專利名稱：一種槲皮素配基瓊脂糖氫鍵吸附色譜分離多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽分離純化方法，具體的是涉及一種槲皮素配基、高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜分離純化多肽的方法。
背景技術(shù)：
自然界存在著數(shù)量龐大種類繁多的生物活性多肽，在各種生命活動中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，涉及各種毒素、激素、抗菌肽、信息素、細(xì)胞因子等，廣泛參與分子識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化及個體發(fā)育調(diào)控等過程。生物活性多肽的開發(fā)與利用已經(jīng)越來越受到醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)的重視，特別是醫(yī)藥行業(yè)，已經(jīng)有大量生物活性多肽作為激素、抗生素、疫苗、診斷試劑、酶抑制劑、抗腫瘤藥物等通過了臨床試驗，投放市場，如催產(chǎn)素、降鈣素、血管緊張肽、內(nèi)啡肽等等。我國地域遼闊，動植物資源極其豐富，具有大量待開發(fā)的生物活性多肽，僅僅海洋生物活性多肽就有數(shù)萬種之多。開發(fā)多肽類藥物具有其特殊優(yōu)勢1)多肽分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，易于化學(xué)合成或生物合成，有利于規(guī)模化、商品化；2)功能特異，合成純度高，不產(chǎn)生熱原，使用安全；3)易于被機(jī)體吸收，給藥途徑多樣化(如口服、噴霧、透皮吸收等)。多肽類藥物的研究已經(jīng)成為目前醫(yī)藥行業(yè)的熱點。生物活性多肽作為藥物，與作為食品添加劑或化妝品添加劑相比，要求具有更高的純度，雜質(zhì)成分不但會降低藥效，還可能產(chǎn)生毒副作用。通常所說的生物活性多肽一般分為兩種一種是天然活性多肽，即生物組織中天然存在的括性多肽，包括抗生素、激素、毒素等；另一種是酶解活性多肽，即通過特異性蛋白酶的水解作用，從大分子蛋白中釋放出的活性肽段。無論是哪一種活性多肽，在對其進(jìn)行毒理、藥理研究，或者精確的結(jié)構(gòu)解析之前，都需要首先將其從成分極其復(fù)雜的組織提取物或蛋白水解物中分離純化出來。在結(jié)構(gòu)和功能研究清楚之后，可以通過生物合成或化學(xué)合成實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，以滿足臨床需要，這時同樣需要高產(chǎn)并且能夠保持多肽生物活性的分離純化方法，從合成混合物中分離純化目標(biāo)多肽，最終形成產(chǎn)品。生物活性多肽的生產(chǎn)工藝可以分為粗分離和純化兩部分。多肽的粗分離方法主要包括液-液萃取、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、超濾等，獲得了粗提物之后，再進(jìn)行進(jìn)一步純化。多肽的純化大多采用幾種色譜技術(shù)相結(jié)合的方法，包括凝膠過濾色譜、離子交換色譜、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、親和色譜、疏水相互作用色譜、反相高效液相色譜和逆流色譜等，每種方法都有其優(yōu)勢和局限。通常多肽的粗分離樣品經(jīng)過1 2步精分離，如離子交換色譜、 凝膠過濾色譜或毛細(xì)管電泳，再經(jīng)過1 3次不同表面基團(tuán)(C18、C8、C4等)的反相高效液相色譜，就能夠得到很好的純化。對于那些結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、易失活的多肽，要盡可能減少分離步驟，從而實現(xiàn)較高的活性回收。凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography)，也稱為分子排阻色譜(size exclusionchromatography, SEC)，根據(jù)多肽分子的分子量和形狀的差異，利用其在多孔凝膠介質(zhì)中擴(kuò)散速率的不同進(jìn)行分離。選擇合適的粒徑、孔隙率和剛性的介質(zhì)，對多肽單體和聚集態(tài)、線性肽和環(huán)肽以及在修飾程度具有微小差異的多肽都能實現(xiàn)很好的分辨率。但對于分子量相近甚至相同的多肽，單純采用凝膠過濾的方法很難將其分開。離子交換色譜(ion exchange chromatography，IEC)根據(jù)多肽分子帶電狀態(tài)的不同實現(xiàn)分離。離子交換介質(zhì)種類較多，大孔樹脂、均孔樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、 瓊脂糖凝膠都可以作為基礎(chǔ)材料，表面鍵合了不同的陰、陽離子，可選擇的范圍廣。IEC需在高鹽濃度洗脫，易發(fā)生聚合而失活的多肽則不宜采用這一方法。反才目高效液才目色 ill (reversed phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)是目前分辨率最高的多肽純化方法，可以精確分辨一個氨基酸殘基的差異，經(jīng)常被用作最終的純度驗證步驟。盡管已經(jīng)有商品化的制備級RP-HPLC色譜柱，但將RP-HPLC技術(shù)應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)生物活性多肽，還是有困難的。第一，RP-HPLC樣品載量較低，且不易放大；第二，介質(zhì)的重復(fù)使用次數(shù)有限，對樣品的要求較高；第三，硅膠基質(zhì)結(jié)合C鏈基團(tuán)的分離介質(zhì)，用作臨床用藥的生產(chǎn)，其生物相容性與生物安全性沒有葡聚糖、瓊脂糖類的介質(zhì)高。鑒于以上常用的多肽分離方法都不能實現(xiàn)一步分離，操作步驟繁瑣，而RP-HPLC 的樣品載量、重復(fù)使用次數(shù)和生物安全性也限制了其規(guī)?；a(chǎn)，需要開發(fā)更加高效高產(chǎn)而且易于規(guī)模化的多肽分離方法。目前還沒有將吸附色譜應(yīng)用于多肽分離的報道。這里所說的吸附色譜(adsorption chromatography)，是指廣義的吸附，不僅包括通常所指的無化學(xué)鍵引入的物理作用，也包括疏水相互作用和氫鍵作用等。利用介質(zhì)對提取物吸附強(qiáng)度的不同來實現(xiàn)分離。涉及的介質(zhì)范圍非常廣泛，包括硅膠、鍵合相硅膠、瓊脂糖、葡聚糖、氧化鋁、大孔吸附樹脂、聚酰胺、活性碳、羥基磷灰石等。氫鍵吸附色譜常用的介質(zhì)為聚酰胺。又有研究表明，一些高濃度、高交聯(lián)度的葡聚糖、瓊脂糖介質(zhì)對小分子物質(zhì)，特別是含芳環(huán)的化合物也有吸附作用，早先把這種吸附作用歸結(jié)為疏水相互作用，但近來的研究表明，在有些流動相條件下，除了疏水相互作用，更主要的還是氫鍵作用，也可以作為氫鍵吸附色譜介質(zhì)使用。多肽所含有的肽鍵本身就可以和介質(zhì)間形成氫鍵，有的氨基酸側(cè)鏈中還含有醇羥基、酚羥基、巰基、氨基等，也可以形成氫鍵。因此，氫鍵吸附色譜在多肽分離領(lǐng)域很有應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是在于簡化多肽分離的步驟，克服傳統(tǒng)方法步驟復(fù)雜，反相色譜介質(zhì)重復(fù)利用度低、難于規(guī)?；?、樣品載量低、生物相容性差等缺點。采用以氫鍵相互作用為主的氫鍵吸附色譜純化多肽，提高選擇性，簡化工藝，提高產(chǎn)品回收率、穩(wěn)定性和生物安全性，提高樣品載量和介質(zhì)重復(fù)利用度。本方法適用于從生物組織提取物、蛋白水解物或多肽生物合成混合物、多肽化學(xué)合成混合物中分離純化天然多肽及其活性同源物、變體、片段及人工修飾過的多肽等。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明提供一種槲皮素配基、高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜分離純化多肽的方法，具體步驟如下1)制備生物組織粗提物、蛋白水解物或多肽合成混合物；
2)選擇瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)以槲皮素配基，以10_30μπι粒徑、12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的分離介質(zhì)；3)選擇流動相水，乙醇-水，乙醇-乙酸-水，乙醇-三氟乙酸-水，甲醇-水， 甲醇-乙酸-水，甲醇-三氟乙酸-水，乙腈-水，乙腈-乙酸-水，乙腈-三氟乙酸-水等體系，采用不同溶劑配比；4)選擇洗脫方式可采用等度洗脫，線性梯度洗脫或分步的等度洗脫分離多肽混和物；5)將步驟2選定的介質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理瓊脂糖凝膠介質(zhì)在20%乙醇保存液中裝柱，平衡到初始流動相即可使用；6)將步驟幻選定并配制好的流動相超聲脫氣或真空脫氣10-30min，室溫靜置 0.5-lh ；7)使用步驟6)配制好的流動相平衡氫鍵吸附色譜柱兩個柱體積，采用步驟4)的洗脫方式，線性流速20 lOOcm/h，紫外檢測器210-280nm或采用示差檢測器在線監(jiān)測，自動收集餾分；8)將步驟7)收集的餾分冷凍干燥，檢測純度采用反相高效液相色譜C18柱，以甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-三氟乙酸-水或乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-三氟乙酸-水為流動相，采用線性梯度洗脫，以B相溶解樣品，紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，計算多肽純度和收率；9)步驟8)獲得的純度95%以上的餾分，質(zhì)譜檢測確定分子量及氨基酸序列，并利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對；10)具有特殊生物活性的多肽在分離前后測定其活性，計算多肽活性回收率。本發(fā)明提供了一種使用槲皮素配基、高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜分離純化多肽的方法，首次將這一方法應(yīng)用于生物組織提取物、蛋白水解物或多肽合成混合物中多肽的分離純化，是對現(xiàn)有多肽，尤其是氫鍵性多肽分離純化方法的有益補(bǔ)充，與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)勢在于一步分離可獲得較高純度的多肽，回收率高；不需要高濃度鹽溶液進(jìn)行洗脫，多肽產(chǎn)生聚合變性的可能性小，不需透析避免耗費大量緩沖液；介質(zhì)對粗樣品耐受強(qiáng)，樣品載量高，介質(zhì)可重復(fù)利用數(shù)十次，易于規(guī)模放大，特別是瓊脂糖介質(zhì)的生物安全性非常好。


圖1槲皮素配基12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離三種甘氨酸寡肽混合物圖2槲皮素配基12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化固相合成胸腺五肽混合物
具體實施例方式實施例1、使用槲皮素配基12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離三種甘氨酸寡肽混合物1)配制甘氨酸寡肽混合物稱取標(biāo)準(zhǔn)品0. 6mgGly-GlyU. 2mgGIy-GIy-GIy和0. ^igGly-Gly-Gly-Gly-Gly,混合后溶解在5mL流動相中，超聲助溶，0. 45 μ m濾膜過濾；2)配制流動相配制乙腈-水(10 90)溶液，超聲脫氣30分鐘，靜置1小時；3)槲皮素配基12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)在20%乙醇保存液中濕法裝柱，層析柱內(nèi)徑10mm，柱床體積24mL，介質(zhì)耐壓2. 5MPa，初始流動相平衡層析柱2個柱床體積；4)通過自動進(jìn)樣閥進(jìn)樣500 μ L配制好的甘氨酸寡肽混合樣品；5)等度洗脫，線性流速30cm/h，紫外檢測器210nm監(jiān)測，收集洗脫峰；6)槲皮素配基12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)層析柱分離甘氨酸寡肽混合物所得的譜圖如圖1所示，分別收集的1、2、3號洗脫峰，凍干，重新溶解，C18柱檢測，根據(jù)保留時間判斷1、2、3號洗脫峰分別為Gly-Gly、Gly-Gly-Gly和 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly，各餾分純度> 95%，回收率> 85%。實施例2、使用槲皮素配基12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化液相合成胸腺五肽混合物1)液相合成胸腺五肽混合物；2)配制流動相配制乙腈-水(30 70)溶液，超聲脫氣30分鐘，靜置1小時；3)槲皮素配基12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)瓊脂糖凝膠介質(zhì)濕法裝柱，層析柱內(nèi)徑10mm，柱床體積2細(xì)1，耐壓2. 5MPa，層析柱用初始流動相平衡2個柱床體積；4)液相合成胸腺五肽混合物樣品通過自動進(jìn)樣閥進(jìn)樣Iml ；5)等度洗脫，一般線性流速在40cm/h，紫外檢測器^Onm監(jiān)測，收集洗脫峰；6)槲皮素配基12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離液相合成胸腺五肽混合物的譜圖如圖2所示，餾分凍干，重新溶解，經(jīng)RP-HPLC (C18柱)檢測，胸腺五肽純度95%。
權(quán)利要求
1.一種槲皮素配基瓊脂糖氫鍵吸附色譜分離多肽的方法，利用槲皮素配基、高濃度、高交聯(lián)度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)與目標(biāo)多肽之間產(chǎn)生的強(qiáng)度不同的氫鍵相互作用，從生物組織提取物、蛋白水解物或多肽合成混合物中分離純化多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的一種槲皮素配基、高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜分離純化多肽的方法，包括如下的步驟1)制備生物組織粗提物、蛋白水解物或多肽合成混合物；2)選擇瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)以槲皮素配基，以10-30μπι粒徑、12%濃度的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的分離介質(zhì)；3)選擇流動相水，乙醇-水，乙醇-乙酸-水，乙醇-三氟乙酸-水，甲醇-水，甲醇-乙酸-水，甲醇-三氟乙酸-水，乙腈-水，乙腈-乙酸-水，乙腈-三氟乙酸-水等體系，采用不同溶劑配比；4)選擇洗脫方式可采用等度洗脫，線性梯度洗脫或分步的等度洗脫分離多肽混和物；5)將步驟2選定的介質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理瓊脂糖凝膠介質(zhì)在20%乙醇保存液中裝柱，平衡到初始流動相即可使用；6)將步驟幻選定并配制好的流動相超聲脫氣或真空脫氣10-30min，室溫靜置 0.5-lh ；7)使用步驟6)配制好的流動相平衡氫鍵吸附色譜柱兩個柱體積，采用步驟4)的洗脫方式，線性流速20 lOOcm/h，紫外檢測器210-280nm或采用示差檢測器在線監(jiān)測，自動收集餾分；8)將步驟7)收集的餾分冷凍干燥，檢測純度采用反相高效液相色譜C18柱，以甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-三氟乙酸-水或乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-三氟乙酸-水為流動相，采用線性梯度洗脫，以B相溶解樣品，紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，計算多肽純度和收率；9)步驟8)獲得的純度95%以上的餾分，質(zhì)譜檢測確定分子量及氨基酸序列，并利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對；10)具有特殊生物活性的多肽在分離前后測定其活性，計算多肽活性回收率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用槲皮素配基、高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化多肽的方法。此方法采用以槲皮素配基，以高濃度、高交聯(lián)度的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的介質(zhì)，根據(jù)以氫鍵相互作用為特征的氫鍵吸附色譜原理，從生物組織提取物、蛋白水解物或多肽合成混合物中一步分離純化得到高純度的多肽，具有選擇性高、純化工藝簡單、樣品載量高、介質(zhì)重復(fù)利用度高等優(yōu)點?？朔鹘y(tǒng)方法步驟復(fù)雜，反相色譜介質(zhì)重復(fù)利用度低、難于規(guī)?；?、樣品載量低、生物相容性差等缺點。獲得的多肽餾分通過反相高效液相色譜確定純度，通過質(zhì)譜確定多肽序列和分子量。
文檔編號C07K1/22GK102212104SQ20101014490
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者俞保彬, 周天瓊, 周正兵, 谷海濤, 顧銘, 高留根 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所, 杭州華津藥業(yè)股份有限公司