專利名稱：：回收Cohn氏組分Ⅳ沉淀中白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血制品的分離方法，具體是采用低溫乙醇法從Cohn氏組分IV沉淀中分離回收白蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：低溫乙醇工藝分離血漿蛋白，自20世紀(jì)40年代創(chuàng)建以來，至今已有60年的歷史。Cohn教授及其領(lǐng)導(dǎo)的開發(fā)團(tuán)隊所創(chuàng)立的Cohn6法已成為白蛋白分離的經(jīng)典方法，是國際上通用的血漿白蛋白分離工藝的基礎(chǔ)。隨后所使用的各種白蛋白分離方法依舊以Cohn6法中的pH值、溫度、乙醇濃度、離子強(qiáng)度和蛋白濃度5項參數(shù)為依據(jù)，通過不同的參數(shù)組合，可進(jìn)行其它多種蛋白制品的分離。Cohn氏組分IV沉淀中殘留有少量白蛋白。從人血組分IV沉淀中分離白蛋白的方法基本使用低溫乙醇法和熱乙醇法。低溫乙醇法是在低溫下，以乙醇作為溶劑，利用白蛋白與其它雜蛋白結(jié)晶條件的不同而將白蛋白與其它雜蛋白分離?！吨袊帢I(yè)》2003年第12巻第04期《從Cohn氏組分IV沉淀中回收白蛋白的低溫工藝》，在低溫乙醇法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，控制溫度、乙醇濃度、酸堿度，提取組分IV沉淀中殘留的白蛋白，每千克組分IV沉淀可回收白蛋白50g左右。熱乙醇法是將組分IV沉淀配制成蛋白液，加熱使蛋白液中的雜蛋白變性固化，再通過加壓過濾使固液分離，將濾液超濾濃縮得到白蛋白粗制品，如CN1660898A、CN1660903A公開的方法，但回收率也不高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提供一種從Cohn氏組分IV沉淀中回收白蛋白的方法，該方法是在低溫乙醇法的基礎(chǔ)上，選擇適當(dāng)?shù)臏囟?、乙醇濃度、酸堿度的參數(shù)組合，使白蛋白與其它蛋白分離，大大提高白蛋白回收率。本發(fā)明方法包括以下步驟A.取組分IV沉淀，加入組分IV沉淀重量的8士0.5倍的02t:，重量濃度0.75±0.03%的NaCl溶液，攪拌溶解后，用醋酸/醋酸鈉緩沖液和/或NaHC03水溶液調(diào)整pH值至6.90±0.10，攪拌5-7小時成為反應(yīng)液；B.用醋酸/醋酸鈉緩沖液調(diào)整反應(yīng)液pH值至5.70±0.05，降溫至_0.5±0.5°C，噴霧加入體積濃度大于60%的乙醇，反應(yīng)液逐漸降低溫度至-4.5±0.5°C，乙醇加入量為反應(yīng)液中乙醇的體積濃度達(dá)到40%，乙醇加完后，將反應(yīng)液pH值調(diào)整在5.85-5.90，繼續(xù)攪拌13小時，靜置8小時以上，然后將反應(yīng)液離心過濾，取濾液；C.濾液用含0.4±0.lmol/L醋酸和體積濃度40±1.0%乙醇的醋酸-乙醇混合溶液調(diào)節(jié)至pH值為4.70±0.IO，攪拌13小時，在-9.0±1.(TC靜置8小時以上，過濾，收集沉淀物即粗制白蛋白；D.將粗制白蛋白純化、濃縮、巴氏病毒滅活，可配制成注射用人血白蛋白。3在步驟A中，NaCl溶液最好分兩次加入，第一次加入組分IV沉淀重量的24倍，反應(yīng)液攪拌成糊狀，再補(bǔ)加剩余的NaCl溶液。噴霧加入的乙醇體積濃度優(yōu)選為7595%。本發(fā)明方法通過選擇pH值、乙醇濃度、酸堿度和溫度，使組分IV沉淀中的白蛋白與其它蛋白充分分離，每公斤組分IV沉淀可制得白蛋白110120克，使血漿中白蛋白的總提取率提高到93%以上。具體實施例方式—、組分IV沉淀的解凍及溶解從-3(TC以下冷庫中取出組分IV沉淀，稱重后置于潔凈的不銹鋼反應(yīng)罐中，向反應(yīng)罐中泵入組分IV重量的3倍的02°C，0.75wt%的NaCl溶液，攪拌溶解，反應(yīng)液成為糊狀。完全溶解后，將反應(yīng)液pH值調(diào)至6.90±0.10，并在該pH條件下攪拌57小時，攪拌速度為14001500rpm。再補(bǔ)加組分IV重量的5倍的0-2°C，0.75wt^的NaCl溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?。二、沉淀分離其它蛋白向反應(yīng)液中噴霧加入pH值4.0的醋酸/醋酸鈉緩沖液，加入速度150200m1/min，將反應(yīng)液pH值調(diào)至5.70±0.05，將反應(yīng)液溫度降至-0.5±0.5°C。噴霧加入95%(v/v)乙醇，反應(yīng)液逐漸降溫至-4.5±0.5°C，乙醇加入量為反應(yīng)液中乙醇的體積濃度為40%。乙醇加完后，繼續(xù)攪拌15分鐘，取樣測定pH值應(yīng)為5.85-5.90，若不在此范圍，用0.5mol/L的NaOH溶液或pH值4.0的醋酸/醋酸鈉緩沖液矯正，繼續(xù)在_4.5±0.5"C攪拌1.5小時，靜置8小時以上。將反應(yīng)液離心過濾，取濾液。三、白蛋白的沉淀濾液用50%(v/v)乙醇調(diào)至乙醇濃度40%(v/v)，繼續(xù)攪拌15分鐘，復(fù)測pH值，用0.5mol/LNaOH溶液或pH值4.0醋酸/醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值為4.70±0.10，再攪拌1.5小時，在-9.0±1.(TC靜置8小時以上。將反應(yīng)液離心過濾，收集沉淀物即為粗制白蛋白。粗制白蛋白及時用02t:注射用水溶解，貯存于-3(rC以下的冷庫。四、粗制白蛋白的純化粗制白蛋白合批后，按粗制白蛋白重量68倍加入02t:的注射用水，于不銹鋼反應(yīng)罐中溶解，溶解溫度控制在02t:之間。充分溶解后，補(bǔ)加0-2t:的注射用水至粗制白蛋白重量的911倍。啟動攪拌裝置，攪拌速度控制在75105轉(zhuǎn)/秒，調(diào)節(jié)pH值至4.60士0.10，噴霧加入-15°〇的65%(v/v)的乙醇，直至溶液中乙醇濃度至12士0.20%(v/v)，乙醇的加入速度開始為500ml/min，溶液中乙醇濃度達(dá)到5X(v/v)時，乙醇的加入速度為1000ml/min，溶液中乙醇濃度達(dá)到10%(v/v)時，乙醇的加入速度為1500ml/min。乙醇加完后，繼續(xù)攪拌1小時，按溶液重量的0.5%加入預(yù)處理好的硅藻土，保持溶液溫度在_2.5±0.5"，靜置8小時以上。用經(jīng)預(yù)處理好的400X400板框濾器進(jìn)行深層過濾，開始濾出的液體返回到原來待深深層過濾的反應(yīng)罐中，待濾出的液體澄清無乳光后開始收集，將澄清的濾液轉(zhuǎn)移至另一個潔凈的反應(yīng)罐內(nèi)。攪拌濾液，以平均《500ml/min的速度向濾液噴霧加入lmol/L的NaHC03溶液，直至濾液pH值為5.10±0.05。濾液降溫至-3.5±0.5°〇，加入95%乙醇(v/v)，將濾液中乙醇濃度調(diào)整至40%(v/v)，加入乙醇過程同時降溫至-9.0±1.(TC，在-9.0±1.(TC下繼續(xù)攪拌1.5小時，靜置8小時以上。離心過濾，控制離心速度5055L/臺/小時，離心出液溫度-7.5士1.(TC。過濾完畢，收集沉淀物即精制白蛋白。精制白蛋白用02t:注射用水溶解，加入0.5%硅藻土于溶液中，攪拌30分鐘，用經(jīng)預(yù)處理好的400X400板框濾器進(jìn)行深層過濾。調(diào)整濾液pH值至7.25±0.05。將上述濾液進(jìn)行兩次濃縮，第一次濃縮至白蛋白含量為105g/L，用注射用水透析至殘余乙醇<0.025%(v/v)，再進(jìn)行第二次濃縮至白蛋白含量至210g/L。濃縮后的溶液配制成辛酸鈉含量為0.165mmol/gPr，蛋白質(zhì)含量為195g/L，Na+含量為150,1/L，pH值6.80±0.20的半成品。半成品進(jìn)行60.0±0.5°C，10小時的巴氏病毒滅活成為注射用人血白蛋白。下表列舉采用上述方法生產(chǎn)的3批產(chǎn)品技術(shù)參數(shù)。生產(chǎn)批號123組分IV沉淀中總蛋白量(克)4501.84788.04398.3取樣分析計算的組分IV沉淀中白蛋白總量(克)801.32799.60818.08分離得到的粗制白蛋白重量(克)617.29626.59626.04粗制白蛋白純度(％)94.794.094.0粗制白蛋白分離收率(粗制白蛋白重量/取樣分析計算的組分iv沉淀中白蛋白總量X100%)77.0378.3676.53純化后的精制白蛋白重量(克)507.33517.58536.27精制白蛋白純度(％)98.798.498.5精制白蛋白回收率(精制白蛋白重量/取樣分析計算的組分iv沉淀中白蛋白總量X100%)63.3164.7365.555<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求回收Cohn氏組分IV沉淀中白蛋白的方法，其特征在于，依次包括以下步驟A.取組分IV沉淀，加入組分IV沉淀重量的8±0.5倍的0-2℃，重量濃度0.75±0.03％的NaCl溶液，攪拌溶解后，用醋酸/醋酸鈉緩沖液和/或NaHCO3水溶液調(diào)整pH值至6.90±0.10，攪拌5-7小時；B.用醋酸/醋酸鈉緩沖液調(diào)整反應(yīng)液pH值至5.70±0.05，降溫至-0.5±0.5℃，噴霧加入體積濃度大于60％的乙醇，反應(yīng)液逐漸降低溫度至-4.5±0.5℃，乙醇加入量為反應(yīng)液中乙醇的體積濃度為40％，乙醇加完后，將反應(yīng)液pH值調(diào)整在5.85-5.90，繼續(xù)攪拌1～3小時，靜置8小時以上，然后將反應(yīng)液離心過濾，取濾液；C.濾液用含0.4±0.1mol/L醋酸和體積濃度40±1.0％乙醇的溶液調(diào)節(jié)至pH值為4.70±0.10，攪拌1～3小時，在-9.0±1.0℃靜置8小時以上，過濾，收集沉淀物即粗制白蛋白；D.將粗制白蛋白純化、濃縮、巴氏病毒滅活、并配制成注射用人血白蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，在步驟A中，NaCl溶液分兩次加入，第一次加入組分IV沉淀重量的24倍，反應(yīng)液攪拌成糊狀，再補(bǔ)加剩余的NaCl溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，在步驟B中，噴霧加入的乙醇體積濃度為7595%。全文摘要本發(fā)明公開一種從Cohn氏組分IV沉淀中回收白蛋白的方法，通過選擇pH值、乙醇濃度、酸堿度和溫度，使組分IV沉淀中的白蛋白與其它蛋白充分分離，每公斤組分IV沉淀可制得白蛋白110～120克，使血漿中白蛋白的總提取率提高到93％以上。文檔編號C07K1/14GK101792490SQ20101010181公開日2010年8月4日申請日期2010年1月19日優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日發(fā)明者汪偉軍,王文杰,陳成坤,黃國華,黃育升,黃進(jìn)義,黃邦春,黃錦程申請人:廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司