專利名稱：抗hiv-i的多肽、其編碼序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及新的抗HIV-I的多肽、其編碼序 列及其用途。
背景技術(shù)：
人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起獲得性免疫缺陷綜 合癥(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，即艾滋病。HIV 屬 RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒科， 可分為I型(HIV-I)和II型(HIV-II)，其中HIV-I感染率高、危害性大。感染者終生攜帶病 毒，在數(shù)年的潛伏期后發(fā)病，全身免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p害，最終走向死亡。因目前對(duì)艾滋病 仍缺乏有效的治療手段，自1981年在美國(guó)紐約發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)艾滋病病例以來，艾滋病已發(fā) 展成一個(gè)全球性的流行病，以其傳播速度快、死亡率高和無(wú)法根治而嚴(yán)重影響了人類健康 和社會(huì)發(fā)展，受到了各國(guó)政府和國(guó)際社會(huì)的廣泛重視。HIV-I從對(duì)細(xì)胞的入侵、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、 組裝及釋放等的全過程都是藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)，但現(xiàn)在仍然缺少既能長(zhǎng)期有效又沒有毒副作 用的治療藥物，隨著研究的深入，病毒對(duì)細(xì)胞的粘附和融合過程越來越受到研究者重視。HIV-I的錨定與侵入主要是膜融合的過程，是由HIV-I外膜前體糖蛋白gpl60的加 工開始的，gpl60經(jīng)前體加工酶水解成兩個(gè)片段表面糖蛋白gpl20和跨膜蛋白gp41，其中 gpl20不含有穿膜區(qū)，它與gp41非共價(jià)鍵連接，gp41與細(xì)胞受體結(jié)合后即導(dǎo)致HIV-I的感 染，gpl20主要與細(xì)胞受體⑶4結(jié)合后而造成感染，因而對(duì)gpl60的裂解，gp41和gpl20的 結(jié)合位點(diǎn)以及與細(xì)胞受體相互作用的研究是了解HIV-I感染機(jī)理和研制抗感染藥物的關(guān) 鍵，已引起了各國(guó)科學(xué)家的極大關(guān)注，各方面的研究圍繞此展開。1993年，Jiang等最早發(fā)現(xiàn)衍生于gp41CHR區(qū)域的具有融合抑制活性的C-多 肽 SJ-2176(630-659 殘基)在 nmol/L 水平可抑制 HIV-I 感染[Jiang S et al. HIV-I inhibition bya peptide [J]. Nature, 1993,365(6442) 1130 ]。麻省理工大學(xué)的 Lu 等 對(duì)gp41用蛋白酶進(jìn)行了 一系列的水解研究，發(fā)現(xiàn)C43(624 666)、C34(628 655)、 C28(628 655)等 C-多肽具有融合抑制活性[ffeissenhorn W, Dessen A, Harrison SC, et al, Atomic structureof ectodomain from HIV-I gp41. Nature,1997 ；387 426. Chan D C, Fass D, Berger JM, etal, Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein. Cell, 1997,89(2) :263_273]。1994 年，Wild 等又發(fā)現(xiàn) gp41C 端多肽 DP-178 (638-673殘基)抑制HIV-I誘導(dǎo)合胞體形成的效率大幅度提高[Wild CT, Shugars DC, Greenwell TK, et al, Peptides corresponding to a predictive alpha-helical domain of humanimmunodeficiency virus type 1 gp41 are potent inhibitorsof virus infection[J],Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994,91 (21) :9770_9774。]。Enfuviritide (T-20)是第一個(gè)阻斷HIV-1侵入靶細(xì)胞的抗膜融合類新型抑制劑[Jason LaBonte et al. Enfuvirtide, Nature reviews drug discovery, May 2003, volume 2, 345-346]，由 36 個(gè)氨基酸殘基組成[Wild CT et al. Peptides corresponding to a predictive α -helical domain of humanimmunodeficiency virus type 1 gp41 are potent inhibitors of virus infection. MedicalSciences, October 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91，pp. 9770-9774。]，其結(jié)構(gòu)模擬 HIV-I 跨膜蛋白 gp41 的 HR2 端，能 夠有效地抑制HIV-I病毒。其抑制機(jī)理為人工模擬HR2合成的T20在病毒與靶細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng) 結(jié)合 HRl [Isabel M et al. Dilation of the HumanImmunodeficiency Virus-I Envelope Glycoprotein Fusion Pore Revealed by thelnhibitory Action of a Synthetic Peptide from gp41. The Journal of Cell Biology, Volume 140, Number 2,January 26, 1998，315-323。]，從而從入口處切斷病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。臨床研究表明多肽enfuviritide作 為口服抑制劑并不可行，但是可用作皮下注射。在一項(xiàng)對(duì)78例HIV-I病毒攜帶者進(jìn)行的每 28天一期的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的大劑量不是很有效，但是可以通過減小劑量一日兩次 進(jìn)行皮下注身寸[Wheeler DA. et al. Safety，tolerability，and plasma pharmacokinetics of high-strength formulations ofenfuvirtide (T-20)in treatment experienced HIV-l-infected patients. Journal ofclinical virology 2004. 30 (2)，183-190]。藥齊[J 量與病毒負(fù)荷量相關(guān)，但持續(xù)皮下注射受阻于技術(shù)問題。最大病毒減小率為enfuvirtide 每日兩次，每次 100mg[Greenberg M et al. Enfuvirtide (T-20) and T-1249 resistance observations from phase II clinical trialsof enfuvirtide in combination with oral antiretrovirals and a phase I/IIdose-ranging monotherapy trial of T-1249. Antiviral Ther 2002 ；7 Suppl :S140· abstract。]。T-1249是在T-20的基礎(chǔ)上發(fā)展的又一個(gè)抗膜融合多肽抑制劑，其綁定區(qū)域與 T-20綁定區(qū)域有部分重合，但是比T-20更加深入HRl的疏水槽區(qū)域[Greenberg ML et al.In vitroantiviral activity of T-1249, a second generation fusion inhibitor. Antiviral Ther2002, 7 (Suppl 1) :S10. abstract。]。這個(gè)六螺旋疏水區(qū)域在膜融合的 過程中起著重要作用。T-1249已經(jīng)在115名HIV-I病毒攜帶者中進(jìn)行了每14天一期的 臨床觀察。T-1249的服用劑量為6. 25-200mg，并且有些對(duì)照組每天一次皮下注射，有些為 兩次，最大病毒減小率為每日皮下注射T-1249總量150-200mg[Eron J et al. A 14-day assessment of the safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of T-1249, a peptide inhibitor of membranefusion. In Programs and abstracts of the Eighth Conference on Retroviruses andOpportunistic Infections, Chicago, February 4-8,2001.Alexandria, Va. :Foundationfor Retrovirology and Human Health, 2001: 47·已bstract。]。另外以gp41核心的HRl和HR2結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，經(jīng)基因重組合成的HR1-HR2系列多 肽，可以形成一個(gè)穩(wěn)定性較好的六螺旋束結(jié)構(gòu)，類似于gp41具有膜融合功能的核心區(qū)域。 在HR1-HR2的C端加上一個(gè)HRl形成HR121結(jié)構(gòu)，或者在N端加上一個(gè)HR2形成HR212結(jié) 構(gòu)，這兩個(gè)融合多肽均具有較好的穩(wěn)定性和溶解性，用假病毒和T細(xì)胞體外融合實(shí)驗(yàn)表明， 融合多肽對(duì)HIV-I的膜融合作用有潛在的抑制效果[Ling Ni et al. Rational designof highlypotent HIV-I fusion inhibitory proteins implication for developing antiviral therapeutics. Biochemical and Biophysical Research Communications 2005,332:831-836。]。申請(qǐng)人:已申請(qǐng)過專利“抗HIV-I多肽C22，其編碼序列及其制備方法”(公開號(hào) CN1810830A)，該申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基于gp41C端多肽序列的多肽抑制劑。目前HIV抑制劑藥物存在的普遍問題在于，藥物進(jìn)入人體以后易于酶解，HIV易對(duì) 藥物產(chǎn)生抗藥性以及因藥物分子量大而產(chǎn)生免疫原性，直接影響了藥物的使用效果。本領(lǐng) 域迫切需要開發(fā)出一種專一性強(qiáng)而又不易酶解的小分子量的新多肽抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一系列活性高的抗HIV-I抑制劑，包括多肽和組合多肽。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一系列抗HIV-I抑制劑的編碼序列。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了本方面多肽和組合多肽的制備方法。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述抗HIV-I抑制劑的多肽和組合多肽的用途。本發(fā)明的第一方面，提供一種抑制HIV病毒的多肽，所述多肽含有SEQ ID N0:1所 示的氨基酸序列(C22 =ELDKffASLffNWF NITNWLWYIK)。在一實(shí)施例中，所述多肽為SEQ ID NO 1所示的多肽與TrpLE的融合蛋白。優(yōu)選的，所述多肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序 列。本發(fā)明的第二方面，提供一種抑制HIV病毒的多肽，所述多肽含有SEQ ID NO :2所 示的氨基酸序列(M3 :EPSCKASRCKSIPPQCHCAN)。在一實(shí)施例中，所述多肽為SEQ ID NO 2 所示的多肽與TrpLE的融合蛋白。優(yōu)選的，所述多肽具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的第三方面，提供一種抑制HIV病毒的組合多肽，其特征在于，該組合多肽 包括SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3 (CD4M9)所示的任意二條或三條氨基酸 序列。優(yōu)選的，所述組合多肽含有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的序列、SEQ ID NO 1和 SEQ IDNO 3 的序列、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 的序列或 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 和SEQID NO :3的序列，其連接方式可以有多種排列組合。更佳的，所述連接方式如SEQ ID N0:13、SEQ ID NO 14, SEQ ID N0:15 或 SEQ ID N0:16 所示。本發(fā)明的第四方面，提供一種上述多肽的編碼序列。優(yōu)選的，所述編碼序列選自下 組中的一種(I)SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第五方面，提供一種編碼上述組合多肽的編碼序列。本發(fā)明的第六方面，提供一種上述多肽的應(yīng)用，即上述多肽在制備預(yù)防或治療HIV 病毒感染的藥物中的應(yīng)用。較佳的，上述多肽用于制備預(yù)防HIV病毒感染的疫苗。本發(fā)明的第七方面，提供一種上述組合多肽的應(yīng)用，即上述組合多肽在制備預(yù)防或治療HIV病毒感染的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，上述組合多肽用于制備預(yù)防HIV病毒感染 的疫苗。本發(fā)明的第八方面，提供一種載體，所述載體含有編碼上述多肽或組合多肽的序列。優(yōu)選的，所述載體選自pTMHa30-51中的一種。本發(fā)明的第九方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是被上述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第十方面，提供一種制備抑制HIV病毒的多肽的制備方法，其特征在于， 該方法包含(a)在適合表達(dá)抑制HIV病毒的多肽的條件下，培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出抑制HIV病毒的多肽。本發(fā)明的第十一方面，提供一種制備抑制HIV病毒的組合多肽的制備方法，其特 征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)抑制HIV病毒的組合多肽的條件下，培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出抑制HIV病毒的組合多肽。本發(fā)明的第十二方面，提供一種能與上述多肽特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選的，所述抗 體為單克隆抗體。本發(fā)明的第十三方面，提供一種能與上述組合多肽特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選的，所 述抗體為單克隆抗體。本發(fā)明的第十四方面，提供一種HIV疫苗，所述疫苗包含上述任意一種或二種以 上的多肽及藥學(xué)上所允許的載體。較佳的，所述疫苗含有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所 示的氨基酸序列、SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列、或者SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的氨基酸 序列。本發(fā)明的第十五方面，提供一種HIV疫苗，所述疫苗包含上述任意一種或二種以 上的組合多肽及藥學(xué)上所允許的載體。所述組合多肽的連接方式是很多的，在此不一一列 舉。較佳的，所述疫苗含有 SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:15 或 SEQ ID NO 16 所示的氨基酸序列，或者所述疫苗含有SEQ ID N0:13、14、15或16中任意二種、三種甚至四 種組合多肽。
具體實(shí)施例方式本研究主要從阻止HIV-I gp41穿膜的三方面入手，獲得各關(guān)鍵的多肽，通過雞尾 酒療法將三個(gè)或兩個(gè)多肽的活性中心組合成一個(gè)組合多肽，探討其治療HIV-I的效果和作 用機(jī)理。近幾年來本實(shí)驗(yàn)室以胰蛋白酶抑制劑MBI結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了一種多肽抑制劑 M3 (SEQ IDNO 2 :EPSCKASRCKSIPPQCHCAN)，對(duì) fur in 酶(蛋白質(zhì)前體加工酶)抑制活性 Ki 值達(dá)到3.26X 10_9M，抑制HIV-I的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)效果也較好。以gp41核心結(jié)構(gòu)的C端多肽分 別與類gp41的核心蛋白結(jié)合的強(qiáng)弱進(jìn)行比較，以最近本實(shí)驗(yàn)室制備的C22多肽對(duì)HIV-I有 非常好的抑制效果，經(jīng)過計(jì)算機(jī)模擬，設(shè)計(jì)出系列類C22多肽；針對(duì)CD4與gpl20綁定的結(jié) 構(gòu)分析，從CD4M3 CD4M9系列肽中，IC50從CD4M3的40 μ M變?yōu)镃D4M9的0. 1 1. 0 μ Μ，抑 制效果得到很大的提高。本研究根據(jù)雞尾酒療法的原理，利用單一多肽來阻止膜融合是有 一定的難度的，必須使用多種藥物或具有多個(gè)活性中心的多肽方可使用，或者使用本發(fā)明 多肽和其他藥物組合，可提高治療艾滋病的效果。綜合分析上述三多肽活性中心，將這些三 個(gè)或兩個(gè)多肽活性中心組合成一個(gè)新的活性多肽，最后篩選出可用于HIV-I治療的多肽或組合多肽藥物。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)在用融合蛋白pTMHa30-51系統(tǒng)表達(dá)抗 HIV-I組合多肽，可以大大簡(jiǎn)化抗HIV-I多肽的生產(chǎn)手段，提高多肽的得率。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是 多肽合成儀合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、 昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)產(chǎn)生。本發(fā)明的組合多肽的序列可以通過多肽合成儀合成或通過PCR技術(shù)將單個(gè)多肽 的DNA序列連接在一起。本發(fā)明涉及一系列含制備本發(fā)明組合多肽的方法，其包括步驟A.表達(dá)載體的構(gòu)建；B.培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有上述的組合多肽表達(dá)前體；C.分離純化出所述的組合多肽融合蛋白；D.用化學(xué)裂解得到所述的組合多肽；E.分離出組合多肽。本發(fā)明中，抗HIV-I組合多肽的核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組 表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒 或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的 一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含抗HIV-I組合多肽編碼DNA序列和合 適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體 內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合 成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的Iac或trp啟動(dòng)子，真核啟動(dòng)子包括CMV早期 啟動(dòng)子、HSV胸腺激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子和其他一些已知的可控制基因在原 核和真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和 轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基團(tuán)，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白 (GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或卡那霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化或 轉(zhuǎn)導(dǎo)到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真核細(xì)胞如酵母；植物 細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所編碼的多肽或組合 多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其他特性通過各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法 是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉 淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超濾、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、 離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其他各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。在一優(yōu)選例中，本發(fā)明的抗HIV-I組合多肽是以融合蛋白的形式表達(dá)，然后再經(jīng) 化學(xué)裂解處理。最后用分子篩層析等方法分離產(chǎn)物，即可獲得本發(fā)明的組合多肽。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片 段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但 仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化 的本發(fā)明多肽或者組合多肽可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá) 本發(fā)明多肽或者組合多肽的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用本 發(fā)明多肽或者組合多肽，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些多肽或者組合多肽可以利用重組方 法制備或利用多肽合成儀合成。與本發(fā)明多肽或者組合多肽的未修飾形式結(jié)合的抗體可以 用原核細(xì)胞(例如E. Coli)中生產(chǎn)的多肽或者組合多肽來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾 形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中 產(chǎn)生的多肽或者組合多肽來免疫動(dòng)物而獲得。多克隆抗體的生產(chǎn)可用本發(fā)明多肽或者組合多肽免疫動(dòng)物，如家兔，羊等。多種佐 劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。本發(fā)明多肽、組合多肽或者本發(fā)明編碼序列可用于制備檢測(cè)、預(yù)防和/或治療HIV 病毒感染的藥物。特別是用于制備預(yù)防和/或治療HIV病毒感染的疫苗。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明多肽或者組合多肽 以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、 水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制 成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。 諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、 片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，每天約5-90微克/千 克體重，較佳的，每天約24微克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使 用。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍 之內(nèi)的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明揭示的組合多肽是根據(jù)雞尾酒療法治療HIV-I的原理，從HIV-I膜融的 過程三個(gè)重要方面入手，將這三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的活性中心合成多肽，使該多肽行使雞尾酒療法 的功能，從而可以作為有效地抗HIV-I膜融合抑制劑。(2)本發(fā)明的多肽或組合多肽可以由表達(dá)的融合蛋白一步裂解就可以得到，或通過多肽合成儀合成得到，制備方法易操作。(3)本發(fā)明的多肽或組合多肽經(jīng)過合理設(shè)計(jì)，具有較高的抑制HIV病毒的效價(jià)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，所用 的試劑均可以在市場(chǎng)上購(gòu)買到。實(shí)施例1組合多肽的基因合成參考大腸桿菌偏愛密碼子，化學(xué)合成組合多肽C22單鏈核苷酸模板(SEQ ID NO 4) (5' GAA TTG GAT AAA TGG GCG TCG CTG TGG AAT TGG TTT AAT ATT ACC AAT TGG CTG TGG TATATT MA3，)和正向引物(SEQ ID NO 5) (5，GCG MG CTT ATG GM TTG GAT AAA TGG GCG3，)及反向引物(SEQ ID NO 6) :5，GCG GGA TCC TTA TTT AAT ATA CCA CAG CCA 3，，用 PCR 反應(yīng)獲得 C22 基因。C22-M3(SEQ ID NO 13)、C22_CD4M9 (SEQ ID NO 14)、M3_CD4M9 (SEQ ID NO :15)、C22-CD4M9-M3(SEQ ID NO 16)皆參照此原理進(jìn)行基因合成，在每個(gè)組合多肽的 正向引物引入限制性酶切位點(diǎn)Hindlll，在反向引物中設(shè)計(jì)限制性酶切位點(diǎn)Ecol I和終止 密碼子。M3 單鏈核苷酸模板(SEQ ID NO 7) (CTT GGA GCA CTA CGA TCT TCA CTT ACGTTC TCT TCA TAT CGA GGA TTG ACG GTA CGA CGA TTG)，正向引物(SEQ ID NO 8) (5，GCGAAG CTT ATG CTT GGA GCA CTA CGA TCT TCA CTT 3，)及反向引物(SEQ ID NO 9) :(5，GCG GGA TCC TTA CAA TCG TCG TAC CGT CTT TCC 3，)；CD4M9單鏈核苷酸模板(SEQ ID NO 10) (ACG TTG MT CGA TCA ACG TTC AAT TCT ACG CTA TCA AAT CCG MT AAT CAG TTC ACG CGACCG TCA CTT ACG CGA ACG CCG GGA)，正向引物(SEQ ID NO 11) (5，GCG AAG CTT ATG ACGTTG AAT CGA TCA ACG TTC AAT 3，)及反向引物(SEQ ID NO 12) (5，GCG GGA TCC TTATCC CGG CGT TCG CGT AAG TGA 3')。PCR 反應(yīng)條件在 50 μ 1 反應(yīng)體系中(50mM KCl，IOmM Tris-HCl, pH8. 3,2. OmM MgC12,200yM dNTPs)加入擴(kuò)增引物各50pmol。充分混勻后開始PCR循環(huán)95°C變性1分 鐘，94°C變性5分鐘，53°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后在72°C保 溫10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收后用于克隆。實(shí)施例2組合多肽質(zhì)粒構(gòu)建將實(shí)施例1中獲得的PCR片段分別使用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切， 與同樣雙酶切的載體pTMHa30 (購(gòu)自Amersham公司)連接，連接好的載體(50 μ 1感受態(tài)細(xì) 胞需25ngDNA)轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞的5%，輕輕 旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物。冰浴30分鐘；將管放入42°C水浴，定時(shí)90秒熱休克；快速將管轉(zhuǎn)移 到冰浴90秒，使細(xì)胞冷卻；每管加入800 μ ILB培養(yǎng)基，37°C緩搖45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇并表 達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因；低速離心2分鐘，去上清，留約100 μ 1培養(yǎng)基在微量離 心管內(nèi)，重懸菌體；用玻璃鋪菌器將菌液在瓊脂板上鋪勻；將平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱， 12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。涂板后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建正確。實(shí)施例3 本發(fā)明組合多肽的表達(dá)將實(shí)施例2中獲得的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)中，挑單菌落于37°C 培養(yǎng)過夜，次日按轉(zhuǎn)接于LB (含kana 10 μ g/ml)中，37°C培養(yǎng)至0D600約為0. 6 0. 8 時(shí)，加入終濃度為0. 5mmol/L IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3 4h，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，離心，收集菌體， 超聲破菌后，再離心，收集上清和沉淀，分別經(jīng)SDS-PAGE (分離膠15%，堆積膠4. 5% )分析目的蛋白的表達(dá)部位。結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物在沉淀中。實(shí)施例4 本發(fā)明組合多肽的純化將實(shí)施例3 中收集的菌體用 IOmM Tris-HCl (pH = 8. 0) UmM EDTA, 10% sucrose 超聲洗滌兩次，再用 IOmMTris-HCl (pH = 8. 0)、ImMEDTA, 1 % TritonX-IOO 超聲洗滌一次， 包涵體用 buffer A(6MGuHCl,50mM phosphate buffer (pH = 8. 0)，DTT)溶解后上預(yù)平衡的 Ni 柱，用 bufferB(8M Urea, 50mM phosphate buffer (pH = 6.3))洗至基線，Buffer C 洗脫 (6MGuHCl，冰醋酸，pH = 2. 0)，收集洗脫液，用水透析過夜。得蛋白，凍干后，用70 %甲酸溶 解，用CNBr裂解3小時(shí)后，水透析過夜。凍干后再次用buffer A溶解，上預(yù)平衡的M柱，并 用buffer A洗至基線，收集所有流出液，用氧化型谷胱苷肽氧化，水透析后，用反相HPLC分 離目標(biāo)蛋白(安捷倫公司Agilent 1100型HPLC)，分別獲得C22-M3、C22-CD4M9、M3-CD4M9 或C22-CD4M9-M3組合多肽。實(shí)施例5 本發(fā)明組合多肽的細(xì)胞毒性及HIV-I進(jìn)入抑制活性檢測(cè)抗病毒活性試驗(yàn)取105MT-2細(xì)胞包被接種在96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入連續(xù)3倍稀釋的實(shí)驗(yàn)多肽 (5,1.67,0. 56,0. 19，0. 021，0mg/ml，每樣作2孔平行試驗(yàn))孵化2小時(shí)。用100半數(shù)致細(xì) 胞病變滴度(TCID50)的HTLV-IIIB (馬里蘭大學(xué)生物醫(yī)學(xué)部提供)感染每孔細(xì)胞，5天后收 取細(xì)胞上清液，測(cè)定HIV-1P24抗原產(chǎn)量。細(xì)胞毒性試驗(yàn)105MT-2細(xì)胞接種在96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入不同稀釋度的實(shí)驗(yàn)多肽(1，0.5， 0. 25，0. 125,0. 064，0. 032,0. 016，Omg/ml，每樣作2孔平行試驗(yàn))，培養(yǎng)5天后，加入MTT試 齊U，測(cè)定OD值。結(jié)果表明C22-M3(SEQID NO 13)、C22-CD4M9 (SEQ ID NO 14)、M3-CD4M9 (SEQ ID NO 15)、C22-CD4M9-M3 (SEQ ID NO 16)等組合多肽抑制HIV-I的LD50均達(dá)到和好于 0. IlmM 水平。各組合多肽在使用濃度未顯示任何毒性。實(shí)施例6 C22-M3組合多肽兔源性多克隆抗體的制備按照分子克隆指南(Coldspring harbor laboratory edition，1989)，將實(shí)施 例4中純化得到的C22-M3組合多肽與福氏佐劑混合后免疫家兔，加強(qiáng)三次后取血，制得抗 C22-M3組合多肽的兔源多克隆抗體抗血清。實(shí)施例7藥物組合物的制備以生理鹽水為溶劑制備藥物針劑，每針劑的藥物溶解量為0. 6毫克。體重為50千克的病人，每天注射兩次，每次一劑。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
一種組合多肽，其特征在于，該組合多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO16。
2.—種權(quán)利要求1所述的組合多肽的編碼序列。
3.權(quán)利要求1所述的組合多肽在制備預(yù)防或治療HIV病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
4.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的編碼序列。
5.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是被權(quán)利要求4所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn) 導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
6.一種制備抑制HIV病毒的多肽或組合多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)抑制HIV病毒的多肽或組合多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主 細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出抑制HIV病毒的多肽或組合多肽。
7.一種能與權(quán)利要求1所述的組合多肽特異性結(jié)合的抗體。
8.—種HIV疫苗，其特征在于，所述疫苗包含權(quán)利要求1所述的組合多肽及藥學(xué)上所允 許的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗HIV-I的多肽和組合多肽，以及這些多肽和組合多肽的編碼序列、表達(dá)載體、制備方法和用途。本發(fā)明的多肽和組合多肽是基因重組后表達(dá)或通過多肽合成儀合成，工藝簡(jiǎn)單，且可提高最終產(chǎn)率和抑制HIV-I的侵入效果，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K16/44GK101838318SQ20101014259
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者何嬌娟, 史鈞, 孫曉宇, 林楠, 汪世龍, 王淵, 王玫 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)