(2005) J. Immunol. 174 2696-2701 ；Liu 等(2006) J. Immunol. 176 6247-54)。在這些實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，提示操縱丨丄-21 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)直接改變CD8+細(xì)胞、B細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、和NK細(xì)胞的功能。如此，本發(fā)明提供通過阻斷IL-21信號傳導(dǎo)途徑來起作用，用于治療例如自身免 疫性疾病的新治療劑，即抗IL-21R抗體。為了使治療劑(諸如抗IL-21R抗體)在體內(nèi)有 效,應(yīng)當(dāng)測定調(diào)控丨丄-21應(yīng)答所必需的抗IL-21R抗體最小血清濃度；因此,需要容許精確測 定此類最小血清濃度的方法。發(fā)明概述本發(fā)明描述了特異性結(jié)合人和鼠IL-21R的結(jié)合蛋白例如人抗體及其片段的分離 和表征。本文中描述的結(jié)合蛋白衍生自抗體18A5，其披露于美國專利No. 7，495，(招5，通過 述及將其全部收入本文。本發(fā)明的結(jié)合蛋白具有程度比親本18A5抗體大得多的對人和！ 或鼠IL-21R的親和力。本發(fā)明至少部分提供以高親和力和特異性結(jié)合IL-21R，特別是人IL-21R的 IL-21R結(jié)合劑(諸如結(jié)合蛋白及其抗原結(jié)合片段)。本發(fā)明的結(jié)合蛋白及其抗原結(jié)合片段 在本文中也分別稱作“抗IL-21R結(jié)合蛋白”及“其片段”。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或 其片段降低、抑制、或拮抗IL-21R活性。此類結(jié)合蛋白可用于通過拮抗IL-21R活性來調(diào)節(jié) 免疫應(yīng)答或IL-21R相關(guān)病癥。在其它實(shí)施方案中，抗IL-21R結(jié)合蛋白可用于診斷，或作為 靶向結(jié)合蛋白用于將治療劑或細(xì)胞毒劑投遞至IL-21R表達(dá)細(xì)胞。如此,本發(fā)明的抗IL-21R 結(jié)合蛋白在診斷和治療IL-21R相關(guān)病癥例如炎性病癥、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)、移植 排斥、血液高增殖性病癥、和其它免疫系統(tǒng)病癥中有用，如本文中更完整描述的。因而,在一個(gè)方面，本發(fā)明的結(jié)合蛋白特征為一種結(jié)合IL-21R，特別是人IL-21R 的分離的結(jié)合蛋白(例如分離的抗體)或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中,抗IL-21R 結(jié)合蛋白(例如抗體)可具有一項(xiàng)或多項(xiàng)下述特征(1)它是單克隆或單特異性結(jié)合蛋白； (2)它是人結(jié)合蛋白；(3)它是體外生成的結(jié)合蛋白；(4)它是體內(nèi)(例如轉(zhuǎn)基因小鼠系統(tǒng)) 生成的結(jié)合蛋白；(5)它抑制IL-21結(jié)合IL-21R;(6)它是IgGl ; (7)它以至少約IO5M1s1 的結(jié)合常數(shù)結(jié)合人IL-21.R ； (8)它以至少約SxlO4M-1S-1的結(jié)合常數(shù)結(jié)合鼠IL-21R ； (9)它 以約KTV1或更少的解離常數(shù)結(jié)合人IL-21R ； (10)它以約KT2P或更少的解離常數(shù)結(jié)合 鼠IL-21R ;(11)它以約1. 75nM或更少的IC5q抑制人IL-21R介導(dǎo)的人IL-21R表達(dá)性BaF3 細(xì)胞增殖；(12)它以約0. 5nM或更少的IC5tl抑制鼠IL-21R介導(dǎo)的鼠IL-21R表達(dá)性BaF3 細(xì)胞增殖；(13)它以約14. OnM或更少的IC50抑制人IL-21.R介導(dǎo)的人IL-21R表達(dá)性TFl 細(xì)胞增殖；(14)它以約1.9nM或更少的IC5ci抑制IL-21介導(dǎo)的人原代B細(xì)胞增殖；(15) 它以約1. 5nM或更少的IC50抑制IL-21介導(dǎo)的人原代CD4+T細(xì)胞增殖；(16)它以約5. OnM 或更少的IC5tl抑制IL-21介導(dǎo)的鼠原代CD4+T細(xì)胞增殖；(17)它在例如靜脈內(nèi)(i. v.)施 用于動物(例如哺乳動物,例如人、非人靈長類動物、嚙齒類動物)后具有約().1^7. Sral/ hr/kg的均值總身體清除；(18)它在例如i. v.、皮下(s. c.)、或腹膜內(nèi)(i. p.)施用于動物 (例如哺乳動物，例如人、非人靈長類動物、嚙齒類動物)后具有約20-700小時(shí)的均值消除半衰期；(19)它在動物(例如哺乳動物,例如人、非人靈長類動物、嚙齒類動物)中具有約 40-1500ml/lig的均值穩(wěn)態(tài)分布體積；(20)它在例如s. c.施用于動物(例如哺乳動物,例如 人、非人靈長類動物、嚙齒類動物)后具有約35-100%的生物利用度；Ql)它在例如i. v.、 s.c.、或i. p.施用于動物(例如哺乳動物,例如人、非人靈長類動物、嚙齒類動物)后具有 約200-10，000 μ g*hr/ml (每lmg/kg劑量)的均值劑量標(biāo)準(zhǔn)化AUC ； (22)它在例如i. v.、 s. c.、或i.p.施用于動物(例如哺乳動物,例如人、非人靈長類動物、嚙齒類動物)后具有 約0. 5-30 μ g/ml的均值劑量標(biāo)準(zhǔn)化Cmax (最大血清濃度)；和(23)它調(diào)控IL-21響應(yīng)性細(xì) 胞因子或IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)。本發(fā)明的結(jié)合蛋白(術(shù)語“結(jié)合蛋白”根據(jù)需要還包括及指其抗原結(jié)合片段) 的非限制性例示性實(shí)施方案在本文中稱作AbA-AbZ,而且這些術(shù)語與美國臨時(shí)專利申請 No. 61/055，543中使用的術(shù)語的關(guān)系呈現(xiàn)于表2A。本發(fā)明的結(jié)合蛋白的其它例示性實(shí)施方 案，即scFv，在本文中稱作H3-H6、Li-L6、L8-L21、和L23-L25,如表2B中詳述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白是抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中,抗體是多 克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、人的、單鏈的、嵌合的、 合成的、重組的、雜合的、突變的、嫁接的(grafted)、體外生成的和/或多特異性的(例如自 至少兩種完整抗體形成的雙特異性抗體)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在受試者中治療或預(yù)防IL-21.R相關(guān)病癥的方法,包括 以足以抑制或降低受試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié)合 蛋白或其抗原結(jié)合片段，由此治療或預(yù)防所述病癥，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段 包含至少一種與選自下組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO :14,16, 18, 20, 22，24, 26, 28, 30, 32，34, 36, 38, 40, 42，44,46, 48, 50, 52，54, 56, 58,60, 62，64, 66, 68, 70，72，74，76，78，80，82,84, 86，88，90，92，94，96,98,100，102’ 104，106’ 108，110’ 112， 114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142,144，146,148，150， 152,154,156,158,160,162,165-168,171-193,213-229,240,242,244,246,和 248。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段可以是例如抗體、scFv、 VH、VL、和 / 或 CDR。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法，包 括以足以抑制或降低受試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié) 合蛋白或其抗原結(jié)合片段，由此治療或預(yù)防所述病癥，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片 段包含至少一種由與選自下組的核苷酸序列至少約95%相同的核苷酸序列編碼的氨基酸 序列SEQ ID NO :13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51， 53, 55, 57, 59, 61,63, 65，67，69, 71, 73, 75, 77, 79, 81，83，85, 87,89, 91,93, 95，97, 99,101’ 103,105，107,109，111,113，115,117，119,121，123,125，127,129，131,133,135,137,139， 141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和 247。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種選自下組的 氨基酸序列:SEQ ID NO :14,16,18, 20，22, 24, 26, 28，30, 32, 34, 36，38,40,42,44，46,48,240, 242, 244, 246,和 248。 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法,包 括以足以抑制或降低受試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié) 合蛋白或其抗原結(jié)合片段，由此治療或預(yù)防所述病癥，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片 段包含至少一種與選自下組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO :6,
60
10，12，14’ 16’ 18，20，22，24，26，28，30, 32, 34，36，38，40，42，44, 46,48，50，52，54，56，58， ，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106， 108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130,132，134,136，138,140，142，144， 146,148,150’ 152,154,156,158,160,1.62-1.95, 213-229, 240, 242, 244, 246,和 248,且其中， 如果所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種與選自下組的序列至少約95%相同的氨 基酸序列=SEQ ID NO 6,8,10,12，163,164,169,170,194,和195，那么所述結(jié)合蛋白或抗 原結(jié)合片段必須還包含至少一種與選自下組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列 SEQ ID KO 14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36，38,40,42,44,46,48,50,52,54,56, 58，60，62，64，66, 68，70，72，74，76, 78，80，82，84，86, 88，90，92，94，96, 98，100，102’ 104， 106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134,136，138，140,142， 144，146，148，150，152，154，156，158，160,162，165-168，171-193，213-229，240,242，244, 246,和 248。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法,包 括以足以抑制或降低受試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合人IL-21R的 結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段，由此治療或預(yù)防所述病癥，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合 片段包含至少一種由與選自下組的核苷酸序列至少約95%相同的核苷酸序列編碼的氨基 酸序列SEQ ID NO :5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43, 45，47,49，51,53，55，57,59，61，63，65，67,69，71，73，75，77,79，81，83，85，87,89，91，93， 95,97,99,101，103，105，107，109，111,113，115，117，119，121，123,125，127，129，131，133, 135，137,139，141,143，145,147，149,151，153,155，157,159，161, 239，241, 243, 245,和 M7,且其中，如果所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種由與選自下組的序列至少約 95%相同的核苷酸序列編碼的氨基酸序列SEQ ID N0:5，7，9，和11，那么所述結(jié)合蛋白或 抗原結(jié)合片段必須還包含至少一種由與選自下組的核苷酸序列至少約95%相同的核苷酸 序列編碼的氨基酸序列=SEQ ID NO :13,15,17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 81, 38, 35, 37, 89,41, 43, 45，47，49，51，53, 55，57，59，61，63,65，67，69,71，73,75，77，79,81，83，85，87，89,91， 93,95,97,99,101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131， 133,135，137,139，141,143，145,147，149,151，153,155，157，159，161，239，241，243，245， 和 247。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種選自下組 的氨基酸序列:SEQ ID NO :6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，組的序列至少約95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :6，8，10,12，163，164，169，170，194， 和195,那么所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段必須還包含至少--種與選自下組的氨基酸序列 至少約 95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO 14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38， 40, 42，44, 46, 48，50, 52，54, 56, 58，60, 62, 64, 66,68，70, 72, 74, 76, 78，80, 82, 84, 86, 88， 90,92,94,96,98,100，102,104,106,108,110,112，114，116,118,120,122,124,126，128， 130，132，134，136，138，140，142,144，146,148，150，152，154，156，158，160，162，165-168， 171-193,213-229,240，242，244，246，和 248。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法，包 括對受試者施用特異性結(jié)合IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段，其中所述結(jié)合蛋白或 其抗原結(jié)合片段包含輕鏈和重鏈,且其中該重鏈包含至少一種選自下組的氨基酸序列=SEQ ID NO 14,16，18，20，68，70，72，88，90，92，94，213，218，219，240，和 242。在一個(gè)實(shí)施方案 中，結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含\域和Vh域，且該Vh域包含至少一種選自下組的序列 SEQ ID NO 14,16,1.8,和 20。本發(fā)明的另--個(gè)實(shí)施方案是在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法,包 括對受試者施用特異性結(jié)合IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段，其中所述結(jié)合蛋白或 其抗原結(jié)合片段包含輕鏈和重鏈,且其中該輕鏈包含至少一種選自下組的氨基酸序列=SEQ ID NO :22, 24，26, 28, 30, 32, 34，36, 38, 40, 42，44, 46, 48, 50，52, 54, 56, 58，60, 62, 64, 66， 74,76，78，80，82，84,86，96，98，100，102，104,106，108，214-217，220-229，244,246，和 248。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含\域和Vh域，且該\域包含至 少一種選自下組的序列:SEQ ID NO :22，24，26，沘，30，32，34，36, 38，40，42，44,46，48，50， 52, 54, 56, 58，60,62,64,66，215,217,221,223,225,227,和 229。在本發(fā)明方法的另--個(gè)實(shí)施方案中，重鏈包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :88，90，92，94，213，218，219，240，和242，且輕鏈包含選自下組的氨基酸序列=SEQ ID NO :96,98,100,102,104,106，108，214，216，220，222，224，226，228，244，246，和 248。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在受試者中治療或預(yù)防IL-21.R相關(guān)病癥的方法,包括 以足以抑制或降低受試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合選自下組的結(jié)合 蛋白識別的人IL-21R表位的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段AbA-AbW，H3-H6, L1-L6，L8-L21, 和L23-L25,由此治療或預(yù)防所述病癥，其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段競爭性抑制選 自下組的結(jié)合蛋白結(jié)合人IL-21.R =AbA-AbW, H 廠H6, Li-L6, L8-L21,禾口 L23-L25。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含重鏈、輕鏈、或Fv片段,其包含選自下組的氨 基酸序列:SEQ ID NO :14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50， 52, 54，56，58,60, 62,64, 66,68, 70，72，74, 76, 78,80, 82, 84，86，88,90, 92,94, 96,98,100, 102，104,106，108,110，112,114，116,118，120,122，124,126,128,1.30,132,134,136,138, 140’142，144’146，148’150，152’154,156’158，160’162，165-168，171-193，213-229，240’ 242，244，246，和M8。在又一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含重鏈、輕鏈、 或Fv片段，其包含由選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 13,15,17,19, 21, 23, 25，27, 29, 31, 33, 35，37, 39, 41,43, 45，47, 49, 51, 53, 55，57, 59, 61，63, 65，67, 69, 71，73，75，77，79，81，83,85,87，89，91，93，95，97，99,101,103,105，107，109，111’ 113’ 115， 117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143,145，147,149，151，153，155,157,159,161, 239, 241, 243, 245,和247。在又一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白特異性結(jié)合受 AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、AbV^P /'或 AbW 識別的 IL-21R 表位，且其中所述結(jié)合蛋 白競爭性抑制 AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、AbV、和 / 或 AbW 對人 IL-21R 的結(jié)合。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，IL-21R相關(guān)病癥選自下組自身免疫性病癥、 炎性狀況、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥、和血液高增殖性病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，IL 21R相關(guān) 病癥選自下組免疫性病癥、血液高增殖性病癥、移植排斥、移植物抗宿主病、變態(tài)反應(yīng)(包 括特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng))、糖尿病、關(guān)節(jié)炎病癥(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎)、脊椎關(guān)節(jié)病、多發(fā)性硬化、腦脊髓炎、重癥肌無 力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、皮膚紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(包括特應(yīng)性皮炎、 濕疹性皮炎)、銀屑病、斯耶格倫(SjSgren)氏綜合癥、IBD(包括克羅恩(Crohn)氏病、潰瘍 性結(jié)腸炎)、哮喘(包括內(nèi)源性哮喘、變應(yīng)性哮喘)、硬皮病和血管炎。在又一個(gè)實(shí)施方案 中，IL-21R相關(guān)病癥選自下組多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、移植排斥、類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、和其它關(guān)節(jié)炎病癥。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段對人IL-21R的結(jié) 合常數(shù)為至少KfM1sΛ在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段以約1. 75ηΜ或 更少的IC50抑制]丄-21介導(dǎo)的BAF3細(xì)胞增殖，其中所述BAF3細(xì)胞包含人]丄-21受體。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段以約14ηΜ或更少的ICm抑制IL-21介導(dǎo)的 TFl細(xì)胞增殖，其中所述Τ 1細(xì)胞包含人IL-21受體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或其 抗原結(jié)合片段以約1.9ηΜ或更少的IC5。抑制IL-21介導(dǎo)的原代人B細(xì)胞增殖，其中所述B 細(xì)胞包含人IL-21R。在又一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段以約1. SnM或更少 的IC5。抑制IL-21介導(dǎo)的原代人CD4+細(xì)胞增殖,其中所述CD4+細(xì)胞包含人IL-21R。在本 發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，在本文中提供這些參數(shù)和其它藥動學(xué)和藥效學(xué)參數(shù)的其它范圍 和數(shù)值。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種確定抗IL-21R抗體是否是治療性抗IL-21R 抗體的方法，包括下述步驟使來自受試者的第--血液樣品與IL-21配體接觸；測定與 IL-21配體接觸的第一血液樣品中至少一種IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平；在抗IL-21R抗 體存在下使來自受試者的第二血液樣品與IL-21配體接觸；測定在抗IL-21R抗體存在下 與IL-21配體接觸的第二血液樣品中至少一種IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平；并比較上文 測定的至少一種IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平,其中至少一種IL-21響應(yīng)性基因表達(dá)水平 的變化指示該抗IL-21R抗體是治療性抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是哺乳 動物,例如猴或人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因選自下組TNF， IFKy , IL-6, IL-8, IL 1(), CDl9, STAT3, TBX21, CSFl, GZMB, PRFl, IL-2Ra ,和 IL-21R。在 又一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因是IL-2Ra。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測定抗IL-21R抗體的藥效活性的方法，包括 檢測受試者的血液樣品中至少一種IL-21響應(yīng)性基因表達(dá)水平的調(diào)控。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí) 施方案中，檢測至少一種IL-21響應(yīng)性基因表達(dá)水平的調(diào)控包括下述步驟對受試者施用 抗IL-21R抗體,其中所述受試者用所述抗IL-21R抗體處理；使來自用所述抗IL-21R抗體 處理的所述受試者的血液樣品與IL-21配體接觸；測定來自用所述抗IL-21R抗體處理的所 述受試者并與所述IL—21配體接觸的所述血液樣品中至少一種IL—21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平；并比較上文測定的至少一種IL 21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平與與IL 21配體接觸的不同 血液樣品中至少一種IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平,其中所述不同血液樣品來自未用所述 抗IL-21R抗體處理的受試者。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是哺乳動物，例如猴 或人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因選自下組TNF，IFN y , IL_6， 丨丄-8, I10, CDl9, STAT3, FBX21, CSFl, GZMB, PRFl，IL-2R α，和 IL-21.R。在又一個(gè)實(shí)施方案 中，所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因選自下組:CD19, GZMB, PRFl, IL_2Ra , IFN γ ,和IL-6。 在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因是IL-2Ra。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在受試者中降低、抑制、或減弱急性期應(yīng)答的方 法,包括以足以降低、抑制或減弱受試者中急性期應(yīng)答的量對受試者施用特異性結(jié)合人 IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段,其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含至少一種 與選自F組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :14,16,18,20,22,24, 26, 28, 30, 32, 34, 36，38,40, 42, 44, 46，48, 50, 52, 54, 56，58, 60, 62,64, 66，68, 70, 72，74, 76，78,80, 82,84, 86, 88，90，92,94, 96,98,100，102,104，106,108，110,112，114,1.16，118, 120，122，124,126，128，130’ 132，134’ 136，138’ 140，142’ 144,146’ 148，150’ 152，154’ 156， 158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施 方案中，結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段是局部施用的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是提高用于免疫受試者的疫苗配制劑的功效的方法,包括 對受試者施用治療有效量的特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段,其中所 述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含至少一種與選自下組的氨基酸序列至少約95%相同的 氨基酸序列:SEQ ID NO :14,16，18, 20, 22，24, 26, 28, 30，32, 34, 36, 38，40，42,44,46,48， 50, 52, 54, 56, 58，60,62, 64, 66, 68，70, 72, 74, 76, 78，80, 82, 84，86, 88，90, 92, 94，96, 98， 100，102’ 104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136， 138，140，142,144,146，148,150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213—229， 240，242，244，246，和248。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段是在免疫之前、 期間和/或之后施用的。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供用于在體外檢測樣品中IL-21R的存在的方法,包 括(a)使樣品與特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段接觸；并(b)檢測結(jié) 合蛋白或其抗原結(jié)合片段與樣品之間復(fù)合物的形成，其中樣品中復(fù)合物形成相對于對照或 參照樣品或水平的顯著差異指示該樣品中存在HlR,且其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合 片段包含至少一種與選自下組的氨基酸至少約95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO 14,16, 18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66， 68，70，72，74，76, 78, 80，82，84，86，88，90，92,94, 96，98，100，102，104，106，108，110，112, 1.14，116,118，120,122,124,126,128,1.30,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150, 152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。在-一個(gè) 進(jìn)一步的實(shí)施方案中，樣品是血清、血漿、或組織。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供用于在體內(nèi)檢測IL-21R的存在的方法，包括 (a)在容許結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段結(jié)合IL-21R的條件下對受試者施用特異性結(jié)合人 IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段；并(b)檢測結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段與IL-21R 之間復(fù)合物的形成，其中受試者中復(fù)合物形成相對于對照或參照樣品或復(fù)合物形成水平的顯著差異指示存在IL-21R,且其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含至少一種與選自 下組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO 14，16,18，20，22，24, 26， 28，30，32, 34，36，38，40，42, 44，46，48，50，52, 54，56，58，60，62, 64，66，68，70，72, 74，76， 78,80，82，84，86，88，90, 92,94，96，98，100，102,104,106，108，110，112，114，116,118，120， 122,124，126,128，130,132，134,136，138,140，142,144，146,148,150,152,154,156,158, 160’ 162,165-168,171-193, 213-229, 240, 242, 244, 246,和 248。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合蛋 白或其抗原結(jié)合片段用可檢測物質(zhì)直接或間接標(biāo)記以便于結(jié)合的或未結(jié)合的抗體的檢測。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可檢測物質(zhì)是酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、或放射性材料。在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明提供的方法進(jìn)一步包括對受試者施用另一種選自下組 的治療劑細(xì)胞因子抑制劑、生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑、 細(xì)胞毒劑、和細(xì)胞抑制劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，治療劑選自F組=TNF拮抗劑、IL-12拮 抗劑、IL-15拮抗劑、IL-17拮抗劑、IL-18拮抗劑、IL-19拮抗劑、IL-20拮抗劑、IL-21拮 抗劑、IL-28拮抗劑、T細(xì)胞消減劑、B細(xì)胞消減劑、甲氨蝶呤、來氟米特、西羅莫司(雷帕霉 素)或其類似物、COx2抑制劑、cPLA2抑制劑、NSAIDjP p38抑制劑。如在本發(fā)明的其它方 法中，在一些實(shí)施方案中，受試者是哺乳動物，例如人。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供用于測量、測定、和/或評估抗產(chǎn)品抗體(例如針對 抗IL-21R結(jié)合蛋白及其抗原結(jié)合片段的抗產(chǎn)品抗體)的生成水平的方法。本公開的別的方面會在說明中部分列出，而且根據(jù)說明會部分顯而易見,或者通 過實(shí)踐本發(fā)明可學(xué)會。本發(fā)明在權(quán)利要求中列出和具體指出，而且本公幵不應(yīng)解釋為限制 權(quán)利要求的范圍。下面的詳細(xì)說明包括本發(fā)明各種實(shí)施方案的例示性呈現(xiàn),它們對于要求 保護(hù)的發(fā)明不是限制性的。附圖構(gòu)成本說明書的一部分,而且與說明一起只用來例示實(shí)施 方案,而非限制本發(fā)明。附圖簡述

圖1 (a-c)描繪scFv對人IL-21R-BaF3細(xì)胞增殖的中和。將細(xì)胞與所示scFv 混合，然后與100pg/ml人IL-21 —起溫育。48小時(shí)后通過CELLTITER GLO (Promega Corporation, Madison, WI) 測量增殖。圖2 (a-c)描繪scFv對人IL-2IR-TFl細(xì)胞增殖的中和。將細(xì)胞與所示scFv混合， 然后與lOOpg/ml人IL-21 一起溫育。48小時(shí)后通過CELLTITER-GLO 測量增殖。圖3 (a-c)描繪scFv對鼠IL-21R-BaF3細(xì)胞增殖的中和。將細(xì)胞與所示scFv混 合,然后與400pg/na鼠IL-21 —起溫育。48小時(shí)后通過CELLTITER-GLO 測量增殖。圖4 (a-c)描繪scFv與親本抗體18A5 IgG競爭對鼠IL-21R的結(jié)合。將scFv與 生物素化的鼠IL-21R H/F混合,并將混合物添加至在ELISA板上固定化的抗體1.8A5。用 HRP-鏈霉親合素檢測mIL-21R捕捉,并以A450信號的降低指示mIL_21R結(jié)合的競爭。圖5描繪21對重鏈/輕鏈對IL-21依賴性增殖的中和。將圖中所示抗體添加至細(xì) 胞。隨后添加IL-21，并在48小時(shí)后用CELLTITER GLO 測量增殖。對人IL-21R-BaF3細(xì) 胞用 100pg/inl 人丨丄-21 (圖 5a-c)、對人 IL-21R-TFl 細(xì)胞用 100pg/inl 人丨丄-21 (圖 5d-f)、 或?qū)κ驣L-21R-BaF3細(xì)胞用400pg/ml鼠IL-21 (圖5g_i)來進(jìn)行測定。圖6描繪21種抗IL-21R IgG對瞬時(shí)表達(dá)人IL_21R(圖6a_c)、大鼠IL_21R(圖 6d-f)、獼猴IL-21R(圖6g—i)、和人伽馬共同鏈(圖6j-1)的CIIO細(xì)胞的結(jié)合。用IL-21R或?qū)φ召ゑR共同鏈瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,并在基于細(xì)胞的ELISA中用HRP偶聯(lián)的抗人IgG測
量結(jié)合。圖7(a_c)描繪特定抗 IL-21R 抗體(圖 7a，AbS ；圖 7b，AbQ、AbT、AbO ；圖 7c， AbR、AbP、和AbU)的結(jié)合特異性，這是通過表面等離振子共振測量得出的。在抗人IgG上 捕捉抗 IL-21R 抗體，并在 BIACORE 儀器(GE Healthcare, Piscataway, Nj)中測量隨后 對鼠IL-21R-H/F、人IL-13-H/F、人IL-2R^、或人可溶性IL-4R任--的結(jié)合。圖7d顯示人 ILIR β和人可溶性IL-4R分別被特異性抗IL-觀β和抗IL-4R抗體所捕捉(對照)。圖8 (a-d)描繪抗IL-21R抗體對人和鼠IL-21R的結(jié)合。在BIACOREtm芯片上固定 化的抗人IgG上捕捉所示人抗IL-21R抗體。讓不同濃度的人IL-21R-His/FLAG(圖8a b) 和鼠IL-2IR-His/FLAG(圖8c-d)流過芯片，并監(jiān)測結(jié)合和解離。圖9描繪抗IL-21R抗體對人和獼猴IL-21R的結(jié)合。在BIAC0RE 芯片....Ll固定化 的抗人IgG上捕捉人抗IL-21R抗體AbS和AbT。讓不同濃度的人和獼猴IL-21R-His/FLAG 流過芯片，并監(jiān)測結(jié)合和解離。圖9a顯示獼猴IL-21R-His/FLAG結(jié)合至AbS0圖9b顯示 人IL-21R-His/FLAG結(jié)合至AbS。圖9c顯示獼猴IL-21R-His/FLAG結(jié)合至AbT。圖9d顯 示人 IL-21R-His/FLAG 結(jié)合至 AbT。圖10描繪IL-21R抗體的表位評估。在圖IOa所示實(shí)驗(yàn)中(還可見Y軸左邊的圖 解)，通過BIACORE 芯片上固定化的抗IL-21.R抗體AbS來捕捉鼠IL-21R-H/F (Hi s-Flag融 合蛋白)。使別的抗IL-21R抗體(AbS、AbT、D5 (D5-20，一種中和性抗鼠IL-21R抗體)、和 7C2(—種非中和性抗鼠IL-21R對照抗體))流過芯片，并監(jiān)測它們對捕捉到的IL-21R-H/F 的結(jié)合。在圖IOb所示實(shí)驗(yàn)中，通過BIACORE 芯片上固定化的抗IL-21R抗體AbS來捕捉 人IL-21.R-H/F。使別的抗IL-21.R抗體(AbS, AbT、和9D2( —種非中和性抗人IL-21.R對照 抗體))流過芯片，并監(jiān)測它們對捕捉到的IL-21R-H/F的結(jié)合。圖11描繪所示抗體對人IL-21R-BaF3細(xì)胞和鼠IL_21R-BaF3細(xì)胞增殖的中和。 將抗體添加至細(xì)胞。隨后添加IL-21,并在48小時(shí)后用CELLTITERGLO 測量增殖。對人 IL-21R-BaF3 細(xì)胞用 l()0pg/ml 人]丄-21 (圖 Ila)、對鼠 IL-21.R-BaF3 細(xì)胞用 200pg/ral 鼠 IL-21 (圖lib)、及對人IL-2IR-TFl細(xì)胞用lOOpg/ml人IL-21 (圖lie)來進(jìn)行測定。圖12描繪對人原代B細(xì)胞的IL-21依賴性增殖的中和。與抗CD40抗體和人IL-21 一起將所示抗體添加至原代人B細(xì)胞。3天后測量3I卜胸苷摻入。圖1 描繪AbQ、AbR、 AbS、AbT、AbU、]丄-1.3三重突變體、和18A5親本抗體之間的比較；圖12b描繪AbT、AbV、AbW、 AbU、和人IgGl對照(hlgl)之間的比較。圖13描繪對人原代CD4+T細(xì)胞的IL-21依賴性增殖的中和。與人IL-21 —起將 所示抗體添加至活化的原代人CD4+T細(xì)胞,并在3天后測量3Ih胸苷摻入。圖14描繪對鼠原代CD8+T細(xì)胞的IL-21依賴性增殖的中和。與人IL-21 —起將 所示抗體添加至活化的原代鼠CD8+T細(xì)胞,并在3天后測量3H-胸苷摻入。圖15描繪由抗IL-21R抗體誘導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)的測量。通 過碘化丙啶摻入來測量經(jīng)所示抗IL-21R抗體包被的CFSE標(biāo)記的BJAB細(xì)胞的PBMC依賴性 殺傷。包括抗 CD20 抗體利妥昔單抗(RITUXAN , Genentech, Inc. , South San Francisco, CA)作為陽性對照,而且包括抗IL-13抗體作為陰性對照。圖化描繪抗IL-21R抗體的補(bǔ)體Clq結(jié)合。在ELISA板上固定化所示抗IL-21R抗體，并在與人血清一起溫育后，用雞抗人Clq和HKP偶聯(lián)的抗雞IgY抗體測量Clq結(jié)合。 包括抗CD20抗體利妥昔單抗(RITUXAN )作為陽性對照，并包括抗IL-13抗體作為陰性 對照。圖17(a-c)描繪八匕0的氨基酸序歹丨」，包括￥11和￥1域丄01 (111，112,113兒1丄2，和[3)、 和恒定區(qū)。圖18(a-c)描繪AbR的氨基酸序列，包括VH和VL域、CDR(Hl,H2,H3,Ll,L2,和L3)、 和恒定區(qū)。圖19 (a-c)描繪 AbW 的氨基酸序列，包括 V1^n Vl域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2,和 L3)、 和恒定區(qū)。圖20 (a-c)描繪 AbS 的氨基酸序列,包括 Vh 和 Vl 域、CDR (HI, H2, H3, Ll, L2,和 L3)、 和恒定區(qū)。圖 21 (a-c)描繪 AbT 的氨基酸序列，包括 V11 和 Vl 域、CDR (Hl，H2,113, Ll，L2，和 L3)、
和恒定區(qū)。圖22 (a-c)描繪 AbO 的氨基酸序列，包括 V11 和 Vl 域、CDR(HI, H2, H3, Ll, L2,和 L3)、 和恒定區(qū)。圖23 (a-c)描繪 AbP 的氨基酸序列，包括 V1^D Vl域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2,和 L3)、 和恒定區(qū)。圖24 (a-c)描繪 AbU 的氨基酸序列,包括 Vh 和 Vl 域、CDR (HI, H2, H3, Ll, L2,和 L3)、 和恒定區(qū)。圖25 (a-c)描繪 AbV 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2,113, Ll，L2，和 L3)、 和恒定區(qū)。圖26(a_g)描繪與產(chǎn)生圖5、11、12、13、和14(上文描述的)所示結(jié)果的研究類似 實(shí)施的別的研究產(chǎn)生的結(jié)果。圖27a描繪IL-21細(xì)胞因子與抗體AbT競爭對鼠IL-21R的結(jié)合。將媒介或漸增 量的IL 21與生物素化的鼠IL 21R HiS/FL.AG混合,并將混合物添加至在ELISA板上固定 化的AbT。用HRP-鏈霉親合素檢測mIL-21R捕捉,并以A450信號的降低指示mIL_21R結(jié)合 的競爭。圖27b描繪AbS與IL-21競爭對鼠IL-21R的結(jié)合。將AbS和mIL-21混合，應(yīng)用 至ELISA板中固定化的mIL-21R-Fe，并監(jiān)測AbS (實(shí)心菱形)、同種型對照抗體(空心三角 形)、或mIL-21(方形)的結(jié)合。圖觀描繪在抗IL-21R抗體AbS、AbU, AbV、或AbW或者同種型對照抗體hlgGl-TM 存在F進(jìn)入大鼠CD3T細(xì)胞的IL-21依賴性3H-胸苷摻入。圖四描繪在10 %含有家兔IL-21的條件化培養(yǎng)基缺失(圖29a)或存在(圖29b) 下AbS對由固定化抗小鼠IgG抗體呈遞的兩種家兔IL-21.R同等型-Fe任一的結(jié)合。圖30描繪用抗IL-21R抗體處理的動物中的NP特異性--抗應(yīng)答。圖30a描繪NP 特異性IgG應(yīng)答，而圖30b描繪NP特異性IgM應(yīng)答。圖30c-f描繪圖30a所示實(shí)驗(yàn)的重復(fù) 中的NP特異性IgG亞類應(yīng)答，為各動物顯示了 ELISA數(shù)據(jù)總IgG (圖30c)，IgGl (圖30d)， IgG2a (圖30e),和IgG2c (圖30f)。圖30g描繪兩個(gè)月時(shí)期里的KP特異性IgG應(yīng)答。圖 30h描繪兩個(gè)月研究期結(jié)束時(shí)在骨髓中找到的NP特異性IgG抗體分泌細(xì)胞(ASC)。圖31描繪用抗IL-21R抗體處理的MRL-Faslpir小鼠中的抗雙鏈DNA(抗dsDNA)抗體。用鹽水(對照)或所示三重突變體抗體任一處理(l()mg/kg, i.p.,每周三次)12周齡 雄性MRL-Faslpr小鼠；對鼠IL-21沒有反應(yīng)性的抗人IL-13人IgGl A234 A235 A237三重 突變體抗體(IL-13 TM)用作同種型對照。通過ELISA對兩周一次收集的血清測試抗dsDNA 的存在。圖31a顯示處理后的抗dsDNA抗體滴度。圖31b顯示采血前的抗dsDNA抗體滴 度。圖31c顯示服藥2周后的抗dsDNA抗體滴度。圖31d顯示服藥4周后的抗dsDNA抗體 滴度。圖31e顯示服藥6周后的抗dsDNA抗體滴度。圖31f顯示服藥8周后的抗dsDNA抗 體滴度。圖31g顯示服藥10周后的抗dsDNA抗體滴度。在圖31a和31c-g中，星號指示與 鹽水和IL-13對照二者相比的顯著差異(ρ < 0. 01)。在圖31b中，星號指示與其它三組相 比的顯著差異(P < 0. 01)。圖31b g中的虛線表示檢測水平。圖32描繪用抗IL-21R抗體處理的MRL-Faslpt'小鼠的腎中的IgG沉積物。用 鹽水(對照)或所示三重突變體抗體任一處理(10mg/kg, i. p.，每周三次)12周齡雄性 MRL-Faslpir小鼠；對鼠IL-21沒有反應(yīng)性的抗人IL-13人IgGl A234 A235 A237三重突變體 抗體用作同種型對照。處理10周后,處死小鼠并通過免疫細(xì)胞化學(xué)來鑒定腎中的IgG沉積 物(圖32b;腎小球以虛線圓圈標(biāo)示；IgG沉積物的例子以箭頭標(biāo)示)。對染色強(qiáng)度在1-5 的尺度—丨二打分(圖32a)。圖33描繪用抗IL-21R抗體處理的MRL-Faslpir小鼠的腎中的IgM和補(bǔ)體C3沉積 物。用鹽水(對照)或所示三重突變體抗體任一處理(l()mg/kg, i.p.,每周三次)12周齡 雄性MRL-Fasltw小鼠。處理10周后，處死小鼠并通過免疫細(xì)胞化學(xué)來鑒定腎中的IgM(圖 33a)和補(bǔ)體C3 (圖33b)。對染色強(qiáng)度在1-5的尺度上打分。圖34描繪用抗IL-21R抗體處理(10mg/kg，i. p.，每周三次)的MRL-Faslpir小鼠的 腦中的IgG、Ig:M:和補(bǔ)體C3沉積物。用鹽水(對照)或所示三重突變體抗體任一處理(IOmg/ kg, i. p.,每周三次)12周齡雄性MRL-Faslpr小鼠。處理10周后,處死小鼠并通過免疫細(xì)胞 化學(xué)來鑒定腦中的IgG(圖34a)、IgM(圖34b)、和補(bǔ)體C3(圖34c)沉積物。對染色強(qiáng)度在 1-5的尺度上打分。圖35描繪用抗IL-21R抗體處理的MRL-Faslpir小鼠的腎中的淋巴細(xì)胞浸潤物。用 鹽水(對照)或所示三重突變體抗體任--處理(10mg/kg, i. p.,每周三次)12周齡雄性 MRL-Fas11"小鼠。處理10周后，處死小鼠并對蘇木精/曙紅(H/E)染色的腎切片檢查皮 質(zhì)-間質(zhì)(腎小球的支持結(jié)構(gòu))(圖35a)、皮質(zhì)-血管周圍區(qū)域(圖35b)、和腎盂周圍區(qū)域 (輸尿管起點(diǎn)附近)(圖35c)這三個(gè)區(qū)帶中的淋巴細(xì)胞浸潤。對淋巴細(xì)胞數(shù)在1-5尺度上 打分。圖36描繪用抗IL-21R抗體處理的MRL-Faslpir小鼠的肺中的淋巴細(xì)胞浸潤物。用 鹽水(對照)或所示三重突變體抗體任一處理(10mg/kg，i. p.，每周三次)12周齡雄性 MRLHsllff小鼠。處理10周后,處死小鼠并對H/E染色的肺切片檢查淋巴細(xì)胞浸潤。對淋 巴細(xì)胞數(shù)在1-5尺度上打分。圖37a_b描繪用抗IL-21R抗體處理的MRL-Faslpir小鼠中的小鼠抗人抗體(MAHA) 應(yīng)答。用所示三重突變體抗體處理(10mg/kg，i. p.,每周三次)12周齡雄性MRL-Faslpi小 鼠。通過ELISA對兩周一次收集的血清測試能夠結(jié)合用于處理小鼠的人抗體的鼠抗體的存 在(圖37a)或能夠結(jié)合其它抗IL-21人抗體的鼠抗體的存在(圖37b)。圖37a中的星號 指示與抗IL-13處理組相比的顯著差異(ρ < 0. 05)。
圖38描繪用抗IL-21R抗體處理的MRL-Faslpir小鼠中抗dsDNA抗體的發(fā)生。圖38a 描繪用AbS處理的小鼠的抗dsDNA抗體滴度，而圖3 描繪用AbT處理的小鼠的抗dsDNA 抗體滴度。圖38c-d呈現(xiàn)用AbS和AbT處理的MRL-Faslpr小鼠中的腎病理和腎炎癥灶。圖39描繪用抗IL-21R抗體處理的小鼠或大鼠中進(jìn)入背部氣袋的細(xì)胞浸潤。圖 39a-e :在BALB/C小鼠的背部皮膚下注射3ml空氣以創(chuàng)建氣袋后3天，給袋補(bǔ)氣。2天后， i. P.注射鹽水(對照)或所示三重突變體抗體任--?？贵w注射后24小時(shí)將IOOng鼠IL-21 注射入氣袋。6小時(shí)后，用:3ml PBS清洗袋，并測定總細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖39a)、單核細(xì)胞(圖 39b)、淋巴細(xì)胞(圖39c)、和嗜中性粒細(xì)胞(圖39d)。圖39e描繪圖39a-d所示實(shí)驗(yàn)的重復(fù) 中的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖39f-j描繪用小鼠IL-21和抗IL-21R抗體處理后大鼠中進(jìn)入氣袋的 總細(xì)胞浸潤。圖39f描繪在AbS或?qū)φ湛贵w存在或缺失下施用20 μ g mIL-21 (6小時(shí))或 lug mIL-21(20小時(shí))任一后的細(xì)胞浸潤。圖39g_h描繪重復(fù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入大鼠氣袋的細(xì) 胞浸潤，其中在1、3、或10 μ g/kg AbS或?qū)φ湛贵w存在下施用20 μ g mIL-21達(dá)6小時(shí)。在 圖891所示實(shí)驗(yàn)中，將大鼠用單一的或組合的20 μ g mIL-21和lmg/kg抗體(AbS或同種型 對照任-_一 ),以及20 μ g mIL-21和lOmg/kg抗體的組合處理6小時(shí)。在圖39j中，測試與1 或 10mg/kg AbS 組合的 10、20、或 40 μ gmIL-21。圖40描繪單次靜脈內(nèi)或皮下施用后CD-I小鼠中AbS的濃度-時(shí)間曲線。低于定 量極限的濃度在計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)作為零處理。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)N = 4-8。圖41描繪單次腹膜內(nèi)施用后DBA和MRL-Faslpr小鼠中AbS的濃度-時(shí)間曲線。低 于定量極限的濃度在計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)作為零處理。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)N = 4-8。圖4 和b描繪以10、5、和2. 5mg/kg劑量、每周三次、持續(xù)10周多次i. p.施用后 MRI^Faslpr小鼠中的觀察和預(yù)測AbS濃度。低于定量極限的濃度在計(jì)算均值和SD時(shí)作為零 處理。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)N =7-8。圖43a和b描繪如所示施用后獼猴中AbS的濃度-時(shí)間曲線。低于定量極限的濃 度(< 30ng/ml)在計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)作為零處理。每個(gè)組N = 3。圖43a中的SAN指 研究動物編號。圖44描繪給小鼠單次施用后AbS和AbT的濃度-時(shí)間曲線。圖4 顯示CD-I小 鼠中10mg/kg i. v.施用后的曲線。圖44b顯示MRL-Faslpir小鼠中10mg/kg i. p.施用后的 曲線。圖44c顯示DBA小鼠中8mg/kg i. p.施用后的曲線。低于定量極限的濃度在計(jì)算均 值和標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)作為零處理。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)N = 4-8。圖45描繪以20mg/kg、每周三次、持續(xù)10周多劑i. p.施用后MRL_FaSlpi‘小鼠中的 觀察和預(yù)測AbT濃度。低于定量極限的濃度在計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)作為零處理。每個(gè)時(shí) 間點(diǎn)N = 6-8。圖46a和b描繪如所示施用后AbT和AbS在獼猴中的濃度-時(shí)間曲線。低于定量 極限的濃度(< 30ng/ml)在計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)作為零處理。每個(gè)組N = 3。圖47 描繪抗 IL-21R 抗體 AbS、AbTjtI 125I_D5 (8mg/kg，i. p.)在雄性 DBA 小鼠中 的濃度-時(shí)間曲線。通過抗人IgG ELISA來定量人抗體AbS和AbT，并通過監(jiān)測放射性標(biāo)記 物來定量125I標(biāo)記的鼠抗體D5。圖48a描繪單劑 10mg/kg i. v.后 AbS、AbT、和同種型對照在 Sprague-Dawley(S-D) 大鼠中的均值血清濃度(Y軸；ng/ml)。圖4 描繪S-D大鼠中單劑10mg/kg i. v.后的抗IL-21R抗體AbS-AbW。< L0Q(45ng/mL)的各數(shù)據(jù)點(diǎn)在計(jì)算均值和SD時(shí)作為零處理。如果 均值低于LOQ(例如當(dāng)所有動物具有< LOQ的值時(shí))，那么不顯示數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖49描繪單劑i. v.、i. p.、或s. c.后S-D大鼠中的AbS均值血清濃度(Y軸；ng/ ml) ο圖50描繪單劑2. 5mg/kg靜脈內(nèi)后125I-AbS在IL-2IR敲除和野生型C57BL/6 (對 照)小鼠中的生物分布。圖50a顯示對照C57BL/6小鼠中的組織中的125I-AbS濃度。圖50b 顯示IL-21R敲除小鼠中的125I-AbS濃度。圖50c顯示對照C57BL/6和IL-21R敲除小鼠中 的125I-AbS血清濃度。圖50d顯示對照C57BL/6和IL-21R敲除小鼠中的125I-AbS累積尿計(jì) 數(shù)。低于LOQ的濃度在計(jì)算均值和SD時(shí)作為零處理。每個(gè)血清或組織時(shí)間點(diǎn)N = 9-10 ； 每個(gè)尿時(shí)間點(diǎn)N = 5-10。圖51描繪單劑2. 5mg/kg i. ρ后125I-AbS在MRL-Faslpir小鼠中的生物分布。圖51a 顯示MRL-Faslpir小鼠中的125I-AbS組織濃度。圖5Ib顯示MRL-Faslpir小鼠中的125I-AbS尿圖52描繪單劑2. 5和10mg/kg i. p.后MRL-Faslpr小鼠中的125I-AbS血清濃度。 低于LOQ的濃度在計(jì)算均值和SD時(shí)作為零處理。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)N = 4-8。圖53a描繪人全血樣品中漸增濃度的AbS (X軸)時(shí)對IL-21誘導(dǎo)的 IL~2Ra (IIIA)、PRFU 丨丄-6、和CD19表達(dá)的百分比抑制(Y軸),自倍數(shù)變化計(jì)算得出；圖 53b描繪人全血樣品中響應(yīng)漸增的AbS濃度(X軸；Ab濃度(nM))時(shí)對IL-21誘導(dǎo)的IL-6 相對表達(dá)水平的抑制(RQ ；Y軸)。圖財(cái)描繪在用于測定的定制TLDACTaqman 低密度陣列)上包括的基因；標(biāo)示了 內(nèi)源對照。圖55展現(xiàn)不同濃度的IL-21時(shí)2、4、6、或24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)(X軸)任一時(shí)六種檢查 的基因 _9、GZMB、IFNy (IFNG)、IL-2R α (IL2RA)、IL-6、和 PRF1)的基因表達(dá)的相對定量 (RQ ；Y 軸)。圖56a展現(xiàn)與IL-21和不同濃度的AbS或IgGlTM對照任一一起溫育(X軸)后六 種檢查的基因(CD 19, GZMB, IFNy、IL_2Ra、IL-6、和PRF1)的基因表達(dá)的相對定量(RQ ；Y 軸)。圖S^3-C描繪用不同濃度的AbS或?qū)φ誌gGl TM任一處理(X軸)后對相同基因的 IL-21響應(yīng)的百分比抑制(Y軸)。圖57描繪用重組人丨丄-21離體剌激后雄性獼猴的全血中IL4R α基因表達(dá)的相 對定量(RQ)值的分布。圖57a展現(xiàn)RQ值(X軸)的柱狀圖分析(Y軸)，而圖57b展現(xiàn)經(jīng) log2換算的RQ值(X軸)的柱狀圖分析(Y軸)，它們是使用統(tǒng)計(jì)軟件包獲得的。實(shí)線表 示高斯(Gaussian)分布。虛線表示登入體內(nèi)研究的截留RQ,其是使用如下公式定義的 IogiRQag }=經(jīng)log換算的RQ值的均值-經(jīng)log換算的RQ值的Si)。圖57c比較各動物 和用IL-21和AbT (三角形)或者IL-21和對照IgG(正方形)剌激的全血等分試樣的中值 (實(shí)線)RQ值(Y軸)，與僅用IL-21刺激(圓形)比較。圖58描繪給雄性獼猴單次lOmg/kg i. v.施用抗IL-21R抗體AbS ( “A”)或 AbT ( “B”)后的血清濃度(Y軸)，AbS收集至第148天而AbT收集至第36天(X軸)。血 清濃度低于下限L0Q(30ng/mL)的數(shù)據(jù)點(diǎn)未顯示。圖59顯示給雄性獼猴單次10mg/kg i. v.施用抗IL—21R抗體AbS后抗體血清濃度(第二 Y軸)、藥效學(xué)(PD)活性(“RQ” ；第一 Y軸)、和抗產(chǎn)品抗體應(yīng)答(以“A”表示) (包括中和性抗產(chǎn)品抗體應(yīng)答(以“AN”表示))的相關(guān)性,如在劑量施用前和后各時(shí)間(X 軸；時(shí)間(天))測量的。圖59a-c分別描繪動物1-3。圖60顯示相關(guān)性，與圖59中關(guān)于AbT(單次lOmg/kg i. v.施用)的相似。圖 60a c分別描繪動物4-6的結(jié)果。圖61描繪單次i. v.施用后AbS-AbW在獼猴中的濃度-時(shí)間曲線。低于定量極 限的濃度(< 30ng/ml)在計(jì)算時(shí)作為零處理。對于AbS(實(shí)心圓圈，研究1 ；空心菱形，研 究2)、AbT (空心圓圈)、AbV(實(shí)心菱形)、和AbU (空心三角)，η = 3 ； 10mg/lig劑量。對于 AbW(孔心方框),η = 2 ； lmg/kg劑量。圖62描繪給經(jīng)破傷風(fēng)類毒素攻擊的雄性和雌性獼猴三次每周一次i. v.施用(箭 號)2 (圖 62a)或 10mg/kg(圖 62b)后 AbS 的各濃度(ng/ml)。圖63描繪i. v.施用后AbS PK參數(shù)的異計(jì)縮放(alIometrie scaling)。體重 (W)；最大跨度潛力(以年計(jì)；MLP)。圖63a呈現(xiàn)針對體重(X軸)繪圖的CLMLP(Y軸)；圖 63b呈現(xiàn)針對體重(X軸)繪圖的分布體積(Y軸)。實(shí)線表示使用來自小鼠、大鼠、和獼猴 的數(shù)據(jù)基于線性回歸擬合的曲線。虛線表示95%置信區(qū)間。圖64呈現(xiàn)i. v.施用后AbT PK參數(shù)的異計(jì)縮放。腦重(“BW”)。圖6 呈現(xiàn)針 對體重(X軸)繪圖的CL*BW (Y軸)；圖64b呈現(xiàn)針對體重(X軸)繪圖的分布體積(Y軸)。圖65(a-b)描繪NZBWF1/J小鼠中AbS對蛋白尿發(fā)生(圖65a)和抗dsDNAIgG血清 抗體滴度(圖65b)的影響。給雌性26周齡NZBWF1/.J小鼠施用400 μ g鹽水、抗艾美爾球蟲 (E. tenella)抗體、mCTLA-4Ig、hIgGTm抗體或AbS抗體任一，每周三次,持續(xù)10周。在研究 開始時(shí)及此后10周每兩周測量尿蛋白質(zhì)水平和抗dsDNA IgG血清抗體滴度。用CTLA4-Ig 處理的動物在第4-10周顯示出抗dsDNA滴度顯著降低(星號；ρ < . 05)。圖66描繪類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的半治療性CIA小鼠模型中抗IL-21R中和對疾病結(jié)局 的影響。對雌性DBA/1小鼠用牛II型膠原免疫接種和強(qiáng)化；當(dāng)研究中10%的動物展現(xiàn)出 爪腫脹時(shí),給小鼠服用(每周三次,持續(xù)30天)8rag/kg鼠IgG2a同種型對照抗體、抗小鼠 IL-21R抗體D5 (鼠IgG2a抗體)、mTNFRII_Fc (陽性對照，鼠IgG2a同種型)(圖66a)；或抗 IL-13TM抗體(人IgGl同種型對照抗體)、AbT、或AbS任一(圖66b)。各動物在研究第30 天的得分描繪于圖66c。圖67描繪在AbS存在下獼猴中針對破傷風(fēng)類毒素的遺忘性(amnestic)破傷風(fēng)特 異性IgM和IgG血清抗體應(yīng)答的形成。給9只雄性和9只雌性獼猴免疫接種破傷風(fēng)類毒素 并休息43天。43天后，將雄性和雌性猴隨機(jī)分派入三組，并用鹽水(媒介),2mg/kg AbS、 或10mg/kg AbS任一處理，每周一次,持續(xù)三周。第一劑媒介或AbS任一后24小時(shí)(箭 號)，第二次給猴免疫接種破傷風(fēng)類毒素。貫穿研究過程對猴例行采血，并檢查破傷風(fēng)特異 性IgM(圖67a)和IgG(圖67b)血清抗體滴度。發(fā)明詳述本發(fā)明的結(jié)合蛋白最初衍生自親本抗體18A5，但是在重鏈和/或輕鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3(CDR3)部分氨基酸序列方面不同于18A5。另外,本發(fā)明的結(jié)合蛋白顯示結(jié)合和中和人和 鼠IL-21R 二者方面與等同形式(例如scFv或IgG)的18A5相比改良的效力。先前沒有報(bào) 告單一結(jié)合蛋白對來自這兩個(gè)物種(人和小鼠)的IL-21R的高效力中和。具有比它們的親本抗體更大的中和效力的本發(fā)明結(jié)合蛋白可轉(zhuǎn)化為與先前記載的藥劑相比更高的功效。 另外，已經(jīng)改變了 Vtl和\框架區(qū)的氨基酸序列以匹配由人基因組序列編碼的序列，由此降 低用本發(fā)明結(jié)合蛋白處理的患者中人抗人抗體應(yīng)答的潛力。定義為了更容易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。別的定義遍及詳述和說明書中的其 它地方列出。術(shù)語“結(jié)合蛋白”如本文中使用的包括如下的任何天然發(fā)生的、重組的、合成的、 或遺傳工程的蛋白質(zhì)或其組合，其結(jié)合抗原、靶蛋白質(zhì)、或肽,或其片段。本發(fā)明的結(jié)合蛋 白可包括抗體,或衍生自至少一種抗體片段。結(jié)合蛋白可包括天然發(fā)生的蛋白質(zhì)和/或合 成工程的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的結(jié)合蛋白可結(jié)合抗原或其片段以形成復(fù)合物,并引發(fā)生物學(xué)應(yīng) 答(例如激動或拮抗特定生物學(xué)活性)。結(jié)合蛋白可包括分離的抗體片段。由抗體重和 輕鏈的可變區(qū)組成的“Fv”片段、其中輕和重鏈可變區(qū)經(jīng)肽接頭相連接的重組單鏈多肽分 子(“scFv蛋白質(zhì)”)、和由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單元。結(jié)合蛋白片段 還可包括功能性抗體片段,諸如例如Fab、Fab\F(ab' )2、Fe、Fd、Fd'、Fv、和單抗體可變域 (dAb)。結(jié)合蛋白抗原是雙鏈或單鏈，而且可包含單個(gè)結(jié)合域或多個(gè)結(jié)合域。結(jié)合蛋白還可包括結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中結(jié)合域多肽融合或以其它 方式連接至免疫球蛋白鉸鏈或絞鏈作用區(qū)多肽,后者繼而融合或以其它方式連接至包含來 自免疫球蛋白重鏈的一個(gè)或多個(gè)天然或工程化恒定區(qū)的區(qū)域,所述恒定區(qū)不同于ChI,例如 IgG和IgA的Ch2和Ch3區(qū)或者IgE的CH3和CH4區(qū)(更完整的說明參見例如Ledbetter等， 美國專利公開文本2005/0136049)。結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白可進(jìn)一步包括如下的區(qū) 域,其包括融合或以其它方式連接至絞鏈區(qū)多肽的天然或工程化免疫球蛋白重鏈Ch2恒定 區(qū)多肽(或CH3,在構(gòu)建物完全或部分衍生自IgE的情況中)和融合或以其它方式連接至 CH2恒定區(qū)多肽(或CH3，在構(gòu)建物完全或部分衍生自IgE的情況中)的天然或工程化免疫 球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽(或CH4，在構(gòu)建物完全或部分衍生自IgE的情況中)。通常，此 類結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一項(xiàng)選自下組的免疫學(xué)活性抗體依賴性細(xì)胞介 導(dǎo)的細(xì)胞毒性、補(bǔ)體結(jié)合、和/或?qū)Π形?例如靶抗原)的結(jié)合。本發(fā)明的結(jié)合蛋白可衍生 自任何物種，包括但不限于小鼠、大鼠、人、駱駝、美洲駝、魚、鯊魚、山羊、家兔、雞、和牛。術(shù)語“抗體”如本文中使用的指對指定蛋白質(zhì)或肽或其片段有反應(yīng)性的免疫球蛋 白。此類抗體包括但不限于人抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、 多克隆抗體、多特異性抗體、非特異性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、合 成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變型抗體、嫁接偶聯(lián)抗體(即偶聯(lián)或融合至其它蛋白質(zhì)、放 射性標(biāo)記物、細(xì)胞毒素的抗體)、和體外生成的抗體。抗體可來自任何類的抗體，包括但不限 于IgG、IgA、IgM、Igl)、和IgE,及來自任何亞類(例如IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗體。 抗體可具有選自例如IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4的重鏈恒定區(qū)?？贵w還可具有選自例如卡 帕(κ )或拉姆達(dá)(λ )的輕鏈。本發(fā)明的抗體可衍生自任何物種，包括但不限于小鼠、大鼠、 人、駱駝、美洲駝、魚、鯊魚、山羊、家兔、雞、和牛。抗體的恒定區(qū)可進(jìn)行改變,例如突變，以修 飾抗體的特性(例如以提高或降低下述一項(xiàng)或多項(xiàng)Fc受體結(jié)合、抗體糖基化、半胱氨酸殘 基的數(shù)目、效應(yīng)器細(xì)胞功能、或補(bǔ)體功能)。通常,抗體特異性結(jié)合預(yù)定抗原,例如與病癥有 關(guān)的抗原，病癥例如炎性的、免疫性的、自身免疫性的、神經(jīng)變性性的、代謝的、和/或惡性的病癥。術(shù)語“單域結(jié)合蛋白”如本文中使用的包括結(jié)合抗原、蛋白質(zhì)、或多肽的任何單域 結(jié)合支架。單域結(jié)合蛋白可包括如下的任何天然的、重組的、合成的、或遺傳工程的蛋白質(zhì) 支架或其組合，其結(jié)合抗原或其片段以形成復(fù)合物，并引發(fā)生物學(xué)應(yīng)答(例如激動或拮抗 特定生物學(xué)活性)。單域結(jié)合蛋白可衍生自天然發(fā)生的蛋白質(zhì)或抗體，或者它們可以合成 工程化或通過重組技術(shù)來生成。單域結(jié)合蛋白可以是任何現(xiàn)有技術(shù)的單域結(jié)合蛋白或任 何未來的單域結(jié)合蛋白，而且可衍生自任何物種，包括但不限于小鼠、人、駱駝、美洲駝、魚、 鯊魚、山羊、家兔、雞、和牛。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，單域結(jié)合蛋白支架可衍生自在魚 中找到的免疫球蛋白的可變區(qū),諸如例如衍生自在鯊魚血清中找到的稱作新型抗原受體 (NAR)的免疫球蛋白同種型的可變區(qū)。生成衍生自NAR可變區(qū)(“IgNAR”)的單域結(jié)合支架的 方法記載于國際申請公開號 No. WO 03/014161 及 Streltsov(2005)Protein Sci. 14(11) 2901-09。在其它實(shí)施方案中，單域結(jié)合蛋白是現(xiàn)有技術(shù)中描述為不含輕鏈的重鏈抗體的天 然發(fā)生的單域結(jié)合蛋白。此類單域結(jié)合蛋白披露于例如國際申請公開號WO 94/004678。出 于清楚原因，衍生自天然不含輕鏈的重鏈抗體的可變域結(jié)合蛋白在本文中稱作VHH或“納 米抗體”(nanobody)以將它與常規(guī)四鏈免疫球蛋白的Vh區(qū)分開。此類VIIH分子可衍生自在 駱駝科(Camelidae)物種中產(chǎn)生的抗體,例如在駱駝、美洲駝、單峰駝、羊駝、和原駝中。駱 駝科以外的其它科也可用于生成天然不含輕鏈的重鏈結(jié)合蛋白。VHH分子比傳統(tǒng)的IgG分 子小大約10倍。它們是單一多肽，而且非常穩(wěn)定，對極端pH和溫度條件有抗性。此外，它們 對蛋白酶的作用有抗性,常規(guī)抗體則不然。此外,體外表達(dá)VHII能生成高產(chǎn)量的、正確折疊 的功能性VHH。另外,在caraelids中生成的結(jié)合蛋白能識別經(jīng)抗體文庫或經(jīng)免疫camel ids 以外的哺乳動物在體外生成的抗體識別的表位以外的表位(參見例如國際申請公開號WO 97/049805和WO 94/004678，通過述及將二者收入本文)。術(shù)語“抗原結(jié)合域”和“抗原結(jié)合片段”指結(jié)合蛋白的一部分，其包負(fù)責(zé)含結(jié)合蛋白 和抗原之間特異性結(jié)合的氨基酸。抗原中受到結(jié)合蛋白特異性識別和結(jié)合的部分稱作“表 位”。抗原結(jié)合域可包含抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(V11)；然而,它不必包含二者。 例如，F(xiàn)d片段具有兩個(gè)Vh區(qū)，而且常常保留完整抗原結(jié)合域的抗原結(jié)合功能。結(jié)合蛋白的 抗原結(jié)合片段的例子包括但不限于(I)Fab片段,即具有VpVH、Cjn ChI域的單價(jià)片段；(2) F(ab' )2片段，即具有通過鉸鏈區(qū)處的二硫橋相連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(3)Fd 片段,其具有兩個(gè)Vh和一個(gè)ChI域；(4) Fv片段,其具有抗體單臂的\和Vh域；(5) dAb片段 (參見例如Ward等(1989) Nature 341 :544-46)，其具有Vh域；(6)分離的CDR;和(7)單鏈 可變片段(scFv)。雖然Fv片段的兩個(gè)域(即\和Vh)由分開的基因編碼，但是它們能接合 在一起,這使用重組方法,通過合成的接頭,使得它們能夠作為單一蛋白質(zhì)鏈生成,其中\(zhòng) 和Vh區(qū)配對以形成單價(jià)分子(稱作scFv)(參見例如Bird等(1988) Science 242 :423-26 ； Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-83)。這些結(jié)合域片段可使用本領(lǐng)域 技術(shù)人員知道的常規(guī)技術(shù)來獲得,而且可以以與完整結(jié)合蛋白諸如例如抗體相同的方式對 片段評估功能。術(shù)語“中和”指結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段(例如抗體)降低或阻斷信號傳導(dǎo)途徑 或抗原，例如IL-21/IL-21R信號傳導(dǎo)途徑或IL-21R抗原的活性。如本文中使用的，“抗產(chǎn)品抗體”指響應(yīng)外源蛋白質(zhì)(例如抗IL-21R抗體)而形成的抗體。如本文中使用的,“中和 性抗產(chǎn)品抗體”指阻斷外源導(dǎo)入蛋白質(zhì)(例如抗IL-21R抗體)的體內(nèi)活性的抗產(chǎn)品抗體。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，中和性抗產(chǎn)品抗體降低IL-21R抗體的體內(nèi)活性，例如IL-21R 抗體的體內(nèi)藥效(PD)活性(諸如抗IL-21R抗體調(diào)控IL-21響應(yīng)性細(xì)胞因子或基因表達(dá)的 能力)。術(shù)語“有效量”指足以調(diào)節(jié)IL-21R活性以改善或減輕臨床癥狀的嚴(yán)重程度或?qū)崿F(xiàn) 期望的生物學(xué)結(jié)果，例如降低T細(xì)胞和/或B細(xì)胞活性、遏制自身免疫、遏制移植排斥的劑
量或量。術(shù)語“人結(jié)合蛋白”包括具有基本上與本領(lǐng)域已知的人種系免疫球蛋白序列(包 括例如 Kabat 等(5th ed. 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91 3242記載的) 對應(yīng)的可變和恒定區(qū)的結(jié)合蛋白。本發(fā)明的人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列 編碼的氨基酸殘基(例如在體外通過隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或在體內(nèi)通過體細(xì)胞突變引入的突 變)，例如在CDR中，特別是在CDR3在。人抗體中可以有至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、 或更多個(gè)位置被不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基替換。短語“抑制”、“拮抗”、“阻斷”、或“中和” IL-21R活性及其類似短語指IL-21R的至 少一種活性由于結(jié)合抗IL-21R抗體而降低、抑制、或以其它方式減弱,其中降低是相對于 IL-21R在該抗體缺失下的活性。IL-21R活性可使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來測量。抑制或 拮抗不必指示完全消除IL-21R生物學(xué)活性?；钚缘慕档涂梢允羌s10%，20%，30%，40%， 50%, 60%，70%，80%，90%, 95%，或更多。術(shù)語“白介素-11受體，，或“ IL-21R”等等指結(jié)合IL-21配體的I類細(xì)胞因子 家族受體，也稱作MU-I (參見例如美國專利申請No. 09/569，384和美國申請公開文本 No. 2004/0265960 ；2006/0159655 ；2006/0024268 ；和 2008/0241098) ,NILR 或 zalphall (參 見例如國際申請公開號WO 01/085792 ；Parrish Novak等(2000)出處同上；Ozaki等 (2000)出處同上)。IL-21.R與]丄-2和IL-15受體分享的β鏈、和IL-4 α同源(Ozaki等 (2000)出處同上)。在配體結(jié)合時(shí)，IL-21R能夠與共同伽馬細(xì)胞因子受體鏈(Yc)相互作 用并誘導(dǎo)STATl和STAT3 (Asao等(2001)出處同上)或STATO (Ozaki等(2000)出處同____丨二) 磷酸化。IL-21R顯示廣泛的淋巴樣組織分布。術(shù)語“白介素-21受體”或“IL-21R”等等還 指能夠與11,21 (優(yōu)選哺乳動物起源的IL-21,例如鼠或人IL-21)相互作用且具有至少一項(xiàng) 下述特征的多肽(優(yōu)選哺乳動物起源的，例如鼠或人IL-21R)或(在上下文需要時(shí))編碼此 類多肽的多核苷酸(1)天然發(fā)生的哺乳動物IL-21R多肽的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO :2(人-對應(yīng)于 GENBANK (U. S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD)登錄號 NP—068570)或 SEQ ID NO :4 (鼠-對應(yīng)于 GENBANK 登錄號 NP—068687)所列 氨基酸序列或其片段；(2)與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所列氨基酸序列或其片段基本 ....丨二同源例如至少85%，90 %，95 %，98%，或99 %同源的氨基酸序列；(3)由天然發(fā)生的哺 乳動物IL-21R核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO :1 (人-對應(yīng)于GENBANK 登錄號 NMJ)21798)或SEQ ID NO 3 (鼠—對應(yīng)于GENBANK 登錄號NM—021887)或其片段)編碼 的氨基酸序列；(4)由與SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :3所列核苷酸序列或其片段基本上同 源例如至少肪％，90 %，95 %，98 %，或99 %同源的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(5)由與天然發(fā)生的IL-21R核苷酸序列或其片段例如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3或其片段簡并 的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或(6)在嚴(yán)格條件(例如高嚴(yán)格條件)下與前述核苷酸 序列之一雜交的核苷酸序列。另外，涵蓋在所公幵的方法中有用的其它非人和非哺乳動物 IL-21R。術(shù)語“白介素-21 ”或“ IL-21 ”指與IL-2、IL-4和IL-15顯示序列同源性 (Parrish-Novak等(2000)出處同上)且結(jié)合IL-21R的細(xì)胞因子。此類細(xì)胞因子分享共同 的折疊，折疊成該家族特征性的“四螺旋束”結(jié)構(gòu)。IL-21主要在活化的CD4+T細(xì)胞中表達(dá)，而 且據(jù)報(bào)告對NK、B和T細(xì)胞有效果(Parrish Novak等(2000)出處同上；Kasaian等(2002) 出處同上)。在I[廠21結(jié)合至IL-21R時(shí)，IL-21R的活化引起例如STAT5或STAT3信號傳導(dǎo) (Ozaki等(2000)出處同上)。術(shù)語“白介素-21”或“IL-21”還指能夠與IL-21R(優(yōu)選哺 乳動物起源的，例如鼠或人IL-21R)相互作用且具有至少一項(xiàng)F述特征的多肽(優(yōu)選哺乳 動物起源的，例如鼠或人IL-21)或(在上下文需要時(shí))編碼此類多肽的多核苷酸(1)天 然發(fā)生的哺乳動物IL-21的氨基酸序列或其片段,例如SEQ ID NO :212 (人)所列氨基酸序 列或其片段；(2)與SEQ ID NO :212所列氨基酸序列或其片段基本上同源例如至少85%, 90 %，95 %，98 %，或99 %同源的氨基酸序列；( 由天然發(fā)生的哺乳動物IL-21核苷酸序列 或其片段(例如SEQ ID N0:211(人)或其片段)編碼的氨基酸序列；(4)由與SEQ ID NO 211所列核苷酸序列或其片段基本上同源例如至少8590%,95%,98%, ^ 99%同源的 核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(5)由與天然發(fā)生的IL-21核苷酸序列或其片段簡并的核 苷酸序列編碼的氨基酸序列；或(6)在嚴(yán)格條件(例如高嚴(yán)格條件)下與前述核苷酸序列 之一雜交的核苷酸序列。術(shù)語“ IL-21R活性”等等(例如“ IL-21R的活性，，、“ IL-21/1L-21R活性”)指因 IL-21R結(jié)合而發(fā)起或中斷的至少一種細(xì)胞過程。IL-21R活性包括但不限于(1)與配體 (例如IL-21多肽)相互作用(例如結(jié)合)；(2)聯(lián)合或活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(也稱作“信號傳導(dǎo)”， 指響應(yīng)特定刺激發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)級聯(lián))和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(例如伽馬鏈(Y c)和JAK1)，和/或 刺激STAT蛋白質(zhì)(例如STAT5和/或STAT3)的磷酸化和/或活化；(3)調(diào)控免疫細(xì)胞(例 如T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和巨核細(xì)胞)的增殖、分化、效 應(yīng)器細(xì)胞功能、細(xì)胞溶解活性、細(xì)胞因子分泌、和/或存活；及(4)調(diào)控IL-21響應(yīng)性基因 或細(xì)胞因子的表達(dá),例如調(diào)控IL-21對例如TNF，IFN y , IL-6，IL-8，IL-10’ CD19, STAT3, ICAM-1, TBX21, CSFl, GZMB, PRFl, IL-2Ra，IL-21R,等的表達(dá)水平的影響。如本文中使用的,“體外生成的抗體”指如下的抗體,其中整個(gè)或部分可變區(qū)(例如 至少一個(gè)CDR)是在非免疫細(xì)胞選擇(例如體外噬菌體展示、蛋白質(zhì)芯片、或能對候選序列 測試它們結(jié)合抗原的能力的任何其它方法)中生成的。術(shù)語“分離的”指基本上不含其天然環(huán)境的分子。例如,分離的蛋白質(zhì)基本上不含 細(xì)胞材料或來自衍生它的細(xì)胞或組織來源的其它蛋白質(zhì)。該術(shù)語還指如下的制備物，其中 分離的蛋白質(zhì)對于藥物組合物是足夠純的，或者至少70-80% (w/w)純的、至少80-90% (w/ w)純的、至少 90-95% (w/w)純的、或至少 95%，96%，97%,98%，99%,或 100% (w/w)純 的。短語“百分比相同，，或“百分比同注”指至少兩種不同序列之間的相似性。此百 分比同一性可通過標(biāo)準(zhǔn)算法來確定，例如Altshul等((1990)1. Mol. BioL 215 :403-10)記載的基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST) ；Needleman 等((1970) J. Mol. Biol. 48 :444-53)的算法；或 Meyers 等((1988) Comput. App 1. Biosci. 4 11-17)的算法。一組參數(shù)可以是Blosum 62評分矩陣及缺口罰分12、缺口延伸罰分4、 和移碼缺口罰分5。兩種氨基酸或核苷酸序列之間的百分比同一性還可以使用Meyers和 Mi Iler ((1989) CABIOS 4 :11-17)的算法來確定,該算法已經(jīng)摻入ALIGN程序(2. O版)，使 用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分12、和缺口罰分4。百分比同一注通常通過比較相似 長度的序列來計(jì)算。術(shù)語“全集(repertoire) ”指完全或部分地自編碼至少一種免疫球蛋白的至少一 種序列衍生的至少一種核苷酸序列?？梢酝ㄟ^在體內(nèi)重排重鏈的V、D、和J區(qū)段及輕鏈的V 和J區(qū)段來生成序列?；蛘?可以自響應(yīng)例如體外剌激而發(fā)生重排的細(xì)胞生成序列。或者， 可以通過DNA剪接、核苷酸合成、誘變、或其它方法來獲得部分或整個(gè)/所有序列(參見例 如美國專利No. 5，565，332)。全集可以只包括一種序列，或者可以包括多種序列，包括遺傳 上多樣的集合中的多種序列。術(shù)語“特異性結(jié)合”等等指兩個(gè)分子形成在生理?xiàng)l件下相對穩(wěn)定的復(fù)合物。特異 性結(jié)合以高的親和力和低至中的能力來表征，與通常具有低的親和力和中至高的能力的非 特異性結(jié)合區(qū)分開。通常，當(dāng)結(jié)合常數(shù)Ka高于約IO6M V1時(shí)，認(rèn)為結(jié)合是特異性的。如果 必要,通過改變結(jié)合條件，能降低非特異性結(jié)合且基本上不影響特異性結(jié)合。熟練技術(shù)人員 能使用常規(guī)技術(shù)來改進(jìn)適宜的結(jié)合條件，諸如結(jié)合蛋白的濃度、溶液的離子強(qiáng)度、溫度、容 許結(jié)合進(jìn)行的時(shí)間、封閉劑(例如血清清蛋白或乳酪蛋白)的濃度、等。本文中列出了例示 性的條件,但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的其它條件落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中使用的,術(shù)語“嚴(yán)格”、“嚴(yán)格性”、等等描述用于雜交和清洗的條件。本發(fā) 明的分離的多核苷酸可用作雜交探針和引物來鑒定和分離具有如下序列的核酸，該序列與 編碼所公開的多核苷酸的序列相同或相似。因此，以此方式分離得到的多核苷酸可用于生 成針對IL-21R的結(jié)合蛋白或鑒定表達(dá)此類結(jié)合蛋白的細(xì)胞。用于鑒定和分離核酸的雜交 方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Southern雜交、原位雜交和Northern雜交,而且是本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的?？梢栽诰哂胁煌瑖?yán)格性的條件F實(shí)施雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性包括任意兩個(gè) 核酸分子會彼此雜交的難度和它們會保持雜交的條件。優(yōu)選的是,在低嚴(yán)格性條件、更優(yōu)選 嚴(yán)格條件、和最優(yōu)選高嚴(yán)格條件下,每個(gè)雜交的多核苷酸雜交至其對應(yīng)多核苷酸。嚴(yán)格條件 是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，而且可見于例如Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989)6. 3. 1-6.3.6。含水的和不含水的方法均在此文獻(xiàn)中有記 載,而且均可使用。嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)例子是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約45°C 雜交,接著在0.2X SSC/0. 1%SDS中于50°C清洗至少一次。嚴(yán)格雜交條件還可用在例如 0. 2X SSC/0. 1% SDS中于55°C、60°C、或65°C清洗來實(shí)現(xiàn)。高嚴(yán)格條件包括例如在0. 5M磷 酸鈉n% SDS中于65°C雜交，接著在0. 2X SSC/1% SDS中于65°C清洗至少一次。嚴(yán)格條 件的其它例子顯示于下文表1 高嚴(yán)格條件指至少像例如條件A-F那樣嚴(yán)格的條件；嚴(yán)格條 件指至少像例如條件G L那樣嚴(yán)格的條件；而低嚴(yán)格條件指至少像例如條件M-R那樣嚴(yán)格 的條件。表1:雜交條件
權(quán)利要求
1.一種在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法，包括以足以抑制或降低受 試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合 片段，由此治療或預(yù)防所述病癥,其中該結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含至少--種與選自 下組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO :14，16，18，20，22，24，26， 28, 30, 32，34, 36, 38, 40, 42，44, 46, 48, 50, 52，54, 56, 58,60, 62，64, 66, 68，70, 72，74, 76, 78, 80,82, 84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104，106,108,110,112,114,116，118，120, 122’ 124，126’ 128，130’ 132，134’ 136，138’ 140，142’ 144，146’ 148，150，152，154，156，158， 160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。
2.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段,其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段是抗
3.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段,其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段是ScFv0
4.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段，其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段是VH。
5.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段，其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段是丨。
6.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段,其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段是CDR。
7.一種在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法，包括以足以抑制或降低受試 者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片 段，由此治療或預(yù)防所述病癥,其中該結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含至少一種由與選自 下組的核苷酸序列至少約95%相同的核苷酸序列編碼的氨基酸序列=SEQ ID NO 13,15, 17，19，21，23, 25，27，29, 31，33，35，37，39, 41，43，45，47，49, 51，53，55，57，59, 61，63，65， 67，69, 71, 73，75，77，79, 81, 83，85，87，89, 91, 93，95，97, 99,101，103，105，107，109，111， 113,115，117,119，121,123，125,127，129,131，133,135，137,139，141,143，145,147，149, 151，153’155’157’159’161,239,241,243,245,和 247。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種選自下組的氨 基酸序列:SEQ ID NO :14,16,18，20，22，24, 26，沘，30，32, 34，36，38，40，42，44,46，48，50， 52，54, 56, 58,60, 62,64, 66，68，70, 72, 74, 76, 78, 80，82，84,86, 88,90, 92,94, 96，98，100, 102，104，106，108，110，112，114,116，118，120’ 122，124’ 126，128’ 130，132’ 134,136’ 138， 140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165—168，171—193，213—229，240，
9. 一種在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法，包括以足以抑制或降低受 試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合 片段，由此治療或預(yù)防所述病癥，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含至少一種與選 自下組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO :6，8，10，12,14，16，18， 20, 22, 24，26, 28, 30, 32, 34，36, 38, 40,42, 44，46, 48, 50，52, 54，56, 58, 60，62, 64，66, 68, 70，72，74，76，78，80，82,84,86，88，90，92，94，96，98,100，102，104，106，108，110’ 112’ 114, 116，118，120，122，124,126，128，130，132，134，136，138，140，142,144,146,148，150，152， 154，156，158，160，162-195，213-229，240，242，244，246，和 248，且其中，如果該結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種與選自下組的序列至少約95% 相同的氨基酸序列SEQ ID NO 6,8,10,12，163，164，169，170，194，和195,那么該結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段必須還包含至少一種與選自下組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基 酸序列:SEQ ID NO :14,16，18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52, 54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102， 104，106，108，110,112，114,116，118,120，122,124，126,128，130,132，134,136，138,140， 142,144,146,148,150,152,154,156,158,160,162,165-168,171-193,213-229,240,242， 244，246，和 248。
10.一種在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法，包括以足以抑制或降低受 試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合人IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片 段，由此治療或預(yù)防所述病癥，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含至少一種由與選 自下組的核苷酸序列至少約95%相同的核苷酸序列編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 5,7, 9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59， 61,63, 65，67，69，71，73，75，77, 79, 81，83，85，87，89，91,93, 95，97，99，101,103，105,107， 109, 111, 113,115,117,119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145, 147，149，151，153，155，157，159，161, 239, 241, 243, 245,和 247，且其中，如果該結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種由與選自下組的序列至少約95% 相同的核苷酸序列編碼的氨基酸序列SEQ ID N0:5，7,9，和11，那么該結(jié)合蛋白或抗原 結(jié)合片段必須還包含至少一種由與選自下組的核苷酸序列至少約95%相同的核苷酸序列 編碼的氨基酸序列=SEQ ID NO :13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43, 45，47, 49，51，53, 55，57, 59，61，63, 65，67，69，71，73, 75，77，79，81，83, 85，87，89，91，93， 95，97,99,101,103，105，107，109，111，113,115，117，119，121,123,125,127,129，131，133， 135,137,139,141,143,145,147,149,151,153，155,157,159,161,239,241,243,245,和 247。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種選自下組的 氨基酸序列:SEQ ID NO 6,8,10，12’ 14,16，18，20,22,24, 26，28,30,32, 34，36, 38,40,42， 44, 46，48, 50, 52，54, 56，58, 60, 62，64, 66, 68, 70, 72，74, 76, 78, 80, 82，84,86, 88, 90, 92， 94,96,98,100’ 102，104,106，108，110，112’ 114，116，118，120，122，124’ 126’ 128，130，132， 134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162-195，213-229，240， 242，244，246，和 248，其中，如果該結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含至少一種與選自下組的序列至少約95% 相同的氨基酸序列=SEQ ID NO 6,8,10，12,163,164,169,170,194,和195,那么該結(jié)合蛋 白或抗原結(jié)合片段必須還包含至少一種與選自下組的氨基酸序列至少約95%相同的氨基 酸序列:SEQ ID NO :14,16，18，20，22, 24，26，28，30, 32，；34，36，38,40，42，44，46,48，50，52， 54，56, 58,60,62,64,66，68，70, 72, 74, 76, 78, 80,82，84，86,88,90,92,94,96,98，100,102, 104’ 106，108’ 110，112’ 114，116’ 118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140， 142，144,146，148,150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242， 244，246，和 248。
12.一種在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法,包括對受試者施用特異性結(jié) 合IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段,其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含輕鏈 和重鏈，且其中該重鏈包含至少一種選自F組的氨基酸序列=SEQ ID NO =14,16,18,20,68,·70,72，88,90,92,94，213，218，219，240，和 242。
13.一種在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法,包括對受試者施用特異性結(jié) 合IL-21R的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含輕鏈 和重鏈，且其中該輕鏈包含至少一種選自下組的氨基酸序列=SEQ ID NO =22,24,26,28,30, 32, 34, 36，38, 40，42, 44, 46，48, 50, 52, 54, 56，58, 60, 62, 64, 66，74, 76, 78, 80, 82，84, 86, 96,98,100，102，104，106，108，214-217，220-229，244，246，和 248。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含\域和Vh域，且其中 該Vh域包含至少一種選自下組的序列=SEQ ID NO 14,16，18，和20。
15.權(quán)利要求13的方法,其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段包含Nl域和Vh域,且其中 該 Vl 域包含至少一種選自下組的序列:SEQ ID NO :22，24, 26，28，30，32, 34，36，38，40,42， 44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，215，217，221，223，225，227，和 229。
16.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述重鏈包含選自下組的氨基酸序列SEQID NO 88,90,92,94，213，218，219，240，和242,且所述輕鏈包含選自下組的氨基酸序列=SEQ ID NO =96,98,100，102，104，106，108，214，216，220，222，224，226，228，244,246，和 248。
17.一種在受試者中治療或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥的方法，包括以足以抑制或降低 受試者中免疫細(xì)胞活性的量對受試者施用特異性結(jié)合受選自下組的結(jié)合蛋白識別的人 IL-21R表位的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段=AbA-AbW, H 3-H6, Li-L6，L8-L21,和L23-L25, 其中所述結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合片段競爭性抑制選自下組的結(jié)合蛋白對人IL-21R的結(jié)合 AbA-Abff, H3-H6, L1-L6，L8-L21，和L23-L25，由此治療或預(yù)防所述病癥。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含重鏈、輕鏈、或 Fv片段，其包含選自下組的氨基酸序列=SEQ ID NO 14,16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36，38，40，42，44, 46，48，50，52，54, 56，58，60，62，64, 66，68，70, 72，74, 76，78，80, 82， 84,86,88,90,92,94,96,98,100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124， 126，128，130，132,134，136,138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162， 165-168,17卜193, 213-229, 240, 242, 244, 246,和 248。
19.權(quán)利要求17的方法,其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段包含重鏈、輕鏈、或Fv片 段，其包含選自下組的氨基酸序列=SEQ ID NO :13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35， 87,89,91,93,95,97,99,101,103,105,107，109,111,113,115,117,119，121,123,125,127, 129，131，133，135，137，139，141,143,145，147,149，151，153，155，157，159，161,239,241, 243，245，和 247。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述結(jié)合蛋白特異性結(jié)合受AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、 AbU, AbVdfl /或AbW識別的IL-21R表位,且其中所述結(jié)合蛋白競爭性抑制AbO, AbP、AbQ、 AbR、AbS、AbT、AbU, AbV、和 /'或 Abff 對人 IL-21R 的結(jié)合。
21.權(quán)利要求1,9,12，13，和17任一項(xiàng)的方法，其中所述IL-21R相關(guān)病癥選自下組自 身免疫性病癥、炎性狀況、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥、和血液高增殖性病癥。
22.權(quán)利要求21的方法,其中所述IL-21R相關(guān)病癥選自下組多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅 斑狼瘡、銀屑病、移植排斥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和其它關(guān)節(jié)炎病癥。
23.權(quán)利要求1，9，12，13，和17任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段對人IL-21R的結(jié)合常數(shù)為至少約IO5MW
24.權(quán)利要求1,9,12,13,和17任一項(xiàng)的方法,其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段以 約1. 75nM或更少的IC5ci抑制IL-21介導(dǎo)的BAF3細(xì)胞增殖，且其中所述BAF3細(xì)胞包含人 IL-21受體。
25.權(quán)利要求1，9，12,13，和1.7任一項(xiàng)的方法,其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段以 約14. OnM或更少的IC5。抑制IL-21介導(dǎo)的Τ 1細(xì)胞增殖,且其中所述Τ 1細(xì)胞包含人IL-21 受體。
26.權(quán)利要求1，9，12，13，和17任一項(xiàng)的方法,其中所述結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段 以約1. 9nM或更少的IC5ci抑制IL-21介導(dǎo)的原代人B細(xì)胞增殖,且其中所述B細(xì)胞包含人 IL-21R。
27.權(quán)利要求1，9，12，13，和17任一項(xiàng)的結(jié)合蛋白或其抗原結(jié)合片段，其中所述結(jié)合蛋 白或抗原結(jié)合片段以約1. SnM或更少的IC5tl抑制IL-21介導(dǎo)的原代人CD4+細(xì)胞增殖，且其 中所述CIM+細(xì)胞包含人IL-21R。
28.一種確定抗IL-21R抗體是否是治療性抗IL-21R抗體的方法,包括下述步驟(a)使來自受試者的第一血液樣品與IL-21配體接觸；(b)測定與IL—21配體接觸的第一血液樣品中至少一種IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水(c)在抗IL-21R抗體存在下使來自該受試者的第二血液樣品與IL-21配體接觸；(d)測定在該抗IL-21R抗體存在下與IL-21配體接觸的第二血液樣品中至少一種 IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平；并(e)比較步驟(b)和⑷中測定的至少一種IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平，其中至少--種IL-21響應(yīng)性基因表達(dá)水平的變化指示該抗IL-21R抗體是治療性抗體。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因選自F組TNF，IFNγ , IL-6，IL-8，IL-10，CD19, STAT3, TBX21，CSF1, GZMB, PRFl, IL-2Ra，和 IL-21R。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因是ILIRa。
31.一種測定抗IL-21R抗體的藥效活性的方法,包括檢測受試者的血液樣品中至少一 種IL-21響應(yīng)性基因表達(dá)水平的調(diào)控。
32.權(quán)利要求31的方法，其中檢測至少一種IL-21響應(yīng)性基因表達(dá)水平的調(diào)控包括下 述步驟(a)對受試者施用抗IL-21R抗體,其中所述受試者用所述抗IL-21R抗體處理；(b)使來自用所述抗IL-21R抗體處理的所述受試者的血液樣品與IL-21配體接觸；(c)測定來自用所述抗IL-21R抗體處理的所述受試者，并與所述IL-21配體接觸的所 述血液樣品中至少一種IL 21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平；并(d)比較步驟(c)中測定的至少一種IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平與與IL-21配體接 觸的另一種血液樣品中至少一種IL-21響應(yīng)性基因的表達(dá)水平，其中所述另一種血液樣品 來自未用所述抗IL-21R抗體處理的受試者。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因選自下組:TNF,IFNy , IL-6, IL-8, IL-10, CD19, STAT3, TBX21, CSFl，GZMB，PRFl，IL_2Ra ’禾口 IL-21R。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因選自F組⑶19，GZMB,
35.權(quán)利要求34的方法,其中所述至少一種IL-21響應(yīng)性基因是IL-2Ra。
全文摘要
本發(fā)明提供特異性結(jié)合人白介素-21受體(IL-21R)的結(jié)合蛋白及其抗原結(jié)合片段，包括人抗體，及使用它們的方法。該結(jié)合蛋白能起例如IL-21R活性拮抗劑的作用，由此調(diào)控一般而言的免疫應(yīng)答，及具體而言的由IL-21R介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。所公開的組合物和方法可以例如在診斷、治療、和/或預(yù)防IL-21R相關(guān)病癥例如炎性病癥、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥、和其它免疫系統(tǒng)病癥中使用。
文檔編號C07K14/715GK102149403SQ200980128941
公開日2011年8月10日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者卡麗莎·K·阿德金斯, 埃米·A·韋弗, 尤利亞·武格梅斯特, 希思·M·瓜伊, 德博拉·A·揚(yáng), 萊爾德·布盧姆, 薩達(dá)納·賈因, 達(dá)文德·吉爾, 馬亞·阿萊, 馬戈·奧圖爾 申請人:惠氏有限責(zé)任公司