專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有抗Cd²⁺和抗Cu²⁺功能的基因DvCRP1、其編碼蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉具有抗鎘和抗銅功能的基因DvCRPl、其編碼蛋白質(zhì)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染日趨嚴(yán)重。重金屬污染引發(fā)的環(huán)境和健康問(wèn)題 在許多國(guó)家都有報(bào)道。鎘(Cd2+)是生物毒性最強(qiáng)的重金屬之一，而且Cd2+在環(huán)境中的化學(xué) 活性強(qiáng)、移動(dòng)性大、毒性持久。自上世紀(jì)20年代起，由于采礦、冶煉、電鍍、化工等行業(yè)的快 速發(fā)展及其廢水的排放，導(dǎo)致水體和土壤Cd2+污染日益嚴(yán)重。水體和土壤中污染的Cd2+易 被水體生物和高等植物吸收和積累，影響它們的生長(zhǎng)及代謝，造成農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)下降 及生態(tài)環(huán)境的破壞。更嚴(yán)重的是水體和土壤中的Cd2+容易通過(guò)食物鏈的富集作用進(jìn)入人 體，對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重的危害。環(huán)境Cd2+污染的生物修復(fù)是一種新興的綠色環(huán)境治理技術(shù)，具有很大的應(yīng)用潛 力。該技術(shù)主要利用對(duì)Cd2+耐性強(qiáng)、吸收和富集量大的生物體(如高等植物和微生物)來(lái) 降低環(huán)境中Cd2+的含量，以達(dá)到修復(fù)的目的。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，生物修復(fù)技術(shù)的長(zhǎng)足進(jìn)步將依賴(lài) 于Cd2+耐受和積累關(guān)鍵基因的鑒定和克隆，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育一批高耐受、高積累Cd2+ 的生物新品種。研究發(fā)現(xiàn)很多綠藻對(duì)Cd2+具有很高的耐受性，如硅藻(Phaeodactylum tricornutum)可以耐受超過(guò) 400 μ M 的 Cd2+，而萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)也 可以耐受200 μ M以上的Cd2+ ；另外很多綠藻還具有很強(qiáng)的吸附和積累Cd2+的能力，因此綠 藻在治理水體Cd2+污染方面被公認(rèn)為具有很好的應(yīng)用前景。此外，綠藻特異耐Cd2+基因的 克隆可為Cd2+污染的生物修復(fù)技術(shù)提供優(yōu)良基因資源。鹽藻(Dimaliella)(又稱(chēng)杜氏鹽藻)是一種生存于極端環(huán)境下的真核單細(xì)胞綠 藻，對(duì)鹽脅迫具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，研究表明鹽藻對(duì)Cd2+也具有較強(qiáng)的耐受性(Tsuji et al.，2002，2003)。但對(duì)鹽藻的研究缺乏轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，不能通過(guò)成熟的遺傳學(xué)方法進(jìn)行研究。利用酵母的功能互補(bǔ)系統(tǒng)克隆外源基因是一個(gè)非常有效的手段，因?yàn)榻湍甘钦婧?生物基因的優(yōu)良表達(dá)系統(tǒng)，具有高效的轉(zhuǎn)化方法，而且酵母有可供篩選的豐富突變體。由于 這一方法通過(guò)功能互補(bǔ)進(jìn)行篩選，因而具有高效、直接、目的性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，更重要的是通過(guò) 該方法可以篩選到與酵母突變基因不同源的新基因。植物很多抗Cd2+基因是通過(guò)這一方法 被克隆的，如擬南芥的AtPCSl和AtPcrl、小麥的TaPCSl、TaTM20和TaHsfA4a及遏藍(lán)菜的 TcHMA4 等。因此，利用酵母功能互補(bǔ)系統(tǒng)從鹽藻中分離抗鎘基因是一個(gè)非常有效的手段，將 有可能從鹽藻中篩選獲得新的抗鎘基因，從而為提高生物體抗鎘能力、增加生物體內(nèi)鎘的 積累量的基因工程提供優(yōu)良基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供了一種從極端生物鹽藻(Dimaliella viridis)中分 離出來(lái)的具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRPl。本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。本發(fā)明的目的之三在于提供該基因在提高生物體抗鎘和抗銅能力中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之四在于提供該基因在增加生物體內(nèi)鎘和銅的積累量方面的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRPl，其特征在于該基因具有下列核苷酸 序列之一1)具有SEQ ID NO 1所示的堿基序列；2)與SEQ ID NO 1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同生物學(xué) 功能蛋白質(zhì)的DNA序列。一種根據(jù)權(quán)利要求1所述DvCRPl基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具有下列氨
基酸序列之一1)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；2)通過(guò)將SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該衍生蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :2的蛋白具有相 同的生物學(xué)功能。一種重組載體，其特征在于，該重組載體含有權(quán)利要求1所述的DvCRPl基因。一種宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的重組載體。一種上述的DvCRPl基因在提高生物抗鎘和抗銅能力基因工程方面的應(yīng)用。一種上述的DvCRPl基因在提高生物鎘和銅積累量基因工程方面的應(yīng)用。一種上述的DvCRPl基因編碼的蛋白在提高生物抗Cd2+和抗Cu2+功能方面的應(yīng)用。一種上述的DvCRPl基因編碼的蛋白在增加生物體內(nèi)鎘和銅的積累量方面的應(yīng)用。一種克隆上述具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRPl的方法，其特征在于該方法 包括如下步驟a)將酵母表達(dá)文庫(kù)通過(guò)LiAc熱擊法轉(zhuǎn)化酵母突變體Δ yapl，在150 μ M Cd2+的篩 選壓力下篩選突變表型回復(fù)的酵母轉(zhuǎn)化子，得到候選克隆；b)將步驟a)得到的候選克隆所攜帶的表達(dá)載體從酵母細(xì)胞中分離出來(lái)，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增；把擴(kuò)增以后的載體回轉(zhuǎn)酵母突變體Ayapl，得到在150μΜ Cd2+的脅迫處 理下仍能夠正常生長(zhǎng)的陽(yáng)性克?。籧)利用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI/XhoI消化步驟b)得到的陽(yáng)性克隆釋放出插入片段， 構(gòu)建到測(cè)序載體中，通過(guò)測(cè)序獲得DvCRPl基因的部分cDNA序列；d)在步驟c)得到的部分cDNA序列上設(shè)計(jì)兩條5’ RACE弓丨物，引物序列分別為5， -gcggctcgtgacgccacactcagacagg-3，5， -gtggcacagcctgtctcccgagctacag-3，，使用SMART RACE cDNA amplification kit 試劑盒進(jìn)行 5，cDNA 擴(kuò)增反應(yīng)，回收 最長(zhǎng)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到測(cè)序載體上，通過(guò)測(cè)序獲得鹽藻DvCRPl基因的全長(zhǎng)編碼序列。本發(fā)明還涉及所述的DvCRPl基因在提高生物體抗鎘和抗銅能力、增加生物體內(nèi)
4鎘和銅的積累量基因工程方面的應(yīng)用；以及所述的DvCRPl基因編碼的蛋白質(zhì)在提高生物 體抗鎘和抗銅能力、增加生物體內(nèi)鎘和銅的積累量基因工程方面的應(yīng)用。


圖1顯示了表達(dá)鹽藻DvCRPl基因的酵母轉(zhuǎn)化子的抗Cd2+表型。圖2顯示了表達(dá)鹽藻DvCRPl基因的酵母轉(zhuǎn)化子的抗Cu2+表型。圖3顯示了表達(dá)鹽藻DvCRPl基因的酵母轉(zhuǎn)化子中的高Cd2+積累量。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆 (Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遺傳法實(shí)驗(yàn)指南(Methods in Yeast Genetics :A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al 編，Cold Spring Harbor Laboratory，1998出版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。實(shí)施例一 =DvCRPl全長(zhǎng)編碼區(qū)的克隆與分析將酵母表達(dá)文庫(kù)通過(guò)LiAc熱擊法轉(zhuǎn)化酵母突變體Δ yapl，在含150 μ M Cd2+的篩 選壓力下篩選突變表型回復(fù)的酵母轉(zhuǎn)化子，得到候選克隆。為了排除由于酵母基因組上自 發(fā)突變?cè)斐傻募訇?yáng)性，將候選克隆所攜帶的表達(dá)載體從酵母細(xì)胞中分離出來(lái)，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增以后的載體回轉(zhuǎn)酵母突變體Ayapl，在150μΜ Cd2+處理下仍能夠穩(wěn)定 生長(zhǎng)得克隆即為真正的陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆所攜帶的表達(dá)載體中的插入片段進(jìn)行測(cè)序， 獲得DvCRPl的部分cDNA序列。 為了得到全長(zhǎng)編碼區(qū)的cDNA序列，本發(fā)明在已知的cDNA序列上設(shè)計(jì)了兩條 5，RACE 弓丨物5，-gcggctcgtgacgccacactcagacagg-3，和 5，-gtggcacagcctgtctcccgagcta cag-3，。使用 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA amplification kit 試劑盒進(jìn)行 5，cDNA 擴(kuò)增反應(yīng)，回收最長(zhǎng)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到測(cè)序載體上進(jìn)行測(cè)序，最終在原有cDNA的基礎(chǔ)上向 5，端補(bǔ)全了 cDNA序列，得到了鹽藻DvCRPl基因的全長(zhǎng)cDNA序列，長(zhǎng)度為1799bp。實(shí)施例二 DvCRPl的序列分析先后采用Blastx、tBlastx和Blastn程序?qū)vCRPl基因的全長(zhǎng)cDNA序列在 NCBI相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov)，都沒(méi)有獲得有效的 Blast搜索結(jié)果，表明鹽藻DvCRPl基因及其同源基因目前還沒(méi)有被克隆和研究，是首次被 發(fā)現(xiàn)的具有抗Cd2+功能的新基因。通 過(guò) NCBI ORF Finder(http://www, ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/Rorf. html)對(duì) DvCRPl基因的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示DvCRPl正義鏈含有一個(gè)長(zhǎng)1497bp的 0RF(88_1584bp。然后，通過(guò)PCR將這個(gè)預(yù)測(cè)的ORF亞克隆到pAJ401中并轉(zhuǎn)化Δ yapl突變 體，轉(zhuǎn)化子的抗Cd2+表型鑒定顯示這個(gè)ORF具有和全長(zhǎng)cDNA同等強(qiáng)度的抗Cd2+功能(見(jiàn)實(shí) 施例三)，表明所預(yù)測(cè)的DvCRP 1基因的ORF是正確的。另外，在DvCRP 1的cDNA序列中，其 ORF的5’端起始密碼子上游存在同框的終止密碼子，這表明DvCRPl基因的ORF是完整的。因此，DvCRPl編碼一個(gè)498個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 2，圖1)。實(shí)施例三DvCRPl在酵母中的功能分析(一 )酵母表達(dá)載體的構(gòu)建通過(guò)PCR方法，以DvCRPl的cDNA克隆為模板，擴(kuò)增獲得DvCRPl的全長(zhǎng)ORF片段。 為了構(gòu)建克隆的需要，借助引物引入法，在靶序列5’端加上EcoRI酶切位點(diǎn)，在其3’端加 上XhoI酶切位點(diǎn)，引物序列如下DvCRPl+ 5' _attgaattcatgaacggagacgagtgtagg_3，DvCRPl- :5，_attctcgagtcagcatctgcacagatcac_3，將PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物利用酶位點(diǎn)EcoRI和XhoI定向克隆至載體pAJ401中，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌ToplO。通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性克隆pAJ401-DvCRPl。(二)轉(zhuǎn)化酵母使用LiAc熱激轉(zhuǎn)化法將空載體PAJ401和DvCRPl的表達(dá)載體pAJ401_DvCRPl分 別轉(zhuǎn)化到酵母鎘敏感突變體Ayapl和酵母銅敏感突變Acupl中，同時(shí)將空載體pAJ401轉(zhuǎn) 化到相應(yīng)的野生型酵母Y252和DTY3中。(三)酵母轉(zhuǎn)化子的表型鑒定將轉(zhuǎn)化pAJ401或pAJ401_DvCRPl的突變體Δ yapl轉(zhuǎn)化子細(xì)胞和轉(zhuǎn)化pAJ401的 野生型Y252轉(zhuǎn)化子細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，5倍梯度稀釋(起始0D600 = 0. 5)后，取5 μ 1各梯 度稀釋菌液分別滴到含O、150、200、250及300 μ M CdCl2的YNB平板上，30°C培養(yǎng)6天。結(jié) 果如圖1所示，表達(dá)DvCRPl的突變體Ayapl轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的抗鎘能力得到了非常顯著的提 高，并大大超出了野生型酵母的抗鎘能力。將轉(zhuǎn)化pAJ401或pAJ401-DvCRPl的突變體Δ cupl轉(zhuǎn)化子細(xì)胞和轉(zhuǎn)化pAJ401的 野生型DTY3轉(zhuǎn)化子細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，5倍梯度稀釋(起始0D600 = 0. 5)后，取5 μ 1各梯 度稀釋菌液分別滴到含0、25、50、75及ΙΟΟμΜ CuSO4的YNB平板上，30°C培養(yǎng)6天。結(jié)果 如圖2所示，表達(dá)DvCRPl的突變體Acupl轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的抗銅能力得到了顯著的提高。(四)酵母轉(zhuǎn)化子中的鎘含量測(cè)定將轉(zhuǎn)化pAJ401或pAJ401-DvCRPl的突變體Δ yapl轉(zhuǎn)化子細(xì)胞和轉(zhuǎn)化pAJ401的野 生型Y252轉(zhuǎn)化子細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期，加入終濃度為20 μ M的CdCl2,繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后， 收集不同酵母轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，80°C烘干48小時(shí)，用電感耦合等離子質(zhì)譜系統(tǒng)(ELAN DRC-e, Perkin-Elmer)測(cè)定樣品中的Cd2+含量。結(jié)果如圖3所示，表達(dá)DvCRPl的突變體Ayapl轉(zhuǎn) 化子細(xì)胞的鎘含量得到了非常顯著的提高，并大大超出了野生型酵母細(xì)胞中的鎘含量。盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的， 即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利 要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
權(quán)利要求
一種具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRP1，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQ ID NO1所示的堿基序列；2)與SEQ ID NO1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同生物學(xué)功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述DvCRPl基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具有下列氨基 酸序列之一1)具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列；2)通過(guò)將SEQID NO :2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該衍生蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :2的蛋白具有相同的 生物學(xué)功能。
3.—種重組載體，其特征在于，該重組載體含有權(quán)利要求1所述的DvCRPl基因。
4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的DvCRPl基因在提高生物抗鎘和抗銅能力基因工程方面 的應(yīng)用。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的DvCRPl基因在提高生物鎘和銅積累量基因工程方面的應(yīng)用。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的DvCRPl基因編碼的蛋白在提高生物抗Cd2+和抗Cu2+功 能方面的應(yīng)用。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的DvCRPl基因編碼的蛋白在增加生物體內(nèi)鎘和銅的積累量方面的應(yīng)用。
9.一種克隆權(quán)利要求1所述具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRPl的方法，其特征 在于該方法包括如下步驟a)將酵母表達(dá)文庫(kù)通過(guò)LiAc熱擊法轉(zhuǎn)化酵母突變體Ayapl，在150μΜCd2+的篩選壓 力下篩選突變表型回復(fù)的酵母轉(zhuǎn)化子，得到候選克?。籦)將步驟a)得到的候選克隆所攜帶的表達(dá)載體從酵母細(xì)胞中分離出來(lái)，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌進(jìn)行擴(kuò)增；把擴(kuò)增以后的載體回轉(zhuǎn)酵母突變體Ayapl，得到在150μΜ Cd2+的脅迫處理下 仍能夠正常生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆；c)利用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI/XhoI消化步驟b)得到的陽(yáng)性克隆釋放出插入片段，構(gòu)建 到測(cè)序載體中，通過(guò)測(cè)序獲得DvCRPl基因的部分cDNA序列；d)在步驟c)得到的部分cDNA序列上設(shè)計(jì)兩條5’RACE引物，引物序列分別為 5，-gcggctcgtgacgccacactcagacagg-3，5' -gtggcacagcctgtctcccgagctacag-3',使用SMART RACE cDNA amplification kit試劑盒進(jìn)行5，cDNA擴(kuò)增反應(yīng)，回收最長(zhǎng) 的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到測(cè)序載體上，通過(guò)測(cè)序獲得鹽藻DvCRPl基因的全長(zhǎng)編碼序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗鎘Cd2+和抗銅Cu2+基因DvCRP1、其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用。本發(fā)明采用了酵母功能互補(bǔ)系統(tǒng)篩選得到了DvCRP1基因，運(yùn)用RACE技術(shù)得到了全長(zhǎng)cDNA序列，并且證明了該基因能夠顯著提高模式生物酵母的抗鎘和抗銅能力、并能顯著增加酵母細(xì)胞內(nèi)鎘的積累量。所公開(kāi)的全長(zhǎng)基因及氨基酸序列為首次發(fā)現(xiàn)的鹽藻特有的抗鎘和抗銅基因，其在提高生物體的抗鎘和抗銅能力、增加生物體內(nèi)鎘和銅的積累量基因工程方面具有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/405GK101921778SQ20101020143
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者孟祥宗, 宋任濤, 許政暟 申請(qǐng)人:上海大學(xué)