專(zhuān)利名稱：：水稻OsAPI5基因在育性控制中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)控制水稻育性的基因0SAPI5的克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。本發(fā)明利用T-DNA標(biāo)簽技術(shù)，通過(guò)正向遺傳學(xué)方法，從水稻T-DNA插入突變體庫(kù)中得到了一個(gè)控制水稻育性的基因0sAPI5，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)及等位突變體分析證明了0sAPI5基因的功能。本發(fā)明還涉及利用該基因通過(guò)基因工程技術(shù)有目的地對(duì)水稻的育性控制進(jìn)行遺傳改良。
背景技術(shù)：
：水稻是世界上最重要的糧食作物之一，它養(yǎng)活了全球近半數(shù)的人口，如何提高水稻的產(chǎn)量是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的重要問(wèn)題。目前，我國(guó)絕大部分的稻米由雜交水稻產(chǎn)生，通過(guò)控制花粉育性培育不育系是雜交水稻生產(chǎn)的關(guān)鍵。雜交水稻的生產(chǎn)使用的一些核基因或細(xì)胞質(zhì)雄性的不育系，在水稻雜交育種和增產(chǎn)中起了重要作用。遺傳和環(huán)境因素都會(huì)影響水稻的花粉育性，而以遺傳因素為主。水稻的花粉在其雄性生殖器官雄蕊中起始發(fā)育、成熟和釋放，這一系列配子發(fā)育過(guò)程包括雄蕊的孢子體組織的發(fā)育受到嚴(yán)密準(zhǔn)確的遺傳調(diào)控，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的遺傳缺陷都可能導(dǎo)致花粉的敗育。被子植物的雄蕊一股由花藥和花絲兩部分組成，花絲富含維管結(jié)構(gòu)，將花藥和花托相連，具有運(yùn)輸水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能。每個(gè)花藥包括四個(gè)相同的花粉囊和連接花粉囊的藥隔組織；發(fā)育完成的花藥由四層二倍體的孢子體壁細(xì)胞表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層(從外到內(nèi)依次)和其包圍著的單倍體配子體細(xì)胞組成。近些年，通過(guò)對(duì)擬南芥和水稻等模式植物的分子遺傳學(xué)研究，克隆鑒定了一系列的控制植物花藥發(fā)育的基因，建立了調(diào)控花藥發(fā)育的分子機(jī)理的框架(Ma，等.2005.Moleculargeneticanalysesofmicrosporogenesisandmicrogametogenesisinfloweringplants.Annu.Rev.plantsBiol.56:393-434.)。在花藥的四層壁細(xì)胞中，最內(nèi)層的絨氈層細(xì)胞的發(fā)育分化對(duì)于小孢子的發(fā)育至關(guān)重要，絨氈層在小孢子發(fā)育的后期會(huì)降解，細(xì)胞降解后的組分為小孢子的后期發(fā)育提共必要白勺營(yíng)養(yǎng)(Papini,^.1999.Programmed-cell-deatheventsduringtapetumdevelopmentofangiosperms._Protoplasma207(3):213_221·)。絨粗層的降角軍過(guò)程被認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡(PCD)的過(guò)程，其降解發(fā)生的時(shí)間與小孢子的發(fā)育時(shí)期高度吻合，提前或推遲降解都會(huì)引起花粉的敗育(Goldberg,等·1993.Antherdevelopment:basicprinciplesandpracticalapplications.ThePlantCell5(10):1217—1229·)。巨Itf，控制絨氈層降解的PCD機(jī)制還不是很清楚，但是，近些年來(lái)，通過(guò)分子遺傳學(xué)的手段，科學(xué)家們還是克隆了一些控制植物花藥絨氈層降解的基因(WilsomZ.andD.Zhang.2009.FromArabidopsistoricepathwaysinpollendevelopment.JournalofExperimentalBotany60(5):1479.)，這為研究其分子機(jī)制提供了線索。Api5是一個(gè)保守的基因家族，廣泛存在于動(dòng)植物中。目前，在動(dòng)物研究中有一些有限的關(guān)于Api5基因功能的報(bào)道。Api5基因也被稱為AAC-11/FIF/MIG8，最早的關(guān)于該基因的報(bào)道是在缺失生長(zhǎng)因子的環(huán)境下，該基因(AAC-Il)的超量表達(dá)會(huì)抑制由此引起的細(xì)3■禾呈個(gè)生^Et(Tewari,^.1997.AAC-11,anovelcDNAthatinhibitsapoptosisaftergrowthfactorwithdrawal._CancerRes57(18):4063_4069.)。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)該基因的上升表達(dá)與腫瘤發(fā)生是相關(guān)的，并且在肝癌細(xì)胞中作為miR224的特異靶基因其表達(dá)受到miR224的調(diào)控(Kim，等·2000.AAC-11overexpressioninducesinvasionandprotectscervicalcancercellsfromapoptosis.LabInvest80(4)587~594；Wang,等.2008.ProfilingmicroRNAexpressioninhepatocellularcarcinomarevealsmicroRNA-224up—regulationandapoptosisinhibitor-5asamicroRNA-224-specifictarget.JBiolChem283(19):13205_13215.)。但是Api5參與的這些腫瘤相關(guān)的分子機(jī)制還不清楚。最近，AAC-Il基因編碼產(chǎn)物能和Acinus蛋白互作并抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡(Rigou，等.2009.TheantiapoptoticproteinAAC-IlinteractswithandregulatesAcinus-mediatedDNAfragmentation.EMBOJ28(11):1576_1588.)。在果蠅中，Api5基因能特異抑制由E2F-1基因功能失調(diào)引起的細(xì)胞程序性死亡(Morris，等.2006.FunctionalidentificationofApi5asasuppressorofE2F_dependentapoptosisinvivo.PLoSGenet2(11):el96.)。從動(dòng)物中的研究來(lái)看，APi5的主要功能是作為細(xì)胞死亡抑制蛋白參與調(diào)控細(xì)胞程序性死亡。與動(dòng)物中API5基因的研究相比，在完成水稻和擬南芥全基因組測(cè)序后，顯示在水稻和擬南芥中分別有一個(gè)和兩個(gè)API5基因的同源基因，但是沒(méi)有它們功能的任何相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明利用0sAPI5的突變體詳細(xì)研究了該基因在絨氈層降解的PCD過(guò)程中的作用，為深入了解水稻花藥絨氈層降解的PCD分子機(jī)制提供重要線索，同時(shí)為人工控制水稻的育性培育不育系提供了新的途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是克隆一個(gè)控制水稻育性的新基因0sAPI5，利用該基因的失活能導(dǎo)致水稻絨氈層推遲降解有助于我們了解控制絨氈層降解過(guò)程的分子機(jī)制，為創(chuàng)建水稻不育系材料奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用水稻育性的基因0sAPI5的轉(zhuǎn)基因植株在水稻育性控制的應(yīng)用，具體的說(shuō)就是利用分子設(shè)計(jì)的方法，將該基因與其它器官或組織特異表達(dá)的調(diào)控元件組合，抑制該基因在雄配子的表達(dá)從而得到雄性不育植株，創(chuàng)造新的雄性不育系材料，這些不育系可以用于水稻雜交種的生產(chǎn)。OsAP15基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，也包括與SEQIDNO1所示的核苷酸序列有90%以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物。本發(fā)明也包括SEQIDN0:2所示的0sAPI5蛋白的氨基酸序列，及與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有90%同源性以上的氨基酸序列，也包括因插入、替代或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸而產(chǎn)生的功能類(lèi)似物。本發(fā)明克隆的水稻0sAPI5基因的T-DNA插入失活突變體osapi5-l表現(xiàn)為花粉敗育(見(jiàn)實(shí)施例1)，其等位突變體0sapi5-2具有與0sapi5-l相同的突變表型(見(jiàn)實(shí)施例3)，并且突變表型也與在0sAPI5基因內(nèi)的T-DNA插入共分離(見(jiàn)實(shí)施例1)。正常功能的0sAPI5基因轉(zhuǎn)化該突變體后植株恢復(fù)正常的表型(見(jiàn)實(shí)施例4)。本發(fā)明還提供了一種利用0sAPI5基因進(jìn)行高效植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種含有SEQIDNO:1所示序列的基因或該基因的部分類(lèi)似功能片段的載體，如圖5A所示的互補(bǔ)載體pC2301-0sAPI5(見(jiàn)實(shí)施例4所示)。本發(fā)明還有一種含有以上表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞。本發(fā)明利用RNAi技術(shù)，抑制水稻內(nèi)源0sAPI5基因的表達(dá)，造成水稻不育，可以培育水稻不育系材料(見(jiàn)實(shí)施例5)。具體的說(shuō)就是將0sAPI5基因與其它調(diào)控元件，如組成型啟動(dòng)子(如CaMV35S啟動(dòng)子)或器官特異性啟動(dòng)子融合構(gòu)建基因抑制表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(如反義RNA或RNAi)人為控制水稻的育性，創(chuàng)造新的雄性不育系，用于水稻雜交種的生產(chǎn)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下1.利用已有的水稻T-DNA插入突變體庫(kù)(突變體庫(kù)的創(chuàng)建方法已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表論文，見(jiàn)ffu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ,2003418-427；Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzingl3,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.PlantJ,2007947-959)蹄詵得到一個(gè)雌雄不育的突變體材料03Z11R053,我們將其侖名Jl^Mi^l，突變體的篩選鑒定方法見(jiàn)實(shí)施例1第1部分中詳細(xì)描述。2.本發(fā)明分析了野生型和突變體0sapi5-l不同發(fā)育時(shí)期的花藥的半薄切片，結(jié)果顯示突變體的花粉敗育是由于其絨氈層的推遲降解導(dǎo)致的(見(jiàn)實(shí)施例2)。3.采用TAIL-PCR方法(Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.PlantJ,2007947-959)分離osapi5_l突變體的側(cè)翼序列，通過(guò)序列分析顯示T-DNA插入0sAPI5基因的編碼序列中(實(shí)施例1第2部分)。4.通過(guò)對(duì)突變體osapi5-l及其等位突變體0sapi5-2(原始編號(hào)3A-10121，來(lái)自韓國(guó)浦項(xiàng)科技大學(xué))的T-DNA插入與突變性狀的共分離驗(yàn)證(實(shí)施例1第3和第4部分及實(shí)施例3)及功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)實(shí)施例4)證明本發(fā)明獲得的候選基因0sAPI5的失活是引起0Sapi5突變表型的原因。5利用RNAi技術(shù)抑制水稻內(nèi)源0sAPI5基因的表達(dá)培育水稻不育系材料(見(jiàn)實(shí)施例5)更詳細(xì)的技術(shù)發(fā)明細(xì)節(jié)將由《具體實(shí)施方式》給出。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.本發(fā)明利用T-DNA標(biāo)簽法分離克隆基因快速、高效。2.雖然0sAPI5基因成員的功能在動(dòng)物中有過(guò)研究，但是在植物中的功能沒(méi)有任何報(bào)道。本發(fā)明提供了調(diào)控水稻育性基因0sAPI5及其編碼蛋白。該基因?qū)τ谒居苑肿訖C(jī)理等理論研究具有重要的價(jià)值。3.將含有SEQIDNO:1所示序列的基因或該基因的部分類(lèi)似功能的DNA片段進(jìn)行改造，導(dǎo)入植物體，可以人工控制水稻的育性，創(chuàng)建不育系材料，對(duì)水稻的遺傳改良具有深遠(yuǎn)的實(shí)際應(yīng)用意義。序列表SEQIDNO1是本發(fā)明克隆的0sAPI5基因的核苷酸序列。序列表SEQIDNO2是本發(fā)明的0sAPI5基因的編碼序列對(duì)應(yīng)的核苷酸。圖1水稻不育突變體0sapi5-l的突變表型。圖IA成熟期水稻野生型植株與不育植株形態(tài)比較左為野生型，右為不育突變體。圖IB野生型植株開(kāi)花后的稻穗，有大量雄蕊伸出散粉。圖IC突變體植株開(kāi)花后的稻穗，很少有雄蕊伸出散粉。圖ID抽穗時(shí)野生型花藥與突變體花藥形態(tài)比較，左邊為野生型花藥，右邊為突變體花藥。圖IE野生型植株(WT)的花粉在經(jīng)淀粉_碘化鉀染色后觀察。圖IF突變體花粉在經(jīng)淀粉_碘化鉀染色后觀察。圖2野生型和突變體花藥半薄切片的比較。圖2A、圖2C、圖2E和圖2G分別表示野生型花藥在小孢子時(shí)期、液泡化花粉時(shí)期、有絲分裂時(shí)期和成熟花粉期的花藥橫切片。圖2B、圖2D、圖2F和圖2H分別表示突變體花藥在小孢子時(shí)期、液泡化花粉時(shí)期、有絲分裂時(shí)期和成熟花粉期的花藥橫切片。英文字母分別表示花藥的結(jié)構(gòu)。E，表皮細(xì)胞；En，藥室內(nèi)壁；ML，中層；T，絨氈層；Ms，造孢細(xì)胞；Msp,小孢子；PG,花粉粒Bars=25μm.圖3.osapi5-l的等位突變體osapi5-2的突變表型也是不育。圖3A野生型植株開(kāi)花后的小花(剝?nèi)?/4穎殼)。圖3B突變體植株開(kāi)花后的小花(剝?nèi)?/4穎殼)。圖3C抽穗時(shí)野生型花藥。圖3D抽穗時(shí)突變體花藥。圖3E野生型植株(WT)的花粉在經(jīng)淀粉-碘化鉀染色后觀察。Bars=30μm圖3F突變體植株的花粉在經(jīng)淀粉_碘化鉀染色后觀察。Bars=30μm圖3G野生型植株(WT)成熟花粉期的花藥橫切片。Bars=25μm.圖3H突變體植株成熟花粉期的花藥橫切片。Bars=25μm.英文字母分別表示花藥的結(jié)構(gòu)。E，表皮細(xì)胞；En，藥室內(nèi)壁；ML，中層；T，絨氈層；PG，花粉粒。圖4.0sAPI5基因與突變表型的共分離驗(yàn)證。圖4A=OsAP15基因的結(jié)構(gòu)和T-DNA插入位點(diǎn)分析。起始密碼(ATG)和終止密碼(TGA)已經(jīng)標(biāo)出，方框表示0sAPI5基因的單外顯子，橫線表上基因的內(nèi)含子；兩個(gè)到三角形分別表示osapi5-l和osapi5-2中T-DNA插入的位置。Pl，P2，表示跨T-DNA的兩條基因組引物，P3表示位于0sapi5-l突變體中T-DNA上的邊界引物，P4，P5表示位于等位突變體osapi5-2中T-DNA插入位點(diǎn)兩端的兩條基因組引物，P6表示T-DNA邊界引物。圖4B是一個(gè)0sapi5-lT-DNA插入雜合植株后代的基因型檢測(cè)。植株基因型的確定當(dāng)Pl和P3配對(duì)時(shí)才可以擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，由于T-DNA插入片段太大，Pl與P2配對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物無(wú)法得到；野生型植株由于沒(méi)有T-DNA的插入，所以Pl和P3配對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有產(chǎn)物，但可以利用引物Pl與P2配對(duì)擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物；而0SAPI5雜合T-DNA插入轉(zhuǎn)基因植株則Pl和P2配對(duì)以及Pl和P3配對(duì)時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。植株表型20個(gè)Tl代單株中第1、4、6、15、17株為突變表型(以M表示)。由圖可知突變植株的基因型均為0sAPI5純合T-DNA插入，而正常植株的基因型為野生(以W表示)或雜合型(以H表示)，這一結(jié)果表明突變表型與0sAPI5基因內(nèi)的T-DNA插入共分離。圖4C是等位突變體0sapi5-2的一個(gè)T-DNA插入雜合植株后代的基因型檢測(cè)。圖4D是RT-PCR分析0sAPI5在野生型(WT)和突變體osapi5_l和osapi5_2中的表達(dá)，結(jié)果表明0sAPI5在突變體中的表達(dá)被完全敲除。以GAPDH做為內(nèi)標(biāo)。圖5.OsAP15基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。圖5A互補(bǔ)載體pC2301_0sAPI5結(jié)構(gòu)示意圖，該載體的構(gòu)建說(shuō)明見(jiàn)實(shí)施例2中的第1部分，即將含有基因0sAPI5的完整的編碼區(qū)和其啟動(dòng)子區(qū)域用BamHI從BAC克隆(OSJNBaOO19G21)酶切后克隆到載體pCAMBIA2301(購(gòu)自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)上形成的新質(zhì)粒。以pCAMBIA2301空載體轉(zhuǎn)化植株作為陰性對(duì)照。圖5B所有互補(bǔ)植株的3個(gè)穗育性的平均值，數(shù)值代表平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)差；圖5C用pCAMBIA2301載體上一段特異的片段做探針檢測(cè)了部分育性恢復(fù)單株的拷貝數(shù)，并挑選了2個(gè)單拷貝單株(第2和第4號(hào)單株)考察其T1代的育性。圖5D第4號(hào)單株T1代植株的育性分離情況，成熟期轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Posi)與轉(zhuǎn)基因陰性植株(Neg)形態(tài)比較左為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Posi)，右為轉(zhuǎn)基因陰性植株(Neg)。圖5E轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Posi)的小花，顯示為正常小花。圖5F轉(zhuǎn)基因陰性植株(Neg)的小花，顯示花藥形態(tài)異常。圖5G轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Posi)與轉(zhuǎn)基因陰性植株(Neg)花藥形態(tài)比較，左為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Posi)的花藥，右為轉(zhuǎn)基因陰性植株(Neg)的花藥，顯示轉(zhuǎn)基因陰性植株(Neg)的花藥較轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Posi)的花藥瘦小。圖5H:轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Posi)的花粉經(jīng)淀粉-碘化鉀染色后觀察，其花粉都著色，說(shuō)明花粉可育。圖51轉(zhuǎn)基因陰性植株(Neg)的花粉經(jīng)淀粉_碘化鉀染色后觀察，很少有花粉可以著色，說(shuō)明花粉敗育。圖5J全部第4號(hào)單株T1代植株的育性分離情況，總計(jì)36株，圖中所示為3個(gè)穗子育性的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)差，膠圖表示的是相對(duì)植株是否為轉(zhuǎn)基因植株，PCR陽(yáng)性代表轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Posi)；PCR陰性代表轉(zhuǎn)基因陰性植株(Neg)，結(jié)果顯示所有轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的育性都恢復(fù)，而所有轉(zhuǎn)基因陰性植株還是不育的。圖6.利用RNAi技術(shù)抑制野生型水稻內(nèi)源0sAPI5的表達(dá)可以降低水稻育性。圖6A.從104株獨(dú)立轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)選取5株育性極低的單株(分別為S10、SlUS14、S24、S105)和1株正常育性的單株(S92)檢測(cè)內(nèi)源0sAPI5基因在這些植株中的表達(dá)量。圖6B.隨機(jī)考察6個(gè)單株的結(jié)實(shí)率。圖7.創(chuàng)建水稻T-DNA插入突變體庫(kù)所以載體pFX_E24.2-15R的載體圖譜。圖8.抑制0sAPI5基因表達(dá)的RNAi載體pDS_0sAPI5的載體示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)理解本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明作限定。實(shí)施例1:0sAPI5基因的分離克隆1.οsapi5-1突變體的獲得所用的水稻T-DNA插入突變體庫(kù)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用載體PFX-E24.2-15R(該載體圖譜見(jiàn)圖7)構(gòu)建而成(突變體庫(kù)的創(chuàng)建方法已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表論文，見(jiàn)Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.2003，PlantJ,35:418_427;Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.2007,PlantJ，49947-959)。2005年，從TO代突變體庫(kù)(見(jiàn)http://rmd.ncpgr.cn/，Zhang等，RMD:aricemutantdatabaseforfunctionalanalysisofthericegenome.2006.NuclAcidsRes,34:D745-D748)挑選出2000份水稻轉(zhuǎn)基因品種“中花11號(hào)(為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的常用水稻品種)，，的種子，經(jīng)浸種、催芽后播于秧田，20天后移栽至大田。每份材料種兩行，每行10株，為一個(gè)家系。種植密度為5寸X8寸，種植地點(diǎn)為中國(guó)湖北省武漢市洪山區(qū)獅子山地區(qū)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的試驗(yàn)田，按常規(guī)的水稻種植方法進(jìn)行田間管理。經(jīng)過(guò)大田篩選共獲到56個(gè)不育或育性低的突變家系。其中，一個(gè)原始編號(hào)為03Z11R053的突變體表型為育性極低(結(jié)實(shí)率為1%，如圖1)，申請(qǐng)人將這個(gè)突變體命名為osapi5-l。2.分離0sAPI5突變體T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列禾Ij用TaiI-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)技術(shù)(Liu等，ThermalsymmetricinterlacedPCRautomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPlandYACclonesforchromosomalwalking.1995，Genomics，25674-681；Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.2007,PlantJ,49947~959)我H分離了這個(gè)突變體的T-DNA側(cè)翼序列。根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配位置確定插入位點(diǎn)，結(jié)果顯示該側(cè)翼序列位于水稻的第2染色體上，插入位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于水稻基因組注釋網(wǎng)站(http://rice.plantbioloRY.msu.edu/)上的一個(gè)基因(登錄號(hào)L0C_0s02g20930)，命名為0sAPI5。T-DNA插入到該基因的最后一個(gè)外顯子中(見(jiàn)圖2A)。TAIL-PCR方法分離得到的0sApi5突變體T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列如下CGGTTTAATTATTAGTAGGTAGGGTCTTGCGCAGTTTAACTATCAGTGTTTGGATAACCCTTCACAAGCTCTGTTCACAAGTTGATTCCGGGCTGCTCCCTCTCCCCGCCCCTTCTTGCTCGCAGGGGTGTTCCCATTTGTAGCAGGCTGGGACCTCTTCCCTCTAAAAGATCCACAAAGCAGACTTAACTATAATGAAATGCAAAGTCTGAGGGGGAAATGGAATATTAGGTAATAGAAATCTAACCCTGTTGTTGTAGGTGCTGGTTTCTTTGGCTGCTCCATCCATGAGAGAGTGATTTTCTTGTCACCAATAAATAAAGGGGATTTCGCACGCAACGGCTGAAATGAACATTCATCACGTTTAGTTAGAAAGCATAAACATTTAGGTAGGTTAGTATTATTAGTATACACAAGCAGTATATTTCATACATTGCCGTGTACTTATGCTTCCTCCAGCAGTAGAATAAGATGTGTTTTAGACATTAACACATGCAACTTTTCCATTGTACAAATTAATACAACTACAATGGAATTTTTTGACACAACCTACTCGTCATTTTCATATATCTAAGGTAATTCGTAGAGATTGGTAGCCCAAAGTTGAATTCGGTTGTGTACATGCAATTATAAAAGGCCACTTTAACTTTTTACTTAAGATAGTCCTGCAGTTCCTTCACAGGCCTCAAAAAGCATAGTGCAAAACTCAAACCAGCATGTGAACTATTTCACTCAAATCAGTCCTCGGTTCGCTGATTCAAACATGGTTTGACAGTGAGCCAGACAGTTCAGAGTTATTAATTTTTGAATTAAACCCCAAGGCCTTGTTATAAAAAATAAAAGGCTCATATTGAAAACTTCCTTGAATGAATCACATGCCCAATCTTCAAACACCAGTTGGCTTTATCAGCACAATCTAACACATGCAATATTAAGCCCTCAGATAAAAAGGGGATTCGGACTTCCAAGGGCGGGAATAAAAAATTGTACCAGAAAAGGTTTAAACATTCCAGTTTTTTCTCACTATCAATTGGTTTTCATTTTAAAACTGCCGA3.T-DNA插入側(cè)翼序列與突變表型的共分離檢測(cè)為了證實(shí)花粉敗育的突變表型是由于0sAPI5基因內(nèi)的T-DNA插入引起，本發(fā)明對(duì)20個(gè)Tl代轉(zhuǎn)基因植株(其中，第1、4、6、15、17株為突變單株)進(jìn)行了T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列與突變表型的共分離檢測(cè)。共分離檢測(cè)的具體步驟為(1)在OsAP15基因T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)基因組引物P1(5‘GATGGCAGATGGACCTGAAAA3‘)和P2(5‘AGCGAACCGAGGACTGATTT3‘)，在T-DNA上設(shè)計(jì)一條載體引物P3(5，-TGCAGGTTCTCTCCAAATGA-3，)，如圖2A。在Tl代植株中，OsApi5純合T-DNA插入植株只有當(dāng)Pl和P3配對(duì)時(shí)才可以擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物；而由于T-DNA插入使Pl與P2配對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物達(dá)到10.5kb，在申請(qǐng)人設(shè)定的PCR反應(yīng)程序無(wú)法得到相應(yīng)PCR產(chǎn)物(這樣鑒定植株基因型的方法是領(lǐng)域內(nèi)的通用方法)。野生型植株由于沒(méi)有T-DNA的插入，所以Pl和P3配對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有產(chǎn)物，但可以利用引物Pl與P2配對(duì)擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物。而0sAPI5雜合T-DNA插入轉(zhuǎn)基因植株則Pl和P2配對(duì)以及Pl和P3配對(duì)時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。(2)應(yīng)用CTAB法(參照Liu等，Agenome-wideanalysisofwidecompatibilityinriceandthepreciselocaionoftheS5locusinthemolecularmap.1997，TAG，95:809_814)從20株T1代單株中分別抽提總DNA作為模板，用⑴中引物組合P1+P3和P1+P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，具體包含DNA模板1μL；10倍體積的Taq酶反應(yīng)緩沖液2μ1；2mMdNTP1.5μL；25mM鎂離子1.2μL；10μM引物0.2μL;0.3單位Taq酶，加雙蒸水至20μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下94°C5min；94°C45sec，55°C45sec，72°C1.5min,28cycles；72°C5min,25°Clmin。(3)將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)凝膠上的帶型判定各個(gè)單株的基因型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20株T1代單株中，5株突變體表型植株的基因型均為0sAPI5純合T-DNA插入，而其他15株表型正常的植株基因型為野生或雜合型(如圖2B)。這表明0sapi5突變體的突變表型是由于0sAPI5基因內(nèi)的T-DNA插入造成，且該突變體表現(xiàn)為隱性純和突變體。實(shí)施例2野生型和突變體不同時(shí)期花藥的半薄切片觀察取不同發(fā)育時(shí)期的來(lái)源于野生型和突變體的花藥在50%FAA固定液(50%dH20，40%乙醇，10%醋酸)固定24小時(shí)(花藥發(fā)育分為8個(gè)時(shí)期，詳情參考Feng，等.2001.Pollendevelopmentanditsstagesinrice(OryzasativaL)·ChineseJ.RiceSci15(1):21-28.)。固定后的材料在系列酒精中脫水(70%酒精、90%酒精、95%酒精、無(wú)水酒精總各順序放置30分鐘)。脫水后的材料用包埋劑Technovit7100樹(shù)脂(購(gòu)自德國(guó)HeraeusKulzer公司)包埋(詳細(xì)方法參考試劑說(shuō)明書(shū))，37°C放置3_5天后，包埋塊作半薄切片(1微米，切片機(jī)型號(hào)為L(zhǎng)EICAEMUC6，方法參考儀器使用說(shuō)明)。材料用苯胺藍(lán)染色(試劑購(gòu)自德國(guó)Merck公司)，顯微鏡觀察，拍照(所用觀察拍照系統(tǒng)為L(zhǎng)eicaDFC480DigitalCamerasystem)0結(jié)果顯示，突變體和野生型花藥的前5個(gè)時(shí)期沒(méi)有明顯差異(注前4個(gè)時(shí)期的沒(méi)9有差異，圖片沒(méi)有列出)，從花藥發(fā)育的第6個(gè)時(shí)期開(kāi)始，野生型的花藥絨氈層開(kāi)始降解，到最后完全消失，產(chǎn)生正常的花粉(圖2C、圖2E和圖2G)。而突變體的花藥絨氈層在應(yīng)該降解的時(shí)候沒(méi)有降解，直至發(fā)育的最后時(shí)期，最終導(dǎo)致花粉的敗育(圖2B、圖2D和圖2H)。由此可見(jiàn)，目的基因0sAPI5的失活引起絨氈層的推遲降解，導(dǎo)致花粉的敗育。實(shí)施例3:osapi5-l的一個(gè)等位突變體osapi5_2的鑒定0sapi5-l的一個(gè)等位突變體osapi5_2的T-DNA插入位點(diǎn)位于該基因的第13個(gè)外顯子內(nèi)(圖2A)。2008年在中國(guó)湖北省洪山區(qū)獅子山地區(qū)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的試驗(yàn)田種植21株0sapi5-2突變體Tl代植株，其中第17、18共2個(gè)單株具有突變表型，即育性極低。共分離檢測(cè)的原理如圖2A，所用的引物為P4(5’-GCCCATAAGGTTTGATGACAGA-3’)、P5(5，-CATGAGAAGCCCAAGCAGAG-3，)和載體引物P6(5，-GTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3，)。由圖4B可知，0sapi5-2家系的突變表型與0sAPI5基因內(nèi)的T-DNA插入是共分離的。這進(jìn)一步表明osapi5-2的突變表型也是由0sAPI5基因的插入突變引起。實(shí)施例4互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)1.互補(bǔ)載體的構(gòu)建互補(bǔ)載體pC2301-0sAPI5的構(gòu)建方法如下以pCAMBIA2301載體為骨架載體(購(gòu)自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)。用BamHI酶切水稻“日本晴“BAC克隆0SJNBa0019G21，得到一系列將酶切片段，其中包括目的片段含整個(gè)0sAPI5基因編碼區(qū)及ATG前約1.6kb和終止密碼后約4.4kb。將酶切片段與BamHI酶切的去磷酸化的的載體質(zhì)粒pCAMBlA2301連接(圖5A)(所使用的內(nèi)切酶、堿性磷酸酶均購(gòu)自Takara公司，連接酶購(gòu)自Promega公司，具體用法與用量參考該產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū))。連接產(chǎn)物通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為印pendorf公司產(chǎn)品，本發(fā)明所用電壓為1800V，具體操作參考該儀器的使用說(shuō)明書(shū))導(dǎo)入大腸桿菌DHlOB(購(gòu)自Promega公司)中，加600ulLB復(fù)蘇45分鐘，取250ul涂于含卡那霉素、5-溴-4-氯-3-口引哚-β-D-半乳糖(Χ-β-gal)及異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LA平板，37°C溫箱培養(yǎng)14-16小時(shí)(LA與LB配方參考薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002年)。挑白色單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證后得到目的克隆。把構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(購(gòu)自CAMBIA公司)中。轉(zhuǎn)化后的菌株命名為EHA105-p2301-0sAPI5。2.遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(參照文獻(xiàn)Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.2003,PlantJ.35418-427)將菌株EHA105-pC2301-0sAPI5導(dǎo)入0sapi5-l突變體的愈傷組織，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有G418(用于篩選真正的轉(zhuǎn)基因愈傷的一種抗生素)(購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司)抗性的愈傷組織(請(qǐng)注意后面的語(yǔ)序)、分化、生根及煉苗移栽大田得到轉(zhuǎn)基因植株(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑及配方參見(jiàn)申請(qǐng)人在先的專(zhuān)利文獻(xiàn)，公開(kāi)號(hào)為CN1995346；
專(zhuān)利名稱：為水稻木質(zhì)素合成基因FCl及應(yīng)用)。按照相同的遺傳轉(zhuǎn)化方法將空載體PCAMBIA2301導(dǎo)入0sapi5-l突變體的愈傷組織，得到的轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對(duì)照。本發(fā)明結(jié)果顯示，將互補(bǔ)載體pC2301_0sAPI5通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入osapi5-l突變體的愈傷組織，共獲得獨(dú)立互補(bǔ)轉(zhuǎn)化苗51株，其中39株陽(yáng)性植株全部恢復(fù)正常育性；獲得空載體轉(zhuǎn)化苗12株，全部表現(xiàn)不育的突變表型(見(jiàn)圖5B)。以上結(jié)果表明0sapi5-l不育突變表型是由于0sAPI5基因突變而造成。為了檢測(cè)Ttl代互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，隨機(jī)選取40株互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株，利用Southern雜交(具體操作參考WuDevelopmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.2003,PlantJ，35:418_427)分析了這些互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，其中有16份互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株為單拷貝插入。大田種植來(lái)源于2份單拷貝Ttl家系的下一代植株(見(jiàn)圖5C中的第2和第4號(hào)植株)，其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株育性均為正常，而轉(zhuǎn)基因陰性植株均表現(xiàn)為不育(圖5D到圖5J)。這些研究結(jié)果進(jìn)一步表明0sapi5-l突變體的突變表型確定是由于0sAPI5基因的突變而造成的。實(shí)施例5抑制0sAPI5的表達(dá)培育水稻不育材料根據(jù)0sAPI5基因結(jié)構(gòu)，在0sAPI5基因編碼區(qū)的3，末端設(shè)計(jì)一對(duì)RNAi引物RNAi-F(5，-CTCactagtggtaccCAGCCAAAGAAACCAGCACC-3，；)和RNAi-R(5，-CTAgagctcggatccGGATGTAAATGAACTAGGGCGTAC-3，，下劃線表示酶切位點(diǎn))。以O(shè)sAP15基因的全長(zhǎng)cDNAJ033050C22(MaruyamaandSugano1994.Oligo-capping-.asimplemethodtoreplacethecapstructureofeukaryoticmRNAswitholigoribonucIeotides.Gene138171-174；Suzuki,等.1997Constructionandcharacterizationofafulllength-enrichedanda5'-end-enrichedcDNAlibrary.Gene200:149-156)為模板擴(kuò)增出長(zhǎng)度為469bp的構(gòu)建RNAi載體的0sAPI5cDNA片段，分兩步構(gòu)建到載體PDS1301上，構(gòu)建好的載體命名為pDS-0sAPI5(載體圖見(jiàn)附圖8)(方法參照Chu，等.2006.Promotermutationsofanessentialgeneforpollendevelopmentresultindiseaseresistanceinrice.GenesDev20:1250-1255)。PCR反應(yīng)體系的總體積為20μL，cDNA質(zhì)粒模板0.IyL(約50ng)、10倍體積的Taq酶反應(yīng)緩沖液2yL、25mMMgCL21.2yL、2mMdNTP1·5μLUOuM引物0·2μL、0.3單位rTaq酶(購(gòu)自Takara公司)。反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min，94°C45s,56°C40s,72°C40s28cycles。構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)入(電轉(zhuǎn)化儀為印pendorf公司產(chǎn)品，本發(fā)明所用電壓為1800V，具體操作參考該儀器的使用說(shuō)明書(shū))農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105，轉(zhuǎn)化后的菌株命名為EHA105-pDS_0sAPI5。用該菌株轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種中花11號(hào)種子誘導(dǎo)的愈傷。(轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例4中第2部分)。通過(guò)本例申請(qǐng)人得到110株獨(dú)立轉(zhuǎn)化苗，其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株104株。育性小于30%的共有54株(其中完全不育的有17株)，占總數(shù)的51.9%。申請(qǐng)人選取了部分單株檢測(cè)其內(nèi)源0sAPI5的表達(dá)量，如圖6A和6B所示，定量RT-PCR結(jié)果顯示在內(nèi)源0sAPI5的表達(dá)量明顯下降的植株，其結(jié)實(shí)率也非常低。結(jié)果表明，這些單株的低育性和0sAPI5的表達(dá)量是共分離的。由此可見(jiàn)，通過(guò)RNAi技術(shù)抑制野生型水稻中內(nèi)源0sAPI5基因的表達(dá)后造成了水稻植株的育性的明顯降低，進(jìn)一步證明了0sAPI5基因?yàn)榭刂扑居缘幕?，并由此方法可以調(diào)控植物的育性，用于實(shí)際生產(chǎn)。本發(fā)明所涉及到的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑及配方如下(1)試劑和溶液縮寫(xiě)6-芐基腺嘌呤(6-BA)；激動(dòng)素(KT)；萘乙酸(NAA)；吲哚乙酸(IAA)；2，4_二氯苯氧乙酸(2，4-D)；乙酰丁香酮(AS)；水解酪蛋白(CH)；潮霉素(HN)；二甲基亞砜(DMSO)；N6大量成分溶液(N6maX)；N6小量成分溶液(N6min)；MS大量成分溶液(MSmax)；MS微量成分溶液(MSmin)(2)主要溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(IOX)]0098]硝酸鉀(KNO3)28.3g0099]磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.Og0100]硫酸銨((NH4)2S04)4.63g0101]硫酸鎂(MgSO4·7H20)1.85g0102]氯化鈣(CaCl2·2H20)1.66g0103]逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。0104]2)N6min母液[100倍濃縮液(100X)]0105]碘化鉀(KI)0.08g0106]硼酸(H3BO3)0.16g0107]硫酸錳(MnSO4·4H20)0.44g0108]硫酸鋅(ZnSO4·7H20)0.15g室溫下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H20)2.78g在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70°C，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H20)3.73g在它們都溶解后混合在一起，70°C水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?114]4)維生素貯存液(100X)0115]煙酸(Nicotinicacid)0.Ig0116]維生素Bl(ThiamineHCl)0.Ig0117]維生素B6(PyridoxineHCl)0.Ig0118]甘氨酸(Glycine)0.2g0119]肌醇(Inositol)IOg0120]加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?121]5)MSmax母液(IOX)0122]硝酸銨(NH4NO3)16.5g0123]硝酸鉀19.Og0124]磷酸二氫鉀1.7g0125]硫酸鎂3.7g0126]氯化鈣4.4g0127]室溫下溶解并定容至1000ml。0128]6)MSmin母液(100X)0129]碘化鉀0.083g120130]硼酸0.62g0131]硫酸錳(MnSO4·4H20)2.23g0132]硫酸鋅(ZnSO4·7H20)0.86g0133]鉬酸鈉(Na2Mo04·2H20)0.025g0134]硫酸銅(CuSO4·5H20)0.0025g0135]氯化鈷(CoCl2·6H20)0.0025g室溫下溶解并定容至1000ml。7)2，4-0貯存液(111^/1111)2,4-DIOOmg.ImlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。8)6_BA貯存液(lmg/ml)6-BAIOOmg.ImlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。9)NAA貯存液(lmg/ml)NAAIOOmg.ImlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?0)IAAC存液(lmg/ml)IAAIOOmg.ImlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液AS0.392gDMSOIOml分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3)IN氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至IOOml，室溫保存?zhèn)溆谩?4)KT貯存液(lmg/ml)KTIOOmg.ImlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。(3)培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基0164]N6max母液(IOX)IOOml0165]N6mix母液(100X)IOml0166]Fe2+EDTA貯存液(100X)IOml0167]維生素貯存液(100X)IOml0168]2，4-D貯存液2.5ml0169]脯氨酸(Proline)0.3g0170]CH0.6g0171]蔴糖(Sucrose)30g0172]Phytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(IOX)IOOmlN6mix母液(100X)IOmlFe2+EDTA貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml2，4-D貯存液2.Oml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝至50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(IOX)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μ1AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液(IOX)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml[0200[0201[0202[0203[0204[0205[0206培養(yǎng)(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)5周，溫度26士1°C。愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度26士1°C。預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4天，溫度26士1°C。農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有卡那霉素的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度280C；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6J).8-1.0；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，溫度19-20"C。愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm頭孢霉素的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次頭孢霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26°C，5_7周。生根(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。在溫室煉苗約2周左右后，再移載大田。權(quán)利要求OsAPI5基因在控制水稻育性中的應(yīng)用，其特征在于，所述OsAPI5基因的核苷酸序列如序列表SEQNO1所示。2.0sAPI5基因在控制水稻育性中的應(yīng)用，其特征在于，所述0sAPI5基因編碼的氨基酸序列如SEQNO:2所示。3.權(quán)利要求1或2所述的基因在控制水稻育性和培育不育系中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開(kāi)了一種水稻育性控制基因OsAPI5及應(yīng)用。具體涉及一個(gè)調(diào)控水稻育性基因OsAPI5的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述OsAPI5基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQIDNO2所示。本發(fā)明克隆的基因及其編碼蛋白可應(yīng)用于調(diào)控水稻育性及培育雜交水稻不育系，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C07K14/415GK101942451SQ20101022306公開(kāi)日2011年1月12日申請(qǐng)日期2010年7月5日優(yōu)先權(quán)日2010年7月5日發(fā)明者吳昌銀,張啟發(fā),李興旺申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)