專利名稱：一種人工合成的新型抗血栓多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽，尤其涉及經(jīng)人工修飾并合成的具有抗血栓活性的多肽。本發(fā)明 還涉及該多肽的制備方法以及作為抗血栓劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人口的老齡化、心血管疾病發(fā)病率的增加，現(xiàn)行抗血栓標(biāo)準(zhǔn)藥物已經(jīng)不能適 應(yīng)和滿足現(xiàn)有需求，該類藥物的市場(chǎng)容量仍在不斷增大。目前的抗血栓藥物未能滿足活性 好、藥效可預(yù)測(cè)、可口服、起效快、副作用小等要求。因而，鑒于市場(chǎng)機(jī)會(huì)較大和現(xiàn)有藥物各有缺陷，尋找安全，方便的新型抗栓藥物已 成為國內(nèi)外醫(yī)藥界的研究熱點(diǎn)，與此同時(shí)，對(duì)于此類藥物的創(chuàng)新性研究，特別是對(duì)多肽及可 口服的小分子類肽或化合物的研究也就具有更加重要的意義和市場(chǎng)前景。動(dòng)脈粥樣硬化是血管系統(tǒng)疾病的主要病理基礎(chǔ)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和繼發(fā)的 血栓形成是大多數(shù)急性血管事件發(fā)生的主要原因。近年研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的形成和 斑塊的破裂與細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和重構(gòu)有密切關(guān)系，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一族Zn2+ 依賴型蛋白水解酶，主要負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)，其表達(dá)水平的增高和活性的增強(qiáng)都能夠加 速不穩(wěn)定斑塊及血栓的形成。因此，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)成為了藥物化學(xué)領(lǐng)域研 究的一個(gè)熱點(diǎn)，越來越多的研究試圖通過抑制MMI3S活性以延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和防 止斑塊破裂、血栓形成。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)屬于半胱氨酸蛋白酶超 家族，為MMPI中一組多功能因子家族，能特異的抑制MMPs的活性，其N端功能區(qū)半胱氨酸 殘基與MMPs的鋅離子活性中心結(jié)合，C端功能區(qū)與MMPs的其他部位結(jié)合，以1 1的比例 非共價(jià)鍵結(jié)合形成MMP-TIMP復(fù)合體，阻斷MMPs與底物的結(jié)合，抑制MMI3S蛋白水解活性。因 此，調(diào)節(jié)MMPs的活性可能是心血管疾病治療，特別是血栓治療的一個(gè)新方向，對(duì)其拮抗劑 的進(jìn)一步研究將促進(jìn)臨床的早日應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種人工合成的具有良好抗血栓活性的新型多肽BNC， 其氨基酸序列為Pyr-Asn-Cys。根據(jù)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)的設(shè)計(jì)思路，基于底物的MMPI的設(shè)計(jì)理論，利 用固相多肽合成技術(shù)，設(shè)計(jì)完成了新型抗血栓多肽BNC，其氨基酸序列為Pyr-Asn-Cys，分 子量為346。本發(fā)明的目的之二是提供一種具有良好抗血栓活性的新型多肽BNC的制備方法。根據(jù)所設(shè)計(jì)的BNC氨基酸序列，利用!^mc固相多肽合成技術(shù)進(jìn)行合成。先將所要 合成肽鏈的C末端半胱氨酸的羧基以酯鍵形式與2-氯三苯甲基氯樹脂相連，然后以此結(jié)合 在固相載體上的半胱氨酸作為氨基組份，經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分進(jìn) 行縮合并脫保護(hù)。重復(fù)(縮合一洗滌一去保護(hù)一洗滌一下一輪縮合)操作，達(dá)到所要合成 的肽鏈長度，最后利用切割液將肽鏈從樹脂上裂解下來，即得粗品。經(jīng)HPLC反相柱進(jìn)行純化后通過質(zhì)譜分析確證。以上所述的!^mc固相多肽合成方法是本領(lǐng)域的常規(guī)并公知的技術(shù)。電刺激大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成、ADP誘發(fā)的小鼠急性肺血栓形成以及小鼠的凝血 時(shí)間測(cè)定等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的多肽BNC具有較強(qiáng)的抗血栓活性。本發(fā)明的目的之三是將新型多肽BNC應(yīng)用于抗血栓藥物的制備中。本發(fā)明的有益效果在于根據(jù)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)的設(shè)計(jì)思路，基于底物的MMPI的設(shè)計(jì)理論，利 用固相多肽合成技術(shù)，設(shè)計(jì)完成的新型抗血栓多肽BNC具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便和良 好的抗血栓活性等有益特點(diǎn)，有望成為一種極具應(yīng)用潛力且安全有效的抗血栓多肽藥物。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)指出，這些實(shí)施例僅用來 對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明中所出現(xiàn)的縮略語的說明HBTUDIEAFomcTFATISEDTDMFDCMMeOH實(shí)施例1新型抗血栓多肽BNC的制備及分離純化按下述序列制備BNC。BNC的氨基酸序列為焦谷氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸。本實(shí)施例采用固相多肽合成技術(shù)進(jìn)行手工合成，合成的多肽經(jīng)高濃度的TFA切割 后，得到粗品。經(jīng)HPLC反相柱進(jìn)行純化后，通過質(zhì)譜分析確證。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下DBNC的制備(以制備1. 323mmol量的BNC為例說明固相合成多肽的方法)以下制備抗血栓多肽BNC的樹脂、Fmoc保護(hù)氨基酸及縮合試劑、切割試劑均購買 于上海吉爾生化有限公司。制備從C端到N端逐個(gè)進(jìn)行。稱取1.01g(1.323mmOl)2-氯三苯甲基氯樹脂放 入小燒杯中，加入DMF(沒過樹脂)溶脹30min，后倒出一半體積的DMF加入等體積的DCM 再溶脹30min，之后倒入砂芯漏斗抽濾干。連接好裝置，并通入氮?dú)?，調(diào)節(jié)使氣流平穩(wěn)。 稱取Fmoc-Cys(Trt)-OH 1. 93g (3. 31mmol)用DMF溶解，之后加入裝置中，并加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，接著補(bǔ)加DMF使反應(yīng)液的總體積為柱床體積的2 3倍，室溫反應(yīng)lh。 利用茚三酮顯色法檢測(cè)反應(yīng)完全后，加入部分20 %的哌啶/DMF先反應(yīng)5min，之后加入剩 余部分再反應(yīng)15min (共30ml)，脫去Fmoc保護(hù)基。用茚三酮顯色法檢測(cè)，結(jié)果表明脫保護(hù) 反應(yīng)已進(jìn)行完全。濾去反應(yīng)液，將樹脂用DMF洗滌4次，至濾液加水無渾濁，濾干。稱取第
苯并三唑-N，N, N’，N’四甲基脲六氟磷酸酯
二異丙基乙胺
9-芴甲氧羰基
三氟乙酸
三異丙基硅烷
1,2-乙二硫醇
二甲基甲酰胺
二氯甲烷
無水甲醇2 個(gè)氨基酸 Fmoc-Asn (Trt)-OHl. 97g(3. 31mmol)，另稱取縮合劑 HBTU 1. 57g(3. 80mmol)，混 合后用DMF溶解，之后將完全溶解的混合液加入到含多肽樹脂的砂心漏斗中，調(diào)節(jié)氮?dú)獾?流速使之處于穩(wěn)速狀態(tài)，之后再加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，后加入DMF使反應(yīng)液的總量 為柱床體積2 3倍，室溫反應(yīng)lh。用茚三酮顯色法檢測(cè)，結(jié)果表明縮合反應(yīng)已進(jìn)行完全。 將反應(yīng)后的樹脂濾干，用DMF洗4次，抽濾干，加入20%的哌啶/DMF重復(fù)脫保護(hù)操作。濾 去反應(yīng)液，將樹脂用DMF洗滌6次，至濾液加水無渾濁，濾干。接著稱取第三個(gè)氨基酸Pyr 0. 55g(4. ^mmol)，縮合劑HBTU1. 57g，混合后于DMF中溶解完全，之后加入反應(yīng)裝置中，調(diào) 節(jié)氮?dú)馐沽魉倨椒€(wěn)，之后再加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，后加入DMF使反應(yīng)液的總量為柱 床體積2 3倍，室溫反應(yīng)lh。用茚三酮顯色法檢測(cè)，結(jié)果表明縮合反應(yīng)已進(jìn)行完全。將反 應(yīng)后的樹脂濾干，用DMF洗4次，無水MeOH洗1次，DCM洗2次，無水MeOH洗2次，每次洗 滌不少于lmin，之后抽濾干。將樹脂轉(zhuǎn)移后，加入切割液TFA TIS EDT H2O (9. 4 0. 1 0. 25 0. 25) 攪拌30min。抽濾，在濾液中加入10倍體積的冰乙醚，充分震蕩后靜置30min。抽干，真空 干燥，即得BNC粗肽。2) BNC 的純化將200mg上述粗肽溶解于50ml純水中，用制備型反相HPLC純化。色譜柱為 Delta-I^akClSZSX200mm ；流動(dòng)相為A液5%甲醇+水相中0. 05%三氟乙酸，B液95%甲 醇+水相中0. 05%三氟乙酸，以70%的B液為流動(dòng)相等度洗脫，流速為5ml/min，檢測(cè)波長 為^Onm和214nm，主峰保留時(shí)間為17min左右，比較合適，分離效果較好，適合樣品的大量 制備。收集主峰峰尖部分后，用分析型反相HPLC對(duì)收集成分進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為蘇州環(huán)球 柱，流動(dòng)相同上，洗脫程序?yàn)?9% B液20min，流速為lml/min，檢測(cè)波長214nm，收集 的成分達(dá)到純度要求。收集液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后冷凍干燥得到BNC純肽。純肽的質(zhì)譜 表明，其分子量為346，與計(jì)算值相符。實(shí)施例2BNC對(duì)電刺激大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜后血栓形成的影響1)樣品溶液的配制陽性對(duì)照組臨用前將氯吡格雷以生理鹽水稀釋成所需濃度的藥液Omg/ml) ；BNC 組臨用前以0. 2% L-精氨酸溶解，并以生理鹽水稀釋成所需濃度的藥液Omg/ml)。各組均 尾靜脈給藥，容積為10ml/kg。2)動(dòng)物模型的制備大鼠腹腔注射10mg/L戊巴比妥鈉溶液(30mg/kg)，麻醉后仰臥位固定。頸部正 中線切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，近心端放置BT87-3型實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)血栓形成測(cè)定儀的刺激電 極，遠(yuǎn)心端放置溫度探頭。當(dāng)刺激電極接通電流后，以2mA直流電刺激動(dòng)脈7min，使刺激部 位的血管內(nèi)皮受損，激活血小板和凝血系統(tǒng)，管腔混合血栓逐漸形成，血流逐漸阻斷，當(dāng)血 流完全阻斷時(shí)，遠(yuǎn)端溫度突降，儀器報(bào)警，顯示堵塞時(shí)間(tt^)，即血栓形成時(shí)間。3)實(shí)驗(yàn)步驟 取Wistar大鼠32只，體重200 250g，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為4組，每組8只， 即空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽性對(duì)照組(劑量為20mg/kg)，BNC組(劑量為20mg/kg)。采 用尾靜脈注射給藥，給藥體積為10ml/kg，給藥后15min開始刺激。空白對(duì)照組給予0. 2% L-精氨酸，模型對(duì)照組給予生理鹽水，陽性對(duì)照組給予氯吡格雷。
4)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差6土S)表示，兩組 間比較用t檢驗(yàn)，結(jié)果見表1。表1各組對(duì)電刺激大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜后血栓形成的影響6士S)
權(quán)利要求
1.一種具有抗血栓活性的多肽BNC，其氨基酸序列為Pyr-Asn-CyS，分子量為346。
2.一種制備權(quán)利要求1多肽的方法，其特征在于，所述的制備方法為i^omc固相合成法。 包括(1)稱取2-氯三苯甲基氯樹脂放入小燒杯中，加入DMF溶脹30min，后倒出一半體積的 DMF加入等體積的DCM再溶脹30min，之后倒入砂芯漏斗抽濾干；(2)經(jīng)保護(hù)的氨基酸在樹脂上按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序從C端到N端逐個(gè)進(jìn)行偶合并脫保護(hù)， 反應(yīng)過程中利用氮?dú)鈹嚢瑁?3)合成的多肽經(jīng)切割液TFA TIS EDT H2O(9. 4 0. 1 0. 25 0.25)剪切 30min后，得到多肽粗品。
3.權(quán)利要求1的多肽在制備抗血栓藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了一種人工合成的具有抗血栓活性的多肽BNC，并公開了其制備方法以及作為抗血栓劑的應(yīng)用。BNC利用Fomc固相化學(xué)法合成，含有3個(gè)氨基酸殘基，序列為Pyr-Asn-Cys，分子量為346，結(jié)構(gòu)式如下。動(dòng)物試驗(yàn)表明該多肽對(duì)電刺激大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜后血栓的形成及對(duì)ADP誘發(fā)的小鼠急性肺血栓的形成均有抑制作用，并且可以延長小鼠的凝血時(shí)間。BNC結(jié)構(gòu)式
文檔編號(hào)C07K1/06GK102060908SQ201010284849
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者孔毅, 楊天雨, 賴伊麗, 邵妤 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)