一種二/三甲基化肽段富集和質(zhì)譜分析的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬蛋白質(zhì)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種二/三甲基化修飾肽段富集和質(zhì)譜分析的方法。
[0002]尤其是利用EZ-NHS-b1tin與未修飾(KmeO)或者單甲基化修飾(Kmel)的賴氨酸發(fā)生特異性反應(yīng)而不會與二、三甲基化(Kme2/3)修飾的賴氨酸反應(yīng)的特點使KmeO/Ι修飾肽段帶上生物素基團(tuán)，通過親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球去除KmeO/Ι修飾的賴氨酸肽段，對Kme2/3修飾的賴氨酸肽段的富集并質(zhì)譜分析的新方法。本發(fā)明方法首次實現(xiàn)對Kme2/3修飾肽段的化學(xué)富集，能顯著地提高Kme2/3修飾肽段的分析質(zhì)譜選擇性，并且具有特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、步驟簡單、操作方便等特點。
【背景技術(shù)】
[0003]現(xiàn)有研究公開了蛋白質(zhì)甲基化是生物體內(nèi)組普遍存在的一種翻譯后修飾，執(zhí)行著重要的生物學(xué)功能。甲基化修飾在各種生命現(xiàn)象中都起著重要的調(diào)控作用，精氨酸甲基化主要參與調(diào)控RNA合成，DNA損傷修復(fù)，蛋白轉(zhuǎn)運以及信號傳遞等過程，而對賴氨酸甲基化的功能研究相對較少，近期的研究發(fā)現(xiàn)非組蛋白賴氨酸甲基化參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。高靈敏地鑒定生物體內(nèi)的甲基化后修飾位點是實現(xiàn)其進(jìn)一步研究的首要前提，然而，它們的研究都面臨著類似的困難，首先，甲基化修飾基團(tuán)非常小，不會像乙酰化或者磷酸化修飾一樣改變所修飾氨基酸位點的電子云分布，因此甲基化修飾肽段和非甲基化修飾肽段之間的理化性質(zhì)差異很小，很難區(qū)分。第二，甲基化修飾的蛋白質(zhì)在體內(nèi)含量通常較低，蛋白酶解后產(chǎn)生的甲基化肽段占全部肽段的比例更低，甚至不到1%。第三，甲基化存在多種不同狀態(tài)，如賴氨酸上可以發(fā)生一甲基化(Kmel)、二甲基化(Kme2)、三甲基化(Kme3)修飾，精氨酸上包括一甲基化(Rmel)、對稱二甲基化(Rme2s)以及非對稱二甲基化(Rme2a)，導(dǎo)致甲基化修飾肽段的信號分散和減弱，更難以被質(zhì)譜檢測。第四，帶有甲基化修飾的肽段在質(zhì)譜中的離子化效率和質(zhì)譜響應(yīng)往往比非修飾肽段低，對質(zhì)譜的靈敏度要求更高。目前已有的甲基化蛋白研究策略包括肽段或者蛋白芯片，甲基化抗體和化學(xué)親和方法與質(zhì)譜聯(lián)合分析，但是這些方法所得到的賴氨酸甲基化蛋白數(shù)目和可靠程度都亟待提高，而且對起始樣本需求量大，通量也并不是很高。因此，本申請的發(fā)明人擬提供一種反應(yīng)更加特異和更加高效的二三甲基化肽段反向富集方法，該方法將有利于實現(xiàn)高選擇性和高靈敏度質(zhì)譜鑒定，從而進(jìn)一步促進(jìn)甲基化蛋白質(zhì)的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于補(bǔ)充現(xiàn)有甲基化修飾肽段富集方法的不足，為二/三甲基化修飾肽段富集和質(zhì)譜分析提供一種步驟簡單、操作方便、高特異性、高重現(xiàn)性的新方法，實現(xiàn)甲基化肽選擇性富集和高靈敏度質(zhì)譜鑒定。
[0005]本發(fā)明提供的二/三甲基化修飾肽段富集和質(zhì)譜分析的方法，利用生物素化試劑(EZ-NHS-b1tin)基團(tuán)能夠與未修飾(KmeO)或者單甲基化(Kmel)(記為KmeO/Ι)修飾的賴氨酸發(fā)生特異性反應(yīng)而不會與二、三甲基化(Kme2/3)修飾的賴氨酸反應(yīng)的特點，通過親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球去除KmeO/Ι修飾的賴氨酸肽段，對Kme2/3修飾的賴氨酸肽段進(jìn)行富集；具體步驟為:
(1)蛋白生物素化修飾:基于N-羥基琥珀酰亞胺與賴氨酸側(cè)鏈氨基的高效反應(yīng)，采用生物素化試劑(EZ-NHS-b1tin)，通過化學(xué)反應(yīng)將生物素基團(tuán)引入賴氨酸KmeO/Ι上，實現(xiàn)蛋白樣品中賴氨酸KmeO/Ι的高效生物素化修飾；
(2)蛋白沉淀:向經(jīng)步驟(I)生物素化修飾的蛋白樣品加入丙酮，過夜，沉淀蛋白，同時去除過量的生物素化試劑；
(3)蛋白酶解:向經(jīng)步驟(2)處理的蛋白中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白的質(zhì)量比1:40-60，充分混合，35-39攝氏度酶切14-16小時，使蛋白完全酶解成氨基酸長度在10-20之間的的肽段；
(4)親和素去除生物素修飾肽段:用緩沖液(例如:20mMNaH2PO4，0.15M NaCl (PH7.4))稀釋肽段至1-1.5ml，用親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球為吸附劑，利用親和素和生物素之間的高親和能力，將生物素化的KmeO/Ι吸附到親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球上，親和吸附過程在2-6攝氏度條件下進(jìn)行，時間2-4小時，充分去除發(fā)生生物素修飾的KmeO/Ι修飾肽段；
(5)質(zhì)譜分析:600-1200g(離心機(jī)的轉(zhuǎn)速，說明:離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)與離心力的換算，r為離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部內(nèi)壁的距離;:rpm(revolut1n per minute)為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù);RCF(relative eentrifugal force)為相對離心力，以地心引力，即重力加速度的倍數(shù)來表示，一般用g表示)離心后取上清，通過除鹽柱富集上清中的肽段，凍干，然后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。
[0006]步驟(I)中，所述蛋白樣品可用緩沖液1(如:l-5%SDS，10-30Mm Hepes，PH=7_8)提取細(xì)胞全蛋白得到，蛋白樣品濃度為lugAiL~ 5ugAiL;所述采用生物素化試劑(EZ-NHS-b1tin)，通過化學(xué)反應(yīng)將生物素基團(tuán)引入賴氨酸KmeO/Ι上，是在蛋白樣品中，加入5_30mM的碳酸氫氨，同時加入等體積5-30mM的EZ-NHS-b1tin，在35-39攝氏度下避光混合，使樣品中的KmeO/1修飾的賴氨酸被充分被生物素化。
[0007]步驟(2)中，蛋白沉淀的操作過程為:在向所述蛋白樣品中加入5-10倍體積的預(yù)冷丙酮，-10-30攝氏度過夜；11000-15000g離心20-40分鐘后得到蛋白沉淀，用預(yù)冷丙酮洗2-4次，完全去除生物素化試劑。
[0008]步驟(3)中，可先用6-10M尿素重溶步驟(2)中得到的蛋白沉淀，用緩沖液2(如15-40 mM NH4HCO3)稀釋至0.5-2M尿素;然后加入胰蛋白酶，進(jìn)行酶解。
[0009]步驟(4)中，稀釋肽段的緩沖液可為15-40mM NH4HCO3ji瓊脂糖微球材料與所富集肽段的體積質(zhì)量比為50-200ul/lmg。
[0010]步驟(4)中，先對親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球用緩沖液進(jìn)行清洗，重復(fù)2-3次，緩沖液可為:15-40 mM NaH2P04，0.1-0.2 M NaCl(PH7.4)。
[0011]步驟(5)中，操作過程為:合并步驟(4)中所得到的上清和清洗液;然后除鹽、凍干；再重溶于0.05-0.2 (優(yōu)選0.1%)FA中；最后進(jìn)行LC-MS/MS分析。
[0012]本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟(I)中的蛋白樣品濃度為IugAiL~ 5ug/yL，溶于2%SDS, 20mM Hepes(PH=7.4)的緩沖液I中；蛋白樣品被5mM的EZ-NHS_B1tin，5mM的碳酸氫錢中避光反應(yīng)30min，加入終濃度碳酸氫錢至終濃度為20 mM混合2分鐘以終止反應(yīng)。
[0013]本發(fā)明的一個實施例中，所述的步驟(3)中用SM尿素重溶蛋白至完全溶解，可適當(dāng)超聲，用25mM NH4HCO3作為緩沖液2對蛋白樣品進(jìn)行稀釋，至尿素終濃度為IM以下，按Img蛋白中加入20ug胰蛋白酶的比例進(jìn)行酶解，并保持37攝氏度酶解14-16小時。
[0014]本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟(4)中的親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球購于天地人和生物科技有限公司；其中加入的瓊脂糖微球材料與所富集肽段的體積質(zhì)量比為10ul/Img;生物素和親和素的結(jié)合溫度是4攝氏度，結(jié)合時間是2-4小時。
[0015]本發(fā)明的一個實施例中，所述的步驟(4)中，用20mM NaH2PO4^0.15M NaCl(PH7.4)作為緩沖液3，每次用400ul緩沖液3對親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球進(jìn)行清洗，重復(fù)2次;每次清洗后100g離心將固相微球和溶液分開，收集瓊脂糖微球；
本發(fā)明采用親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球為吸附劑，利用親和素和生物素化修飾后的肽段上的生物素之間的親和作用，經(jīng)離心將生物素化修飾的肽段去除，最終實現(xiàn)二、三甲基化修飾肽段富集和質(zhì)譜分析。本發(fā)明首次實現(xiàn)對Kme2/3修飾肽段的化學(xué)富集，能顯著地提高Kme2/3修飾肽段的分析質(zhì)譜選擇性，并且具有特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、步驟簡單、操作方便等特點。
【附圖說明】
[0016]圖1為本富集并質(zhì)譜鑒定方法的流程圖。
[0017]圖2為0.05 mM標(biāo)準(zhǔn)肽段FQLTDIPAAPR，ALSNSTPQNSFSEK的MALD1-T0F-MS譜圖，MALD1-T0F-MS譜圖縱坐標(biāo)為質(zhì)譜峰的相對強(qiáng)度(％ Intensity )，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比(m/z);(a/d)未反應(yīng)肽段，(b/e) 1mM EZ-B1tin,PBSCPH 7.4)，室溫 30min 反應(yīng)后的肽段，(c/f)1mM EZ-B1tin，1mM NH4CO3,2% SDS，20mM HepesCPH 7.4)37°C 30min反應(yīng)后的肽段。*為肽段底物的單電荷峰，#為生物素修飾后的肽段;對比圖(a/d)、圖(b/e)和圖(c/f)可以看出，圖(c/f)中的生物素化效率達(dá)到95%以上，能夠?qū)崿F(xiàn)肽段的高效生物素