專利名稱：：一種小麥千粒重相關蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種小麥千粒重相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
：在高等植物中，細胞分裂素(CK)通過控制細胞分裂與分化而廣泛參與了植物生長發(fā)育的調控。研究表明，細胞分裂素在植物胚胎發(fā)育、根和芽的分化、維管束形成、葉綠體成熟、頂端優(yōu)勢、光信號轉導以及延緩衰老等過程中均具有重要的調控作用。細胞分裂素氧化/脫氫酶(CKX)是降解植物體內細胞分裂素的主要酶類，可以通過氧化或還原反應去除細胞分裂素N6上帶有的不飽和側鏈而使其徹底喪失活性，該降解途徑被認為是調節(jié)植物體內細胞分裂素動態(tài)平衡的一種重要方式，因此，分離克隆農作物中的CKX基因，并深入了解其在作物生長發(fā)育以及形態(tài)建成中的作用機理，對于作物產(chǎn)量、抗性等重要農藝性狀的改良無疑將具有重要的現(xiàn)實意義。自1999年Houba等和Morris等采用功能克隆的方法首先從玉米中分離出第一個植物CKX基因(ZmCKXl)以來，在擬南芥、蘭花、水稻、大麥中也相繼分離到了CKX基因。在玉米中的研究發(fā)現(xiàn)，CKX活性與玉米籽粒中的CK含量和細胞分裂速率之間明顯相關。2005年，日本科學家通過圖位克隆策略鑒定出了一個控制水稻穗粒數(shù)的主效QTL位點(Gnla，可解釋表型變異的20%)，分析發(fā)現(xiàn)該位點編碼一個細胞分裂素氧化/脫氫酶(0sCKX2)。通過對不同品種中0sCKX2等位變異的比較發(fā)現(xiàn)，0sCKX2基因功能的降低或喪失可以導致細胞分裂素在花序分生組織的積累，進而在不同品種中表現(xiàn)出穗粒數(shù)不同程度的提高。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質及其編碼基因，該蛋白質及其編碼基因與小麥千粒重性狀相關。本發(fā)明提供的蛋白和基因來源于小麥，基因記作TaCKX6基因。本發(fā)明提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與小麥千粒重相關的由(a)衍生的蛋白質。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列r^lpf^ijPoly-Arg5-6(通常為5個)RRRRR<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5‘端和/或3‘端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4)或5)的基因1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；(此基因為TaCKX6基因的開放讀碼框的基因組序列，其中第2內含子中具有18bp插入的基因)2)如下核苷酸序列所示的DNA分子序列表中序列1缺失了自其5'末端起第3062-3079位核苷酸后得到的序列；(此基因為TaCKX6基因的開放讀碼框的基因組序列，此基因為第2內含子中具有18bp缺失的基因)3)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；(此基因為TaCKX6基因的cDNA序列)4)與1)或2)限定的DNA分子具有98%以上同源性且編碼所述小麥千粒重相關蛋白質的DNA分子；(此基因具體可為與1)或2)所述基因序列存在1個或幾個堿基突變的基因)5)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述小麥千粒重相關蛋白質的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC,0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。擴增上述任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引物對為如下1)或2)所示1)一條引物序列如序列4所示，另一條引物序列如序列5所示；(此為擴增基因全長的引物)2)一條引物序列如序列6所示，另一條引物序列如序列7所示。(此為鑒定待測小麥18bp插入/缺失變異的In-Del標記引物)含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述任一所述編碼基因在鑒別小麥千粒重中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述任一所述引物在鑒別小麥千粒重中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種鑒別小麥千粒重的方法。本發(fā)明所提供的鑒別小麥千粒重的方法，包括如下步驟檢測待測小麥品種基因組中的上述編碼基因(即TaCKX6基因的開放讀碼框的基因組序列)中的第2個內含子中是否含有如下18bpDNA片段序列表中序列1自5'末端起第3062-3079位核苷酸所示DNA片段；不含有所述18bpDNA片段的待測小麥品種的千粒重高于含有所述ISbpDNA片段的待測小麥品種的千粒重；所述待測小麥品種為2個，其中一個品種含有所述ISbpDNA片段且另一個品種不含有所述ISbpDNA片段；所述2個待測小麥品種的千粒重是所述2個待測小麥品種在相同環(huán)境下生長得到的小麥的千粒重；所述在相同環(huán)境下生長為在相同時間和相同地點生長。所述檢測待測小麥品種基因組中的上述編碼基因中的第2個內含子中是否含有所述所述18bpDNA片段的方法為如下⑴或(2)所述(1)所述方法包括如下步驟以所述待測小麥品種基因組DNA為模板，用上述2)所示引物進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述PCR擴增產(chǎn)物在所述聚丙烯酰胺凝膠上顯示為108bp-190bp之間的條帶的小麥品種的千粒重高于所述PCR擴增產(chǎn)物在所述聚丙烯酰胺凝膠上顯示為201-217bp之間的條帶的小麥品種的千粒重；(2)所述方法包括如下步驟以所述待測小麥品種基因組DNA為模板，用上述1)所示引物進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，得到所述待測小麥品種基因組中的上述編碼基因的序列，分析所述待測小麥品種基因組中的上述編碼基因中的第2個內含子中是否含有所述18bpDNA片段；所述方法(1)中，所述聚丙烯酰胺凝膠的濃度為6%。本發(fā)明鑒別小麥千粒重的方法準確、可靠，可用于檢測小麥發(fā)育早期的千粒重性狀，對培育高產(chǎn)、優(yōu)質的小麥具有重要指導作用，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點，適于推廣應用，對小麥的遺傳育種有重要的意義。本發(fā)明的與小麥千粒重相關蛋白及其編碼基因，對研究小麥的籽粒發(fā)育有重要意義。圖1為用引物組合C19P5/C19P6PCR擴增普通小麥中國春基因組DNA(泳道1和2)和小麥授粉后第6-8天籽粒總mRNA反轉錄成的cDNA(泳道3和4)的結果；圖2為用In-Del標記進行插入/缺失類型檢測；圖3為檢測自然群體中66份小麥材料的插入/缺失變異的膠圖；圖4為小麥千粒重相關蛋白的編碼基因近等基因系與百農3217粒長的差異；圖5為不同年份小麥千粒重相關蛋白的編碼基因近等基因系與百農3217千粒重的比較；圖6為小麥千粒重相關蛋白的編碼基因(TaCKX6基因)的組織表達特異性；圖7為小麥千粒重相關蛋白的編碼基因(TaCKX6基因)在籽粒發(fā)育各時期的實時定量PCR。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的試劑如無特殊說明均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、小麥蛋白TaCKX6及其編碼基因TaCKX6的獲得一、小麥基因TaCKX6的cDNA序列獲得1、小麥cDNA全長庫的構建構建中國春小麥的cDNA全長庫，該文庫包括幼苗、根、愈傷組織、花藥、胚乳等不同組織，插入片段平均為1.5kb左右，克隆的全長比例為93%左右。2、小麥基因TaCKX6的cDNA序列獲得根據(jù)已知的水稻細胞分裂素氧化/脫氫酶基因0sCKX2的cDNA序列(GenBank登錄號AB205193)，Blast小麥EST庫(TIGR:http://www.tigr.org/tdb/e2kl/tael/)，獲得與其高度同源的小麥EST序列1條，GenBank登錄號為BQ235927，長度為512bp。再以小麥EST:BQ235927為探針，Blast步驟1獲得的小麥cDNA全長庫，獲得含有目標EST的cDNA陽性克隆1個，編號為CWFTAALSCS-19A1-T7_C19_B10，該克隆3，端已經(jīng)測序815bp，經(jīng)過中間引物延伸測序獲得了陽性克隆的序列全長，共1924bp。分析陽性克隆CWFTAALSCS-19A1-T7_C19_B10的序列，在其5‘端第56位和第62位含有兩個同框的起始密碼子ATG，其ORF長度分別為1644bp和1638bp，將二者推演的氨基酸序列與水稻0sCKX2蛋白序列比較分析，推測小麥中與水稻細胞分裂素氧化/脫氫酶基因0sCKX2對應的基因的開放讀碼框長度應為1638bp，起始密碼子ATG位于第62位。將小麥中與水稻細胞分裂素氧化/脫氫酶基因0sCKX2對應的基因記作基因TaCKX6。小麥品種中國春(張磊，張寶石，周榮華，趙光耀，宋彥霞，賈繼增.小麥細胞分裂素氧化/脫氫酶基因(TaCKX2)的克隆及其遺傳作圖.作物學報，2007，33(9):1419_1425.)二、小麥基因TaCKX6的基因組DNA序列的獲得根據(jù)步驟一的序列比對結果，跨越起始密碼子和終止密碼子設計基因全長引物C19P5-tagctaagacacacacgcagg-3‘(Ιψβ]4)；C19P6-tgacatttcatgataacaacaggct-3’(序列5)。以普通小麥品種中國春的基因組DNA為模板，用引物組合C19P5/C19P6進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；以普通小麥品種中國春開花授粉后第6-8天籽?？俶RNA反轉錄成的cDNA為模板，用引物C19P5和C19P6進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。檢測結果如圖1所示(其中，M為200bpDNALadder；1-2為擴增普通小麥品種中國春基因組DNA的結果，3-4為擴增普通小麥品種中國春授粉后第6-8天籽?？俶RNA反轉錄成的cDNA的結果)。將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行克隆測序，測序結果表明，該PCR產(chǎn)物中含有基因TaCKXe的開放讀碼框，C19P5/C19P6位于該開放讀碼框的上游和下游，該開放讀碼框的基因組DNA序列(即是小麥細胞分裂素氧化/脫氫酶基因TaCKX6的基因組序列)如序列表中序列1所示，由3747bp個核苷酸組成；獲得普通小麥品種中國春中基因TaCKX6的cDNA序列(即是小麥細胞分裂素氧化/脫氫酶基因TaCKX6的cDNA序列)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。將序列表中序列1與序列表中序列2進行比較，明確了TaCKX6基因的結構，TaCKX6基因包含3個外顯子和2個內含子，Exonl=1617bp；Intronl=618702bp；Exon2=7031138bp；Intron2=1139—3162bp；Exon3=31633747bp；其開放讀碼框為1638bp,編碼545個氨基酸(即是小麥千粒重相關蛋白，也就是小麥細胞分裂素氧化/脫氫酶蛋白TaCKX6)，其序列如序列表中序列3所示，理論分子量為59.OkD，等電點pi值為5.39。實施例2、TaCKX6基因的等位變異類型的確定小麥品種偃展1號、內鄉(xiāng)188、旱選10號、魯麥14(張磊，張寶石，周榮華，趙光耀，宋彥霞，賈繼增.小麥細胞分裂素氧化/脫氫酶基因(TaCKX2)的克隆及其遺傳作圖.作物學報，2007，33(9)1419-1425.)(由中國農業(yè)科學院作物科學研究所提供)1、TaCKX6基因的等位變異類型的確定分別以偃展1號、內鄉(xiāng)188、旱選10號、魯麥14的基因組DNA為模板，用引物組合C19P5/C19P6進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行克隆測序，并對測得的序列進行比對。比對結果表明，TaCKX6基因在四個品種中存在18bp插入/缺失的差異與內鄉(xiāng)188和旱選10號二品種相比，在偃展1號和魯麥14二品種中，TaCKX6基因在第2個內含子接近第3個外顯子處存在18bp的缺失，即缺失自序列1的5'末端起第3062-3079位核苷酸。偃展1號和魯麥14二品種的TaCKX6基因的基因組序列如下序列表中序列1缺失了自其5'末端起第3062-3079位核苷酸后得到的序列。2、設計用于鑒定待測小麥18bp插入/缺失變異的In-Del標記引物根據(jù)小麥TaCKX6基因的18bp插入缺失兩側的保守區(qū)域設計了一對In-Del標記，引物序列如下，C19L3:5，-CACGTCGATAGTCTCATGCA-3，；C19L45’-CAGGAACTCCACGTAAGACA-3’。分別以偃展1號、內鄉(xiāng)188、旱選10號、魯麥14的基因組DNA為模板，用引物組合C19L3/C19L4進行PCR擴增，以驗證此引物組合是否可以用來鑒定小麥變異類型。將PCR擴增產(chǎn)物用濃度為6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，膠聯(lián)比為丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺=491，檢測結果如圖2所示，所用的marker的條帶分別為217bp、201bp、190bp、108bp、結果表明偃展1號和魯麥14的產(chǎn)物位于108_190bp之間，即為18bp缺失類型；而內鄉(xiāng)188和旱選10號的產(chǎn)物位于201-217bp之間，即為18bp插入類型；與步驟1中測序比對結果相符，表明此引物可以用來鑒定待測小麥的插入/缺失變異類型。實施例3、小麥TaCKX6基因與千粒重性狀的關聯(lián)分析本實施例中的基因_性狀關聯(lián)分析的方法如下使用DPS軟件對基因的不同變異類型所對應的表型平均值進行t檢驗(蓋均益，2000)，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯-frh-者O一、自然群體中小麥TaCKX6基因與千粒重性狀的關聯(lián)分析1、自然群體中66份小麥的千粒重的測量將66份小麥品種，于2004-2005年度秋播于北京同一試驗田(中國農業(yè)科學院試驗田)。采用隨機區(qū)組設計，兩次重復，行長2m，行距25cm，每行播種100個籽粒，分行收獲、脫粒，種子收獲后按下述方法測定千粒重，具體步驟為隨機取兩組試樣(每組試樣中1000粒種子)。然后兩組試樣分別稱重。以克為單位。最后取兩組的平均數(shù)，求得千粒重。千粒重的測定結果如表1所示。2、自然群體中66份小麥的TaCKX6基因的變異類型的確定分別以步驟1中所述66份小麥葉子(葉子和籽粒的基因組DNA相同，但提葉子DNA更容易些)的基因組DNA為模板，用In-Del標記C19L3/C19L4引物組合進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物用濃度為6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，膠聯(lián)比為丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺=491。檢測結果如圖3所示，結果表明，其中28份材料屬于18bp缺失類型，38份材料屬于18bp插入類型(表1，A-缺失類型；B-插入類型)。3、自然群體中66份小麥的TaCKX6基因與千粒重的關聯(lián)分析對66份小麥材料中18bp插入/缺失類型個體所對應的千粒重性狀平均值進行t檢驗，結果表明18bp插入類型和18bp缺失類型之間的千粒重差異達到了0.01的極顯著水平(表1、2)，缺失類型的平均千粒重高于插入類型的平均千粒重。表1中的66個品種的小麥均由中國農業(yè)科院作物科學研究所和農業(yè)部作物品種資源與生物技術重點實驗室提供。具體可以登陸“中國作物種質信息網(wǎng)，，httD//WWW,cgris.net/query/croplist.php查詢禾口獲取。表1、66份小麥種質資源的千粒重(g)及變異類型<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>品種名稱插入、缺失變異類型千粒重(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從已經(jīng)構建的高代回交材料中進行了千粒重相關蛋白編碼基因近等基因系的篩選，結果篩選獲得了不同世代的以百農3217為輪回親本，以R43為供體親本的3套近等基因系:R43/百農32175F5(2004年)、R43/百農32176F1(2000年)、R43/百農32177F1(2001年)。R43/百農32175F5株系、R43/百農32176F1株系、R43/百農32177F1株系、R43、百農3217均在文獻(RonghuaZhou，ZhendongZhu,XiuyingKong,NaxinHuo,QingzhenTian，PeiLi，CuiyunJin,YuchenDongandJizengJia02005·Developmentofwheatnear-isogeniclinesforpowderymildewresistance。TAG，110:640_648)中公幵過。(由中國農業(yè)科學院作物科學研究所提供)從回交世代來看，最高代近等基因系經(jīng)歷了7次回交，5次自交，理論上輪回親本的背景回復率達到99%以上(R43/百農3217TF1)，并且近等基因系在不同世代中表現(xiàn)穩(wěn)定，因此可以認為近等基因系與輪回親本表現(xiàn)型的差異主要是由于TaCKX6基因插入/缺失變異而造成的。R43/百農32175F5株系用百農3217與R43連續(xù)回交4次再自交5次獲得。R43/百農32175F5株系與百農3217的遺傳背景一致，僅基因TaCKX6位點不同。2、近等基因系籽粒性狀的測量將R43/百農32175F5株系和百農3217分別在2004年10月份種植于北京同一試驗田(中國農業(yè)科學院試驗田)，2005年7月份收獲。按照實驗一中1所述方法進行種植、測定千粒重，并測定粒長和粒寬。將R43/百農32176F1株系和百農3217分別在2000年10月份種植于北京同一試驗田(中國農業(yè)科學院試驗田)，第二年7月份收獲。按照實驗一中1所述方法進行種植、測定千粒重，并測定粒長和粒寬。將R43/百農3217TF1株系和百農3217分別在2001年10月份種植于北京同一試驗田(中國農業(yè)科學院試驗田)，第二年7月份收獲。按照實驗一中1所述方法進行種植、測定千粒重，并測定粒長和粒寬。3、近等基因系TaCKX6基因插入/缺失變異類型的確定近等基因系基因型的測定使用的方法是使用引物組合C19P5/C19P6分別對每份材料進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物挖膠回收直接測序，使用的測序引物為C19P6；將測得序列與序列1進行比較，得出各近等基因系和百農3217的插入/缺失變異類型。結果表明，該3套近等基因系的基因為缺失類型，輪回親本百農3217基因為插入類型。4、近等基因系中TaCKX6基因與籽粒性狀的關聯(lián)分析對近等基因系(缺失類型)和輪回親本百農3217(插入類型)所對應的表型性狀平均值進行t檢驗，試驗涉及到的主要農藝性狀包括粒長、粒寬、千粒重。每份材料的樣本容量分別為(2004年)R43/百農32175F5=11株，百農3217=10株；(2000年)R43/百農32176F1=10株，百農3217=7株；(2001年)R43/百農32177F1=16株，百農3217=15株。結果表明，回交5代又自交5代的近等基因系R43/百農32175F5(2004年)與輪回親本百農3217相比，在千粒重和粒長上差異顯著(表3，圖4，圖5;圖4中A為近等基因系R43/百農32175F5中小麥籽粒，B為輪回親本百農3217中小麥籽粒)，但在粒寬和長/寬比上差異不顯著(表3)；回交6代(R43/百農32176F1，2000年)和7代(R43/百農3217TF1，2001年)的近等基因系的千粒重同樣顯著高于輪回親本百農3217(表4，圖5)。表明近等基因系(缺失類型)的平均粒長與千粒重高于輪回親本百農3217(插入類型)的平均粒長與千粒重。粒長與千粒重有明顯的正相關關系，推測TaCKX6基因可能通過控制粒長間接影響千粒重。說明:NIL-gw3D表示R43/百農32175F5(2004年)、R43/百農32176F1(2000年)、R43/百農3217TF1(2001年)株系，為缺失類型；其中，gw是粒重的縮寫，表示是百農3217的近等基因系；百農3217為插入類型。表3、TaCKX6基因的近等基因系籽粒性狀的考查(2004年，北京)千粒重(g)粒長(《)粒寬(《)長/寬比~<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>P值；*，P<0.05;**，P<0.01.綜上研究表明，在自然群體、近等基因系二種不同的群體中，TaCKX6基因均與小麥千粒重性狀相關，表明TaCKXe基因是與小麥千粒重相關的基因，該基因可以用來鑒別小麥千粒重性狀?？偨Y上述鑒別小麥千粒重的方法如下分別檢測2個待測小麥品種基因組中的TaCKX6基因開放讀碼框中的第2個內含子中是否含有如下18bpDNA片段序列表中序列1自5'末端起第3062-3079位核苷酸所示DNA片段；不含有所述18bpDNA片段的待測小麥品種為缺失類型，含有所述18bpDNA片段的待測小麥品種為插入類型，缺失類型千粒重高于插入類型千粒重；每次比較2個品種，2個被檢測的小麥品種中，其中一個品種含有所述ISbpDNA片段且另一個品種不含有所述ISbpDNA片段；2個被檢測的小麥品種的千粒重是如下前提下的千粒重2個被測小麥品種在相同時期和相同環(huán)境下生長后得到的小麥的千粒重。實施例4、普通小麥千粒重相關蛋白編碼基因的表達模式1、分別提取普通小麥品種中國春幼穗、發(fā)育時期籽粒、一葉一心期的根、葉的總RNA，并反轉錄合成第一鏈cDNA，對千粒重相關蛋白編碼基因進行了RT-PCR分析。其中，用于小麥不同組織部位總RNA提取的材料按照如下方法采集中國春的種子表面消毒后浸泡在蒸餾水中12小時，露白后轉入培養(yǎng)皿中，室溫條件下生長至一葉一心時采集葉片和根，立即用液氮處理后，置于-70°C冰箱中保存?zhèn)溆?；于幼穗尚未抽出葉鞘時采集幼穗；授粉開始后6-8天采集籽粒，液氮處理后于_70°C冰箱中保存?zhèn)溆?。結果如圖6所示，表明，千粒重相關蛋白編碼基因TaCKX6是在發(fā)育時期籽粒中特異表達的基因，所以千粒重相關蛋白編碼基因在小麥籽粒發(fā)育過程中行使功能。2、使用實時熒光定量PCR檢測千粒重相關蛋白編碼基因在不同發(fā)育階段的籽粒中的表達情況。實時熒光定量PCR的方法如下相對定量法測定基因在幼穗與籽粒不同發(fā)育時期的表達模式，使用天為時代公司QuantSYBRGreenPCR試劑盒，實時熒光定量PCR在美國ABIPRISM7000SDS上進行，Tubulin基因的表達作為內參，2_ΔΔ"法統(tǒng)計分析實驗結果(LivakandSchmittgen，2001)。1)反應體系(20μ1)將20XSYBR溶液在室溫下平衡并徹底混勻。m-用量2.5XRealMasterMix/20XSYBR溶液9μ1正向引物(ΙΟμΜ)0.5μ1反向引物(ΙΟμΜ)0·5μ1_DNA模板(20ng/ul)_Iul2)反應程序一循環(huán)步驟溫度(°C)時間IX1942min29420s40X36030s_4_68_40s分別提取授粉后第0天、3天、8天、14天、18天、22天籽粒的總RNA，反轉錄成cDNA，用Tubulin作組成型基因的標記，對千粒重相關蛋白編碼基因進行實時熒光定量PCR分析。結果如圖7所示(其中，0d、3d、8d、14d、18d、22d分別代表授粉后第0天、3天、8天、14天、18天、22天的籽粒)。表明，千粒重相關蛋白編碼基因從授粉開始到授粉后第8天在籽粒中的表達量逐漸增強，第8天以后逐漸減弱，籽粒形成前8天正是決定粒長的關鍵時期，表明，千粒重相關蛋白編碼基因與粒長形成有關，基因的表達分析結果與在近等基因系中所得結論是一致的。本研究通過同源克隆獲得了與水稻0sCKX2基因直向同源的小麥千粒重相關蛋白編碼基因(TaCKX6基因)，同時使用由66份材料組成的自然群體以及一對背景回復率在99%以上的近等基因系證明了小麥千粒重相關蛋白編碼基因在第2內含子處存在18bp的缺失/插入的差異，且與千粒重相關顯著，并且在近等基因系之間粒長差異顯著，通過表達分析發(fā)現(xiàn)小麥千粒重相關蛋白編碼基因在授粉之后到籽粒形成0-6天表達逐漸增強，此階段正是決定粒長的關鍵時期，因此推測小麥中的千粒重相關蛋白編碼基因通過控制粒長間接影響千粒重。權利要求一種蛋白，為如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與小麥千粒重相關的由(a)衍生的蛋白質。2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據(jù)權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4)或5)的基因1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)如下核苷酸序列所示的DNA分子序列表中序列1缺失了自其5'末端起第3062-3079位核苷酸后得到的序列；3)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA分子具有98%以上同源性且編碼所述小麥千粒重相關蛋白質的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述小麥千粒重相關蛋白質的DNA分子。4.擴增權利要求2或3所述編碼基因全長或其任意片段的引物對。5.根據(jù)權利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對為如下1)或2)所示1)一條引物如序列4所示，另一條引物如序列5所示；2)一條引物如序列6所示，另一條引物如序列7所示。6.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒。7.權利要求2或3所述編碼基因在鑒別小麥千粒重中的應用。8.權利要求5中所示引物在鑒別小麥千粒重中的應用。9.一種鑒別小麥千粒重的方法，包括如下步驟檢測待測小麥品種基因組中的權利要求2或3所述編碼基因中的第2個內含子中是否含有如下18bpDNA片段序列表中序列1自5'末端起第3062-3079位核苷酸所示DNA片段；不含有所述18bpDNA片段的待測小麥品種的千粒重高于含有所述18bpDNA片段的待測小麥品種的千粒重；所述待測小麥品種為2個，其中一個品種含有所述ISbpDNA片段且另一個品種不含有所述ISbpDNA片段；所述2個待測小麥品種的千粒重是所述2個待測小麥品種在相同環(huán)境下生長得到的小麥的千粒重；所述在相同環(huán)境下生長為在相同時間和相同地點生長。10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述檢測待測小麥品種基因組中的權利要求2或3所述編碼基因中的第2個內含子中是否含有所述所述18bpDNA片段的方法為如下⑴或(2)所述(1)所述方法包括如下步驟以所述待測小麥品種基因組DNA為模板，用權利要求5中2)所示引物進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述PCR擴增產(chǎn)物在所述聚丙烯酰胺凝膠上顯示為108bp-190bp之間的條帶的小麥品種的千粒重高于所述PCR擴增產(chǎn)物在所述聚丙烯酰胺凝膠上顯示為201-217bp之間的條帶的小麥品種的千粒重；(2)所述方法包括如下步驟以所述待測小麥品種基因組DNA為模板，用權利要求5中1)所示引物進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，得到所述待測小麥品種基因組中的權利要求2或3所述編碼基因的序列，分析所述待測小麥品種基因組中的權利要求2或3所述編碼基因中的第2個內含子中是否含有所述18bpDNA片段；所述方法(1)中，所述聚丙烯酰胺凝膠的濃度為6%。全文摘要本發(fā)明公開了一種小麥千粒重相關蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白為如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與小麥千粒重相關的由(a)衍生的蛋白質。本發(fā)明蛋白及其編碼基因與小麥千粒重相關，對研究小麥的籽粒發(fā)育有重要意義。本發(fā)明方法準確、可靠，可用于檢測小麥發(fā)育早期的千粒重性狀，對培育高產(chǎn)、優(yōu)質的小麥具有重要指導作用，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點，適于推廣應用，對小麥的遺傳育種有重要的意義。文檔編號C07K14/415GK101805399SQ20101014732公開日2010年8月18日申請日期2010年4月13日優(yōu)先權日2010年4月13日發(fā)明者周榮華,張磊,賈繼增,高麗鋒申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所