專利名稱：檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及定性地和/或定量地檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法。通過(guò)本發(fā)明的方法尤其還能夠?qū)ι飳W(xué)樣品中微量存在的、通常檢測(cè)困難的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。
背景技術(shù)：
為了檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)，傳統(tǒng)上廣泛采用利用特異性結(jié)合該物質(zhì)(被檢物質(zhì))的物質(zhì)的方法。例如有利用抗原抗體反應(yīng)的所謂免疫測(cè)定、利用核酸鏈之間的氫鍵的核酸雜交等。例如，在免疫測(cè)定的情況下，如果被檢物質(zhì)是抗體就將抗原、相反地如果被檢物質(zhì)是抗原就將抗體固定化在微板、微珠或傳感器芯片等承載體上，使之與被檢物質(zhì)反應(yīng)后，檢測(cè)、測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的有無(wú)或程度。作為固定化的通用方法，已知有疏水鍵、共價(jià)鍵等?！笆杷I”利用承載體的疏水性表面與和需檢測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)(以下有時(shí)也稱作“特異性蛋白質(zhì)”)的疏水性部分之間的相互作用使承載體與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，從無(wú)需特殊試劑這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)是簡(jiǎn)便的。 然而，一般而言結(jié)合力弱，在用于ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)等的情況下，在結(jié)合后的洗滌操作等中蛋白質(zhì)從承載體上脫離的情況時(shí)有發(fā)生。此外，在通過(guò)疏水鍵使特異性蛋白質(zhì)與承載體結(jié)合的情況下，許多該蛋白質(zhì)完全或部分喪失其功能的情況時(shí)有發(fā)生?！肮矁r(jià)鍵”利用特異性蛋白質(zhì)中的官能團(tuán)(例如氨基)與配置于承載體表面的官能團(tuán) (例如羧基)之間的相互作用，結(jié)合力強(qiáng)。但是，在通過(guò)共價(jià)鍵使特異性蛋白質(zhì)與承載體結(jié)合的情況下，與疏水鍵的情況相似，結(jié)合的蛋白質(zhì)常常會(huì)完全或部分喪失其功能。除了疏水鍵和共價(jià)鍵以外，還已知將多個(gè)組氨酸融合在蛋白質(zhì)的末端、使該具有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)結(jié)合于表面配置有鎳的例如蛋白芯片等基板等上的方法。然而， 組氨酸標(biāo)簽與鎳離子的相互作用不是很強(qiáng)，而還已知鎳離子存在與各種生物分子的非特異性結(jié)合。此外，還考察了利用抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白的生物素(維生素H)結(jié)合性來(lái)使蛋白質(zhì)結(jié)合于承載體的方法。抗生物素蛋白是卵清來(lái)源的糖蛋白質(zhì)，可與生物素極強(qiáng)力地結(jié)合?？股锼氐鞍着c生物素的相互作用是最強(qiáng)的非共價(jià)鍵之一(Green(1975)Adv Protein Chem 29 :85-133)。此外，鏈霉抗生物素蛋白是放線菌來(lái)源的抗生物素蛋白樣蛋白質(zhì)，亦與生物素強(qiáng)結(jié)合。生物素是分子量244的小分子，使用市售的試劑盒等能夠容易地使其與各種生物分子例如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)或者糖鏈等結(jié)合，且很少會(huì)改變生物素化的分子的性質(zhì)。至今為止，(鏈霉)抗生物素蛋白-生物素的相互作用因其作用力之強(qiáng)而在例如抗原、抗體的檢測(cè)等分子生物學(xué)、生物化學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用(Green(1990)Methods Enzymol 184:51-67)。當(dāng)利用抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白使蛋白質(zhì)與承載體結(jié)合時(shí)，有首先通過(guò)共價(jià)鍵、疏水鍵使(鏈霉菌)抗生物素蛋白結(jié)合于諸如微板等基板，再通過(guò)使其與生物素化的蛋白質(zhì)結(jié)合而進(jìn)行固定化的方法。此外，還報(bào)道了下述技術(shù)首先藉由抗生物素蛋白-生物素結(jié)合使抗生物素蛋白結(jié)合在結(jié)合有生物素的基板上，然后通過(guò)使生物素化的希望的蛋白質(zhì)結(jié)合于抗生物素蛋白的其他生物素口袋，而在其上按基板-生物素-抗生物素蛋白-生物素-希望的蛋白質(zhì)的順序進(jìn)行固定(日本特開(kāi)平4-23635 。使用采用這樣的方法固定化的平板，可以檢測(cè)被檢物質(zhì)。一般而言，在使用通過(guò)疏水鍵或共價(jià)鍵結(jié)合有抗原、抗體這樣的與特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)的固相的特異性結(jié)合測(cè)定系統(tǒng)中，減少作為背景信號(hào)的原因的非特異性結(jié)合是重要課題。作為解決該課題的方法，提出了例如下述方法使細(xì)菌成分提取液中含有檢測(cè)用試劑的方法(日本特開(kāi)昭59-99257)；將導(dǎo)入了與用于產(chǎn)生特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的重組蛋白質(zhì)的載體同種類、且不包含編碼該蛋白質(zhì)的基因的載體的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)成分添加到樣品中的方法(日本特開(kāi)平8-4339 ；對(duì)與產(chǎn)生特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞同種類、且不包含該蛋白質(zhì)的細(xì)胞的水提取液進(jìn)行加熱處理后，將其水溶性級(jí)分添加到樣品中的方法(特開(kāi)2004-301646)等。通過(guò)這些方法，可見(jiàn)對(duì)非特異結(jié)合的抑制具有一定效果。此外，在利用抗生物素蛋白-生物素結(jié)合的測(cè)定中，與使用通過(guò)疏水鍵、共價(jià)鍵等結(jié)合有特異于被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)的固相的測(cè)定相似，背景信號(hào)的應(yīng)對(duì)也是一個(gè)大問(wèn)題。對(duì)此，除了上述的非特異抑制方法以外，還提出了下述方法使樣品接觸結(jié)合有滅活的(鏈霉)抗生物素蛋白的固相后，再與結(jié)合有活性(鏈霉菌)抗生物素蛋白的固相接觸的方法 (特開(kāi)平8-114590)；使生物素化物質(zhì)與抗生物素蛋白結(jié)合固相結(jié)合后，再與聚乙二醇和生物素的偶聯(lián)物接觸的方法(日本特開(kāi)平11-211727)；使之與含有生物素的溶液接觸的方法 (特開(kāi)2002-48794)等。然而，實(shí)用上的效果不可謂充分?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1特開(kāi)昭59-99257
專利文獻(xiàn)2特開(kāi)平8-43392
專利文獻(xiàn)3特開(kāi) 2004-301646
專利文獻(xiàn)4特開(kāi)平 4-236；353
專利文獻(xiàn)5特開(kāi)平8-114590
專利文獻(xiàn)6特開(kāi)平 11-211727
專利文獻(xiàn)7特開(kāi) 2002-48794
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1 :Green (1975) Adv Protein Chem 29 :85-133
非專利文獻(xiàn) 2 :Green (1990)Methods Enzymol 184:51—6
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供定性地和/或定量地檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法。本發(fā)明的目的特別在于提供在抑制背景信號(hào)的同時(shí)對(duì)生物學(xué)樣品中微量存在的物質(zhì)定性地和/或定量地進(jìn)行檢測(cè)、測(cè)定的方法。解決問(wèn)題的方法本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，對(duì)在利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合將在特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)上結(jié)合生物素而成的生物素化蛋白質(zhì)固定化在承載體上而得到的系統(tǒng)中、特別是在對(duì)生物學(xué)樣品中微量存在的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)降低背景信號(hào)進(jìn)行了鉆研，從而想到了本發(fā)明。具體地，在向生物學(xué)樣品中添加細(xì)胞破碎提取液以及生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的情況下，降低非特異結(jié)合的效果顯著?；蛘撸砑訌耐ㄟ^(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液來(lái)替代添加生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，也能夠取得同樣效果。基于以上認(rèn)識(shí)，本發(fā)明提供在利用抗生物素蛋白-生物素結(jié)合、將特異性地檢測(cè)被檢物質(zhì)的物質(zhì)固定化在承載體上而成的系統(tǒng)中，非特異結(jié)合減少、靈敏度更高的檢測(cè)方法。本發(fā)明包括以下實(shí)施方式，但不限于此。[實(shí)施方式1]一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法，所述方法包括1)準(zhǔn)備結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體、以及將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)；2)藉由生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合，將生物素化蛋白質(zhì)結(jié)合在步驟1) 中準(zhǔn)備的承載體上，制作結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體；3)將(a)生物學(xué)樣品，以及(b-i)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或從與用于表達(dá)生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液、和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、或者(b-ii)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或從使與用于表達(dá)生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)而得到的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液混合并添加至步驟2)中制作的結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體；然后4)檢測(cè)特異性結(jié)合于生物素化蛋白質(zhì)的被檢物質(zhì)。[實(shí)施方式2]實(shí)施方式1所述的方法，其中，在實(shí)施方式1的步驟3 (b-i)中，添加從包含任意載體的細(xì)胞提取得到的細(xì)胞破碎提取液作為細(xì)胞破碎提取液。[實(shí)施方式3]實(shí)施方式1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中，生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)是tamavidin或其突變體。[實(shí)施方式4]實(shí)施方式1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，生物學(xué)樣品選自血液、血清、腦脊液、 唾液、咽拭子、汗、尿、淚液、淋巴液、精液、腹水以及母乳。[實(shí)施方式5]一種用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑，該試劑包含1)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)；或2)從通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。[實(shí)施方式6]一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的試劑盒，該試劑盒包含
5
A)通過(guò)生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間結(jié)合而結(jié)合有將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)的承載體；以及用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑，該試劑包含B-i)從與用于表達(dá)Α)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、 和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液，和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、或者B-ii)從通過(guò)基因工程技術(shù)使與用于表達(dá)Α)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)而得到的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的方法，在生物學(xué)樣品中的被檢物質(zhì)的檢測(cè)中，能夠抑制背景信號(hào)，穩(wěn)定地進(jìn)行更高靈敏度的檢測(cè)。本發(fā)明的方法，特別是還可以用于生物學(xué)樣品中微量存在的、 通常難以檢測(cè)或準(zhǔn)確定量的物質(zhì)的檢測(cè)、測(cè)定。


[圖1]圖1顯示了Biofese標(biāo)簽(生物素化標(biāo)簽)融合SITH-I蛋白質(zhì)的表達(dá)。 具體地，圖IA是用于SITH-I蛋白質(zhì)檢測(cè)的western印跡的結(jié)果，圖IB是用于生物素化蛋白質(zhì)檢測(cè)的活性染色的結(jié)果。對(duì)表達(dá)BioEase標(biāo)簽融合SITH-I蛋白質(zhì)的大腸桿菌BL21 (DE3)進(jìn)行超聲波破碎， 將所得大腸桿菌粗提取液級(jí)分用SDS-PAGE (15%丙烯酰胺凝膠)展開(kāi)，使得為20 μ g總蛋白質(zhì)/泳道，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。具體地，圖IA是與抗SITH-I抗體(1/1000稀釋)反應(yīng)后，再與堿性磷酸酶(AP) 標(biāo)記的抗兔IgG抗體(1/1000稀釋)反應(yīng)，然后利用AP進(jìn)行染色。圖IB是鏈霉抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶(HRP) (1/1000稀釋)反應(yīng)后的染色圖像。圖1A、圖IB中，對(duì)照均采用僅具有表達(dá)載體的大腸桿菌來(lái)源的提取樣品。Biofese標(biāo)簽融合SITH-I蛋白質(zhì)的位置用箭頭示出。圖IB的Mi^ptavidin-HRP染色中，檢測(cè)到2條粗條帶。下方的條帶用圖IA的抗 SITH-I抗體未檢出，因而可以認(rèn)為其是SITH-I位點(diǎn)的一部分發(fā)生分解后的帶BioEase標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。[圖2]圖2是顯示各種血清稀釋液對(duì)非特異結(jié)合的效果的圖表。將血清用PBS稀釋的區(qū)以白四邊形(虛線)標(biāo)示、用在PBS中加入純化tamavidin2(TM2)而得到的液體稀釋的區(qū)以白四邊形(實(shí)線)標(biāo)示、用僅具有表達(dá)載體的大腸桿菌破碎提取液稀釋的區(qū)以星號(hào)(虛線)標(biāo)示、用在僅具有表達(dá)載體的大腸桿菌破碎提取液中加入純化TM2而得到的液體稀釋的區(qū)以星號(hào)(實(shí)線)標(biāo)示、用表達(dá)TM2的大腸桿菌破碎提取液稀釋的區(qū)以黑圈(實(shí)線)標(biāo)示。各圖表的縱軸(發(fā)光)表示抗SITH-I抗體的檢出量，橫軸表示梯度稀釋的抗 SITH-I抗體的稀釋比例。[圖3]圖3是根據(jù)圖2所示的結(jié)果，針對(duì)各抗SITH-I抗體的稀釋比例求出S/N比的圖表。將血清用PBS稀釋的區(qū)以白四邊形(虛線)標(biāo)示、用在PBS中加入純化tamavidin2(TM2)而得到的液體進(jìn)行稀釋的區(qū)以白四邊形(實(shí)線)標(biāo)示、用僅具有表達(dá)載體的大腸桿菌破碎提取液稀釋的區(qū)以星號(hào)(虛線)標(biāo)示、用在僅具有表達(dá)載體的大腸桿菌破碎提取液中加入純化TM2而得到的液體進(jìn)行稀釋的區(qū)以星號(hào)(實(shí)線)標(biāo)示、用表達(dá)TM2的大腸桿菌破碎提取液稀釋的區(qū)以黑圈(實(shí)線)標(biāo)示。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式I.檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法本發(fā)明的檢測(cè)方法包括1)準(zhǔn)備結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體、以及將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)；2)藉由生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合將生物素化蛋白質(zhì)結(jié)合在步驟1) 中準(zhǔn)備的承載體上，制作結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體；3)將(a)生物學(xué)樣品、以及(b-i)從與用于表達(dá)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液、和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、或者(b-ii)從通過(guò)基因工程技術(shù)使與用于表達(dá)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)而得到的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液，混合并添加至步驟2)中制作的結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體；然后4)檢測(cè)特異性結(jié)合于生物素化蛋白質(zhì)的被檢物質(zhì)。1.生物學(xué)樣品中的檢測(cè)物質(zhì)本發(fā)明涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法。作為本發(fā)明中的生物學(xué)樣品，沒(méi)有特殊限制，只要是可能包含作為檢測(cè)對(duì)象的物質(zhì)即可。可以是包含采集自生物的細(xì)胞、組織或其碎片等的樣品，例如體液，更優(yōu)選是血液、 血清、腦脊液、唾液、咽拭子、汗、尿、淚液、淋巴液、精液、腹水以及母乳等。這些體液可以視需要稀釋使用。稀釋率是通常2倍 10000倍左右、優(yōu)選100倍 1000倍左右，但不限于此。用于稀釋的溶液可以使用任意緩沖液，也可以包含適當(dāng)?shù)姆忾]劑。作為封閉劑，以抑制非特異性結(jié)合的效果高者為佳，可以使用BSA、酪蛋白等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的封閉劑。作為本發(fā)明的被檢物質(zhì)，沒(méi)有特殊限制，是生物學(xué)樣品中的希望檢測(cè)或測(cè)定的物質(zhì)即可，優(yōu)選可以列舉出抗體、抗原等蛋白質(zhì)或其片段、肽、核酸、激素、糖類、糖脂、或者生物學(xué)樣品中包含的細(xì)菌、病毒等。本發(fā)明也能夠測(cè)定生物學(xué)樣品中濃度低，采用傳統(tǒng)方法難以檢測(cè)、準(zhǔn)確定量的物質(zhì)。例如，在被檢物質(zhì)是血清中的抗體、且其抗體效價(jià)低的情況下(例如下述這樣的低抗體效價(jià)的情況在將血清1000倍稀釋的情況下難以檢測(cè)，而100倍稀釋的情況下勉強(qiáng)能夠檢測(cè))，需要抑制血清的稀釋率，結(jié)果血清中成分來(lái)源的非特異性結(jié)合也會(huì)增加，因而采用現(xiàn)有方法難以進(jìn)行該抗體的檢測(cè)、定量，但采用本發(fā)明的方法則能夠容易地檢測(cè)，或者更準(zhǔn)確地定量。并非進(jìn)行限定，在本發(fā)明中的被檢物質(zhì)是抗體的情況下，包括例如針對(duì)Small
7protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV—6 (由 HHV—6 的潛伏感染中 |1] 階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì))(SITH-I)的抗體。此外，可以列舉出針對(duì)皰疹病毒的上述以外的抗原的抗體、針對(duì)巨細(xì)胞病毒、肝炎病毒、HIV病毒、HTLV病毒、麻疹病毒、流感病毒等來(lái)源的病毒相關(guān)抗原的抗體、或者針對(duì)幽門螺旋桿菌等來(lái)源的細(xì)菌相關(guān)抗原的抗體、或者針對(duì)真菌相關(guān)抗原的抗體等。此外，并非進(jìn)行限定，在本發(fā)明中的被檢物質(zhì)是抗原的情況下，可以列舉出上述病原體來(lái)源的抗原、癌抗原、前列腺特異抗原等?；赑CT/.TP2008/67300 的記載內(nèi)容的 SITH-I(I)SITH-I 蛋白質(zhì)、核酸SITH-I蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)構(gòu)以及功能在PCT/JP2008/67300中公開(kāi)，將其全部?jī)?nèi)容引用在本說(shuō)明書中。SITH-I是參與皰疹病毒的潛伏感染的因子、更具體地是皰疹病毒的潛伏感染時(shí)特異性地表達(dá)的蛋白質(zhì)。這里，“皰疹病毒的潛伏感染時(shí)特異性地表達(dá)”是指在感染皰疹病毒的宿主中，皰疹病毒潛伏感染(未進(jìn)行增殖感染)時(shí)，皰疹病毒來(lái)源的基因或基因產(chǎn)物特異性地表達(dá)。作為SITH-I的蛋白質(zhì)以及核酸，可以列舉出例如由(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、以及編碼該蛋白質(zhì)的核酸。由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成的SITH-I蛋白質(zhì)如后述的參考例所示， 是作為在人皰疹病毒-6(HHV-6)的潛伏感染時(shí)特異性地表達(dá)的蛋白質(zhì)被分離、鑒定的。 SITH-I蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，該蛋白質(zhì)由159個(gè)氨基酸組成，分子量約 17. 5kDa0SITH-I蛋白質(zhì)由SITH-I基因的核酸編碼。該SITH-1基因的cDNA如SEQ ID NO 3所示，具有1795個(gè)堿基對(duì)(約1. 79kbp)的大小，％4位 956位的堿基序列是起始密碼子(Kozak ATG)，1431位 1433位的堿基序列是終止密碼子(TAA)。因此，所述SITH-I核酸具有SEQ ID NO 3所示的堿基序列中的第％4位至第1430位的堿基序列作為開(kāi)放閱讀框(ORF)，此ORF具有477個(gè)堿基對(duì)(約0. 48kbp)的大小。將SITH-I的cDNA之中表示ORF 區(qū)域的堿基序列示于SEQ ID NO :2。此外，所記載的SEQ ID NO :2所示的堿基序列包含了終止密碼子的3個(gè)堿基。SITH-I核酸經(jīng)常在潛伏感染有HHV-6的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，但在增殖感染細(xì)胞中未觀察到表達(dá)。編碼SITH-I蛋白質(zhì)的核酸由與目前為止報(bào)告的HHV-6潛伏感染特異性基因(H6LT)構(gòu)成互補(bǔ)鏈關(guān)系的DNA編碼，其表達(dá)在HHV-6的潛伏感染的中間階段增強(qiáng)。由這些事實(shí)可以認(rèn)為SITH-I蛋白質(zhì)是在HHV-6的潛伏感染時(shí)特異性地表達(dá)的蛋白質(zhì)。SITH-I蛋白質(zhì)與作為宿主蛋白質(zhì)的CAML(鈣調(diào)節(jié)性親環(huán)蛋白配體，Accesion# ； U18242)結(jié)合，提高神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。CAML在宿主生物內(nèi)大量存在于腦和淋巴細(xì)胞， 是已知能夠提高細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度的蛋白質(zhì)。此外據(jù)信，基于SITH-I蛋白質(zhì)的表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的提高帶來(lái)潛伏感染細(xì)胞內(nèi)的普遍性的信號(hào)傳導(dǎo)的活化，對(duì)HHV-6的高效率的再活化做出貢獻(xiàn)。已知HHV-6在腦內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中潛伏感染，據(jù)信如果處于潛伏感染時(shí)或作為活性高的潛伏感染狀態(tài)的中間階段的HHV-6表達(dá)SITH-1，則神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度提高。據(jù)信腦的細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的提高與心境障礙等精神障礙有很大關(guān)系(理研年報(bào) 2003)。SITH-I蛋白質(zhì)保持與宿主蛋白質(zhì)CAML結(jié)合的活性，具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的功能。此外，通過(guò)將SITH-I蛋白質(zhì)在被認(rèn)為是表達(dá)該蛋白質(zhì)最強(qiáng)的腦內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，能夠誘導(dǎo)精神障礙。因此，據(jù)信SITH-I蛋白質(zhì)具有在皰疹病毒的潛伏感染時(shí)或再活化初期表達(dá)，使宿主產(chǎn)生精神障礙的功能。(2)針對(duì)SITH-I的抗體針對(duì)SITH-I的抗體可以以SITH-I蛋白質(zhì)或其突變體、或者它們的部分肽作為抗原，采用公知方法以多克隆抗體或單克隆抗體的形式得到。作為公知方法，可以列舉出例如文獻(xiàn)(Harlow 等的“Antibodies :A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)) ”、巖崎等的“ ) ” 口一 > 抗體？、^ V K 一 i ELISA、講談社(1991)”)所述的方法。這樣得到的抗體可以用于SITH-I蛋白質(zhì)的檢測(cè)、測(cè)定等。術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM以及它們的Fab片段、 F(ab' )2片段、Fc片段)，作為例子可以列舉多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體、抗獨(dú)特型抗體以及人源化抗體，但并不限定于這些抗體。術(shù)語(yǔ)“識(shí)別SITH-I蛋白質(zhì)的抗體”意思是包含可以與SITH-I蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的完整的分子以及抗體片段(例如Fab以及F(ab' )2片段)。Fab、F(ab，)2以及SITH-I 抗體的其他片段可以按照本說(shuō)明書中公開(kāi)的方法、或公知方法來(lái)使用。典型地，這樣的片段通過(guò)基于使用如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)等酶進(jìn)行的蛋白質(zhì)分解的切割而產(chǎn)生。據(jù)信心境障礙患者或具有心境障礙的可能性的個(gè)體中，SITH-I蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加，其結(jié)果是SITH-I抗體效價(jià)也提高。本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)生物學(xué)樣品中的SITH-I抗體，能夠鑒定出心境障礙患者或具有心境障礙可能性的個(gè)體。2.結(jié)合有勿素結(jié)合在Φ寺異+牛結(jié)合需檢測(cè)丨4勿質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的勿素仆, 白質(zhì)的承載體本發(fā)明中利用了通過(guò)生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間結(jié)合結(jié)合有將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)的承載體。本發(fā)明的承載體可以如下地制作1)準(zhǔn)備結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體、以及將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)；2)藉由生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合，將生物素化蛋白質(zhì)結(jié)合在步驟1) 中準(zhǔn)備的承載體上，制作結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體?！吧锼亍笔荄-[⑴-順-六氫-2-氧代-IH-噻吩并-(3，4)-咪唑_4_戊酸]的通用名。生物素是屬于B族維生素的一種水溶性維生素，也稱作維生素B7、維生素H或輔酶 R0生物素非常強(qiáng)烈地結(jié)合卵清中所含的一種糖蛋白質(zhì)-抗生物素蛋白，使其吸收遭到阻礙。因此，大量攝入生卵清有時(shí)會(huì)產(chǎn)生生物素缺乏癥。在本說(shuō)明書中，“生物素”除了上述的生物素以外，還包括亞氨基生物素 (iminobiotin) (Hofmann, et al.，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4666-4668)、脫硫生物素(desthiobiotin) (Hirsch,et al.，(2002) Anal. Biochem.，308 :343-357)、生物胞素(biocytin)或生物素亞砜(biotin sulfoxide)等生物素類似物。使用生物素-抗生物素蛋白(生物素結(jié)合性蛋白質(zhì))復(fù)合體的系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、組織免疫學(xué)、DNA分析或者臨床檢查等領(lǐng)域。本發(fā)明包括利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)之間的結(jié)合將特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)固定在承載體上。在本發(fā)明中，有時(shí)也將“生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)之間的結(jié)合”稱作“抗生物素蛋白-生物素結(jié)合”。牛物素結(jié)合件蛋白質(zhì)作為生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，只要是抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、AVR 蛋白質(zhì)(Biochem. J.，(2002), 363 :609-617)、BradavidinQ. Biol. Chem.， (2005)，280 13250-13255)、Rhizavidin (Biochem. J.，(2007)，405 :397-405)、tamavidin 或它們的突變體等與生物素強(qiáng)結(jié)合的蛋白質(zhì)，均可以適宜使用。優(yōu)選地，與生物素的解離常數(shù)(KD)是IO-8M以下、更優(yōu)選IO-ltlM以下、更優(yōu)選以下。但是，關(guān)于被檢樣品中添加的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)如后述。作為生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選可以使用在大腸桿菌中高表達(dá)的tamavidin 及其突變體。tamavidin是在食用蘑菇擔(dān)子菌白黃側(cè)耳(pleurotus comucopiae)中發(fā)現(xiàn)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)(W0 02/072817 ；Takakura et al.，(2009) FEBS J.，276 :1383-1397)。 作為tamavidin的突變體，可以列舉出例如高結(jié)合能力/低非特異性結(jié)合tamavidin(PCT/ JP2009/64302)等。本發(fā)明中的“tamavidin” 是指tamavidin 1 (TMl)、tamavidin 2(TM2)或它們的突變體。具體地，本發(fā)明的tamavidin典型地可以是包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者可以是由包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)?；蛘撸景l(fā)明的tamavidin可以是包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或由包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)的突變體、且具有與tamavidin 1或2相同的生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)或具有高結(jié)合能力 /低非特異性結(jié)合的活性的蛋白質(zhì)。在本說(shuō)明書中，有些情況下也簡(jiǎn)單地將tamavidin 1、 tamavidin 2以及它們的突變體統(tǒng)稱為tamavidin。tamavidin 1或2的突變體可以是包含在SEQ ID NO :5或7的氨基酸序列中包含 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列、并且具有與tamavidin 1或 2等同的生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。取代可以是保守取代，即將特定的氨基酸殘基替換為具有相似的物理化學(xué)特征的殘基。保守取代的非限制性例子包括含脂肪族基團(tuán)的氨基酸殘基之間的取代(例如lie、Val, Leu或Ala間的相互取代)、極性殘基之間的取代(例如Lys 和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之間的相互取代)等。通過(guò)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而產(chǎn)生的突變體可以通過(guò)對(duì)編碼野生型蛋白質(zhì)的DNA進(jìn)行例如作為公知技術(shù)的定點(diǎn)誘變(例如參見(jiàn)Nucleic Acid Research, Vol. 10,No. 20,p. 6487-6500，1982，通過(guò)引用將其全文引入到本說(shuō)明書中)來(lái)制作。在本說(shuō)明書中，“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”是指通過(guò)定點(diǎn)誘變方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本說(shuō)明書中，“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”根據(jù)情況也可以指1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。并非進(jìn)行限定，“1個(gè)或多個(gè)氨基酸”是指50個(gè)以內(nèi)、優(yōu)選40個(gè)以內(nèi)、30個(gè)以內(nèi)、20個(gè)以內(nèi)、10個(gè)以內(nèi)、8個(gè)以內(nèi)、5個(gè)以內(nèi)、3個(gè)以內(nèi)的氨基酸。
tamavidin 1或2的突變體還可以是包含與SEQ ID NO :5或7的氨基酸序列具有至少60%以上、優(yōu)選65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95% 以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更優(yōu)選99. 3%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列，并且具有與tamavidin 1或2等同的生物素結(jié)合活性或者具有高結(jié)合能力/低非特異性結(jié)合的活性的蛋白質(zhì)。兩個(gè)氨基酸序列的同一性％可通過(guò)目測(cè)和數(shù)學(xué)計(jì)算來(lái)確定?；蛘?，兩個(gè)蛋白質(zhì)序列的同一性百分比可以通過(guò)使用以Needleman，S. B.及Wunsch，C. D. (J. Mol. Bol. ,48 443-453,1970)的算法為基礎(chǔ)的、可從威斯康星州大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(UWGCG)獲得的GAP 計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列信息比較來(lái)確定。GAP程序優(yōu)選的默認(rèn)參數(shù)包括= (I)Henikoff, S.以 R Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 10915-10919，1992)所記載的得分 / 矩陣、blosum62 ；⑵空位權(quán)重12 ； (3)空位長(zhǎng)權(quán)重4 ；以及(4)末端空位不扣分。也可使用該領(lǐng)域技術(shù)人員使用的其它進(jìn)行序列比較的程序。關(guān)于同一性百分比， 例如，可以使用 Altschul 等(Nucl. Acids. Res.，25，p. 3389-3402，1997)中記載的 BLAST 程序與序列信息進(jìn)行比較來(lái)加以確定。該程序可于網(wǎng)絡(luò)上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI) ^DNA Data Bank of Japan(DDBJ)網(wǎng)立占才目同站點(diǎn)上對(duì)利用BLAST程序進(jìn)行同一性檢索的各種條件(參數(shù))進(jìn)行了詳細(xì)記載，可對(duì)部分設(shè)定進(jìn)行適當(dāng)變更，但檢索通常使用默認(rèn)值來(lái)進(jìn)行。此外，兩個(gè)氨基酸序列的同一性％也可用遺傳信息處理軟件GENEITX Ver. 7 (GENEITX制)等程序或FASTA算法等來(lái)確定。此時(shí)， 也可用默認(rèn)值檢索。兩個(gè)核酸序列的同一性％可通過(guò)目測(cè)和數(shù)學(xué)計(jì)算來(lái)確定，或者，此類比較更優(yōu)選使用計(jì)算機(jī)程序比較序列信息來(lái)進(jìn)行。具有代表性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序?yàn)檫z傳學(xué)計(jì)算機(jī)組 (GCG ；威斯康星州Madison)的威斯康星·軟件包、10. O版“GAP”程序(Devereux等，1984， Nucl. Acids Res. ,12 :387)。使用該“GAP”程序，不僅可對(duì)兩個(gè)核酸序列進(jìn)行比較，還可比較兩個(gè)氨基酸序列，并可對(duì)核酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比較。而且，結(jié)合于承載體的“生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)”用于制作藉由生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合而結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體。因而，并非進(jìn)行限定，優(yōu)選上述 tamavidinl或2的突變體與利用它們的野生型形成生物素化蛋白質(zhì)的情況相比較，生物素結(jié)合活性沒(méi)有大幅減少。因而，非限定性地，關(guān)于tamavidinl的突變體，優(yōu)選在SEQ ID NO :5的氨基酸序列中N14、S18 J34、S36、S78、W82、W98、W110、D118不進(jìn)行修飾。而且，該表示方式中，例如 Y34是指SEQ ID NO :5的氨基酸序列的第34位的酪氨酸殘基?；蛘?，在對(duì)它們進(jìn)行修飾的情況下，優(yōu)選修飾為性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，例如，優(yōu)選地，對(duì)于天冬酰胺(N14)，修飾成谷氨酰胺(Q)或天冬氨酸O)，優(yōu)選天冬氨酸；對(duì)于絲氨酸(S18、S36、S78)，修飾成蘇氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，優(yōu)選蘇氨酸；對(duì)于酪氨酸(Y34)，修飾成絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或者苯丙氨酸(F)，優(yōu)選苯丙氨酸；對(duì)于色氨酸(W82、W98、W110)，修飾成苯丙氨酸(F)；對(duì)于天冬氨酸(D118)，修飾成谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)，優(yōu)選天冬酰胺。此外，對(duì)于tamavidin2的突變體，優(yōu)選在SEQ ID NO 7的氨基酸序列中4個(gè)色氨酸殘基(W69、W80、W96、W108)不進(jìn)行修飾。或者，在對(duì)它們進(jìn)行修飾的情況下，優(yōu)選修飾成性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，例如苯丙氨酸(F)。此外，對(duì)于被認(rèn)為與生物素直接相互作用
11的氨基酸殘基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)也希望不進(jìn)行修飾?；蛘?，在對(duì)它們進(jìn)行修飾的情況下，優(yōu)選修飾成性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，以便能夠保持與生物素的結(jié)合， 例如，優(yōu)選地，對(duì)于天冬酰胺(W4)，修飾成谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，優(yōu)選天冬氨酸；對(duì)于天冬氨酸(D40)，修飾成天冬酰胺(N)；對(duì)于絲氨酸(S18、S36、S76)，修飾成蘇氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，優(yōu)選蘇氨酸；對(duì)于酪氨酸(Y34)，修飾成絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或者苯丙氨酸(F)，優(yōu)選苯丙氨酸；對(duì)于蘇氨酸(T78)，修飾成絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)，優(yōu)選絲氨酸；對(duì)于天冬氨酸(D116)，修飾成谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，優(yōu)選天冬酰胺。在本發(fā)明中，優(yōu)選的tamavidin修飾體包括以下修飾體。(PCT/JP2009/64302)。在包含SEQ ID NO 7所述的氨基酸序列、或者在該序列中具有1 數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或者與該序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)中，選自下組中的1或多個(gè)殘基被取代成酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)DSEQ ID NO 7的104位的精氨酸殘基；2) SEQ ID NO 7的141位的賴氨酸殘基；3) SEQ ID NO 7的洸位的賴氨酸殘基；以及4) SEQ ID NO 7的73位的賴氨酸殘基。更優(yōu)選地，選自下組中的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)在SEQ ID NO 7中，104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)(R104E-K141E)；在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)(D40N-R104E)；在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)(D40N-K141E)；以及在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)(D40N-R104E-K141E)。^^^mm^^m&mmmM構(gòu)成固體承載體的材料包括纖維素、特氟隆(注冊(cè)商標(biāo))、硝基纖維素、瓊脂糖、高交聯(lián)球形瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、 尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、聚苯乙烯膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹(shù)脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳以及它們的組合，但不限于此。此外，優(yōu)選具有一定強(qiáng)度、組成穩(wěn)定、且非特異結(jié)合少者。固體承載體的形狀包括但不限于珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、板、微板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本技術(shù)領(lǐng)域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體承載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。本發(fā)明的一類實(shí)施方式中，珠子可以具有約25nm 約Imm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，珠子具有約50nm 約ΙΟμπι范圍的直徑。珠子的大小可以根據(jù)特定用途進(jìn)行選擇。并非進(jìn)行限定，例如，在希望高檢測(cè)靈敏度的情況下，從需檢測(cè)物質(zhì)與與之特異性結(jié)合的物質(zhì)之間的接觸頻率、洗滌操作的容易性這樣的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用諸如上述的珠子作為固體承載體。作為制作結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體的方法，可以將生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)直接結(jié)合于承載體，或者可以購(gòu)買預(yù)先固定化有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體?；蛘撸部梢越逵缮锼?生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間結(jié)合來(lái)結(jié)合于生物素化的承載體。作為使生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)直接結(jié)合的方法，有利用疏水鍵、共價(jià)鍵的方法等?；蛘?，可以在諸如NEW ELISA Plate Kit (SUMITOMO BAKELITE公司)等微板上，按照試劑盒附帶的說(shuō)明書直接結(jié)合、固定化生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)。而且，抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白在例如SIGMA公司等有售。在利用疏水鍵的情況下，利用承載體的疏水性表面與生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的疏水性部分之間的相互作用進(jìn)行結(jié)合。具體地，通過(guò)使生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)溶液直接接觸例如微板等(例如但不限于，Nunc-Immunoyy Plate (Nunc 公司)、SpectraPlate_96HB (Perkin Elmer 公司)、或者 Reacti-Bind (商標(biāo))96-Well Plates Corner Notch (PIERCE 公司)等) 承載體表面，放置一定時(shí)間，借助生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的疏水性部分與承載體的疏水性部分之間的相互作用使之結(jié)合、固定化。另一方面，在利用共價(jià)鍵的情況下，在承載體的表面配置官能團(tuán)，使之與生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)中的官能團(tuán)結(jié)合。為了進(jìn)行這樣的結(jié)合，表面配置有各種官能團(tuán)的各種承載體已經(jīng)市售，可以優(yōu)選使用。例如但并非限定，作為表面配置有官能團(tuán)的微板， 馬來(lái)酸野平板有例如 Reacti-Bind(商標(biāo))Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96-ffell Plates (PIERCE 公司)，活性型氨基平板有例如 Immobilizeryy-Amino Modules/ Plates (Nunc公司)，羧基平板有例如ELISA用平板MS-8796F (96孔· C型 平底 羧基)(SUMITOMO BAKELITE公司)。此外，在表面配置有官能團(tuán)的微珠方面，作為高交聯(lián)瓊脂糖珠有例如kpharose (商標(biāo))(GE Healthcare Bio-Science公司)，作為磁珠有例如 Dynabeads (商標(biāo))(Dynal公司)等，但不限于此。生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)與固體載體的連接可以按照承載體附帶的說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行。具體地，并非進(jìn)行限定，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白質(zhì)與固體載體的偶聯(lián)方法來(lái)進(jìn)行。例如，可以對(duì)固體承載體表面進(jìn)行修飾，使得羧基露出來(lái)，然后使該羧基與生物素結(jié)合性的氨基在交聯(lián)試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)的存在下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，從而將生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)與固體承載體連接起來(lái)?；蛘?，例如，通過(guò)將表面的羧基被N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯化后的固體承載體與生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)在不含伯氨基的PH6. 5 9的緩沖液中混合，可以將固體承載體表面的羧基與生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的氨基連接起來(lái)?；蛘?，可以使用交聯(lián)試劑BS3(雙[硫代琥珀酰亞胺基]辛二酸酯)或DSS(二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)將固體承載體表面的氨基與生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的氨基連接起來(lái)，或者使用交聯(lián)試劑SPDP (N-琥珀酰亞胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酸酯) 或GMBS (N-(4-馬來(lái)酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺)將固體承載體表面的氨基與生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的巰基連接起來(lái)。作為固定化有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體，可以列舉出例如Reacti-Bindyy Streptavidin Coated Plates (PIERCE 公司)、Nunc Streptavidin Coated 96Micro Wellyy Plates (Nalge Nunc 公司)等微板類、或者 DynabeadsM_28(^tr印tavidin (Dynal 公司)、MagnaBindyy Streptavidin Beads (PIERCE公司)等磁珠類等市售品，但不限于此。此外，生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)也可以如上述將承載體生物素化，藉由抗生物素蛋白-生物素結(jié)合來(lái)結(jié)合。即，利用生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)多為四聚體的事實(shí)，在結(jié)合有生物素的承載體上結(jié)合生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，然后再結(jié)合生物素化的蛋白質(zhì)的方法。作為使生物素結(jié)合于承載體的方法，可以列舉出例如使用生物素化試劑的方法。 作為生物素化試劑，可以利用例如PIERCE公司制造的EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-生物素(13. 5埃、伯胺)(括號(hào)內(nèi)依次為接頭長(zhǎng)度、反應(yīng)基團(tuán))、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-LC-生物素4埃、伯胺)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-LCLC-生物素(30. 5 埃、伯胺)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))PFP-生物素(9. 6埃、胺)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))馬來(lái)酰亞胺-PEO2-生物素( . 1埃、硫醇基)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))生物素-PEO2K (20. 4埃、羧基)、 EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-PEO3-LC胺9埃、羧基)、EZ_Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-酰胼(15. 7埃、醛基)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-LC-酰胼( . 7埃、醛基)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))NHS-亞胺基生物素(13. 5埃、伯胺)等，但不限于此。使用上述生物素化試劑，可以采用公知方法在微板、微珠或者傳感器芯片等期望的承載體上結(jié)合生物素。例如有使用具有氨基、羧基、巰基、甲苯磺?；h(huán)氧基、馬來(lái)酰亞胺基、活化酯等各種官能團(tuán)的承載體(例如磁珠、kpharose珠子、瓊脂糖珠子、膠乳珠子、 微滴定板等)的方法。這些情況例如，在使用含NHS酯的生物素化試劑的情況下，通過(guò)用 DMSO(二甲基亞砜)這樣的有機(jī)溶劑或pH7-9的磷酸緩沖液進(jìn)行溶解、并添加至具有氨基的固定化承載體，可以結(jié)合生物素。此外，例如，在使用含氨基的生物素化試劑的情況下，通過(guò)使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)這樣的碳化二亞胺，在將固定化承載體的羧基轉(zhuǎn)換為活化酯后，添加用PH5附近的緩沖液溶解的生物素化試劑，可以結(jié)合生物素。而且，生物素化的固定化承載體優(yōu)選在將未反應(yīng)官能團(tuán)滅活后，用BSA等進(jìn)行封閉。此外，可以利用生物素化的市售承載體。作為生物素化的微板，可以利用例如 Reacti-Bind (商標(biāo))Biotin Coated Polystyrene Plates (PIERCE 公司制)，但不限于此。 在生物素化的微珠方面，例如，作為磁珠，可以利用BioMagBiotin (Polysciences公司制)； 作為納米磁珠，可以利用Corefront公司制的nanomag(注冊(cè)商標(biāo))-D Biotin、nanomag(注冊(cè)商標(biāo))_Silica Biotin ；作為聚苯乙烯制微珠，可以利用Beadlyte (注冊(cè)商標(biāo))Biotin Beads (Upstate公司制)；作為瓊脂糖，可以利用Sigma公司制的Biotin Agarose、 2-Iminobiotin-Agarose ；作為高交聯(lián)瓊月旨糖，可以禾lJ用 Biotin-Sepharose (Bioresearch Technology公司制)，但不限于此。承載體與生物素相連接的接頭的長(zhǎng)度優(yōu)選至少長(zhǎng)于5埃，更優(yōu)選13. 5埃以上。通過(guò)使生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)接觸這樣的生物素化承載體，可以制作結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體。生物素化蛋白質(zhì)在本發(fā)明中，可以在特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)上結(jié)合生物素而制作生物素化蛋白質(zhì)，并利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間結(jié)合將其結(jié)合于承載體。作為生物素化蛋白質(zhì)的制作方法，沒(méi)有特殊限制，可以使用生物素標(biāo)記試劑盒(例如但不限于，EZ-Linkyy NHS-Lc-Biotin PIERCE 公司)、Biotin LabelingKit-NH2 (D0JIND0 MOLECULAR TECHNOLOGIES INC.公司)等)在特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)上結(jié)合生物素。或者，可以通過(guò)將特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因與編碼包含生物素化序列的肽的DNA融合，構(gòu)建表達(dá)該融合基因的載體，并在任意宿主中以與生物素化序列所成的融合蛋白質(zhì)的形式進(jìn)行表達(dá)，來(lái)制作生物素化蛋白質(zhì)(Schwarz et al., (1988) · J. Biol. Chem. 263 :9640-9645.)。作為這樣的載體，并非進(jìn)行限定，可以列舉出例如包含有hvitrogen公司的BioEase (商標(biāo))標(biāo)簽的載體(本說(shuō)明書的實(shí)施例1)。這其中， 供哺乳類細(xì)胞表達(dá)用的有PcDNA (商標(biāo))6載體，供大腸桿菌表達(dá)用的有pET 104載體，或者供果蠅(Drosophila)表達(dá)用的有pMT/Biofese載體。而且，對(duì)于期望的蛋白質(zhì)的生物素化，也可優(yōu)選利用與上述的將承載體生物素化時(shí)采用的方法相同的方法。即，可以列舉出使用生物素化試劑的方法。作為生物素化試劑， 可以利用例如PIERCE公司制造的EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-生物素(13. 5埃、伯胺) (括號(hào)內(nèi)依次為接頭長(zhǎng)度、反應(yīng)基團(tuán))、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-LC-生物素4 埃、伯胺)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-LCLC-生物素(30. 5埃、伯胺)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))PFP-生物素(9.6埃、胺)』2-1^1^(注冊(cè)商標(biāo))馬來(lái)酰亞胺-PE02-生物素1埃、 硫醇基)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-PE02胺QO. 4埃、羧基)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-PE03-LC胺9埃、羧基)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-酰胼(15. 7埃、醛基)、 EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-LC-酰胼7埃、醛基)、EZ_Link (注冊(cè)商標(biāo))NHS-亞胺基生物素(13. 5埃、伯胺)等，但不限于此。使用這樣的生物素化試劑，可以采用公知方法在期望的蛋白質(zhì)上結(jié)合生物素。例如，在使用含NHS酯的生物素化試劑的情況下，通過(guò)用DMSO (二甲基亞砜)這樣的有機(jī)溶劑或PH7-9的磷酸緩沖液進(jìn)行溶解、并添加至期望的蛋白質(zhì)，可以結(jié)合生物素。此外，例如，在使用含氨基的生物素化試劑的情況下，通過(guò)使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)這樣的碳化二亞胺，在將期望的蛋白質(zhì)的羧基轉(zhuǎn)換為活化酯后，添加用PH5附近的緩沖液溶解的生物素化試劑，可以結(jié)合生物素。而且，在如上述地使用生物素化試劑來(lái)制作生物素化蛋白質(zhì)的情況下，優(yōu)選預(yù)先對(duì)特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。純化可以從該蛋白質(zhì)原始來(lái)源的生物進(jìn)行純化，或者可以將編碼該蛋白質(zhì)的基因組入表達(dá)載體，并用期望的宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程表達(dá)，然后再進(jìn)行純化。作為宿主細(xì)胞，可以列舉出哺乳類細(xì)胞(非限制性地例如人、猴等靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠等嚙齒類、或者犬等來(lái)源的細(xì)胞)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(利用桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)或果蠅的系統(tǒng)等)、酵母、大腸桿菌、植物、枯草桿菌等。優(yōu)選可以列舉出大腸桿菌。此外，例如，在人方面優(yōu)選利用HEK293、HeLa、H印G2J93T，在嚙齒類方面優(yōu)選利用CH0、 NIH3T3、PCI2，在其他哺乳類方面優(yōu)選利用C0S-1、C0S-7、MDCK, Vero，在昆蟲(chóng)細(xì)胞方面優(yōu)選利用Sf9、S2等已經(jīng)確立的培養(yǎng)細(xì)胞系。此外，還可以使用利用小麥胚芽提取液、昆蟲(chóng)細(xì)胞提取液等的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)。在表達(dá)載體方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適宜選擇適于所用的宿主細(xì)胞的表達(dá)載體。對(duì)表達(dá)出的蛋白質(zhì)的純化可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法?？梢越M合使用常規(guī)的離子交換色譜、疏水色譜、凝膠過(guò)濾色譜等色譜，也可以使用純化用的標(biāo)簽序列。在該情況下，例如，可以將特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)以與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、纖維素結(jié)合蛋白、殼多糖結(jié)合蛋白、硫氧還蛋白結(jié)合蛋白等所成的融合蛋白質(zhì)形式在大腸桿菌、哺乳類等任意宿主中表達(dá)，分別利用與谷胱甘肽、麥芽糖、纖維素、殼多糖、硫氧還蛋白的親和性(例如使用谷胱甘肽固定化柱)來(lái)進(jìn)行純化。此外，如果預(yù)先在和特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)的融合位點(diǎn)導(dǎo)入蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)，在純化后通過(guò)用該蛋白酶處理標(biāo)簽序列，也能夠?qū)⑵涑ァＷ鳛榈鞍酌?，可以是例如腸激酶、因子敘等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白酶。此外，使用HisTagjtrepdD-Tag，能夠分別使用固定化有離子化的鎳、 StrepTactin的柱來(lái)進(jìn)行純化。而且，為了提高純度，可以將多個(gè)標(biāo)簽和特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)融合，并將純化方法組合。例如，可以在特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)的末端融合HisTag和BioEASE (商標(biāo))anvitrogen公司)等的生物素化序列，在宿主中以重組蛋白質(zhì)的形式進(jìn)行表達(dá)后，用鎳柱進(jìn)行純化，再用低親和性抗生物素蛋白、低親和性鏈霉抗生物素蛋白(例如SA mutein、Roche公司)柱進(jìn)行純化。在本發(fā)明中，通過(guò)準(zhǔn)備結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體和生物素化蛋白質(zhì)， 并使兩者接觸，能夠通過(guò)抗生物素蛋白-生物素結(jié)合在承載體上結(jié)合蛋白質(zhì)。并非進(jìn)行限定，以0. lmg/ml 5mg/ml、優(yōu)選0. 2mg/ml ^iig/ml的總蛋白質(zhì)濃度準(zhǔn)備含生物素化蛋白質(zhì)的細(xì)胞破碎粗提取液。將其在10°c 40°C、優(yōu)選20°C 30°C與結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體接觸5分鐘 2小時(shí)、優(yōu)選30分鐘 1小時(shí)。通過(guò)該操作，生物素化蛋白質(zhì)被固定化于結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體。優(yōu)選然后再于含 0. 05 % 1 %、優(yōu)選0. 1 % 0. 3 %的Tween20等表面活性劑的PBS或者TBS等緩沖液中，洗去多余的細(xì)胞破碎粗提取物。而且，在通過(guò)這樣與細(xì)胞破碎粗提取液接觸，結(jié)合生物素化蛋白質(zhì)的情況下，事實(shí)上純化與固定化同時(shí)進(jìn)行。因此，該情況下，無(wú)需另外進(jìn)行純化作業(yè)。此外，可以使0. 1 μ g/ml 5μ g/ml濃度的純化的生物素化蛋白質(zhì)與結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體接觸。3.本發(fā)明的方法在步驟3)中，將(a)生物學(xué)樣品、以及(b)從與用于表達(dá)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液混合并添加于步驟2)中制作的結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體。細(xì)菌破碎提取液的添加一般地，在利用承載體的檢測(cè)方法中，為了減少作為背景信號(hào)的原因的非特異結(jié)合，已知有下述方法使細(xì)菌成分提取液中含有檢測(cè)用試劑的方法(日本特開(kāi)昭 59-99257)；將導(dǎo)入了與用于產(chǎn)生特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的重組蛋白質(zhì)的載體同類、且不包含編碼該蛋白質(zhì)的基因的載體的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)成分添加到樣品中的方法(日本特開(kāi)平8-4339 ；對(duì)與產(chǎn)生特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞同種類、且不包含該蛋白質(zhì)的細(xì)胞的水提取液進(jìn)行加熱處理后，將其水溶性級(jí)分添加到樣品中的方法(特開(kāi) 2004-301646)等。本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，想到了在利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合將檢測(cè)用蛋白質(zhì)結(jié)合于承載體的系統(tǒng)中，取得更顯著效果的方法。具體地發(fā)現(xiàn)了 在使被檢樣品與承載體接觸時(shí)，讓細(xì)胞破碎提取液以及生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)這兩者同時(shí)存在是理
術(shù)目的
> LH、U J ο對(duì)細(xì)胞破碎提取液所來(lái)源的細(xì)胞沒(méi)有特殊限制，可以是大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、 哺乳類細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞等。但是，優(yōu)選的是與用于表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞。例如，在用大腸桿菌制備生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的情況下，理想的是細(xì)胞破碎提取液也從大腸桿菌制備。此外，在利用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的情況下， 可以將使用的細(xì)胞破碎提取液直接、或者懸浮于期望的緩沖液來(lái)使用。根據(jù)用于表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的組合，可以使用2種或2種以上的細(xì)胞破碎提取液。此外，生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)和/或特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)也可以不是通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)的，而是從本來(lái)就具有這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取、純化的。例如，在使用tamavidin作為生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的情況下，也可以利用擔(dān)子菌白黃側(cè)耳(Pleurotus conucopiae)細(xì)胞的細(xì)胞破碎提取液。這樣，本來(lái)包含生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)和/或特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)的細(xì)胞的破碎提取液也包含在本發(fā)明的細(xì)胞提取液中。此外，用于制備細(xì)胞破碎提取液的細(xì)胞可以包含任意的載體、優(yōu)選空載體?？蛰d體是指與表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或其生物素化蛋白質(zhì)時(shí)使用的載體同種類、且不包含編碼這些蛋白質(zhì)的基因的載體。此外，例如可以是這些空載體進(jìn)一步包含任意核酸而成的任意載體。此外，也可以是與表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的蛋白質(zhì)和/或生物素化蛋白質(zhì)時(shí)使用的載體無(wú)關(guān)的任意載體。此外，作為細(xì)胞的破碎提取液，沒(méi)有特殊限制，是細(xì)胞來(lái)源的成分即可，可以使用例如其蛋白質(zhì)成分、糖類成分、脂質(zhì)成分或其混合成分。優(yōu)選地，可以使用細(xì)胞的可溶性提取物。作為細(xì)胞的破碎提取液的制備方法，沒(méi)有特殊限制，可以采用各種方法。通常，將用適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞通過(guò)超聲波等物理手段或者使用表面活性劑等的化學(xué)手段或者酶處理等進(jìn)行破碎或者可溶化，通過(guò)離心分離或過(guò)濾等操作，以可溶性成分的形式進(jìn)行制備。此外，為了延長(zhǎng)保存壽命，優(yōu)選可以對(duì)通過(guò)離心分離或過(guò)濾等而澄清的液體例如添加蛋白酶抑制劑、或進(jìn)行高壓滅菌處理等加熱處理，使細(xì)胞來(lái)源的各種酶等被抑制或失活。 加入細(xì)胞破碎提取液的濃度可以根據(jù)產(chǎn)生的非特異反應(yīng)的強(qiáng)度而變化，可以適宜設(shè)定對(duì)吸收該非特異反應(yīng)而言充分的濃度。作為制備細(xì)胞破碎提取液的具體方法的例子，并非進(jìn)行限定，例如，對(duì)于大腸桿菌細(xì)胞的情況，將大腸桿菌(可以包含載體、此外載體可以包含編碼生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的基因)接種于含抗生素的LB培養(yǎng)基，15°C 37°C、優(yōu)選25°C 37°C振蕩培養(yǎng)直至0D600 處的吸光度為0. 1 2、優(yōu)選0. 25 1、更優(yōu)選0.4 0.6，然后添加0. OlmM 5mM、優(yōu)選 0. ImM ImM的IPTG，再進(jìn)行15°C 37°C、優(yōu)選25°C 37°C、2小時(shí) M小時(shí)、優(yōu)選4小時(shí) 16小時(shí)的振蕩培養(yǎng)。從培養(yǎng)液通過(guò)離心回收菌體，將菌體懸浮于期望的緩沖液中后， 進(jìn)行破碎，對(duì)破碎液進(jìn)行離心，將其上清作為大腸桿菌粗提取液回收。在生物學(xué)樣品中混合細(xì)胞破碎粗提取液時(shí)，并非進(jìn)行限定，在樣品中混合用期望
17的緩沖液(可以包含BSA、酪蛋白、市售的封閉劑等)制備成總蛋白質(zhì)濃度0.05mg/ml 5mg/ml、優(yōu)選0. 5mg/ml 5mg/ml的細(xì)胞破碎粗提取液，在10°C 30°C、優(yōu)選20V 30°C反應(yīng)1分鐘 4小時(shí)、優(yōu)選10分鐘 1小時(shí)。而且，在生物學(xué)樣品為血清等的情況下，通常將血清用細(xì)胞破碎提取液稀釋10倍 10000倍、優(yōu)選100倍 1000倍、更優(yōu)選100倍 500
倍來(lái)使用。牛物素結(jié)合件蛋白質(zhì)的添加在本發(fā)明的方法中，通過(guò)在生物學(xué)樣品中添加生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，能夠最終抑制背景信號(hào)。這樣的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)可以與上述的結(jié)合于承載體的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)相同，也可以不同。此外，可以是野生型，也可以是突變體，生物素結(jié)合能力與野生型相比較可以等同，也可以更高或更低。此外，作為添加的方式，可以直接添加生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)(可以是天然來(lái)源的，也可以是基因工程表達(dá)的)的粉末，也可以用適當(dāng)液體溶解后再添加。此外，例如也可以是下述方式不是將生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)直接添加在樣品中，而是將樣品與細(xì)胞破碎提取液的混合物用固定有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體進(jìn)行處理(例如通過(guò)柱子)(步驟b-i)。在將生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)添加于細(xì)胞破碎粗提取液時(shí)，并非進(jìn)行限定，生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的濃度以最終濃度計(jì)添加1 μ g/ml 500 μ g/ml、優(yōu)選10 μ g/ml 100 μ g/ml。 對(duì)于在該細(xì)胞中基因工程表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)時(shí)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的濃度而言， 并非進(jìn)行限定，也可以是同樣的濃度。或者，可以將編碼生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞并進(jìn)行表達(dá)，以將破碎該宿主細(xì)胞而得到的含生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取液的形式使用(步驟b-ii)。該情況下，生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)可以在期望的宿主中以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法表達(dá)，但在基因工程表達(dá)特異性結(jié)合被檢物質(zhì)的期望的蛋白質(zhì)和/或期望的生物素化蛋白質(zhì)的情況下，優(yōu)選是與該宿主同種類的。在宿主為大腸桿菌的情況下，將編碼生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的基因組入表達(dá)載體， 并將其導(dǎo)入大腸桿菌，在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的同時(shí)，進(jìn)行大腸桿菌的培養(yǎng)。表達(dá)載體、宿主大腸桿菌株、培養(yǎng)基成分、IPTG濃度、培養(yǎng)溫度等誘導(dǎo)條件可以適宜選擇適于生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的表達(dá)的條件。承載體中牛物學(xué)樣品等的添加承載體中生物學(xué)樣品以及細(xì)胞破碎提取液的添加可以采用任意方法進(jìn)行。但必須在生物學(xué)樣品與承載體接觸的同時(shí)、或者在此之前，使生物學(xué)樣品與細(xì)胞破碎提取液接觸。 即，使生物學(xué)樣品與細(xì)胞破碎提取液充分地接觸即可，細(xì)胞破碎提取液來(lái)源的成分并不一定需要最終與生物學(xué)樣品一起添加至承載體。例如，可以采用制作結(jié)合有細(xì)胞破碎提取液成分的承載體，然后向其添加生物學(xué)樣品，使用經(jīng)處理的生物學(xué)樣品。具體地，可以列舉出將生物學(xué)樣品通過(guò)細(xì)胞破碎提取液成分柱等方式。而且，添加后，并非進(jìn)行特別限定，使生物學(xué)樣品以及細(xì)胞破碎提取液與承載體于 10°C 30°C、優(yōu)選20°C 30°C反應(yīng)10分鐘 4小時(shí)、優(yōu)選30分鐘 2小時(shí)。4.被檢物質(zhì)的檢測(cè)方法本發(fā)明的檢測(cè)方法在步驟4)中對(duì)特異性結(jié)合于生物素化蛋白質(zhì)的被檢物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)被檢物質(zhì)的方法可以基于期望的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，由本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜選擇。作為優(yōu)選的方法，可以列舉出諸如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(含ELISA、夾心ELISA法)、放射性免疫測(cè)定法(RIA)等免疫測(cè)定法、核酸雜交測(cè)定法、表面等離子體共振法等的測(cè)定法。 使被檢樣品與使用抗生物素蛋白-生物素結(jié)合固相化的、與被檢物質(zhì)特異性結(jié)合-相互作用的物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)后，檢測(cè)該被檢物質(zhì)。在免疫測(cè)定中，例如，在需測(cè)定的物質(zhì)是抗體的情況下，將抗原固定化，使存在于被檢樣品中的抗體與抗原反應(yīng)，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行檢測(cè)。例如，在被檢樣品來(lái)源于人的情況下，使用抗人抗體檢測(cè)與抗原結(jié)合的人抗體。此時(shí)，將該抗人抗體預(yù)先用熒光、酶、或者放射性同位素標(biāo)記，最終測(cè)定熒光量、酶活性、或者放射性量，來(lái)間接地測(cè)定、 定量抗體的量。此外，在需測(cè)定的物質(zhì)是抗原的情況下，固定化針對(duì)該抗原的某部分(表位)的抗體，使之與存在于被檢樣品中的抗原反應(yīng)后，再與針對(duì)該抗原的其他表位的抗體反應(yīng)。如果預(yù)先將針對(duì)該其他表位的第二抗體如上述地進(jìn)行標(biāo)記，能夠間接地測(cè)定抗原的量。此外，在核酸雜交測(cè)定中，預(yù)先將具有與需測(cè)定的核酸互補(bǔ)的序列區(qū)域的數(shù)十 數(shù)百、 或者數(shù)千堿基的核酸利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間結(jié)合進(jìn)行固相化。使之與包含預(yù)先用熒光、放射性同位素標(biāo)記的核酸的被檢樣品反應(yīng)，測(cè)定熒光量或放射性量。上述標(biāo)記可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，也可以使用市售的經(jīng)熒光或酶標(biāo)記的抗人抗體等。作為熒光標(biāo)記，可以考慮例如利用熒光素以及羅丹明等的標(biāo)記、利用 GFP等熒光蛋白質(zhì)的標(biāo)記。作為酶標(biāo)記，可以利用過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、或者螢光素酶、 葡萄糖氧化酶等，但不限于此。用于利用這些酶進(jìn)行測(cè)定的底物有市售，例如，對(duì)過(guò)氧化物酶的情況，可以使用TBA或化學(xué)發(fā)光用底物。此外，作為放射性同位素，可以列舉出例如碘 (1ΜΙ、121Ι)、碳(14C) M (35s)、以及氚(3H),在核酸的情況下，可以列舉出磷(32P)等。生物學(xué)樣品(樣品)中存在的抗原或抗體的量可以采用例如線性回歸計(jì)算機(jī)算法，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)制備物(例如在臨床檢測(cè)體的情況下，是健康正常者的標(biāo)準(zhǔn)樣品或者典型患者的標(biāo)準(zhǔn)樣品)中存在的量進(jìn)行比較，通過(guò)簡(jiǎn)單容易地計(jì)算得出。用檢測(cè)抗原、抗體的這樣的測(cè)定方法，例如關(guān)于ELISA，記載于Iacobelli等Breast Cancer Research and Treatment 11:19-30(1988)?；蛘呃?，在生物學(xué)樣品中的需檢測(cè)物質(zhì)例如抗體少的情況下(抗體效價(jià)低的情況下)、或者在血清等生物學(xué)樣品本身的非特異性結(jié)合多的情況下，非特異結(jié)合所致的背景信號(hào)的影響變大。因此，通過(guò)從測(cè)定值中適當(dāng)?shù)乜鄢尘靶盘?hào)，能夠更準(zhǔn)確地測(cè)定希望檢測(cè)的物質(zhì)?？鄢谋尘翱梢愿鶕?jù)實(shí)驗(yàn)體系由本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜判斷。例如，這樣的實(shí)施方式的例子有檢測(cè)血清中存在的針對(duì)膠原的抗體的“人/猴抗I 型以及II型膠原IgG抗體測(cè)定試劑盒”(Chondrex公司制)。使用該試劑盒時(shí)，從樣品測(cè)定值中扣除背景的值(不加血清、僅由第二抗體引起的測(cè)定值)來(lái)進(jìn)行計(jì)算。此外，對(duì)于諸如血清這樣的生物學(xué)樣品本身的非特異性結(jié)合多的情況，為了扣除由非特異反應(yīng)引起的背景，如實(shí)施例2中記載的那樣，采用下述實(shí)施方式是也有效的從通過(guò)tamavidin固定化有生物素化的SITH-I抗原(特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì))的承載體的測(cè)定值中扣除未固定化生物素化SITH-I抗原的區(qū)(但是在區(qū)中，承載體上固定化有 tamavidin，而且像固定化有SITH-I抗原的區(qū)那樣，用BSA等進(jìn)行封閉操作，并添加了包含抗SITH-I抗體(生物學(xué)樣品中的希望檢測(cè)的物質(zhì))的血清(生物學(xué)樣品)的區(qū))的測(cè)定值。此外，優(yōu)選地，通過(guò)扣除固相化有樣品所來(lái)源的生物(例如，對(duì)于SITH-I而言是人)不具有抗體的任意蛋白質(zhì)(并非限定，當(dāng)上述生物是哺乳類時(shí)可例舉如GFP(綠色熒光蛋白)等)的區(qū)的測(cè)定值，能夠更準(zhǔn)確地求出。作為固定化的方法，沒(méi)有特殊限制，優(yōu)選將該蛋白質(zhì)生物素化，藉由生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合固定化于固定化有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體上。諸如以上的計(jì)算方法可以根據(jù)生物學(xué)樣品的性質(zhì)、使用的抗體的特點(diǎn)等由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)、選擇。本發(fā)明的檢測(cè)方法優(yōu)選能夠特異性地檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)低的抗體。II.生物學(xué)樣品的稀釋劑此外，本發(fā)明提供用于對(duì)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的系統(tǒng)的、供稀釋生物學(xué)樣品用的試劑。本發(fā)明的稀釋劑包含1)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、或2)從通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。該稀釋劑是用于在對(duì)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的系統(tǒng)中，在將生物學(xué)樣品添加至通過(guò)生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間結(jié)合而結(jié)合有將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)的承載體上之前，對(duì)生物學(xué)樣品進(jìn)行稀釋的試劑。本發(fā)明的稀釋劑優(yōu)選根據(jù)結(jié)合于承載體的蛋白質(zhì)，即生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過(guò)程來(lái)選擇其組成。具體地，在對(duì)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的系統(tǒng)中，優(yōu)選利用與用于表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞。本發(fā)明的稀釋劑可以包含1)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法中，這能夠在步驟幻(b-i)的方式中使用?；蛘撸梢园?2)從通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。這能夠在步驟3) (b-ii)的實(shí)施方式中使用?！坝糜谙♂屔飳W(xué)樣品的試劑”可以是細(xì)胞破碎提取液(以及生物素結(jié)合性蛋白質(zhì))本身，或者可以是將細(xì)胞破碎提取液與生物學(xué)樣品一起進(jìn)一步稀釋的試劑，其中可以包含適當(dāng)?shù)木彌_液、市售的細(xì)胞稀釋液或者血清稀釋液等溶劑。III.試劑盒此外，本發(fā)明提供用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含A)通過(guò)生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間結(jié)合而結(jié)合有將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)的承載體；以及用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑，該試劑包含B-i)A)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或從與用于表達(dá)生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液、以及生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)；或者B-ii)從通過(guò)基因工程技術(shù)使與用于表達(dá)Α)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)而得到的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液?！坝糜谙♂屔飳W(xué)樣品的試劑”可以是細(xì)胞破碎提取液(以及生物素結(jié)合性蛋白質(zhì))本身，或者可以是將細(xì)胞破碎提取液與生物學(xué)樣品一起進(jìn)一步稀釋的試劑，其中包含適當(dāng)?shù)木彌_液、市售的細(xì)胞稀釋液或者血清稀釋液等溶劑。
實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，但這些并非是對(duì)本發(fā)明技術(shù)范圍的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本說(shuō)明書的記載能夠容易地對(duì)本發(fā)明加以修飾和變更，這些也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。在本說(shuō)明書中的實(shí)施例中，用大腸桿菌表達(dá)人皰疹病毒6(HHV_6)來(lái)源的SITH-I 蛋白與生物素化序列anvitrogen公司的Biofese標(biāo)簽)的融合蛋白，然后使由此獲得的大腸桿菌粗抽提液直接與tamavidin2(以下記作“TM2”)固定化微板反應(yīng)，通過(guò) tamavidin-生物素結(jié)合使融合蛋白結(jié)合于微板。使這樣得到的SITH-I蛋白質(zhì)結(jié)合平板與用大腸桿菌粗抽提液稀釋的人血清(含兔抗SITH-I抗體。市售的人血清中不含抗SITH-I抗體，因此在本試驗(yàn)中，將兔的抗SITH-I 抗體(抗血清)梯度稀釋后加入到市售的人血清中，用來(lái)作為被檢測(cè)物)進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定了人血清中所含的抗SITH-I抗體效價(jià)。實(shí)施例1 SITH-I與生物素化序列(BioEase標(biāo)簽)的融合蛋白質(zhì)表達(dá)用載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)了編碼在SITH-I蛋白質(zhì)的N末側(cè)配置Biofese標(biāo)簽而得到的融合蛋白質(zhì)的基因。該BioEase標(biāo)簽是包含能夠在生物內(nèi)(此時(shí)為大腸桿菌)被生物中的生物素化酶生物素化的序列的肽標(biāo)簽。Biofese-SITH-I融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示， 編碼堿基序列如SEQ ID NO 9所示。1-1.引物的設(shè)計(jì)為了構(gòu)建Biofese-SITH-I融合基因，首先設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增SITH-1基因的引物。 即，設(shè)計(jì)了由編碼SITH-I蛋白質(zhì)的N末端位點(diǎn)的DNA序列構(gòu)成的引物(SITHlNtermGW-F) 和由反向編碼SITH-I蛋白質(zhì)的C末端位點(diǎn)的DNA序列構(gòu)成的引物(SITHlCtermGW-R)。SITH-I與Biofese標(biāo)簽的融合基因構(gòu)建用引物總結(jié)于表1。[表1]SITH-I基因擴(kuò)增用引物
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟1)準(zhǔn)備結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體、以及將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)；2)藉由生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合使生物素化蛋白質(zhì)結(jié)合在步驟1)中準(zhǔn)備的承載體上，制作結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體；3)將(a)生物學(xué)樣品，以及(b-i)從與用于表達(dá)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液，和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，或者(b-ii)從通過(guò)基因工程技術(shù)使與用于表達(dá)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)而得到的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液混合并添加至步驟2)中制作的結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體；然后4)檢測(cè)特異性結(jié)合于生物素化蛋白質(zhì)的被檢物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟3(b-i)中，添加從包含任意載體的細(xì)胞提取得到的細(xì)胞破碎提取液作為細(xì)胞破碎提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)是 tamavidin或其突變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述生物學(xué)樣品選自血液、血清、腦脊液、唾液、咽拭子、汗、尿、淚液、淋巴液、精液、腹水和母乳。
5.一種用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑，該試劑包括1)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)；或2)從通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。
6.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的試劑盒，該試劑盒包含A)通過(guò)生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間結(jié)合而結(jié)合有將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)的承載體；以及用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑，所述用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑包含B-i)從與用于表達(dá)Α)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/ 或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液，和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，或者B-ii)從通過(guò)基因工程技術(shù)使與用于表達(dá)Α)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)而得到的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品中的物質(zhì)的方法、該方法中使用的承載體、以及試劑盒。該方法包括下述步驟1)準(zhǔn)備結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的承載體、以及將生物素結(jié)合在特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)上而成的生物素化蛋白質(zhì)；2)藉由生物素-生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)間的結(jié)合將生物素化蛋白質(zhì)結(jié)合在步驟1)中準(zhǔn)備的承載體上，制作結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體；3)將(a)生物學(xué)樣品，以及(b-i)從與用于表達(dá)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液、和生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)，或者(b-ii)從通過(guò)基因工程技術(shù)使與用于表達(dá)步驟1)的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)、特異性結(jié)合需檢測(cè)物質(zhì)的蛋白質(zhì)、和/或生物素化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞同種類的細(xì)胞表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)而得到的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液混合并添加至步驟2)中制作的結(jié)合有生物素化蛋白質(zhì)的承載體；然后4)檢測(cè)特異性結(jié)合于生物素化蛋白質(zhì)的被檢物質(zhì)。
文檔編號(hào)C07K17/00GK102439446SQ201080015608
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者岡直美, 近藤一博, 高倉(cāng)由光 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社