專利名稱：一種蓽茇堿的提取方法和包含蓽茇堿的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蓽茇堿的提取方法、包含按照該提取方法得到的蓽茇堿的藥物組合物及其在治療高脂血癥的藥物組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蓽茇(Piper longum L.)屬于胡椒科，是蒙醫(yī)常用的一種藥材。蒙醫(yī)理論認(rèn)為屬 于醫(yī)治“巴達(dá)干”類藥物，本品味辛，性溫，膩、銳、輕、燥；有調(diào)理胃火，祛“巴達(dá)干·赫依，，， 滋補(bǔ)強(qiáng)壯、平喘、祛痰，止痛、調(diào)元，等功效。以蓽茇入藥的蒙藥處方五味清濁散，主治胃火衰 敗，清濁未分離證，不思飲食。所謂清濁未分離證，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的代謝紊亂病變，如高脂 血癥。五味清濁散臨床療效很好。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蓽茇中主要包含生物堿、揮發(fā)油和木脂素等成分?，F(xiàn)代研究表明， 蓽茇對(duì)心血管系統(tǒng)具有抗心肌缺血缺氧、降血脂、擴(kuò)冠、抗心律、抗胃潰瘍、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、抗 炎殺菌等作用，有很好的藥用價(jià)值。長(zhǎng)期以來(lái)，由于對(duì)于蓽茇中各種具體組分的提取存在一 定的困難，人們普遍采用蓽茇提取物或其生物堿提取物的形式來(lái)用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。比如中國(guó) 專利申請(qǐng)CN101554409A公開了一種用于腫瘤或心血管疾病的提取物，其是從蓽茇中分離 得到由蓽茇生物堿組成的提取物，該提取物是多種生物堿的混合物；CN101352487A也公開 了一種用于治療高血脂、鎮(zhèn)痛、抗炎或胃潰瘍的蓽茇提取物，其也是包含7種蓽茇酰胺化合 物和胡椒酸甲酯的混合物；CN1322543A公開了一種降血脂藥的制備方法，其中也采用的是 從蓽茇中提取得到的不皂化物，包含7種生物堿類物質(zhì)。針對(duì)蓽茇的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，從蓽茇中提取得到的胡椒堿具有顯著的降血脂的活 性(包蘭蘭等，“胡椒堿降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究”，中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2004，10(1) :22-23)，
(DawareM. B. Mujumdar A Μ. Ghaskadbi s. Reproductivtoxicity of piperine inSwiss albino mice Planta Med. 2000. 66 (3) :231_236)，致使進(jìn)一步的開發(fā)受 到一定的限制。蓽茇堿(PiPerlonguminine)，簡(jiǎn)稱PPAjljS 蓽撥亭、蓽茇寧、蓽撥明堿、胡椒亭、
畢撥明寧堿、胡椒明寧堿、蓽茇寧酰胺，結(jié)構(gòu)如下
O
^ 3
U5'PPAN-異丁基-5- (3,4-亞甲雙氧苯基)-2E，4E-戊二烯酰胺是從蒙藥蓽茇中提取得到的有效成份，白色針狀結(jié)晶，C16H19NO3, mp 160. 0-162. O0C (甲醇)，。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該類化合物不僅具有同胡椒堿類似的降血脂作用，而且毒性很低，比如中國(guó)專利申請(qǐng)CN1634029A中就公開了異丁胡椒酰胺在制備降血脂藥 物或保健品中的應(yīng)用，但是，由于現(xiàn)有的技術(shù)從蓽茇中提取該類胡椒酰胺類物質(zhì)比較困難， 常規(guī)方法的提取率低且提取費(fèi)用高 ，該專利申請(qǐng)CN1634029A采用了化學(xué)合成該化合物的 方法來(lái)獲得高純度的異丁胡椒酰胺，其不僅合成條件要求嚴(yán)格、合成費(fèi)用昂貴。更重要的是 在合成中使用了具有劇毒的甲醇作為溶劑，由于甲醇在藥物工業(yè)禁用的，因此，其將其用于 藥用是有害且不被允許的。因而，特別地考慮到安全性，本領(lǐng)域迫切需要一種成本低、提取效率高、簡(jiǎn)單方便 的從天然植物蓽茇中提取蓽茇堿的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，首先用無(wú)水乙醇提取蓽茇，得到醇提物，再經(jīng)連續(xù)兩次硅膠柱分 離，結(jié)晶之后可獲得純蓽茇堿的晶體，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蓽茇堿的提取方法，其包括如下步驟(1)取蓽茇藥材顆粒，加入約6 8倍量(w/v)的無(wú)水乙醇，在45 55°C，優(yōu)選約 50°C下加熱回流4 5小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾得濾液；給濾渣中再加約2倍量(w/v) 的無(wú)水乙醇，在45 55°C，優(yōu)選約50°C下加熱回流1小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾得濾液； 合并兩次得到的濾液，回收乙醇，得到醇提物；(2)將得到的醇提物經(jīng)100 200目硅膠柱層析，以正己烷-乙酸乙酯為洗脫液， 勻速洗脫，洗脫速度為約4ml/min，并用高效液相色譜法或薄層層析法分析，依次得到6種 組分，回收洗脫液，得到固體狀F1 F6，其中F4與F5是以混合物的形式存在；(3)將F4+5的混合物再次經(jīng)100 200目硅膠柱層析，以正己烷_乙酸乙酯為洗脫 液，洗脫速度為3. 8 4. 2ml/min，依次洗脫得到3種組分F4、F5(1)和F5(2)，回收洗脫液；(4)將組分F4再次經(jīng)100 200目硅膠柱層析來(lái)純化，以正己烷-乙酸乙酯為洗 脫液洗脫，洗脫速度為3. 0 3. 5ml/min，用高效液相色譜法或薄層層析法分析，保留其中 含有單一組分的洗脫部分，回收洗脫液將得到較純的單體組分，在無(wú)水乙醇中重結(jié)晶，得到 白色針狀結(jié)晶蓽茇堿晶體。本發(fā)明提取得到的蓽茇堿晶體的純度高達(dá)85 90% .在本文中的提取方法中，其中步驟(1)中蓽茇藥材顆粒的粒徑為14 20目；其 中洗脫液正己烷-乙酸乙酯中，正己烷與乙酸乙酯的體積比為1.5 1;其中回收洗脫液是 指通過(guò)蒸發(fā)回收的，比如在減壓條件下40 50°C，常壓條件下78 80°C范圍內(nèi)蒸發(fā)回收； 其中過(guò)濾可以采用濾膜過(guò)濾，所述濾膜是本領(lǐng)域常規(guī)使用的普通濾膜，常速濾速時(shí)孔徑為 200 100 μ m。在本文中，蓽茇藥材是指天然胡椒科植物蓽茇的未成熟果實(shí)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療高脂血癥的藥物組合物，其包括按照上 述提取方法制備得到的蓽茇堿與藥學(xué)可接受的載體。該藥物組合物可以是片劑或膠囊等固 體制劑。在所述藥物組合物中，藥學(xué)可接受的載體可以為淀粉、糊精、滑石粉。在一個(gè)實(shí)施 方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物制備的片劑或膠囊中，蓽茇堿、淀粉、糊精、滑石粉的重量 比例為10. 0 77. 7 17.3 5，片劑中包衣增重量占重量的3. 9 4. 1 %。本發(fā)明的包含蓽茇堿的片劑是通過(guò)如下方法制備的將按照本發(fā)明的方法提取得到的蓽茇堿PPA粉碎，加入淀粉和糊精混勻，40%的乙醇潤(rùn)濕，16目制粒，50°C干燥1小時(shí)， 整粒，加入滑石粉混勻，壓片得素片，薄膜包衣使增重3. 9 4. 1%，即得。其中所述薄膜包 衣可以采用如下方法將胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑與95%乙醇攪拌溶解一小時(shí)以上，使充分 溶解混合均勻即可，其中包衣預(yù)混劑的用量為蓽茇堿量的4%左右，包衣預(yù)混劑95%乙 醇=1 I0(w/v)；將所述素片置包衣鍋內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)并打開熱風(fēng)使藥片溫度達(dá)到35 40°C時(shí)， 開始采用噴射儀器噴包衣預(yù)混劑，邊吹熱風(fēng)邊噴，使噴霧量均勻適度；熱風(fēng)量控在不致藥片 潮濕為宜，包衣結(jié)束后，用40°C烘干1小時(shí)。本發(fā)明的包含蓽茇堿的膠囊是通過(guò)如下方法制備的將按照本發(fā)明的方法提取得到的蓽茇堿PPA粉碎，加入淀粉和糊精混勻，用40%的乙醇潤(rùn)濕，16目制粒，50°C干燥1小 時(shí)，整粒，加入滑石粉混勻，裝相應(yīng)規(guī)格的膠囊得膠囊劑。本發(fā)明還提供所述蓽茇堿或藥物組合物在制備用于治療高脂血癥、動(dòng)脈硬化、月旨 肪肝或肝硬化的藥物中的用途，特別是在治療高脂血癥的藥物中的用途。在本發(fā)明中，“w/v”是指重量(g)/體積(ml)比，比如步驟(1)中，“蓽茇藥材顆粒 的約6 8倍量(w/v)的無(wú)水乙醇”是指蓽茇藥材顆粒的重量(g)無(wú)水乙醇(ml)的體積 =1 6 8。本發(fā)明的提取方法簡(jiǎn)單易行、無(wú)污染、安全性極高，且提取效率高，極易提純、分離 和回收；處方設(shè)計(jì)合理，輔料經(jīng)濟(jì)來(lái)源豐富，并可最大程度地保護(hù)藥物的穩(wěn)定性和生物利用度。下面將參照


和實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不 限于這些實(shí)施例以及使用的制備方法。

圖1為按照實(shí)施例1的方法提取得到的PPA的13C NMR圖譜；圖2為按照實(shí)施例1的方法提取得到的PPA的13C NMR和DEPT (135° )圖譜；圖3為按照實(shí)施例1的方法提取得到的PPA的1H NMR圖譜；圖4為按照實(shí)施例1的方法提取得到的PPA的局部1H NMR圖譜；圖5為按照實(shí)施例1的方法提取得到的PPA的局部1H NMR圖譜；圖6為按照實(shí)施例1的方法提取得到的PPA的IR圖譜；圖7為按照實(shí)施例1的方法提取得到的PPA的GCT-MS圖譜。
具體實(shí)施方案實(shí)施例1蓽茇堿的提取按照如下步驟從蓽茇中提取蓽茇堿(1)取500g蓽茇藥材顆粒(14目)置回流裝置中，加入3000ml無(wú)水乙醇，在50°C 下加熱回流4小時(shí)，之后冷卻至室溫，濾膜(100 200 μ m)過(guò)濾得濾液。給濾渣中再加無(wú) 水乙醇1000ml，在50°C下加熱回流1小時(shí)，之后冷卻至室溫，濾膜(100 200 μ m)過(guò)濾得 濾液；合并兩次濾液，回收乙醇，得到醇提物；(2)將得到的醇提物經(jīng)100目硅膠柱層析，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸乙酯為 洗脫液，勻速(4. Oml/min)洗脫(經(jīng)高效液相色譜法分析)依次得到6種組分回收洗脫液，得到固體狀F1 F6，其中F4與F5是以混合物的形式存在；(3)將F4+5的混合物再次經(jīng)100目硅膠柱層析，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸乙 酯為洗脫液，洗脫速度為4. Oml/min,依次洗脫得到3種組分F4、F5(1)和F5(2)；(4)將組分F4再次經(jīng)100目硅膠柱層析來(lái)純化，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸 乙酯為洗脫液洗脫，洗脫速度為3. 3ml/min，保留其中含有單一組分的洗脫部分，回收洗脫 液，將得到的組分在無(wú)水乙醇中進(jìn)行重結(jié)晶，得到白色針狀結(jié)晶，經(jīng)液相色譜測(cè)定純度為 85%。Mp 160. 0-162. O°C (甲醇) 元素分析理論值:C,70.29 ；H, 7. Oll ；N, 5. 127 ；實(shí)測(cè)值:C,70.39 ；H, 7. 306 ；N, 5. OlO實(shí)施例1的方法提取得到的蓽茇堿的13C NMR圖、13C NMR和DEPT (135° )圖、1H NMR圖、局部1H NMR圖譜、局部1H NMR圖、IR圖、GCT-MS圖譜依次參見圖1至圖7。1H和13CNMR數(shù)據(jù)參見表1
cncnmr1HNMR(jzhz)‘ hmbc
1 fα麗——――^p――
2123.27095.92(d, J=14.3, 1H)4
4124.6444 6.66(dd,/=11.0; 5.0, 1H)2,5
5138.70726.74(d, J=6.6, 1H)3,2' 1' 130.8326 一 4,5 2' 105.6524 6.95(s, 1H) 5,6'
3'148.1383_O-CH2-O5 2', 5', 6'
4'148.1383—O-CH2-0,2', 56'
5'108.42986.75(d, J=8.2, 1H)6'
6'122.53086.86(d, J=7.7, 1H)5,2'
-O-CH2-O- 101.24975.96(s, 2H)_
1〃46.96713.17(t,J=6.6,2H)2〃，3〃 ,N-H
2"28.60841.81(m, 1H)1〃，3"
3〃20.12350.93(d, J=6.6,6H)1" ,2〃
5.77(brm, N-H)
—■■■圖■■ ......................................................................................................-..................如洲W.....................———......................—從1H-1H COSY可以看出，PPA有如下幾個(gè)片段CH3-CH-(0. 93， 1. 81) ,-CH2-CH-(3. 17，1. 81)，-CH2-NH-(3. 17，5. 77), -CH-CH- (5. 92，7. 35), -CH-CH- (7. 35，6. 66)，-CH-CH-(6. 66，6. 74)，-CH-CH- (6. 75，6. 86)。IR圖譜有以下幾個(gè)特殊吸收峰(見圖6) =3295,1548 (N-H)，1644 (共軛的羰基雙 鍵)，1606 (共軛的雙鍵)，998 (雙鍵上的反式二氫)，1258、1037 (亞甲雙氧基)，1467、1447、 1191、1161 (C(CH3)),960-965之間沒峰表明(2E-4E)- 二烯酰胺體系存在Mm，855(苯環(huán)上 的孤獨(dú)氫)，795 (苯環(huán)上的相鄰兩個(gè)氫)cm—1 (見圖7)。UV圖譜有以下幾個(gè)特殊吸收峰310nm(3，4-亞甲雙氧苯乙烯反式共軛體系)， 241nm(共軛的不飽和酰胺)，341nm(長(zhǎng)鏈共軛體系存在)。根據(jù)1H NMR、13C匪R、IR、UV等，證實(shí)其具有如下結(jié)構(gòu) 即就是，按照本發(fā)明的提取方法得到的化合物就是蓽茇堿。實(shí)施例2蓽茇堿的提取(1)取500g蓽茇藥材顆粒(16目)置回流裝置中，加入3500ml無(wú)水乙醇，在45°C 下加熱回流4小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾(100 200 μ m孔徑濾膜)得濾液。給濾渣中再 加無(wú)水乙醇1000ml，在45°C下加熱回流1小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾得濾液；合并兩次濾 液，回收乙醇，得到醇提物；(2)將得到的醇提物經(jīng)100目硅膠柱層析，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸乙酯為 洗脫液，勻速(4. Oml/min)洗脫(經(jīng)高效液相色譜法分析)依次得到6種組分回收洗脫 液，得到固體狀F1 F6，其中F4與F5是以混合物的形式存在；(3)將F4+5的混合物再次經(jīng)100目硅膠柱層析，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸乙 酯為洗脫液，洗脫速度為4. Oml/min,依次洗脫得到3種組分F4、F5(1)和F5(2)；(4)將組分F4再次經(jīng)100目硅膠柱層析來(lái)純化，以正己烷_乙酸乙酯為洗脫液洗 脫，洗脫速度為3. Oml/min，保留其中含有單一組分的洗脫部分，回收洗脫液，將得到的組分 在無(wú)水乙醇中進(jìn)行重結(jié)晶，得到白色針狀結(jié)晶，經(jīng)液相測(cè)定純度為88. 1%。Mp 160. 0-162. O°C (甲醇)元素分析理論值:C,70.29 ；H, 7. Oll ；N, 5. 127 ；實(shí)測(cè)值:C,70. 30 ；H, 7. 206 ；N, 5. 110實(shí)施例3蓽茇堿的提取(1)取500g蓽茇藥材顆粒(20目)置回流裝置中，加入3000ml無(wú)水乙醇，在48°C 下加熱回流4. 5小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾得濾液。給濾渣中再加無(wú)水乙醇1000ml，在 48°C下加熱回流1小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾得濾液；合并兩次濾液，回收乙醇，得到醇提 物；(2)將得到的醇提物經(jīng)200目硅膠柱層析，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸乙酯為 洗脫液，勻速洗脫(經(jīng)高效液相色譜法分析)，依次得到6種組分回收洗脫液，得到固體狀F1 F6，其中F4與F5是以混合物的形式存在；(3)將F4+5的混合物再次經(jīng)200目硅膠柱層析，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸乙 酯為洗脫液，洗脫速度為4. Oml/min,依次洗脫得到3種組分F4、F5(1)和F5(2)；(4)將組分F4再次經(jīng)200目硅膠柱層析來(lái)純化，以正己烷-乙酸乙酯為洗脫液洗 脫，速度為3. Oml/min，保留其中含有單一組分的洗脫部分，回收洗脫液，將得到的組分在無(wú) 水乙醇中進(jìn)行重結(jié)晶，得到白色針狀結(jié)晶，經(jīng)液相測(cè)定純度為86%。Mp 160. 0-162. O°C (甲醇)元素分析理論值:C,70.29 ；H, 7. Oll ；N, 5. 127 ；實(shí)測(cè)值:C,70. 34 ；H, 7. 206 ；N, 5. 019實(shí)施例4蓽茇堿的提取(1)取500g蓽茇藥材顆粒(18目)置回流裝置，加入4000ml無(wú)水乙醇，在55°C下 加熱回流5小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾(150 μ m孔徑濾膜)得濾液。給濾渣中再加無(wú)水乙 醇1000ml，在55°C下加熱回流1小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾得濾液；合并兩次濾液，回收乙 醇，得到醇提物；(2)將得到的醇提物經(jīng)200目硅膠柱層析，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸乙酯為洗脫液，勻速洗脫(經(jīng)高效液相色譜法分析)，依次得到6種組分回收洗脫液，得到固體狀 F1 F6，其中F4與F5是以混合物的形式存在；(3)將F4+5的混合物再次經(jīng)200目硅膠柱層析，以1. 5 1 (ν/ν)正己烷-乙酸乙 酯為洗脫液，洗脫速度為4. 2ml/min,依次洗脫得到3種組分F4、F5(1)和F5(2)；(4)將組分F4再次經(jīng)200目硅膠柱層析來(lái)純化，以正己烷-乙酸乙酯為洗脫液同 上法洗脫，速度為3. Oml/min，保留其中含有單一組分的洗脫部分，回收洗脫液將得到的組 分。在無(wú)水乙醇中進(jìn)行重結(jié)晶，得到白色針狀結(jié)晶，經(jīng)液相測(cè)定純度為90%。Mp 160. 0-162. O°C (甲醇)元素分析理論值:C,70.29 ；H, 7. Oll ；N, 5. 127 ；實(shí)測(cè)值:C,70. 34 ；H, 7. 206 ；N, 5. 019實(shí)施例5蓽茇堿的片劑片劑組成組分含量* 蓽茇堿10. Og淀粉77. 7g糊精17. 3g滑石粉5g#胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑4. Og注解*蓽茇堿采用根據(jù)實(shí)施例1的方法提取得到的。**胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑是胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑(捷彩)含有用于薄膜包衣 的多種藥用輔料的混合物，著白色，無(wú)嗅粉末。批準(zhǔn)文號(hào)滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(2009)第28011號(hào)， 由上?，F(xiàn)代浦東藥廠有限公司生產(chǎn)。國(guó)家藥品生產(chǎn)企業(yè)許可證號(hào)滬XyzF20000117。制備方法取蓽茇堿粉碎，加入淀粉和糊精混勻，用40%的乙醇潤(rùn)濕，16目制 粒，50°C干燥1小時(shí)，整粒，加入滑石粉混勻，壓片得素片。將胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑與95%乙醇攪拌溶解一小時(shí)，使充分溶解混合均勻即可。其中包衣預(yù)混劑95%乙醇= IOg IOOml ；將所述素片置包衣鍋內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)并打開熱風(fēng)使藥片溫度達(dá)到35 40°C時(shí)，開始 噴包衣預(yù)混劑，邊吹熱風(fēng)邊噴，使噴霧量均勻適度；熱風(fēng)量控在不致藥片潮濕為宜，包衣結(jié) 束后，用40°C烘干1小時(shí)，即得薄膜片，經(jīng)檢驗(yàn)，其符合《中國(guó)藥典(2005年版一部)片劑項(xiàng) 下各項(xiàng)規(guī)定。實(shí)施例6蓽茇堿的片劑片劑組成組分含量蓽茇堿10. Og淀粉77. 7g糊精17. 3g胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑4. Og(注解同實(shí)施例5)制備方法取蓽茇堿粉碎，加入淀粉和糊精混勻，用40%的乙醇潤(rùn)濕，16目制粒， 50°C干燥1小時(shí)，整粒，壓片得素片。將胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑與95%乙醇攪拌溶解一小 時(shí)，使充分溶解混合均勻即可。其中包衣預(yù)混劑95%乙醇=IOg 100ml;將所述素片置 包衣鍋內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)并打開熱風(fēng)使藥片溫度達(dá)到35 40°C時(shí)，開始噴包衣預(yù)混劑，邊吹熱風(fēng)邊 噴，使噴霧量均勻適度；熱風(fēng)量控在不致藥片潮濕為宜，包衣結(jié)束后，用40°C烘干1小時(shí)，即 得薄膜片。經(jīng)檢驗(yàn)片重差異較實(shí)施例5大。實(shí)施例7蓽茇堿的膠囊處方組成組分含量蓽茇堿10. Og淀粉77. 7g糊精17. 3g滑石粉5g制備方法取實(shí)施例2的方法得到的PPA粉碎，加入淀粉和糊精混勻，用40%的乙 醇潤(rùn)濕，16目制粒，50°C干燥1小時(shí)，整粒，加入滑石粉混勻，裝相應(yīng)規(guī)格的膠囊得膠囊劑。 經(jīng)檢驗(yàn)符合《中國(guó)藥典》(2005年版一部)膠囊劑項(xiàng)下各項(xiàng)規(guī)定。蓽茇堿(PPA)的急性毒性試驗(yàn)(5000mg/kg劑量水平的限度試驗(yàn))目的初步判斷PPA的毒性大小及安全范圍，擬定藥效實(shí)驗(yàn)的給藥劑量提供依據(jù)。 經(jīng)預(yù)試發(fā)現(xiàn)本品毒性很小，無(wú)法測(cè)出LD5tlt5故本試驗(yàn)，以上下法選擇了 5000mg/kg劑量水平 的限度試驗(yàn)。試驗(yàn)試劑取實(shí)施例5制得的蓽茇堿片劑適量，用0. 5%的羧甲基纖維素鈉水溶液 配制成20%混懸劑。空白對(duì)照0. 5%的羧甲基纖維素鈉水溶液。試驗(yàn)方法取小白鼠15只，雌雄個(gè)半，體重20士2g，適應(yīng)性飼養(yǎng)24小時(shí)，禁食12小 時(shí)，按性別均衡隨機(jī)分為試驗(yàn)組(10只)和對(duì)照組(5只)，試驗(yàn)組經(jīng)灌胃一次給試驗(yàn)試劑 0.25ml/10g(5g八g#i)，同時(shí)對(duì)照組經(jīng)灌胃一次空白對(duì)照。給藥后連續(xù)觀察14天。
試驗(yàn)結(jié)果在給藥后及其觀察期間動(dòng)物狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，飲食量可，無(wú)一死亡。 觀察第14天后脫椎處死，肉眼尸檢未發(fā)現(xiàn)異常。第4天至第14天，小鼠體重增長(zhǎng)均勻(見 表2)。說(shuō)明PPA是毒性很小。根據(jù)毒性試驗(yàn)原理，如果該藥物超過(guò)5g/kg劑量給藥沒有死 亡，確定其LD5tl大于5g/kg，判定該藥物為無(wú)毒級(jí)藥物。而從蓽茇中提取的總提取物或總化合物(從蓽茇中95%乙醇提取，經(jīng)15%的 KOH水溶液皂化，用超臨界精餾工藝得到的混合物)LD5tl為0. 3g/kg，其實(shí)驗(yàn)鼠安全劑量為 300mg · kg—1 · cf1。而按照本發(fā)明的方法提取得到的PPT的LD5tl大于5g/kg，實(shí)驗(yàn)鼠安全劑 量為5000mg -kg"1 .d-1以上，安全性為前者的20倍以上。說(shuō)明按照本發(fā)明的方法提取得到 的PPA毒性很低或無(wú)毒性。表2小鼠急性中毒情況(η = 10) 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) PPA對(duì)大白鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥模型的調(diào)脂作用。藥劑辛伐他汀、實(shí)施例5制得的PPA片劑，總堿混合物(從蓽茇中95%乙醇提取， 經(jīng)15%的KOH水溶液皂化，用超臨界精餾工藝得到的混合物)片劑(按照實(shí)施例5法代替 PPA制得)，分別研細(xì)，用0. 5%的羧甲基纖維素鈉水溶液配制成不同濃度的混懸液。高脂飼料配方膽固醇1%，蛋黃粉7. 5%，豬油8%，基礎(chǔ)飼料83. 5%。實(shí)驗(yàn)方法取雄性Wister大白鼠50只，體重170士 IOg ；用常規(guī)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)48 小時(shí)，按體重均衡隨機(jī)分為5組，每組10只。I空白組飼喂足夠的普通飼料；II模型組飼喂高脂飼料20g/日 只，如果不足以常規(guī)飼料補(bǔ)充，實(shí)驗(yàn)灌胃等容量 蒸餾水；III陽(yáng)性組飼喂高脂飼料20g/日 只，如果不足以常規(guī)飼料補(bǔ)充，實(shí)驗(yàn)灌胃辛伐他 汀混懸液10mg/kg ·體重；IV總堿組飼喂高脂飼料20g/日 只，不足以常規(guī)飼料補(bǔ)充，實(shí)驗(yàn)灌胃總堿混合物 片劑混懸液10mg/kg ·體重。V PPA組飼喂高脂飼料20g/日 只，不足以常規(guī)飼料補(bǔ)充，實(shí)驗(yàn)灌胃實(shí)施例5制 得的PPA片劑的混懸液10mg/kg ·體重。各組動(dòng)物每天固定時(shí)間經(jīng)灌胃給藥一次，全部自由飲水，實(shí)驗(yàn)給藥15天。末次給 藥起禁食不禁水12小時(shí)，空腹斷頭采血測(cè)定血清4項(xiàng)血脂指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每隔三天測(cè)一 次空腹體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。1.給藥15天對(duì)血清膽固醇的影響PPA組的結(jié)果顯著降低血清總膽固醇(TC)、甘 油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)，提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)；活性強(qiáng)度 與辛伐他汀相當(dāng)。表4PPA片對(duì)大白鼠高脂癥模型TC的影響(單位mmol/L，η = 10) 注表示與空白組比較ρ小于0.01 ；*表示ρ小于0.05 與模型組比較ρ小于 0. 05。@表示PPA組與總堿組比較ρ小于0. 05。2.給藥15天對(duì)大白鼠體重的影響
表5提取得到的PPA對(duì)實(shí)驗(yàn)大白鼠平均體重增長(zhǎng)的影響(g) 從表5可見，各組之間的大白鼠平均體重增長(zhǎng)無(wú)顯著差異。說(shuō)明PPA對(duì)實(shí)驗(yàn)大白 鼠體重增長(zhǎng)沒有明顯影響。3討論給藥本發(fā)明的方法提取得到的PPA 15天，對(duì)實(shí)驗(yàn)性雄性Wister大白鼠高 脂血癥模型的TC、TGjP LDL-c具有顯著地抑制作用，顯著提高HDL-c水平；在降血清總膽 固醇方面的作用顯著地高于總堿混合物，對(duì)動(dòng)物體重沒有影響。說(shuō)明本發(fā)明的方法提取得 到的PPA是較為理想的調(diào)脂天然成分，比蓽茇總堿混合物作用優(yōu)越。
權(quán)利要求
一種蓽茇堿的提取方法，其包括如下步驟(1)取蓽茇藥材顆粒，加入約6～8倍量(w/v)的無(wú)水乙醇，在45～55℃，優(yōu)選50℃下加熱回流4～5小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾得濾液；給濾渣中再加2倍量(w/v)的無(wú)水乙醇，在45～55℃，優(yōu)選50℃下加熱回流1小時(shí)，之后冷卻至室溫，過(guò)濾得濾液；合并兩次得到的濾液，回收乙醇，得到醇提物；(2)將得到的醇提物經(jīng)100～200目硅膠柱層析，以正己烷-乙酸乙酯為洗脫液，勻速洗脫，洗脫速度為4ml/min，并用高效液相色譜法或薄層層析法分析，依次得到6種組分，回收洗脫液，得到固體狀F1～F6，其中F4與F5是以混合物的形式存在；(3)將F4+5的混合物再次經(jīng)100～200目硅膠柱層析，以正己烷-乙酸乙酯為洗脫液，洗脫速度為3.8～4.2ml/min，依次洗脫得到3種組分F4、F5(1)和F5(2)，回收洗脫液；(4)將組分F4再次經(jīng)100～200目硅膠柱層析來(lái)純化，以正己烷-乙酸乙酯為洗脫液洗脫，洗脫速度為3.0～3.5ml/min，用高效液相色譜法或薄層層析法分析，保留其中含有單一組分的洗脫部分，回收洗脫液將得到較純的單體組分，在無(wú)水乙醇中重結(jié)晶，得到白色針狀結(jié)晶蓽茇堿晶體。
2.權(quán)利要求1的蓽茇堿的提取方法，其中蓽茇藥材顆粒的粒徑為14 20目。
3.權(quán)利要求1的蓽茇堿的提取方法，其中洗脫液正己烷_乙酸乙酯中正己烷與乙酸乙 酯的體積比為1.5 1。
4.一種用于治療高脂血癥的藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法制 備得到的蓽茇堿與藥學(xué)可接受的載體。
5.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述藥物組合物是片劑或膠囊制劑。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述片劑包括所述蓽茇堿、淀粉、糊精、滑石粉，任選 地，可以采用胃溶型薄膜包衣預(yù)混劑對(duì)其進(jìn)行包衣。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述片劑中蓽茇堿、淀粉、糊精、滑石粉的重量 比例為10.0 77. 7 17.3 5，包衣增重量占藥片重量的3.9 4. 1%。
8.權(quán)利要求7的片劑的制備方法，其包括將蓽茇堿粉碎，加入淀粉和糊精混勻，40% 的乙醇潤(rùn)濕，16目制粒，50°C干燥1小時(shí)，整粒，加入滑石粉混勻，壓片得素片，薄膜包衣使 增重3. 9 4. 1%，即得。
9.權(quán)利要求8的片劑的制備方法，其中所述薄膜包衣采用如下方法將胃溶型薄膜包 衣預(yù)混劑與95%乙醇攪拌溶解一小時(shí)以上，使充分溶解混合均勻即可，其中包衣預(yù)混劑的 用量為蓽茇堿量的4%，包衣預(yù)混劑95%乙醇=1 10 (w/v)；將所述素片置包衣鍋內(nèi)， 轉(zhuǎn)動(dòng)并打開熱風(fēng)使藥片溫度達(dá)到35 40°C時(shí)，開始噴包衣預(yù)混劑，邊吹熱風(fēng)邊噴，使噴霧 量均勻適度；熱風(fēng)量控在不致藥片潮濕為宜，包衣結(jié)束后，用40°C烘干1小時(shí)。
10.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法制備得到的蓽茇堿或權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)的藥物 組合物在制備用于治療高脂血癥、動(dòng)脈硬化、脂肪肝、肝硬化的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蓽茇堿的提取方法，其包括首先用無(wú)水乙醇提取，得到醇提物，再經(jīng)連續(xù)兩次硅膠柱分離，結(jié)晶之后可獲得純蓽茇堿的晶體。本發(fā)明的提取方法除去了大量雜質(zhì)，得到了純度高達(dá)85～95％的蓽茇堿，并且該方法的成本低、提取效率高，無(wú)需采用緊缺、有毒的試劑和技術(shù)復(fù)雜的設(shè)備，便于批量成產(chǎn)，特別地，按照本發(fā)明的提取方法得到的蓽茇堿毒性低而活性強(qiáng)。本發(fā)明還提供包含所述蓽茇堿的藥物制劑、其制備方法及其在制備治療高脂血癥的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07D317/60GK101863872SQ20101020188
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月5日
發(fā)明者烏興榮, 侯峰, 包勒朝魯, 胡日樂(lè)巴根, 那生桑 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院