包含Gc-巨噬細胞活化因子的組合物及其用圖
【專利說明】包含Gc-巨隘細胞活化因子的組合物及其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及穩(wěn)定的藥物組合物，所述穩(wěn)定的藥物組合物包含Gc巨隧細胞活化因子 (GcMAF)。本發(fā)明特別設(shè)及儲存穩(wěn)定的藥物組合物，所述儲存穩(wěn)定的藥物組合物包含GcMAF 和至少一種藥學上可接受的表面活性劑和/或具有表面活性的合成的水溶性聚合物，W及 其用于治療與巨隧細胞活化相關(guān)的疾病的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 巨隧細胞活化在炎癥發(fā)展和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起重要作用。與炎癥相關(guān)的巨隧細胞 活化需要B淋己細胞和T淋己細胞和血清維生素 D結(jié)合蛋白（還稱為"組特異性組分"或Gc蛋 白）的參與。
[0004] Gc蛋白是人血漿α-2巨球蛋白級分的多態(tài)糖蛋白，具有52kDa的表觀分子量，通常 構(gòu)成人血漿中約0.5%的蛋白。Gc蛋白攜帶包含具有雙分支半乳糖和唾液酸末端的N-乙酷 半乳糖胺的Ξ糖。該寡糖被炎癥引發(fā)的B淋己細胞的可誘導(dǎo)的膜β-半乳糖巧酶水解W產(chǎn)生 巨隧細胞前體活化因子。巨隧細胞前體活化因子繼而被Τ淋己細胞的膜Neu-1唾液酸酶水解 W產(chǎn)生巨隧細胞活化因子(GcMAF)。用固定化的β-半乳糖巧酶和唾液酸酶逐步處理純化的 Gc蛋白也被顯示產(chǎn)生GcMAF。
[000引已經(jīng)顯示GcMAF具有破壞腫瘤的作用。證明了因為血清Gc蛋白在癌癥患者中被由 癌細胞分泌的血清α-Ν-乙酷半乳糖巧酶(Nagalase)去糖基化，GcMA巧舌性在運些患者中被 消除或降低。因此，去糖基化的Gc蛋白不轉(zhuǎn)化為GcMAF,且巨隧細胞活化被降低或消除。施用 外源GcMAF到患有黑素瘤、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的癌癥患者顯示出GcMAF 通過克服活性巨隧細胞不足的治療效應(yīng)(Yamamoto等，2008，Int. J. Cancer，122:461-467; Yamamoto等，Trans. Oncol. 2008，1:65-72)。在用GcMAF治療的感染HIV的和骨硬化的患者中 觀察到對巨隧細胞活化的相似效應(yīng)。
[0006] 美國專利號5,177,002公開了產(chǎn)生巨隧細胞活化因子的方法，該方法包括使糖基 化的人組特異性組分與β-半乳糖巧酶或β-半乳糖巧酶與唾液酸酶、α-甘露糖巧酶或其混合 物的組合體外接觸，并獲得巨隧細胞活化因子。美國專利號5，177,002還公開了用于在有相 應(yīng)需要的個體中誘導(dǎo)巨隧細胞活化的方法，該方法包括對個體施用由此產(chǎn)生的人巨隧細胞 活化因子。
[0007] W0 93/07288公開了用于產(chǎn)生有效的巨隧細胞活化因子的方法，其中使動物維生 素 D結(jié)合蛋白在體外與（i )β-半乳糖巧酶或（i i )β-半乳糖巧酶與唾液酸酶、α-甘露糖巧酶或 其混合物的組合接觸。W0 93/07288還公開了用于活化巨隧細胞的方法，該方法包括對動物 施用由此產(chǎn)生的巨隧細胞活化因子。
[0008] W0 96/40903公開了維生素 D結(jié)合蛋白（Gc蛋白）及其小結(jié)構(gòu)域(還被稱為結(jié)構(gòu)域 III)經(jīng)由桿狀病毒載體的克隆?？寺〉腉c蛋白和克隆的結(jié)構(gòu)域III用固定化的β-半乳糖巧 酶和唾液酸酶處理W分別產(chǎn)生巨隧細胞活化因子，GcMAFc和CcIMAFdWO 96/40903還公開了 巨隧細胞活化因子用于治療癌癥、人類免疫缺陷病毒化IV)感染和骨質(zhì)疏松的用途。
[0009] W0 2012/137199公開了包含基本上缺乏糖巧酶的巨隧細胞活化因子(MAF)的藥物 組合物，及使用其治療癌癥或感染HIV的患者的方法。
[0010] Pihl等（Basic&Clin Pharm&Toxicol. ,2010,107:853-860)公開了對純化的血漿 來源的人Gc蛋白進行的臨床前毒理學實驗，并指出發(fā)現(xiàn)了 Gc蛋白在5%麥芽糖的存在下W 憐酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中約lOmg/ml的濃度穩(wěn)定四年，完全保留肌動蛋白結(jié)合能力且Gc蛋 白的量無顯著變化。
[0011 ] F*acini等Kancer Immunol. Immunother. ,2011,60:479-485)評價了不同GcMAF制 劑在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)測定中它們抑制PGEi-刺激的血管生成的效力，并表明在25°C儲 存15天減少了約50 %的GcMAF效力。
[0012]對保持GcMAF化學穩(wěn)定性和生物活性的儲存穩(wěn)定的GcMAF藥物組合物存在未滿足 的需求。
[001引發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明提供了藥物組合物，所述藥物組合物在儲存后具有改進的穩(wěn)定性，所述藥 物組合物包含Gc蛋白來源的巨隧細胞活化因子(GcMAF)和至少一種藥學上可接受的表面活 性劑和/或具有表面活性的合成的水溶性聚合物。本發(fā)明還提供了治療與巨隧細胞活化相 關(guān)的疾病或素亂的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用所述穩(wěn)定的藥物組合 物。
[0015] 本發(fā)明部分基于W下發(fā)現(xiàn)：當將低濃度的GcMAF的含水溶液儲存在4°C或冷凍并然 后解凍時，該溶液的儲存導(dǎo)致了 GcMAF的化學穩(wěn)定性和生物活性的顯著損失。
[0016] 現(xiàn)公開了常規(guī)藥學上可接受的多膚穩(wěn)定劑，諸如人血清白蛋白化SA)、精氨酸和糖 醇甘露糖醇，無論單獨或組合加入對穩(wěn)定GcMAF的含水溶液(低于30μg/ml)中的GcMAF基本 上無效。
[0017] 本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)了向具有低濃度GcMAF的含水溶液中加入藥學上 可接受的表面活性劑克服了在儲存后化學穩(wěn)定性和生物活性損失的問題。例如，加入非離 子表面活性劑到化g/ml GcMAF的含水溶液在4°C、25°C和甚至37°C下多達Ξ個月的儲存期 間保持GcMAF化學穩(wěn)定性。本發(fā)明的發(fā)明人還公開了非離子表面活性劑能夠在具有低濃度 例如化g/ml的GcMAF的溶液的一輪或更多輪冷凍和解凍之后保持溶液中的GcMAF。
[0018] 還公開了非離子表面活性劑不僅在長期儲存低濃度GcMAF溶液期間保持了 GcMAF 化學穩(wěn)定性，而且如通過巨隧細胞活化測量的，在此儲存期間還保存了GcMAF生物活性。
[0019] 本發(fā)明的發(fā)明人還公開了離子表面活性劑W及具有表面活性的水溶性聚合物在 長期儲存期間有效穩(wěn)定GcMAF。然而，多糖諸如透明質(zhì)酸或海藻酸鹽對GcMAF不發(fā)揮顯著的 穩(wěn)定效應(yīng)。因此，本發(fā)明的組合物是高度有益的，因為當被配制為低濃度(~lOOng/ml到~ lmg/ml)GcMAF的液體制劑時，其在長期儲存之后，即在4°C下至少六個月之后，保持GcMAF的 化學穩(wěn)定性和生物活性。而且，本發(fā)明的組合物簡化GcMAF的操作和遞送并使冷凍組合物并 在解凍后對GcMAF化學穩(wěn)定性基本上極小或沒有影響成為可能，由此進一步避免解凍后立 即使用組合物的需要。
[0020] 根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含穩(wěn)定的或穩(wěn)定 化的Gc巨隧細胞活化因子(GcMAF)或其生物活性變體或片段和選自由W下組成的組的至少 一種藥學上可接受的賦形劑:表面活性劑和水溶性聚合物。
[0021] 根據(jù)一些實施方案，穩(wěn)定的GcMAF選自由W下組成的組:獨立地具有連接到氨基酸 殘基的N-乙酷半乳糖胺基團的人GcMAF和動物GcMAF。根據(jù)一個實施方案，穩(wěn)定的GcMAF是具 有連接到氨基酸殘基的N-乙酷半乳糖胺基團的人GcMAF。根據(jù)另外的實施方案，穩(wěn)定的 GcMAF包含如SEQ ID NO: 1到3中的任一個所列出的氨基酸序列。根據(jù)另外的實施方案，穩(wěn)定 的GcMAF片段包含相應(yīng)于Gc蛋白的氨基酸400-435的氨基酸序列。根據(jù)還另外的實施方案， 穩(wěn)定的GcMAF片段由如SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5中列出的氨基酸序列組成。
[0022] 根據(jù)另外的實施方案，當組合物呈液體的形式時，穩(wěn)定的GcMAFW從約10化g/ml到 約Img/ml范圍的濃度存在，可選地當組合物呈液體的形式時，GcMAF W從約1 OOng/ml到約 300μg/ml、另外可選地從約200ng/ml到約30μg/ml且仍另外可選地從約200ng/ml到約化g/ ml范圍的濃度存在。每種可能性是本發(fā)明的單獨的實施方案。根據(jù)某個實施方案，當組合物 呈液體的形式時，GcMAF W從約200ng/na到約化g/ml范圍的濃度存在。
[0023] 根據(jù)另外的實施方案，表面活性劑選自由W下組成的組:非離子表面活性劑、陰離 子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兼性表面活性劑(amphoteric surfactant)和兩性離子 表面活性齊iKzwitterionic surfactant)。
[0024] 根據(jù)一些實施方案，非離子表面活性劑選自由W下組成的組：山梨聚糖脂肪酸醋、 聚氧山梨聚糖脂肪醋（polyoxysorbitan fatty acid esters)、聚氧化締高級醇酸 (polyoxya化ylene higher alcohol ethers)和聚氧化締高級醇醋。非離子表面活性劑的 實例包括，但不限于，聚氧乙締山梨糖醇醋、聚氧乙締異辛基苯基酸、聚氧乙締壬基苯基酸、 聚氧乙締十二烷基酸、辛基葡萄糖巧和烷基麥芽糖巧。根據(jù)還另外的實施方案，非離子表面 活性劑選自由W下組成的組：聚山梨醇醋8〇(TWEEN?8〇)、聚山梨醇醋6〇(tWEEN? 60)、聚山梨醇醋20(TWEEN?20)、N-十二烷基-β-D-麥芽糖巧、Triton X-100、Brij 58、 泊洛沙姆188、泰洛沙泊、PEG-40硬脂酸醋、NP-40、Pluronic? F-68和泊洛沙姆4070。每種可 能性是本發(fā)明的單獨的實施方案。根據(jù)某個實施方案，非離子表面活性劑是聚山梨醇醋，例 如，聚山梨醇醋 8〇(tween"8〇)。
[0025] 根據(jù)另外的實施方案，水溶性聚合物是具有表面活性的合成的水溶性聚合物。根 據(jù)另外的實施方案，具有表面活性的合成的水溶性聚合物選自由W下組成的組:聚乙締醇、 聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙燒嵌段共聚物、乙二醇/丙二醇的共聚物、聚-1,3-二氧戊燒、聚-1，3,6-Ξ嗯燒、乙締/馬來酸酢共聚物、丙二醇均聚物和聚氧乙基化多元醇。根據(jù)示例性實施方案， 具有表面活性的水溶性聚合物是聚乙締醇。
[0026] 根據(jù)另外的實施方案，藥物組合物還可包含張度劑。根據(jù)某個實施方案，張度劑是 氯化鋼。
[0027] 根據(jù)另外的實施方案，該藥物組合物還可包含緩沖劑。緩沖劑的實例包括，但不限 于，憐酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和巧樣酸鹽緩沖液。
[0028] 根據(jù)還另外的實施方案，藥物組合物還可包含藥學上可接受的載體或稀釋劑。根 據(jù)某個實施方案，載體是水。
[0029] 根據(jù)仍另外的實施方案，藥物組合物W選自由W下組成的組的形式被配制:溶液、 懸浮液、乳劑、粉末、片劑和膠囊。根據(jù)某個實施方案，組合物W水溶液的形式被配制。根據(jù) 示例性實施方案，藥物組合物包含GcMAF、聚山梨醇醋80、氯化鋼、憐酸鹽緩沖液和水，其中 組合物的pH范圍在約5到約8之間，且其中GcMAF在組合物中的濃度范圍從約1 OOng/ml到約 Img/ml、可選地從約1 OOng/ml到約300μg/ml、還可選地從約200ng/ml到約30μg/ml，及仍還 可選地從約2(K)ng/ml到約化g/ml。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨的實施方案。
[0030] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療與巨隧細胞活化相關(guān)的疾病或素亂的方 法，所述方法包括對需要運樣治療的受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的原理的藥物組 合物。
[0031] 根據(jù)一些實施方案，受試者是人類或動物。根據(jù)某個實施方案，動物是寵物動物， 諸如狗。
[0032] 根據(jù)另外的實施方案，與巨隧細胞活化相關(guān)的疾病或素亂選自由W下組成的組： 癌癥、病毒性疾病、細菌感染、自身免疫性疾病、孤獨癥和慢性疲勞綜合癥。每種可能性代表 了本發(fā)明的單獨的實施方案。
[0033] 根據(jù)另外的實施方案，穩(wěn)定的GcMAF是獨立地具有連接到氨基酸殘基的N-乙酷半 乳糖胺基團的人GcMAF或動物GcMAF。根據(jù)某個實施方案，GcMAF是具有連接到氨基酸殘基的 N-乙酷半乳糖胺基團的人GcMAF。根據(jù)另外的實施方案，GcMAF包含如SEQ ID NO: 1到3中的 任一個中列出的氨基酸序列。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨的實施方案。
[0034] 根據(jù)另外的實施方案，藥物組合物通過非腸道或通過口服施用途徑來施用。根據(jù) 某個實施方案，藥物組合物通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或通過皮下施用途徑來施用。每種可能性代 表了本發(fā)明的單獨的實施方案。