專利名稱：：曲札茋苷在制備防治心腦缺血疾病制劑中的應用及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及植物活性成分曲札芪苷在制備防治心腦缺血制劑中的用途及曲札芪苷、曲札芪苷提取物的一種制備方法。所述曲札芪苷為化合物(E)-l-(3，5-二羥苯基)-2-(3-羥基-4-0-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，其制備方法是從拉薩大黃的根和/或根莖中提取，通過純化步驟制備。
背景技術：
：曲札芪苷為化合物(E)-l_(3，5-二羥苯基)-2-(3-羥基-4_0-|3_D_吡喃葡萄糖苯基)乙烯，或稱為3，5，3'，4'-四羥基芪_3'-O-P-葡萄糖苷，因其植物來源拉薩大黃根莖在藏藥材中又名曲札(羅達尚主編。新修晶珠本草，四川科學技術出版社，2004)，故稱該化合物為曲札芪苷。芪類物質是一類由二苯乙烯(圖1)作為母體結構的衍生物，并由Gorham(GorhamJ.ProgressinPhytochemistry，PergamonPress:0xford，1980，Vol.6，pp.203-252)于1980年正式命名為芪(Stilbenoids)。芪類物質作為植物防御素多存在種子植物中，隨著研究的深入，其化學、生物學多樣性和不斷新發(fā)現的生物活性受到了人們的重視。芪的母體結構式如下90年代以后，以白藜戸醇(Resveratrol)為代表的天然芪類成分的藥理活性研究受到廣泛關注。國際上對如白藜戸醇、紫檀芪(Pterostilbene)等芪的藥理作用研究主要集中于抗氧化、抗腫瘤以及植物雌激素活性等方面。國內在芪苷類成分如虎杖苷(Polydatin，piceid)、大黃降月旨素(Rhapontin，rhaponticin，土大黃苷)、二苯乙烯苷的降血脂、降血糖以及心腦血管活性方面進行一系列研究。芪及芪苷類物質在多方面凸顯出的潛在應用價值受到越來越多的關注。如中國專利申請99806755.5及02806583.2均公開了含有芪類化合物的復合抗癌劑，中國專利申請99122378.0公開了波葉組大黃所含芪苷化合物的降糖活性；中國專利申請01118193.5公開了波葉組大黃所含芪苷類化合物的降血脂活性；中國專利01134283.8公開了提取自何首烏的芪苷類化合物二苯乙烯甙的抗心腦缺血作用。曲札芪苷于1984年(Y.Kashiwada，etal.IsolationandCharacterizationofStilbenes.Chem.Pharm.Bull.1984,32(9):3501-3517)首次從芋大黃(商品名lmo-Diao)中得到并進行了結構確認，得率約為0.4%，此后，有報道從河套大黃中分離得到少量該化合物(李軍林等。河套大黃非蒽醌類成分研究，中草藥，98，29:721)，華北大黃中也含有該化合物，得率約為1.8%(王愛芹等。華北大黃中芪類成分研究，中草藥，2001，32:878)。目前尚無曲札芪苷相關藥理活性方面的研究或報道。曲札芪苷的糖苷取代位于非間位羥基取代的苯環(huán)上，與大黃降脂素、去氧土大黃苷、虎杖苷及何首烏中得到的系列二苯乙烯苷等芪苷類化合物的糖苷取代位置有結構上的差異。與大黃降脂素、去氧土大黃苷、虎杖苷相比，曲札芪苷具有較多的酚羥基，本發(fā)明通過清除DPra自由基試驗發(fā)現曲札芪苷的自由基清除能力高于上述化合物。自由基是缺血再灌注時形成的，是缺血組織損傷的重要根源，抗氧化劑和自由基清除劑可減輕缺血組織的損傷，曲札芪苷強的自由基清除活性使其在保護缺血心腦組織損傷中更具優(yōu)勢。本發(fā)明人首次對來源于拉薩大黃的曲札芪苷提取物及其純品進行了系列防治缺血性心腦血管疾病方面的藥理和藥效研究。研究采用兩種與人類疾病相近的動物模型，測定多種藥效學指標，綜合評價兩種樣品對急性心腦缺血的影響。試驗結果表明，曲札芪苷提取物和純品能明顯降低冠狀動脈結扎致心肌缺血大鼠血清CK-MB及LDH的釋放，縮小心肌梗死范圍，抑制血小板聚集，提示其對心肌缺血有明顯保護作用。曲札芪苷提取物和純品可以明顯減少MCAO大鼠腦梗塞范圍，使其行為障礙程度得到明顯改善，對缺血性心腦血管疾病的具有顯著的保護作用。因此，曲札芪苷提取物及其純品在防治心腦缺血方面具有潛在的臨床應用價值。曲札芪苷不同的結構還帶來化合物單體水溶性的優(yōu)勢。芪類物質結構中苯環(huán)上羥基的增加和葡糖基的取代使化合物的水溶性增加，如白藜蘆醇在水中溶解度是O.03g/L(標準狀況25°C，100kPa)，虎杖苷因帶有糖基使其在水中的溶解度增加到約0.5g/L，比白藜蘆醇多一個羥基的白杉皮醇(Piceata皿ol)水溶解度為0.5g/L。而結構中苯環(huán)上甲氧基的取代使化合物水溶性大大降低。如大黃降脂素和去氧土大黃苷(甲基虎杖苷)的水溶性小于0.04g/L。曲札芪苷結構中帶有糖基和較多的酚羥基，其溶解度約為1.lg/L，為其制作成注射、口服液等制劑應用帶來便利。芪類物質如白藜戸醇可從虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc)中提取純化，也可進行合成，而芪苷類物質多從植物資源中提取。研究表明，寥科植物(Polygonaceae)，特別是大黃屬(Rheum)植物中常含有較高的芪苷類成分，如河套大黃(RheumhotaoenseC.Y.ChengetC.T.Kao)的根莖中土大黃苷的含量可達3%(逯海龍等，HPLC法測定栽培河套大黃中土大黃苷的含量，藥物分析雜志，2007，27:ll)，大黃降脂素在部分地區(qū)栽培的唐古特大黃(Rhe咖tangutic咖Maxim,exBalf.)根莖中的含量可達到10%(張德等，天然產物研究與開發(fā)，2005，17:217)。本發(fā)明人在對野生和種植的拉薩大黃(RheumlhasaenseA.J.LietP.K.Haiao)根莖進行系統(tǒng)的成分研究中首次發(fā)現該植物含有豐富的芪苷類成分，除去氧土大黃苷、虎杖苷外(中國發(fā)明專利200510010757.X，200710066456.8)，還含有35%的曲札芪苷。我們在系統(tǒng)研究拉薩大黃化學成分和制備曲札芪苷提取物、純品的過程中還發(fā)現，與上述富含芪苷成分的大黃植物品種相比，拉薩大黃除含高含量的多羥基芪苷類化合物的特點外，幾乎不含具有潛在毒副作用的蒽醌及蒽醌苷類化學成分，此特點為該植物中芪苷類有效部位或單一成分的開發(fā)、產業(yè)化生產帶來了實用性和應用優(yōu)勢。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服上述現有技術不足，發(fā)明一種曲札芪苷在制備預防和治療缺血性心腦血管疾病制劑中的應用，及發(fā)明一個制備曲札芪苷及含有曲札芪苷提取物的方法。本發(fā)明是這樣實現的曲札芪苷在制備預防和治療缺血性心腦血管疾病制劑中的應用，所述曲札芪苷為化合物(E)-l-(3，5-二羥苯基)-2-(3-羥基-4-0-e-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，化學結構是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>使用的曲札芪苷為曲札芪苷提取物。所述曲札芪苷提取物，按重量百分比計，曲札芪苷提取物中含有曲札芪苷的有效成份為50%-100%。所述制備方法包括下列步驟(1)前處理前處理步驟包括拉薩大黃原植物根或根莖的采集、凈制和/或干燥、切碎或粉碎；(2)提取所述提取是采用水、含水或不含水有機溶劑作為提取溶劑對步驟(1)所述拉薩大黃根或根莖進行提取獲得拉薩大黃提取液；所述有機溶劑包括含有廣4個碳原子的醇、酮、醚以及它們的混合物。(3)后處理后處理步驟包括回收或部分回收步驟(2)所得提取液中的有機溶劑得到提取濃縮液，所得提取濃縮液可加入或不加水，繼而將提取液進行靜置沉淀，固液分離除去部分雜質；除雜質后的液相經進一步吸附樹脂層析純化、分段洗脫、洗脫物濃縮析晶獲得到以重量百分比計，含有曲札芪苷為50%_100%的曲札芪苷提取物。上述曲札芪苷提取物的一種制備方法，其步驟(2)所述有機溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇或乙醚；其步驟(2)所述提取溶劑為50100%的乙醇或甲醇水溶液。上述曲札芪苷純品的一種制備方法，其特征在于，所述制備方法是采用拉薩大黃作為原料，通過提取純化步驟獲得所需曲札芪苷純品；所述曲札芪苷純品純度以重量百分比計，為90%-100%。所述曲札芪苷提取物的一種制備方法，其特征在于曲札芪苷提取物是從野生或栽培的拉薩大黃(RheumlhasaenseA.J.LietP.K.Haiao)的根或根莖中提取。曲札芪苷在制備曲札芪苷純品中的用途。曲札芪苷提取物在制備預防或治療心腦血管疾病制劑中的用途。曲札芪苷制劑作為各種醫(yī)藥上可接受的制劑或保健食品，可用于制作藥物或保健食品。提供曲札芪苷的在制備防治心腦缺血疾病制劑中的應用，所述曲札芪苷為(E)-l-(3，5-二羥苯基)-2-(3-羥基-4-0-e-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯或3，5，3'，4'-四羥基芪心腦_3'-O-P-葡萄糖苷，曲札芪苷的化學結構式如下。HOOH/32HO目前研究較多的多羥基芪苷類化合物如虎杖苷、土大黃苷、去氧土大黃苷等，其葡萄糖基取代在所示曲札芪苷的化學結構的C-3位，曲札芪苷的糖基則取代在C-3'位，這種類型的芪苷類化合物在抗心腦缺血活性方面目前尚無研究。本發(fā)明對曲札芪苷進行了抗心腦缺血方面的藥理和藥效研究，發(fā)現曲札芪苷純品及含有曲札芪苷的提取物在急性心腦缺血疾病的模型中均顯示了顯著的藥理學活性。研究采用兩種與人類疾病相近的動物模型，測定多種藥效學指標，綜合評價兩種樣品對急性心腦缺血的影響。試驗結果表明，50、100mg/kg曲札芪苷提取物和15、30mg/kg純品腹腔注射能明顯降低冠狀動脈結扎致心肌缺血大鼠血清CK-MB及LDH的釋放，顯著縮小心肌梗死范圍，顯示其對心肌缺血帶來的損傷有顯著的保護作用。50、100mg/kg曲札芪苷提取物和15、30mg/kg還可以明顯減少MCA0大鼠腦梗塞范圍，明顯改善大鼠局灶性腦缺血所致的神經功能程度，表明其對腦缺血的損傷具有顯著的保護作用。多個劑量的曲札芪苷提取物和純品均能抑制血小板聚集-腎上腺素所致的小數體內血栓形成。上述試驗指標顯示，曲札芪苷在防治心腦缺血方面具有潛在的臨床應用價值，由此，本發(fā)明提供曲札芪苷在制備治療缺血性心腦血管疾病藥物中的用途。所述的制備方法是從拉薩大黃的根和/或根莖提取目標物質，所述拉薩大黃為RheumlhasaenseA.J丄ietP.K.Haiao。本發(fā)明進一步提供曲札芪苷和含有曲札芪苷提取物的制備方法，所述制備方法包括下列步驟(1)前處理前處理步驟包括拉薩大黃原植物根或根莖的采集、凈制和/或干燥、切碎或粉碎。(2)提取所述提取是采用含水或不含水有機溶劑作為提取溶劑對步驟(1)所述拉薩大黃根或根莖進行提取獲得拉薩大黃提取液；所述有機溶劑包括含有廣4個碳原子的醇、酮、醚以及它們的混合物。(3)后處理后處理步驟包括回收或部分回收步驟(2)所得提取液中的有機溶劑得到提取濃縮液，所得提取濃縮液可加入或不加水，繼而將提取液進行靜置沉淀，固液分離除去部分雜質；除雜質后的液相經進一步吸附樹脂層析純化、分段洗脫、洗脫物濃縮析晶可得到權利要求23所述的提取物。6步驟(1)所述前處理步驟中，所述拉薩大黃是指蓼科植物RheumlhasaenseA.J丄ietP.K.Haiao。所述拉薩大黃可以是野生的，也可以是人工種植的，人工引種栽培大黃的成功可以進一步擴大拉薩大黃的藥源或產生更優(yōu)的變種。本發(fā)明發(fā)現，拉薩大黃根及根莖中存在高含量的曲札芪苷，隨采收年限、季節(jié)、地點以及其它因素的不同，拉薩大黃根及根莖所含曲札芪苷的量可達3%5%(以干重計)，此在植物中非常罕見。此外，本發(fā)明還驚奇發(fā)現，拉薩大黃根和根莖中幾乎不含蒽醌類化合物，此在大黃類植物中為罕見，這是拉薩大黃的一項非常重要的特征其一，應用拉薩大黃入藥不存在對蒽醌類化合物潛在嚴重毒副作用的擔憂；其二，應用拉薩大黃提取二苯乙烯類活性成分時，其提取工藝可以不受蒽醌類化合物特別是蒽醌苷的干擾，因此工藝可以更簡便，上述特點為拉薩大黃中芪苷類有效部位或單一成分的開發(fā)、利用和產業(yè)化生產帶來了應用優(yōu)勢和實用性。拉薩大黃地上莖葉中二苯乙烯類成分含量很低，作為提取原料的價值相對較低，但是仍可作為二苯乙烯類化合物的來源之一。本發(fā)明優(yōu)選采用拉薩大黃的地下根和根莖作為提取原料，但不排除以其整個植株作為提取原料。采集的拉薩大黃一般需要經過凈制、切制和/或粉碎等前處理。所述凈制可包括去除采集過程中附著于拉薩大黃根和根莖上的泥土等雜物，還可以包括將根和根莖與地上莖葉分開等。所采集的拉薩大黃可以應用其鮮品，也可以采用其風干、曬干或機器干燥的干品；所得此根和根莖或整個植株優(yōu)選進行適當切制或粉碎以利提取。步驟(2)所述有機溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇或乙醚。其提取溶劑優(yōu)選乙醇或甲醇的水溶液；其中特別優(yōu)選乙醇水溶液作為提取溶劑；進一步地，本發(fā)明優(yōu)選采用45%95%乙醇水溶液作為提取溶劑。步驟(2)所得拉薩大黃提取液需經適當的后處理方可獲得曲札芪苷提取物。由于拉薩大黃所含的一些主要的芪及芪苷類物質如土大黃苷元、去氧土大黃苷元、去氧土大黃苷、虎杖苷水溶性有限，本發(fā)明發(fā)現，回收提取液中的有機溶劑和/或適當濃縮提取物可以使提取物所含的部分脂溶性芪及芪苷類化合物、雜質從提取液中析出，而曲札芪苷由于水溶性較好則保留在上清液中。其轉移率可達85%以上。上清液中的曲札芪苷可以采用合適的有機溶劑萃取進行純化，例如采用正丁醇、乙酸乙酯_甲醇混合溶劑、正丁醇_二氯甲烷混合溶劑等萃?。淮祟惢衔镞€可以采用連續(xù)逆流萃取法等本領域內熟知的方法萃取純化。本發(fā)明中優(yōu)選采用大孔吸附樹脂層析法純化上清液中的二苯乙烯類化合物。上述后處理步驟中，隨著提取液中的有機溶劑的回收，上清液上樣于大孔吸附樹脂柱時，上清液中所含的曲札芪苷易于被樹脂柱床所吸附；上樣吸附后，樹脂柱床可采用水以及低濃度有機溶劑水溶液洗滌以進一步去除極性較大的雜質，隨后可采用較高濃度的有機溶劑水溶液分步洗脫所需的化學成分，所得洗脫溶液經濃縮、析晶、干燥即可獲得所述的曲札芪苷提取物。提取物可采用醇水或單純的水溶液重結晶進行進一步精制來提高曲札芪苷的純度，通過反復重結晶、脫色或其它純化手段可得權利要求78所述的純品。采用大孔樹脂吸附上清液所含曲札芪苷時，柱床體積一般按每100ml吸附樹脂(裝柱后體積)吸附l3g上清液設置，這時一般可以獲得良好的吸附轉移率。上清液上樣吸附后，可采用水溶液、10%15%的乙醇溶液或甲醇水溶液洗滌除去大部分水溶性雜質，7隨后采用約25%50%的乙醇或甲醇水溶液即可洗脫吸附于大孔樹脂的曲札芪苷。本發(fā)明中，優(yōu)選的大孔吸附樹脂為弱極性和中極性的樹脂，例如商品型號D101、D1300、AB8型吸附樹脂。在合適的條件下，大孔樹脂吸附法所得產物中，曲札芪苷總含量可達約50%至85%，轉移率為80%95%。經過上述純化步驟后，曲札芪苷已經得到富集，采用這些提取物作為原料可以方便地制備曲札芪苷含量更高的提取物和純品。例如，本發(fā)明中，采用大孔樹脂吸附法所得洗脫部分為原料，通過合適濃縮，析晶可得含量為70%89%的曲札芪苷提取物，此提取物采用反復重結晶、活性碳脫色、硅膠層析、聚酰胺等層析結合重結晶法純化可獲得純度高達90%以上的曲札芪苷純品。通過上述步驟制備的提取物是以曲札芪苷為主要化學成分的混合物。可以理解，此提取物中曲札芪苷的含量隨原料批次不同、處理工藝參數變化而有所變化。一般地，按重量百分比計，所述提取物中含有約50%85%的曲札芪苷。顯然，上述提取物可以用于進一步精制純化以獲得曲札芪苷純品。本發(fā)明中，所謂純品是指化合物的純度不低于90%。由此本發(fā)明進一步提供拉薩大黃提取物在制備曲札芪苷純品，以及曲札芪苷提取物在制備該曲札芪苷純品中的用途。研究結果顯示，曲札芪苷提取物及曲札芪苷純品在作為制備治療心腦血管疾病的治療藥物方面有廣泛的用途。所述的有效部位中活性成分的結構清楚、組成明確，有利于各級產品的質量監(jiān)測和控制，符合天然產物復合制劑的發(fā)展方向和要求。另外，本發(fā)明所述有效部位的制備方法簡單易行，生產成本低，可連續(xù)操作，具有極強的實用性。按照常規(guī)的制劑工藝，可以將本發(fā)明之提取物制備成任何一種適用于臨床應用的藥物制劑。如片劑，膠囊劑，丸劑，散劑，膏劑，分散劑，顆粒劑，粉針劑，水針劑等。同樣，本發(fā)明之曲札芪苷提取物也可以與其它活性成分聯合使用形成新的制劑。顯然，這些含有本發(fā)明所述有效部位的制劑在本發(fā)明的權利要求范圍內。圖1為本發(fā)明薄層鑒別(碘顯色)。圖2野生拉薩大黃原料供試品液HPLC典型圖譜(曲札芪苷，RT:7.862)。圖3種植拉薩大黃原料供試品液HPLC典型圖譜(曲札芪苷，RT:7.885)。圖4曲札芪苷提取物供試品液HPLC典型圖譜(曲札芪苷，RT:7.878)。圖5曲札芪苷純品HPLC典型圖譜(曲札芪苷，RT:7.896)。其中在圖l中l(wèi).表示去氧土大黃苷對照品液；2.表示曲札芪苷對照品液；3.表示野生拉薩大黃原料(20080913)供試品液；4.表示種植拉薩大黃原料(20080915)供試品液；5.表示種植拉薩大黃原料(20080915)供試品液；6.表示種植拉薩大黃原料(20080915)供試品液。具體實施方案以下通過具體實施例將進一步說明本發(fā)明的內容。下文實施例僅為就本發(fā)明所述有效部位的來源、制備方法、化學組成及其用途的特殊說明，顯然，本發(fā)明權利范圍不受這些實施例限制。實施例1:拉薩大黃原料及曲札芪苷提取物中曲札芪苷的定性鑒別與定量檢測(1)樣品來源野生拉薩大黃根莖收購于西藏拉薩地區(qū)，除去雜質，洗凈，切成片或塊，曬干。批號20080913種植拉薩大黃根莖收獲于云南香格里拉縣，除去雜質，洗凈，切成片或塊，曬干。批號20080915對照品曲札芪苷，自制，純度99%，批號080602。(2)樣品及標準品溶液配制對照品溶液配制精密稱取以五氧化二磷真空干燥的曲札芪苷對照品適量，以甲醇配成lmg/ml對照品儲備液，27%甲醇_3%乙酸溶液稀釋成25g/ml作為標準品溶液。拉薩大黃原料供試品溶液制備精密稱取以五氧化二磷真空干燥的上述拉薩大黃根莖粉末10g，95X乙醇回流提取3次(120min/次)，合并提取液，濾紙過濾，濾液進一步以0.45iim微孔濾膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液作為拉薩大黃供試品溶液。曲札芪苷提取物供試品溶液制備精密稱取以五氧化二磷真空干燥的實施例2所述曲札芪苷提取物適量，以甲醇配成10mg/ml樣品儲備液，精密吸取lml，置于25ml容量瓶中，27%甲醇定容，密塞，搖勻，過0.45iim微孔濾膜，棄初濾液，取續(xù)濾液作為拉薩大黃提取物供試品溶液。(3)定性鑒別薄層色譜法檢查本法采用硅膠薄層層析。取上述供試品液及對照品液各41，分別點于同一硅膠薄層層析板(硅膠G)板上，以氯仿甲醇(體積比，7.5:2.5)為展開劑展開，取出，晾干，置于碘缸中顯色，在對照品相同的位置，供試品應有相應的斑點。(4)供試品所含曲札芪苷含量定量檢測高效液相色譜法(HPLC)色譜條件采用ZorbaxSB-C18(4.5X150mm，Agilent)反相色譜柱，27%甲醇_3%醋酸水為流動相，流速0.8ml/min，用DAD紫外檢測儀進行檢測，檢測波長319nm。標準曲線建立上述對照品儲備液分別稀釋成5、15、25、35、45iig/ml溶液，各取10iU分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以各對照品峰面積(Y，A)對進樣量(X，mg)進行線性回歸，回歸方程:Y=6.3324X+0.1158，r=0.9999(曲札芪苷，n=5)。樣品測定上述拉薩大黃原料供試品溶液、曲札芪苷提取物供試品溶液各10iU分別注入液相色譜儀中，根據標準曲線計算拉薩大黃原料提取物、曲札芪苷提取物中曲札芪苷的含量。(4)結果i)定性鑒別拉薩大黃原料提取物及曲札芪苷提取物的典型薄層色譜圖如圖3所示，結果表明，在對照品相同的位置，供試品均有相應的斑點。ii)曲札芪苷含量檢測拉薩大黃原料及其曲札芪苷提取物的典型HPLC譜圖如圖46所示，結果表明，拉薩大黃野生藥材原料和種植藥材原料中曲札芪苷的含量分別為4.38%和4.18%，提取物中曲札芪苷的含量為78.5%。實施例2:曲札芪苷提取物制備(1)材料拉薩大黃根莖收購于西藏拉薩地區(qū)，除去雜質，洗凈，切成片或塊，曬干。批號20080913樹脂DIOI大孔吸附樹脂，天津市海光化工有限公司產品，按照生產廠說明書進行預處理。(2)制備i)拉薩大黃前處理及其曲札芪苷含量測定采集的拉薩大黃植株，去泥晾干，分離地下根莖和地上莖葉，粉碎機分別將其粉碎成粗粉末。取地下根莖和地上莖葉粉末各100g，用95%乙醇浸泡回流提取，120分鐘/次，間隔取樣進行HPLC檢測，直至提取液中基本不含曲札芪苷，合并提取液，按實施例1中所述方法方法曲札芪苷的含量，此檢測結果作為藥材所含該化合物總量。結果批號20080913的拉薩大黃地下根莖和地上莖葉中的所含曲札芪苷化合物總量分別為5.01%和0.001%。ii)提取拉薩大黃地下根莖粉末每份600g，分別以50%、75%、95%乙醇；50%、90%甲醇；50%丙酮；正丁醇作為提取溶劑提取。各份藥材分別以上述不同提取溶劑共5.4L回流提取3次(2.4L/1.8L/1.2L)，120min/次。分別合并提取液，HPLC法檢測提取液中曲札芪苷平均量(A):，計算曲札芪苷轉移率(B):提取液中曲札芪苷總量/藥材曲札芪苷總量X100%。提取試驗結果如表1所示。表1:不同提取溶劑的提取試驗結果提取液50%乙醇75%乙醇95%乙醇50%甲醇90%甲醇50%丙酮正丁醇A22.50g23.10g27.12g21.60g28.68g27.18g24.36gB74.8%76.8%90.2%70.6%93.5%90.4%81.2%A:HPLC法檢測的提取液中曲札芪苷化合物量；B:曲札芪苷轉移率上述提取試驗中，以50%、75%、95%乙醇；50%、90%甲醇；50%丙酮；正丁醇作為提取溶劑提取時，提取步驟中曲札芪苷轉移率在70%95%之間?？梢娝鼈兙勺鳛樵摶衔锏挠行崛∪軇?，其中，鑒于乙醇的安全、廉價且提取轉移率較高，因此本發(fā)明優(yōu)選乙醇水溶液作為提取溶劑。iii)后處理沉淀處理分別合并步驟ii)所得各提取溶液，減壓(0.10.08Mpa，6(TC)回收其中所含的有機溶劑，加水定容至600mL后，混合均勻，4"放置24h，離心(4000rpmX30min)，得上清液和沉淀。沉淀真空干燥，稱重(C);HPLC法檢測上清液和沉淀中曲札芪苷的量(D、)。計算上清液和沉淀中曲札芪苷轉移率(F、G):上清液或沉淀曲札芪苷總量/提取液曲札芪苷總量X100%。表2:沉淀處理試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>C:沉淀量D:沉淀中曲札芪苷量E:上清液中曲札芪苷量E:沉淀中曲札芪苷轉移率F:上清液中曲札芪苷轉移率；表2數據顯示，上述各組提取液濃縮除有機溶劑加水后低溫靜置，除正丁醇組外，其余各組樣品均產生沉淀，沉淀中曲札芪苷的轉移率在2%5%之間，沉淀量在1030g之間，上清液中曲札芪苷轉移率在85%95%之間，可見該步驟處理可有效去除脂溶性雜質，且曲札芪苷的損失較小。因此本發(fā)明把該步驟作為制備曲札芪苷提取物的一個重要環(huán)節(jié)。上清液處理除正丁醇提取液外，合并其它全部上清液，再次過濾，HPLC法檢測所得濾液中的曲札芪苷總量，將其平均分成4份，分別上樣于4根D101大孔吸附樹脂柱(小5.Ocm，105cm，柱床體積2000ml)和HPLC檢查D101樹脂柱上樣流出液，未見二苯乙烯類化合物泄漏。4根D101樹脂柱分別順次以1000ml水、1000ml15%乙醇或10%甲醇洗滌，HPLC檢查洗滌流出液，流出液基本不含或僅含少量曲札芪苷。D101樹脂柱再分別以25、50%7醇或20%甲醇、45%甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，真空干燥得曲札芪苷提取物，計量所得終產物的重量(H)，HPLC法檢測終產物中曲札芪苷總量(I);計算終產物中的曲札芪苷的含量(J):終產物中曲札芪苷總量/終產物重量X100X;計算曲札芪苷轉移率(K):終產物中曲札芪苷總量/上樣濾液中曲札芪苷總量X100%。表3上清液處理試驗結果樹脂柱D101大孔吸附樹脂<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>H:終產物量；I:終產物量中曲札芪苷總量J:終產物量中曲札芪苷含量K:曲札芪苷轉移率；每根樹脂柱上樣濾液(750ml)中曲札芪苷總量33.82g表3數據顯示，從吸附樹脂上洗脫部分的曲札芪苷含量在50%85%之間，曲札芪苷的轉移率在85%96%之間。其中，鑒于乙醇的安全、廉價，因此本發(fā)明優(yōu)選乙醇水溶液作為洗脫劑，洗脫濃度優(yōu)選25%50%之間，可以預見，隨著洗脫液乙醇濃度的降低，洗脫部分曲札芪苷的含量會有所上升，而轉移率有所下降，乙醇濃度升高則反之。實施例3:由拉薩大黃提取物及曲札芪苷提取物制備純品曲札芪苷(1)材料拉薩大黃根莖收購于西藏拉薩地區(qū)，除去雜質，洗凈，切成片或塊，曬干。批號20080913。(2)拉薩大黃提取物制備取拉薩大黃干燥根莖粉末100g，采用95%乙醇作為提取溶劑回流提取3次(2.4L/1.8L/1.2L)，120min/次，合并提取液，濃縮，真空干燥，得拉薩大黃提取物。(3)純化拉薩大黃提取物2g，以40g200目硅膠拌，采用硅膠柱層析純化。采用氯仿/甲醇(V/V，8/1)作為洗脫溶劑，分部收集不同流份，薄層層析(TLC)監(jiān)測，合并含有曲札芪苷的流分，減壓回收溶劑，15%乙醇重結晶，真空干燥，得曲札芪苷純品。實施例2中所述曲札芪苷提取物2g，按16:1加入純水(32ml)，6(TC加熱溶解，放置4小時析晶，抽濾，晶體加入適量水，O.5%活性碳脫色，重結晶，得1.25g曲札芪苷，真空干燥，得曲札芪苷純品。(4)HPLC檢測按實施例1中HPLC法檢測所得曲札芪苷的純度，其不同流份產物中去氧土大黃苷的純度可在90%99.9%之間；結晶-脫色-重結晶所得曲札芪苷純度在98%99.6%之間。HPLC檢測典型圖譜見圖7。(5)曲札芪苷結構確認檢測所得曲札芪苷的UV、negativeFABMS、MSHNMR、13CNMR譜圖，其檢測數據如下曲札芪苷白色毛狀晶體(水)，mp.220-225°C。紫外燈下呈藍紫色熒光。UV入max(Me涯)217(4.38)，320(4.48);EI_MS(m/z):406[M]+，244[M_glycosy]+;negativeFAB-MS(m/z):405[M_H]—，243[M-H-glycosy]—;1H畫R(CD30D，500MHz)Sppm:7.44(1H，d，J=2.0Hz，C2'_H)，7.05(1H，dd，^=2.OHz，J2=8.0Hz，C6'_H)，6.92(lH，d，J=16.3Hz，C-H)，6.83(1H，d，J=16.3Hz，C-H)，6.82(1H，d，J=8.3Hz，C5'_H)，6.47(1H，d，J=2.2Hz，C2,6-H)，6.18(1H，t，J=2.2Hz，C4_H)，4.81(1H，d，J=7.4Hz，anomericH)，3.95(1H，dd，1=2.0，2.lHz，J2=12.2Hz，C6〃—H)，3.74(1H，dd，^=6.OHz，J2==12.lHz，C6〃-H)，3.41-3.56(4H，msugar-H);13CNMR(CD30D，125MHz)Sppm:141.1(C_l)，105.9(C-2，6)，159.4(C-3，5)，102.7(C-4)，131.3(C-1')，116.6(C_2')，146.9(C_3')，148.1(C-4')，117.2(C-5')，123.0(06')，127.8(C_a)，129.1(C_P)，104.4(C_l〃)，74.9(C-2〃)，78.4(C-3〃)，71.4(C_4")，77.5(C_5〃)，62.5(C_6〃)。通過與文獻的比較，可以看出，本檢測結果中各質子的化學位移數值與偶合常數的數值均與文獻中(Y.Kashiwada，etal.IsolationandCharacterizationofStilbenes.Chem.Pharm.Bull.1984,32(9):3501-3517;鄭俊華，果德安。大黃現代研究.北京大學醫(yī)學出版社，2007，第一版，286)的相應數值吻合。曲札芪苷鑒定為(E)-l-(3，5-二羥苯基)-2-(3-羥基-4-0--D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯[(E)_1_(3，5_dihydroxyphenyl)_2_(3_hydroxyl_4_0_P_D_glucopyranyphenyl)ethylene]，或稱為3，5，3'，4'-四羥基芪_3'_0_P-葡萄糖苷(3，5，3'，4'-tetrahydroxystilbene-3'-O-P_D_glucopytanoside)。實施例4:拉薩大黃提取物的藥理學作用[cms](1)試驗樣品曲札芪苷提取物實驗代號QZQ-OO-Ol。樣品按照實施例2所述步驟制備。其中曲札芪苷含量為78.5%曲札芪苷實驗代號QZQ。樣品按照實施例3所述步驟有曲札芪苷提取物制備，純度為99.1%。虎杖苷購自西安華萃生物技術有限公司，批號P0L050817，純度為98.0X。上述試驗樣品均以-羥丙基環(huán)糊精配制成不同濃度的供試溶液。(2)試驗動物SPF級ICR小鼠，購自于昆明醫(yī)學院實驗動物中心。SPF級SD大鼠，購自于昆明醫(yī)學院實驗動物中心。(3)試驗方法對大鼠MCAO局灶性腦缺血的影響各組雄性SD大鼠動物每日按劑量灌胃給藥一次，連續(xù)5天。末次灌胃后30min，用12%水合氯醛腹腔注射350mg/kg麻醉動物，左側臥位，沿右耳眼線中點切開皮膚，分離顳肌，絞斷顴骨，在顴骨根前方用牙科鉆鉆孔，暴露MCAO，在大腦下靜脈和嗅束間用針挑起，斷之，棉球壓迫止血后，分層縫合肌肉和皮膚。假手術組除了不挑斷MCAO外，其余步驟相同。動物于造模后6h及24h根據運動等行為表現進行神經功能評分，以此作為腦功能障礙指標。評分采用盲法，即評分者不知道給藥的情況，0127]評分標準如下0128]癥狀行為障礙評分0129]_0130]0131]0132]0133]0134]0135]0136]0137]0138]提鼠尾離開地面約一尺，手術對側前肢出現腕屈曲，肘屈曲，肩內旋14或有腕，肘屈曲又有內旋。將動物置于平地面上，分別推雙肩向內側，檢查阻力。13將動物置于金屬網面上，觀察兩前肢的張力。廣3將動物置于平地面上，觀察有無轉圈。廣2滿分12以上標準滿分為12分，分數越高，表明動物行為障礙越嚴重造模24h，經神經功能評分后，頸動脈插管取血，一份分離血清按試劑盒方法測定AST及LDH的活性；一份用3.8%枸櫞酸鈉以1:9抗凝，1000rpm離心5min制備富血小板血漿(PRP)，3500rpm離心10min制備貧血小板血漿(PPP)。按比濁法測定ADP-2Na誘導的血小板聚集率，ADP的終濃度為6mol/L;按試劑盒方法分別測定TT、PT、APTT及FIB。取血后快速斷頭取腦，放入冰生理鹽水中去除嗅球、小腦和低位腦干，吸干水分稱取腦重，沿冠狀切成5片，置入5ml含有4%TTC及l(fā)mol/LK2HP040.lml的溶液中，避光于37"溫孵30min，其間每隔7-8min翻動一次，經染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈白色，將梗塞部位剪下稱重，以重量求面積法計算梗死組織重量占雙側大腦半球重的百分比作為腦梗塞范圍。對膠原蛋白-腎上腺素所致小鼠血栓形成影響取2022g小鼠，雌雄各半，按性別和體重隨機分組，見表6。各組動物每日按劑量腹腔注射給藥一次，連續(xù)5天。末次給藥后30min，每鼠按0.lml/10g體重的劑量靜脈注射由膠原蛋白-腎上腺素制成的誘導劑，觀察并記錄15min內各組動物偏癱發(fā)生率、死亡率及恢復率。X2檢驗組間差異的顯著性。對冠脈結扎致大鼠心肌缺血影響雄性SD大鼠，330385g，按體重隨機分組見表7，各組動物按劑量每日灌胃給藥一次，連續(xù)5天，空白組和模型組給予等容量0.5%CMC-Na10ml/kg體重。末次給藥后30min，用12%水合氯醛腹腔注射350mg/kg麻醉動物，行開胸手術暴露心臟，于肺動脈圓錐及左心房間找出冠狀動脈左前降支，距根部23mm處結扎，快速心臟復位關閉胸腔。假手術組僅置線頭而不結扎，造成急性心肌缺血模型，24h后，頸動脈插管取血分離血清按試劑盒方法測定AST、LDH及CK-MB的活性；取血后立即取心臟，置于冰生理鹽水中泵出心腔內積血，去掉心房及脂肪組織，吸干水分稱取心室重，隨后沿冠狀切成5片，在1%TTC溶液中避光于37t:孵育染色10min。經染色后，正常心肌組織呈紅色，而梗死組織呈白色，將梗塞部位剪下稱重，計算壞死部分占心室重的百分比為心肌梗塞范圍。(5)試驗結果對大鼠中動脈結扎(MCA0)致局灶性腦缺血的影響曲札芪苷提取物以50，100mg/kg，曲札芪苷純品以15，30mg/kg的劑量分別于MCA0手術后即刻和缺血再灌注6h靜脈注射2次，能明顯減輕大鼠局灶性腦缺血所致的神經功能障礙，明顯減小腦梗塞的范圍，曲札芪苷提取物兩劑量組分別縮小65.87%、40.38%;曲札芪苷純品兩劑量組分別縮小75.87%、52.21%，優(yōu)于虎杖苷。表4曲札芪苷純品及提取物對MCA0再灌注大鼠神經功能障礙及腦梗塞范圍的影響(X士SD)14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與假手術組相比AAP<0.01;與模型組相比*P<0.05，**P<0.01;表5曲札芪苷純品及提取物對MCAO再灌注大鼠血凝及血小板聚集的影B向(；±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與假手術組相比AP<0.05;與模型組相比:*P<0.05，**P<0.01;對膠原蛋白_腎上腺素所致小鼠血栓形成影響曲札芪苷提取物60mg/kg、120mg/kg劑量組，曲札芪苷純品各劑量組均能明顯抑制膠原-腎上腺素所致的小鼠體內血栓形成；。表6曲札芪苷純品及提取物對小鼠體內血栓形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>與對照組相比:*P<0.05，**P<0.01對冠脈結扎致大鼠急性心肌梗塞范圍的影響模型組大鼠血清AST、LDH及CK-MB活性有不同程度的增高，尤以CK-MB及LDH活性增高更明顯，表明心肌損傷造模成功。曲札芪苷(50mg/kg)及曲札芪苷提取物(200mg/kg)均能明顯降低CK-MB和LDH的釋放，表明減輕心肌細胞損傷作用顯著；兩給藥組大鼠的心肌梗塞范圍均顯著小于模型對照組，與模型組相比分別縮小64.33%和47.72%。結果見表7。表7.QHQ及QZQ對大鼠心肌梗塞范圍和酶學的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例5幾種芪苷類物質的DPPH自由基清除活性試驗(1)試驗樣品曲札芪苷自制，樣品按照實施例3所述步驟有曲札芪苷提取物制備，純度為99.1%?；⒄溶召徸晕靼踩A萃生物技術有限公司，批號P0L050817，純度為98.0X。土大黃苷自制，按中國發(fā)明專利200510010757.X中所述土大黃苷純品制備，純度99.5%。大黃降脂素自制，從河套大黃(RheumhotaoenseC.Y.ChengetC.T.Kao)中制備，純度99.0%維生素E(-Tocpherol)、BHA(butylatedhydroxyanisol)、DPPH自由基(，-diphenyl--picrylhydrazyl)均為Sigma產品。其中，維生素E為常用的天然來源的抗氧化劑，BHA為食品工業(yè)中常用的合成抗氧化劑。上述試驗樣品均以甲醇配制成不同樣品濃度的供試溶液。(2)試驗方法自由基清除活性測定參照M.H.Gorden等人的方法(M.H.Gordon,etal.Antioxidantactivityofhydroxytyrosolacetatecomparedwiththatofotheroliveroilpolyphenols.J.Agric.FoodChem.，2001，49:2480)。每一測定的試液為0.06MmDPPH自由基甲醇溶液.參照品及供試樣品均配成2.1(0.06X35)mM的甲醇溶液，分別稀釋成1/10，1/4，1/2三個不同的濃度。測定時，在3.5mlDPPH自由基甲醇溶液中加入O.1ml參照品或樣品溶液，混合，在15分鐘測定其光吸收值(A，pJ，檢測波長為515nm，每個不同濃度的參照品及樣品平行測定三次。甲醇為空白，0.06mMDPm溶液為對照(Control)。每一參照品和供試樣品得到3-4個不同濃度分別在不同時間的三組平行測定值。每一測定值表示DPra自由基在溶液中的殘留值，用以下公式將其換算成DPra自由基清除率(scavengedDPPHradicalrate%):ScavengedDPPHradicalrate%=controlnsample^/ncontro]y以此值作出樣品在不同濃度時DPra自由基清除率與時間的關系圖及在不同時間下DPra自由基清除率與樣品濃度的關系。樣品濃度用加入樣品與DPPH自由基的摩爾數比值(molarratio)來表示，本實驗中取O.10，0.25，0.50,1.00。樣品清除自由基的活性EC5。是指使DPra自由基被清除50%所需的樣品摩爾數與加入DPra摩爾數的比值。(3)試驗結果表8cophero1、BHA及各芪苷類化合物DPffl自由基活性<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表8數據顯示，曲札芪苷清除DPra自由基的活性較強。實施例6曲札芪苷片劑制備曲札芪苷提取物樣品按照實施例2所述步驟制備，其中提取溶劑采用90%乙醇；其中曲札芪苷的含量為78.5%。制法稱取曲札提取物100g，溶解于適量乙醇中，加入900gPVPK29/32，混合均勻，使充分溶解；旋轉蒸發(fā)使乙醇揮發(fā)，冷卻，干燥，固化，粉碎固化物，取100克與50克乳糖、30克預膠化淀粉、10克羧甲基淀粉鈉混合，過80目篩2遍，混合均勻，以1%低取代羥丙基纖維素乙醇溶液(濃度50%)為粘合劑制軟材，過40目篩制粒，6(TC干燥，過30目篩整粒，加入1.5克滑石粉混合均勻，壓片，可制備曲札芪苷片1000片。實施例7:曲札芪苷凍干粉針曲札芪苷純品樣品按照實施例3所述步驟制備，其中提取溶劑采用90%乙醇；其中曲札芪苷的含量為99.0%。配方曲札芪苷純品10g大豆磷脂8g甘露醇200g制備工藝在1萬級的條件下，將合格的藥物和輔料一起溶于注射用水中，經脫色等處理后，加入注射用水稀釋至所2000ml。過濾，濾液經過濾紙及0.4iim的濾膜粗濾等處理后，在100級的條件下，用0.2ym以下的濾膜過濾。精濾液送入分裝機，按每支2ml分裝，蓋上帶槽的蓋子，送入冷凍真空干燥機，快速冷至35°C40°C，23小時，逐步緩慢升溫至35t:45t:(約需10小時)。塞緊蓋子，取出制品，扎蓋、包裝、檢驗、合格的藥用粉針成品(1000支10mg之規(guī)格的凍干粉針)。實施例8:曲札芪苷口服液產品配方脂溶性芪苷(含量98%)48g蜂蜜1000g丙二醇500g蒸餾水加至10kg制備方法取處方量藥物和輔料，按普通口服液制備方法制備，可得IOOO支的口服液。權利要求曲札茋苷在制備預防和治療缺血性心腦血管疾病制劑中的應用，所述曲札茋苷為化合物(E)-1-(3，5-二羥苯基)-2-(3-羥基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，化學結構是使用的曲札茋苷為曲札茋苷提取物。FSA00000046829000011.tif2.權利要求1所述曲札芪苷在制備預防和治療缺血性心腦血管疾病制劑中的應用其特征在于所述曲札芪苷提取物，按重量百分比計，曲札芪苷提取物中含有曲札芪苷的有效成份為50%-100%。3.權利要求1所述曲札芪苷提取物的一種制備方法，其特征在于所述制備方法包括下列步驟(1)前處理前處理步驟包括拉薩大黃原植物根或根莖的采集、凈制和/或干燥、切碎或粉碎；(2)提取所述提取是采用水、含水或不含水有機溶劑作為提取溶劑對步驟(1)所述拉薩大黃根或根莖進行提取獲得拉薩大黃提取液；所述有機溶劑包括含有廣4個碳原子的醇、酮、醚以及它們的混合物。(3)后處理后處理步驟包括回收或部分回收步驟(2)所得提取液中的有機溶劑得到提取濃縮液，所得提取濃縮液可加入或不加水，繼而將提取液進行靜置沉淀，固液分離除去部分雜質；除雜質后的液相經進一步吸附樹脂層析純化、分段洗脫、洗脫物濃縮析晶獲得到以重量百分比計，含有曲札芪苷為50%_100%的曲札芪苷提取物。4.根據權利要求3所述曲札芪苷提取物的一種制備方法，其步驟(2)所述有機溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇或乙醚；其步驟(2)所述提取溶劑為50100%的乙醇或甲醇水溶液。5.曲札芪苷純品的一種制備方法，其特征在于，所述制備方法是采用拉薩大黃作為原料，通過提取純化步驟獲得所需曲札芪苷純品；所述曲札芪苷純品純度以重量百分比計，為90%-100%。6.根據權利要求3所述曲札芪苷提取物的一種制備方法，其特征在于曲札芪苷提取物是從野生或栽培的拉薩大黃(RheumlhasaenseA.J.LietP.K.Haiao)的根或根莖中提取。7.曲札芪苷在制備曲札芪苷純品中的用途。8.曲札芪苷提取物在制備預防或治療心腦血管疾病制劑中的用途。9.曲札芪苷制劑作為各種醫(yī)藥上可接受的制劑或保健食品，可用于制作藥物或保健食全文摘要本發(fā)明涉及多羥基芪苷類化合物曲札芪苷在制備防治缺血性心腦血管疾病制劑中的用途及其制備方法。所述曲札芪苷為化合物(E)-1-(3，5-二羥苯基)-2-(3-羥基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，具有如下化學結構式，試驗結果顯示，曲札芪苷能顯著減輕心腦梗塞后的缺血再灌注造成的損傷，在制備防治缺血性心腦血管疾病制劑方面具有廣泛用途。曲札芪苷可從拉薩大黃的根和/或根莖中提取，在單純的醇/水系統(tǒng)下進行制備，簡單易行，環(huán)境友好，實用性強。文檔編號C07H1/08GK101787061SQ201010116358公開日2010年7月28日申請日期2010年3月2日優(yōu)先權日2010年3月2日發(fā)明者代家紅,何金星,胡琳,胡群,胡茂申請人:昆明翔昊科技有限公司