專利名稱：對(duì)IL12受體β亞基特異的治療性抗體的組合物和方法
對(duì)IL12受體β亞基特異的治療性抗體的組合物和方法本發(fā)明涉及與IL12Ri3 1(異二聚IL12受體(連同IL12Ri3 2鏈)的非信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈)以及IL23受體(連同IL23Ra鏈)特異結(jié)合的抗體。本發(fā)明更具體地涉及能抑制血細(xì)胞IL12/IL18誘導(dǎo)的IFN γ產(chǎn)生的，是IL12和IL23受體拮抗劑的特異性抗體，以及將所述抗體用于治療可以通過抑制IFNy產(chǎn)生來治療的病理疾病的組合物和方法，所述病理疾病例如為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病或炎性腸病或者其他自身免疫和炎癥疾病。已知IL12受體β 1 (IL12Ri3 1)鏈為治療Thl/Thl7介導(dǎo)的疾病例如銀屑病和其他自身免疫和炎癥疾病的潛在治療靶。銀屑病是以表皮層的過度增殖以及樹突細(xì)胞和T細(xì)胞的明顯浸潤為特征的常見慢性炎癥皮膚疾病。T細(xì)胞在發(fā)生于皮膚中的病理反應(yīng)中通過分泌1型細(xì)胞因子(誘導(dǎo)性IFN-γ和TNF-α)起關(guān)鍵作用，并且所述1型細(xì)胞因子誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞過度增殖、血管發(fā)生和嗜中性粒細(xì)胞浸潤。認(rèn)為在銀屑病中對(duì)產(chǎn)生Thl免疫應(yīng)答重要的兩個(gè)細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素 12(IL12)和白細(xì)胞介素23(IL23)。兩個(gè)細(xì)胞因子都由抗原呈遞細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞產(chǎn)生，并且其功能為活化T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。IL12和IL23是可溶性細(xì)胞因子的異二聚家族成員，所述可溶性細(xì)胞因子在IL12的情況中包含p35/p40蛋白質(zhì)亞基，并且在 IL23的情況中包含pl9/p40蛋白質(zhì)亞基。任一細(xì)胞因子的IL12p40亞基與在免疫細(xì)胞的表面上發(fā)現(xiàn)的跨膜IL12受體β l(IL12Ri3 1)結(jié)合。破壞IL12p40/IL12Rβ 1相互作用可以阻止IL12和IL23 二者的生物學(xué)活性。幾種炎癥和自身免疫疾病包括銀屑病都與加劇的Thl和/或Thl7應(yīng)答有關(guān)。目前，許多炎癥和自身免疫疾病都用一般的免疫抑制劑或者非常選擇性起作用的生物制劑例如抗TNF-α抗體治療，其并非在所有患者中都有效。發(fā)現(xiàn)這些藥劑增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)，并且在重復(fù)治療后會(huì)變得無效。因此，對(duì)于具有增加的安全性并同時(shí)能誘導(dǎo)長期緩解或治愈疾病能力的治療，還存在未滿足的醫(yī)學(xué)需求。即使在轉(zhuǎn)移了誘導(dǎo)銀屑病樣疾病的T細(xì)胞亞集后施用時(shí)，IL12p40的中和抗體也在小鼠中成功地消除了銀屑病病變(Hong等人，J. Immunol. 162. 12 (1999) 7480-91)。靶向IL12和IL23 二者的抗IL12p40抗體目前已用于銀屑病(Kauffman等人 J. Invest Dermatol. 123. 6(2004) :1037-44, Papp 等人 Lancet. 371. 9625(2008) 1675-84，Kimball 等人 Arch. Dermatol. 144. 2(2008) :200-07)、Crohns 病((Sandborn 等人，Gastroenterology. 135. 4 (2008) 1130-41)和多發(fā)性硬化(Segal 等人，Lancet Neurol. 7. 9 (2008) :796-804))的臨床試驗(yàn)中。靶向IL12R3 1并因此分化和維持Thl和 Thl7細(xì)胞群體，以及由這些細(xì)胞所產(chǎn)生的IL12和IL23介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子，提供了改進(jìn)治療劑的可能性。美國專利6，046，012 一般地涉及與抗IL12R^ 1結(jié)合的IL12R^ 1和抗體。Becton Dickinson也商品化了抗小鼠IL12R0 1單克隆抗體(目錄號(hào)551455)。然而，到目前為止，本領(lǐng)域還沒有將顯示出IL12Ri3 1拮抗活性的人IL12Ri3 1的結(jié)合分子用于治療自身免疫疾病和炎癥疾病，例如銀屑病或Crohns病的描述。僅只有通過靶向各個(gè)相互作用配偶體(IL12p40)的間接證據(jù)證實(shí)了該途徑是有效的。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗體或包含所述抗體的針對(duì)IL12Ri3 1多肽(SEQ ID NO 41)中靶標(biāo)的抗原結(jié)合部分的結(jié)合蛋白質(zhì)，其特征在于所述抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)特異地結(jié)合IL12Ri3 1多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體來自例如人類或駱駝來源的哺乳動(dòng)物，或者其是人源化抗體。在特定的實(shí)施方案中，抗IL12Ri3 1抗體的特征在于其具有對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)IL12Ri3 1特異的并與IL12Ri3 1或IL12Ri3 1的片段結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體是不具有或具有低激動(dòng)活性的IL12Ri3 1 拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，抗體結(jié)合靶蛋白質(zhì)IL12Ri3 1并在人血細(xì)胞中抑制IL12依賴性的IFN-Y產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制IL12和IL23與IL12Ri3 1結(jié)合。更優(yōu)選地，抗體是不具有激動(dòng)活性的ILURii 1拮抗劑。可以通過一種或多種測(cè)定法測(cè)量結(jié)合，所述測(cè)定法用于測(cè)量通過抗體產(chǎn)生的活性是拮抗作用還是激動(dòng)作用。優(yōu)選地，測(cè)定法測(cè)量抗體對(duì)IL12Ri3 1的至少一種作用，其包括 人血細(xì)胞中IL12依賴性的IFN-Y產(chǎn)生、人血細(xì)胞中IL23/IL17依賴性的IFN-γ產(chǎn)生、靈長類動(dòng)物血細(xì)胞中IL12離體IFN-Y產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合IL12Ri3 1的共同IL12/IL23p40配體結(jié)合區(qū)的抗體。根據(jù)另一個(gè)特定的實(shí)施方案，抗體以IOOnM或更小、IOnM或更小、InM或更小的Kd 與IL12RM結(jié)合，并如在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法中所測(cè)量的，以大約IOnM或更小、InM或更小、IOOpM或更小的IC5tl抑制IL12和IL23與IL12R3 1多肽的結(jié)合。在另一個(gè)備選的實(shí)施方案中，抗體特異地結(jié)合IL12Ri3 1，并如在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法中所測(cè)量的，以約IOnM或更小、InM或更小、IOOpM或更小的IC5tl選擇性抑制IL12與 IL12R^ 1多肽結(jié)合，而不抑制IL23與IL12R0 1多肽結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中個(gè)，抗體以約IOnM或更小、InM或更小、IOOpM或更小的IC5tl 抑制人血細(xì)胞中IL12依賴性的IFNy產(chǎn)生。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，與未治療的對(duì)照動(dòng)物比較，抗體能在IBD小鼠模型中緩解疾病。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，在用單劑量治療的獼猴(cynomolgous monkey) 的外周血單核細(xì)胞中，抗體能完全阻斷IFNy應(yīng)答更長的時(shí)間。在H(/PD研究中，10yg/ml 以上的抗IL12Ri3 ImAb血漿水平導(dǎo)致了離體IL12誘導(dǎo)的IFNy產(chǎn)生的完全抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體阻斷了 IL12Ri3 1與其亞基IL12Ri3 2和/或IL23R的異二聚化。在一些特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不與至少一種其他細(xì)胞因子受體交叉反應(yīng)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不與人IL4Rci受體交叉反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體至少與嚙齒動(dòng)物或靈長類動(dòng)物IL12Ri3 1受體交叉反應(yīng)。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體是不具有抗體依賴性細(xì)胞毒作用 (ADCC)活性的完全人IgG4抗體或人源化IgG4抗體或者沉默突變的IgGl抗體，并且其以約 IOnM或更小、InM或更小、IOOpM或更小的IC5tl抑制人血細(xì)胞中IL12依賴性的IFNy產(chǎn)生。本發(fā)明也涉及包含針對(duì)IL12Ri3 1多肽(SEQ ID NO 41)中靶標(biāo)的所述抗體的抗原結(jié)合部分的結(jié)合蛋白質(zhì)，其中所述抗原結(jié)合部分是聚乙二醇化的。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，聚乙二醇化抗原結(jié)合部分是聚乙二醇化!^b。本發(fā)明涉及分離的抗體，特別是人抗體或人源化抗體，其抑制IL12和IL23與 IL12Ri3 1結(jié)合，并在人血細(xì)胞中抑制IL12依賴性的IFNy產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體衍生自特定的重鏈和輕鏈序列和/或包含特定的結(jié)構(gòu)特征例如含有特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供了分離的抗體，制備此類抗體的方法、包含此類抗體的免疫綴合物和多價(jià)或多特異性分子，以及含有抗體的藥物組合物、本發(fā)明的免疫綴合物或雙特異性分子。本發(fā)明也涉及使用抗體抑制(即拮抗)IL12Ri3 1的功能的方法，以抑制受IL12、IL23 和/或IL12Ri3 1調(diào)節(jié)的疾病或病癥的發(fā)生，例如，其導(dǎo)致由IL12Ri3 1介導(dǎo)的或者可以通過抑制血細(xì)胞中IFNy產(chǎn)生來治療的病理疾病的治療；例如，Thl/Thl7介導(dǎo)的疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和炎性腸病。為了使本發(fā)明更易于理解，首先定義了一些術(shù)語。其他定義在詳細(xì)描述中描述。術(shù)語“免疫應(yīng)答”指例如，淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，其導(dǎo)致選擇性損害、破壞或從人體清除侵入性病原體、受病原體感染的細(xì)胞或組織、癌性細(xì)胞，或者(在自身免疫或病理炎癥的情況下)正常人細(xì)胞或組織?！靶盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”或“信號(hào)活性”指通常由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用例如生長因子與受體的結(jié)合引發(fā)的生物化學(xué)因果關(guān)系，其導(dǎo)致信號(hào)從細(xì)胞的一部分傳遞到細(xì)胞的另一部分?？偠灾瑐鬟f涉及在引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一系列反應(yīng)中，在一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)上，一個(gè)或多個(gè)酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基的特異磷酸化。次末過程一般包括核事件，其導(dǎo)致基因表達(dá)的改變。術(shù)語IL12R3 1或IL12受體β 1指如在SEQ ID NO 41中所定義的人IL12R3 1。本文涉及的術(shù)語“抗體”包括完整抗體和其任何抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié)合部分”)或單鏈。包含抗體的抗原結(jié)合部分的結(jié)合蛋白質(zhì)意在被術(shù)語“抗體”包括。特別地， 術(shù)語“與IL12Ri3 1結(jié)合的抗體”意在包括包含抗體的IL12Ri3 1結(jié)合部分的IL12Ri3 1結(jié)合
蛋白質(zhì)。天然存在的“抗體”是糖蛋白，其包含通過二硫鍵連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中簡(jiǎn)寫和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中簡(jiǎn)寫為Vj和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域Q?？梢詫1^nt進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱作互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)，其散布在更保守的稱作構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域中。每個(gè)V1^Pt由三個(gè)CDR和四個(gè)FR 組成，它們從氨基末端到羧基末端以下面的順序排列FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。 重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞) 和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。如本文中所用，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)單地“抗原部分”)指抗體的全長或者一個(gè)或多個(gè)片段，其保留特異結(jié)合抗原(例如，IL12Ri3 1的一部分)的能力。已經(jīng)表明抗體的抗原結(jié)合功能可以通過全長抗體的片段執(zhí)行。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包括的結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段、由八、Vh、(^和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab)2片段、 包含通過二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；由V1^PCHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體的單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341 :544-546)；和分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域\和Vh由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以用重組方法通過合成接頭連接，所述接頭使得它們成為一條蛋白質(zhì)鏈，其中\(zhòng)和Vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱作單鏈 Fv(scFv)；見例如，Bird 等人，1988 Science 242 :423-426 ；和 Huston 等人，1988Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :5879-5883)。此類單鏈抗體意在被術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”包括。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)得到這些抗體片段，并且以與完整抗體相同的方式篩選所述片段的效用。如本文中所用，“分離的抗體”指抗體，其基本上沒有具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，特異結(jié)合IL12Ri3 1的分離的抗體基本上無特異結(jié)合不同于IL12Ri3 1的其他抗原的抗體)。然而，特異結(jié)合IL12Ri3 1的分離的抗體可以與其他抗原，如來自其他物種的 IL12Ri3 1分子具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上無其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)
P
ΡΠ O如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物顯示出對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。如本文中所用，術(shù)語“人抗體”意在包括具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)二者都來自人來源的序列的可變區(qū)的抗體。此外，如果抗體含有恒定區(qū)，那么該恒定區(qū)也來自該人類序列， 例如，人種系序列、或人種系序列的突變形式，或者來自含有來自人構(gòu)架序列分析的共有構(gòu)架序列的抗體，例如，如在Knappik，等人(2000. J Mol Biol 296,57-86)中所述。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過在體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。然而，如本文所用的術(shù)語“人抗體” 不意在包括這樣的抗體，其中來自另一哺乳動(dòng)物物種如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人構(gòu)架序列上。術(shù)語“人單克隆抗體”指顯示出單結(jié)合特異性的抗體，其具有可變區(qū)，其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都來自人序列。如本文所用的術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，如從對(duì)于人免疫球蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如，小鼠)或從其制備的雜交瘤分離的抗體，從被轉(zhuǎn)化而表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞分離的抗體，例如，從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，從重組的組合人抗體文庫分離的抗體，和通過涉及將人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接成其他DNA序列的任何其他手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此類重組人抗體具有可變區(qū)，其中構(gòu)架和CDR區(qū)來自人種系免疫球蛋白序列。然而，在一些實(shí)施方案中，此類重組人抗體可以進(jìn)行體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且從而重組抗體的Vh和\區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，其盡管來自并且涉及人種系％和\序列，但是可以不天然在體內(nèi)存在于人抗體種系所有組成成分。如本文中所用，“同種型”指通過重鏈恒定區(qū)基因分類的抗體類別(例如，IgM、IgE、 IgG 如 IgGl 或 IgG4)。短語“識(shí)別抗原的抗體”和“對(duì)抗原特異的抗體”在本文中與術(shù)語“特異結(jié)合抗原的抗體”可互換使用。如本文中所用，“特異結(jié)合人IL12Ri3 1多肽”的抗體意指以IOOnM或更小、IOnM或更小、InM或更小的Kd結(jié)合人IL12Ri3 1多肽的抗體?！芭c不同于人IL12Ri3 1的抗原交叉反應(yīng)”的抗體意指以0. 5x10-8M或更小、5X10_9M或更小、2X 10_9M或更小的Kd結(jié)合該抗原的抗體。“不與特定抗原交叉反應(yīng)”的抗體意指以1. 或更大，或5-lOx 10_1或& IO^7M 或更大的Kd結(jié)合該抗原的抗體。在一些實(shí)施方案中，不與所述抗原交叉反應(yīng)的此類抗體在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定中顯示出對(duì)于這些蛋白質(zhì)的基本上檢測(cè)不到的結(jié)合。如本文中所用，術(shù)語“拮抗劑”意指在人血細(xì)胞中的人細(xì)胞測(cè)定法例如IL12依賴性的IFNy產(chǎn)生測(cè)定法中IL12存在的情況下，抑制IL12Ri3 1誘導(dǎo)的信號(hào)活性的抗體。在以下的實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了人血細(xì)胞中IL12依賴性的IFNy產(chǎn)生測(cè)定法和人血細(xì)胞中幾23依賴性的正^^產(chǎn)生測(cè)定法的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，如在人血細(xì)胞測(cè)定法中所測(cè)量，抗體以IOnM或更小、InM或更小、IOOpM或更小的IC5tl抑制IFNy產(chǎn)生。如本文中所用，具有“無激動(dòng)活性”的抗體意指在基于細(xì)胞的測(cè)定法，例如人血細(xì)胞IFNy產(chǎn)生測(cè)定法中IL12不存在的情況下，并不顯著增加IL12Ri3 1介導(dǎo)的信號(hào)活性的抗體。在以下的實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了此類測(cè)定法。如本文中所用，抑制IL12和IL23與IL12Ri3 1多肽結(jié)合的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)意指如在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法例如Bioveris 測(cè)定法中所測(cè)量，以IOnM或更小的EC5tl，優(yōu)選地以InM或更小的EC5tl，更優(yōu)選地以IOOpM或更小的EC5tl抑制IL12和IL23與IL12R3 1多肽結(jié)合的抗體。在以下的實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了此類測(cè)定法。如本文中所用，抑制靈長類動(dòng)物血細(xì)胞中IL12離體IFNy產(chǎn)生的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)意指以10yg/ml以上的抗IL12Ri3 1 mAb血漿水平，降低IL12離體IFN γ產(chǎn)生水平至對(duì)照水平10%以下的抗體。在一些實(shí)施方案中，其指在具有10 μ g/ml以上的抗IL12Ri3 1 mAb 血漿水平的靈長類血細(xì)胞中，完全終止IL12離體IFNy產(chǎn)生的抗體。在以下的實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了此類測(cè)定法。如本文中所用，術(shù)語"Kass。?！被颉癒a”意指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而如本文中所用，術(shù)語"Kdis”或“KD”意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文中所用，術(shù)語“K/意指解離常數(shù)，其從Kd與Ka的比(即Kd/Ka)得到并且表達(dá)為摩爾濃度(M)。 可以使用本領(lǐng)域成熟的方法測(cè)定抗體的Kd值。用于測(cè)定抗體Kd的方法是通過使用表面等離振子共振，或者使用生物傳感器系統(tǒng)，如Biacore 系統(tǒng)。如本文中所用，術(shù)語“親和性”指在單一抗原位點(diǎn)，抗體和抗原之間相互作用的強(qiáng)度。在每一抗原位點(diǎn)內(nèi)，抗體“臂”的可變區(qū)通過弱非共價(jià)作用力與抗原在多個(gè)位點(diǎn)相互作用；相互作用越多，親和性越強(qiáng)。如本文中所用，術(shù)語“親和力”指抗體-抗原復(fù)合物的整體穩(wěn)定性或強(qiáng)度的信息性測(cè)量。其受三個(gè)主要因素控制抗體表位親和性；抗原和抗體二者的效價(jià)；和相互作用部分的結(jié)構(gòu)重排。這些因素最終定義了抗體的特異性，即，特定的抗體結(jié)合精確的抗原表位的可能性。為了得到更高親和力的探針，可以構(gòu)建二聚綴合物(與FACS標(biāo)志物偶聯(lián)的兩個(gè)抗體蛋白質(zhì)分子)，從而制備更容易被FACS檢測(cè)的低親和性相互作用(例如與種系抗體相互作用)。此外，增加抗原結(jié)合親和力的另一手段涉及產(chǎn)生抗IL12Ri3 1抗體的任一本文中所述的構(gòu)建體的二聚體、三聚體或多聚體。可以通過例如模仿天然的C末端與NF末端結(jié)合或者通過模仿借助其恒定區(qū)結(jié)合在一起的抗體二聚體，經(jīng)各個(gè)組件之間共價(jià)結(jié)合來產(chǎn)生此類多聚體。改造成Fc/Fc界面的鍵可以是共價(jià)的或者非公價(jià)的。此外，在IL12Ri3 1雜交中可以使用非Fc的二聚化或多聚化配偶體，以產(chǎn)生此類更高級(jí)的結(jié)構(gòu)。例如，可使用的多聚化結(jié)構(gòu)域如三聚化結(jié)構(gòu)域描述于Borean (W02004039841)。如本文中所用，術(shù)語“選擇性”對(duì)于抗體而言指與確定的目標(biāo)多肽而非密切相關(guān)的多肽結(jié)合的抗體。如本文中所用，術(shù)語“高親和性”對(duì)于抗體而言指與目標(biāo)抗原具有InM或更小的Kd 的抗體。如本文中所用，術(shù)語“受試者”包括任一人類或非人類動(dòng)物。術(shù)語“非人類動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人類靈長類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。如本文中所用，術(shù)語“優(yōu)化的”意為核苷酸序列已經(jīng)用在生產(chǎn)細(xì)胞或生物中優(yōu)選的密碼子改變以編碼氨基酸序列，生產(chǎn)細(xì)胞或生物一般為真核細(xì)胞例如畢赤酵母屬(Pichia) 的細(xì)胞、木霉屬(Trichoderma)的細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或人細(xì)胞。改造優(yōu)化的核苷酸序列以完全地或者盡可能多地保留由起始核苷酸序列原始編碼的氨基酸序列，其也已知為“親本”序列。本文中已經(jīng)改造了優(yōu)化的序列，其具有在CHO哺乳動(dòng)物細(xì)胞中優(yōu)選的密碼子；然而，本文中也考慮了在其他真核細(xì)胞中這些序列的優(yōu)化表達(dá)。將由優(yōu)化的核苷酸序列編碼的氨基酸序列也稱為優(yōu)化的。用于評(píng)估抗體對(duì)多種物種IL12Ri3 1的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的， 包括例如，ELISA、蛋白質(zhì)印跡和RIA。合適的測(cè)定法在實(shí)施例中詳述。也可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法，如通過Biacore分析評(píng)估抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如，結(jié)合親和性)。用于評(píng)估抗體對(duì)IL12Ri3 1的功能性質(zhì)(例如，受體結(jié)合、IL12或IL23配體結(jié)合的抑制、抑制 IL12誘導(dǎo)的IFNy產(chǎn)生)的影響的測(cè)定法在實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)描述。因此，如通過本領(lǐng)域已知的和本文所述的方法測(cè)定的“抑制”這些IL12Ri3 1功能性質(zhì)(例如，生物化學(xué)、免疫化學(xué)、細(xì)胞的、生理的或其他生物活性等等)一種或多種的抗體將被理解為涉及相對(duì)于不存在所述抗體時(shí)(例如，或者當(dāng)存在不相關(guān)特異性的對(duì)照抗體時(shí))具體活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低。抑制IL12Ri3 1活性的抗體實(shí)現(xiàn)所測(cè)量參數(shù)的這種統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著減少至少10 %，至少50 %、80 %或90 %，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體抑制 IL12R^ 1功能活性大于95%、98%或99%。術(shù)語“交叉阻斷”、“經(jīng)交叉阻斷的”和“交叉阻斷的”在本文中互換地用于指在標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法中，抗體或其他結(jié)合劑干擾其他抗體或結(jié)合劑與IL12Ri3 1結(jié)合的能力。可以使用標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法測(cè)定抗體或其他結(jié)合劑干擾另一抗體或結(jié)合分子與IL12Ri3 1結(jié)合的能力或程度，并從而測(cè)定其是否可以稱作為根據(jù)本發(fā)明的交叉阻斷。一種合適的測(cè)定法涉及Biacore技術(shù)(例如，通過使用BIAcore 3000儀器(Biacore， Uppsala，瑞典))的用途，其使用表面等離振子共振技術(shù)測(cè)量相互作用的程度。用于測(cè)量交叉阻斷的另一測(cè)定法使用基于ELISA的方法。在實(shí)施例中給出了這些方法的進(jìn)一步詳細(xì)說明。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的交叉封閉抗體或其他結(jié)合劑在所述BIAcore交叉阻斷測(cè)定法中與IL12Ri3 1結(jié)合，使得抗體或結(jié)合劑的組合物(混合物)的記錄結(jié)合在最大理論結(jié)合的80%至0. 之間(例如80%至4%)，特別地在最大理論結(jié)合的75%至0. 之間(例如75%至4% )，和更特別地在70%至0. 之間(例如70%至4% )，和更特別地在組合的兩個(gè)抗體或結(jié)合劑的最大理論結(jié)合(如上所定義)的65%至0. 之間(例如65%至 4% )。與在不存在溶液相抗IL12Ri3 1抗體的情況下獲得的抗IL12Ri3 1檢測(cè)信號(hào)(即陽性對(duì)照孔)比較，如果溶液相抗IL12Ri3 1抗體能引起IL12Ri3 1檢測(cè)信號(hào)(即被包被的抗體結(jié)合的IL12Ri3 1的量)在60%至100%之間，特別地在70%至100%之間，和更特別地在80%至100%之間的降低，那么如在實(shí)施例中所述，在ELISA測(cè)定法中將抗體定義為交叉阻斷。重組抗體本發(fā)明的抗體包括如在實(shí)施例中所述的分離的和結(jié)構(gòu)表征的人重組抗體。根據(jù)本發(fā)明分離的抗體的Vh氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:29-32。本發(fā)明分離的抗體的\氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO :25- 。本發(fā)明的其他抗體包括已經(jīng)通過氨基酸缺失、插入或替換而突變，然而在⑶R區(qū)中與上述序列中描述的⑶R區(qū)具有至少60、70、80、90或95%同一性的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，其包括這樣的突變氨基酸序列，其中當(dāng)與上述序列中所述的⑶R區(qū)比較時(shí)，通過⑶R區(qū)中氨基酸缺失、插入或替換，已經(jīng)突變了不超過1、2、3、4或 5個(gè)氨基酸?？勺兊妮p鏈核苷酸序列顯示于SEQ ID NO 33-36.可變的重鏈核苷酸序列顯示于 SEQ ID NO 37-40。編碼本發(fā)明抗體的其他核酸包括已經(jīng)突變，然而與上述序列具有至少 60、70、80、90或95%同一性的核酸。在一些實(shí)施方案中，其包括這樣的變體核酸，其中當(dāng)與上述序列中所述的可變區(qū)比較時(shí)，通過可變區(qū)中核苷酸缺失、插入或替換，已經(jīng)改變了不超過1、2、3、4或5個(gè)核苷酸。對(duì)于與相同表位結(jié)合的抗體，可以將VH、\、全長輕鏈和全長重鏈序列(核苷酸序列和氨基酸序列)“混合和匹配”以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗IL12Ri3 1結(jié)合分子。可以使用上述和實(shí)施例中所述的結(jié)合測(cè)定法(例如，ELISA)測(cè)試此類“混合和匹配的”抗體的IL12Ri3 1 結(jié)合。當(dāng)這些鏈被混合和匹配時(shí)，來自具體VH/\配對(duì)的Vh序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的Vh序列置換。同樣，來自具體全長重鏈/全長輕鏈配對(duì)的全長重鏈序列應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上相似的全長重鏈序列置換。同樣，來自具體配對(duì)的\序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的\序列置換。 同樣，來自具體全長重鏈/全長輕鏈配對(duì)的全長輕鏈序列應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上相似的全長輕鏈序列置換。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的重組抗體，其具有包含選自SEQ ID NO 29-32的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；包含選自SEQ ID NO 25-28的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異結(jié)合IL12R3 1。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的重組抗體，其具有包含選自SEQ ID NO :29-32 的Vh氨基酸序列的全長重鏈；和包含選自SEQ ID NO :25-28的\氨基酸序列的全長輕鏈； 其中該抗體特異結(jié)合IL12Ri3 1。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的重組抗體，其具有由包含選自SEQ ID NO 37-40的序列的核苷酸序列編碼的全長重鏈；和由包含選自SEQ ID NO :33-36的序列的核苷酸序列編碼的全長輕鏈；其中該抗體特異結(jié)合IL12Ri3 1。根據(jù)本發(fā)明的抗體的Vh⑶Rl的氨基酸序列的實(shí)例顯示于SEQ ID NO :1_4。根據(jù)本發(fā)明的抗體CDR2的氨基酸序列的實(shí)例顯示于SEQ ID NO :5_8。根據(jù)本發(fā)明的抗體 WVh⑶R3的氨基酸序列的實(shí)例顯示于SEQ ID N0:8-12。根據(jù)本發(fā)明的抗體的八⑶Rl的氨基酸序列的實(shí)例顯示于SEQ ID N0:13-16。根據(jù)本發(fā)明的抗體的\⑶R2的氨基酸序列的實(shí)例顯示于SEQ ID N0:17-20。根據(jù)本發(fā)明的抗體的\⑶R3的氨基酸序列的實(shí)例顯示于 SEQ ID NO :21-24ο 使用 Kabat 系統(tǒng)描述 CDR 區(qū)(Kabat，Ε. A.，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。考慮到這些抗體的每一種可以結(jié)合IL12Ri3 1并且抗原結(jié)合特異性主要通過 CDRU2和3區(qū)提供，可以將Vh CDRU2和3序列與Vl CDRU2和3序列“混合和匹配”(即， 來自不同抗體的⑶R可以被混合和匹配，含有Vh⑶Rl、2和3和Vl⑶Rl、2和3的每個(gè)抗體產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗IL12Ri3 1結(jié)合分子?？梢允褂蒙衔暮蛯?shí)施例中描述的結(jié)合測(cè)定法 (例如，ELISA)測(cè)試此類“混合和匹配的”抗體的IL12Ri3 1結(jié)合。當(dāng)混合和匹配Vh⑶R序列時(shí)，來自具體Vh序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的⑶R序列置換。 同樣，當(dāng)混合和匹配VfDR序列時(shí)，來自具體八序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列置換。技術(shù)人員將容易顯而易見的是，通過用來自本文所示本發(fā)明單克隆抗體的CDR序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列替代一個(gè)或多個(gè)V1^n /或\ CDR序列，可以產(chǎn)生新的Vh和Vl序列。分離的重組抗體，或者其抗原結(jié)合部分具有包含選自SEQ ID NO :1_4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；包含SEQ ID NO :5_8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R2 ；包含選自 SEQ ID NO :9-12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ；包含選自SEQ ID NO 13-16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ；包含選自SEQ ID NO 17-20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；包含選自SEQ ID NO 21-24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R3 ；其中該抗體特異結(jié)合IL12R3 1。在一些實(shí)施方案中，抗體包含SEQ ID NO 1的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；SEQ ID NO 5的重鏈可變區(qū)CDR2 ；SEQ ID NO :9的重鏈可變區(qū)CDR3 ；SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)CDRl ；SEQ ID NO 17的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和SEQ ID NO 21的輕鏈可變區(qū)⑶R3。在一些實(shí)施方案中，抗體包含SEQ ID NO 2的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；SEQ ID NO 6的重鏈可變區(qū)⑶R2 ；SEQ ID NO 10的重鏈可變區(qū)⑶R3 ；SEQ ID NO 14的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； SEQ ID NO 18的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和SEQ ID NO 22的輕鏈可變區(qū)CDR3。在一些實(shí)施方案中，抗體包含SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)CDR2 ；SEQ ID NO 11的重鏈可變區(qū)CDR3 ；SEQ ID NO 15的輕鏈可變區(qū)CDRl ； SEQ ID NO 19的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和SEQ ID NO 23的輕鏈可變區(qū)CDR3。在一些實(shí)施方案中，抗體包含SEQ ID NO 4的重鏈可變區(qū)CDRl ；SEQ ID NO 8的重鏈可變區(qū)CDR2 ；SEQ ID NO 12的重鏈可變區(qū)CDR3 ；SEQ ID NO 16的輕鏈可變區(qū)CDRl ； SEQ ID NO 20的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和SEQ ID NO 24的輕鏈可變區(qū)⑶R3。如本文中所用，人抗體包含重鏈或輕鏈可變區(qū)或全長重或輕鏈，如果該抗體的可變區(qū)或全長鏈從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)得到，那么所述可變區(qū)或全長鏈?zhǔn)翘囟ǚN系序列的“產(chǎn)物”或“來自”該特定種系序列。此類系統(tǒng)包括用目的抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或者用目的抗原篩選在噬菌體上展示的人免疫球蛋白基因文庫。 為人種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或者“來自”所述序列的人抗體可以如下鑒定通過比較人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列并選則在序列上與人抗體的序列最接近(即，最大的％同一性)的人種系免疫球蛋白序列。為具體的人種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或者“來自，，所述序列的人抗體可以由于例如天然存在的體細(xì)胞突變或者有意引入定點(diǎn)誘變而與種系序列相比含有氨基酸差異。然而，所選的人抗體通常與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90%同一性并且含有這樣的氨基酸殘基，當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠種系序列)比較時(shí)，所述氨基酸殘基將所述抗體鑒定為人的抗體。在一些情況中，人抗體可以在氨基酸序列上與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%、或至少95%、或甚至至少96%、 97%、98%、或99%同一性。通常，來自具體人種系序列的人抗體將顯示出與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不超過10個(gè)氨基酸差異。在一些情況中，人抗體可以顯示出與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不超過5個(gè)，或甚至不超過4、3、2或1個(gè)氨基酸差
已同源抗體在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有全長重鏈和輕鏈氨基酸序列；全長重鏈和輕鏈核苷酸序列、可變區(qū)重鏈和輕鏈核苷酸序列或可變區(qū)重鏈和輕鏈氨基酸序列，其與本文所述抗體的氨基酸和核苷酸序列同源，并且其中所述抗體保留本發(fā)明的抗IL12Ri3 1 抗體的所希望的功能性質(zhì)。例如，本發(fā)明提供了包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離的重組抗體(或包含其抗原結(jié)合部分的結(jié)合蛋白質(zhì))，其中重鏈可變區(qū)與選自SEQ ID NO :29-32的氨基酸序列至少80%或至少90%的同一性；輕鏈可變區(qū)與選自SEQ ID NO :25- 的氨基酸序列至少80% 或至少90%的同一性；所述抗體特異結(jié)合IL12Ri3 1，并且該抗體顯示出至少一種下面的功能性質(zhì)其抑制IL12和IL23與ILURβ 1的結(jié)合，其抑制人血細(xì)胞中IL12依賴性的IFNy 產(chǎn)生，其抑制人血細(xì)胞中IL23依賴性的IFNy產(chǎn)生或者其抑制靈長類動(dòng)物血細(xì)胞中IL12 離體IFNy產(chǎn)生。在另一實(shí)例中，本發(fā)明提供了包含全長重鏈和全長輕鏈的分離的重組抗體，其中 重鏈可變區(qū)由與選自SEQ ID NO 37-40的核苷酸序列至少80%或至少90%的同一性的核苷酸序列編碼；輕鏈可變區(qū)由與選自SEQ ID NO :33-36的核苷酸序列至少80%或至少90% 的同一性的核苷酸序列編碼；所述抗體特異結(jié)合IL12Ri3 1，并且該抗體顯示出至少一種下面的功能性質(zhì)其抑制IL12和IL23與IL12Ri3 1的結(jié)合，其抑制人血細(xì)胞中IL12依賴性的 IFNy產(chǎn)生，其抑制人血細(xì)胞中IL23依賴性的IFNy產(chǎn)生或者其抑制靈長類動(dòng)物血細(xì)胞中 IL12離體IFNy產(chǎn)生。在多種實(shí)施方案中，抗體可以顯示出上面討論的功能性質(zhì)的一種或多種、兩種或多種、三種或多種或者四種。該抗體可以是例如，人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。優(yōu)選地， 抗體是完全人沉默IgGl抗體。在其他實(shí)施方案中，￥11和/或\氨基酸序列可以與上面給出的序列50%、60(%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在其他實(shí)施方案中，除在不超過1、 2、3、4或5個(gè)氨基酸位置中的氨基酸替換外，Vh和/或\氨基酸序列可以是同一的。具有分別與SEQ ID NO 29-32和SEQ ID N025-28的Vh和Vl區(qū)有高(例如，80%或更高)同一性的Vh和\區(qū)的抗體可以如下得到誘變(例如，定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)分別編碼 SEQ ID NO :37-40和33-36的核酸分子，接著使用本文討論的功能測(cè)定法對(duì)所編碼的經(jīng)改變抗體測(cè)試保留的功能(即，上文給出的功能)。
如本文中所用，兩個(gè)序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)是這兩個(gè)序列共有的相同位置數(shù)目的函數(shù)(即，％同一性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)X100)，考慮缺口數(shù)、每個(gè)缺口的長度，它們被引入以進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳比對(duì)?？梢允褂萌缦滤龅臄?shù)學(xué)算法完成序列的比較和兩個(gè)序列之間同一性百分?jǐn)?shù)的確定?？梢允褂肊.Meyers 和 W. Miller (Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17,1988)的算法， 使用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4，確定兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)，該算法已經(jīng)被整合到ALIGN程序(版本2.0)中。此外，可以使用整合到GCG 軟件包(可以在 http //www, gcg. com 得到)的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol， Biol. 48 :444-453,1970)算法，使用 Blossom 62 矩陣或 PAM250 矩陣，和缺口權(quán)重 16、14、 12、10、8、6或4和長度權(quán)重1、2、3、4、5或6確定兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。具有保守修飾的抗體在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列輕鏈可變區(qū)，其中這些⑶R序列的一個(gè)或多個(gè)具有基于本文所述抗體或者其保守修飾的特定氨基酸序列，并且其中所述抗體保留本發(fā)明的抗IL12Ri3 1 抗體的所需功能性質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了包含抗原結(jié)合部分的分離的重組抗體，其組成為；包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)CDRl氨基酸序列選自SEQ ID NO :1_4和其保守修飾；重鏈可變區(qū) ⑶R2氨基酸序列選自SEQ ID NO :5-8和其保守修飾；重鏈可變區(qū)⑶R3氨基酸序列選自SEQ ID NO :9-12和其保守修飾；輕鏈可變區(qū)⑶Rl氨基酸序列選自SEQ ID NO :13-16和其保守修飾；輕鏈可變區(qū)⑶R2氨基酸序列選自SEQ ID NO :17-20和其保守修飾；輕鏈可變區(qū)⑶R3 氨基酸序列選自SEQ ID NO :21- 和其保守修飾；該抗體特異結(jié)合IL12Ri31，并且該抗體顯示出至少一種下面的功能性質(zhì)其抑制IL12和IL23與IL12Ri3 1的結(jié)合，其抑制人血細(xì)胞中IL12依賴性的IFNy產(chǎn)生，其抑制人血細(xì)胞中IL23依賴性的IFNY產(chǎn)生或者其抑制靈長類動(dòng)物血細(xì)胞中IL12離體IFNy產(chǎn)生。在多種實(shí)施方案中，抗體可以顯示出一種或多種、兩種或多種，三種或多種、或者四種上面列出的功能性質(zhì)。此類抗體可以是例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在其他實(shí)施方案中，用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中優(yōu)化表達(dá)的本發(fā)明抗體具有全長重鏈序列和全長輕鏈序列，其中這些序列的一個(gè)或多個(gè)具有基于本文所述的抗體或其保守修飾的特定氨基酸序列，并且其中所述抗體保留了本發(fā)明抗IL12Ri3 1抗體想要的功能特性。 因此，本發(fā)明提供了用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中優(yōu)化表達(dá)的分離的單克隆抗體，其由全長重鏈和全長輕鏈組成，其中全長重鏈包含選自SEQ ID NO :29-32的可變氨基酸序列和其保守修飾；并且全長輕鏈包含選自SEQ ID NO 25-28的可變氨基酸序列和其保守修飾；該抗體特異結(jié)合IL12Ri3 1，并且該抗體顯示出至少一種下面的功能性質(zhì)其抑制IL12和IL23與 IL12R β 1的結(jié)合，其抑制人血細(xì)胞中IL12依賴性的IFN γ產(chǎn)生，其抑制人血細(xì)胞中IL23依賴性的IFNy產(chǎn)生，或者其抑制靈長類動(dòng)物血細(xì)胞中IL12離體IFNY產(chǎn)生。在多種實(shí)施方案中，抗體可以顯示出一種或多種、兩種或多種，三種或多種、或者四種上面列出的功能性質(zhì)。此類抗體可以是例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。如本文所用的，術(shù)語“保守序列修飾”意指氨基酸修飾，其不顯著影響或改變含有該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征。此類保守修飾包括氨基酸替代、添加和缺失。
保守氨基酸替代是其中將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基置換的替代。 在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、 色氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 甲硫氨酸)、β分枝側(cè)鏈氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈氨基酸 (例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。從而，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以用來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基置換，并且可以使用本文所述的功能測(cè)定法測(cè)試經(jīng)改變的抗體所保留的功能?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變向本發(fā)明的抗體中引入修飾。結(jié)合與本發(fā)明的杭IL12RP 1杭體相同表擬的杭體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合與本文提供的多種具體抗IL12Ri3 1抗體所結(jié)合表位相同的表位的抗體。因此，此類額外的抗體可以基于它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)IL12Ri3 1結(jié)合測(cè)定法中與本發(fā)明的其他抗體以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著方式交叉競(jìng)爭(zhēng)(即，競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合)的能力來鑒定。受試抗體抑制本發(fā)明的抗體與人IL12Ri3 1結(jié)合的能力表明該受試抗體與本發(fā)明抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人 IL12Ri3 1 ；根據(jù)非限制性理論，這種抗體可以結(jié)合人IL12Ri3 1上與它所競(jìng)爭(zhēng)的抗體相同或相關(guān)的(例如，結(jié)構(gòu)上相似或空間上接近的)表位。在一些實(shí)施方案中，與本發(fā)明的抗體結(jié)合人IL12Ri3 1上相同表位的抗體是人重組抗體。此類人重組抗體可以如實(shí)施例中所述進(jìn)行制備和分離。改造和修飾的抗體還可以使用具有本文所示的一個(gè)或多個(gè)Vh和/或\序列的抗體作為起始物質(zhì)以改造修飾的抗體來進(jìn)一步制備本發(fā)明的抗體，該修飾的抗體可以具有不同于起始抗體的改變性質(zhì)。通過修飾一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即，Vdn/或VJ，例如，一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)和/或一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基，可以改造抗體。額外或備選地，通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來改造抗體，例如，以改變抗體的效應(yīng)功能?？梢赃M(jìn)行的一種類型的可變區(qū)改造是⑶R嫁接?？贵w主要通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，各抗體之間CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列更多樣化。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)多數(shù)抗體-抗原相互作用，所以可能通過構(gòu)建表達(dá)載體表達(dá)重組抗體，其模擬特定天然存在的抗體的性質(zhì)，所述表達(dá)載體包括來自特定天然存在的抗體的CDR序列，其嫁接到來自具有不同性質(zhì)的不同抗體的構(gòu)架區(qū)上(見例如，Riechmann，L.等人，1998 Nature 332:323-327 Jones,P.等人，1986 Nature 321 :522-525 ；Queen, C.等人，1989 Proc. Natl. Acad. See. U. S. Α. 86 :10029-10033 ；winter 的美國專利號(hào)5，225，539，和Queen等人的美國專利號(hào)5，530，101 ；5，585,089 ；5，693，762 和 6，180，370)。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及分離的單克隆IL12Ri3 1抗體，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)包含分別具有選自SEQ ID NO :1-4的氨基酸序列的⑶Rl序列；具有選自SEQ ID NO 5-8的氨基酸序列的⑶R2序列；具有選自SEQ ID NO :9_12的氨基酸序列的⑶R3序列；輕鏈可變區(qū)分別具有選自SEQ ID NO :13-16的氨基酸序列的⑶Rl 序列；具有選自SEQ ID NO 17-20的氨基酸序列的CDR2序列；具有選自SEQ ID NO 21~24 的氨基酸序列的CDR3序列。從而，此類抗體含有單克隆抗體的V1^nt CDR序列，而可以含有來自這些抗體的不同構(gòu)架序列。此類構(gòu)架序列可以從公共DNA數(shù)據(jù)庫或公布的參考文獻(xiàn)得到，其包括種系抗體基因序列。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在"VBase"人種系序列數(shù)據(jù)庫(可以在英特網(wǎng)網(wǎng)址www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase獲取)，以及在Kabat, Ε. Α.，等人， 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 ;Tomlinson，I. M.，等人，1992 J. fol. Biol. 227 :776-798 ；和 Cox，J. P. L.等人，1994 Eur. J Immunol. 24 :827-836 中找到。用于本發(fā)明抗體的構(gòu)架區(qū)的實(shí)例是與所選的本發(fā)明抗體使用的構(gòu)架序列，例如， 本發(fā)明的單克隆抗體使用的共有序列和/或構(gòu)架序列結(jié)構(gòu)上相似的那些構(gòu)架序列?？梢詫V11⑶Rl、2和3序列，和\⑶Rl、2和3序列嫁接在構(gòu)架區(qū)上，該構(gòu)架區(qū)具有與該構(gòu)架序列所來源的種系免疫球蛋白基因中發(fā)現(xiàn)的相同的序列，或者可以將CDR序列嫁接在構(gòu)架區(qū)上，該構(gòu)架區(qū)與種系序列相比具有一個(gè)或多個(gè)突變。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些情況中，有益的是突變構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基以保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力(見，例如，Queen等人的美國專利號(hào) 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 和 6，180，370)。另一類型的可變區(qū)修飾是突變Vh和/或Vl⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基從而提高目的抗體的一種或多種結(jié)合性質(zhì)(例如，親和性)，稱作“親和性成熟”?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或者PCR介導(dǎo)的誘變以以導(dǎo)入突變，并且可以用如本文所述的和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)測(cè)定法評(píng)估對(duì)抗體結(jié)合或者其他目的功能性質(zhì)的影響。可以引入保守修飾 (如上文討論)。突變可以是氨基酸替代、添加或缺失。此外，通常改變CDR區(qū)內(nèi)不超過1、 2、3、4或5個(gè)殘基。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗IL12Ri3 1單克隆抗體，其由重鏈可變區(qū)組成，該重鏈可變區(qū)具有由選自SEQ ID NO :1-4的氨基酸序列或與SEQ ID N0 1-4相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列組成的Vh⑶Rl區(qū)；具有選自SEQ ID NO :5-8的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :5_8相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的Vh CDR2區(qū)；具有選自SEQ ID NO :9_12的氨基酸序列或與SEQ ID NO :9-12相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列 CDR3區(qū)；具有選自SEQ ID NO 13-16的氨基酸序列或與SEQ ID NO :13-16相比具有1、2、3、 4或5個(gè)氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的\⑶Rl區(qū)；具有選自SEQ ID NO :17-20 的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :17-20相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的\⑶R2區(qū)；和具有選自SEQ ID NO 21~24的氨基酸序列或與SEQ ID NO 21-24相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的\⑶R3區(qū)。mmmw^mmm^mm^^可以應(yīng)用多種抗體/免疫球蛋白構(gòu)架或支架，只要得到的多肽包含與IL12Ri3 1特異結(jié)合的至少一個(gè)結(jié)合區(qū)。此類框架或支架包括人免疫球蛋白的5種主要獨(dú)特型或者其片段(例如本文中其他地方所公開的那些)，并包括其他動(dòng)物物種的免疫球蛋白，優(yōu)選地具有人源化方面。在這點(diǎn)上，單重鏈抗體例如在駱駝(camelids)中鑒定的那些單重鏈抗體是特別感興趣的。本領(lǐng)域技術(shù)人員繼續(xù)發(fā)現(xiàn)并研發(fā)了新的構(gòu)架、支架和片段。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用可以在上面嫁接本發(fā)明的CDR的非免疫球蛋白支架，產(chǎn)生基于非免疫球蛋白的抗體?？梢詰?yīng)用已知的或?qū)淼姆敲庖咔虻鞍讟?gòu)架和支架，只要它們包含對(duì)于SEQ ID NO :41的目標(biāo)蛋白質(zhì)特異的結(jié)合區(qū)。此類化合物在本文中稱為“包含目標(biāo)特異結(jié)合區(qū)的多肽”。在以下部分(駱駝抗體和非抗體支架)中進(jìn)一步描述了非免疫球蛋白構(gòu)架的實(shí)例。駱駝抗體已經(jīng)對(duì)獲自駱駝和單峰駝(雙峰駝(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)家族成員包括新大陸成員如美洲駝(llama)物種(Lama paccos、馬駝(Lama glama)和小羊駝(Lama vicugna))的抗體蛋白質(zhì)的大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和對(duì)人受試者的抗原性進(jìn)行了表征。發(fā)現(xiàn)來自該哺乳動(dòng)物家族的一些IgG抗體天然缺失輕鏈，并因此就來自其他動(dòng)物的抗體而言，其在結(jié)構(gòu)上不同于具有兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈的一般四鏈四級(jí)結(jié)構(gòu)。見 PCT/EP93/02214(1994 年 3 月 3 日公布的 WO 94/04678)。通過基因改造可以獲得定義為Vhh的小單可變區(qū)的駱駝抗體的一個(gè)區(qū)域，以產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)具有高親和性的小蛋白質(zhì)，其導(dǎo)致稱為“駱駝納米抗體(camelid nanobody)“ 的低分子量抗體衍生蛋白質(zhì)。見1998年6月2日頒布的美國專利5，759，808;也 β StijIemans, B.等人，2004 J Biol Chem 279 :1256-1261 ；Dumoulin, M.等人， 2003Nature 424:783-788 ；Pleschberger，Μ·等人 2003 Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo，V.等人 2002 Int J Cancer 89 :456-62 ；禾口 Lauwereys，Μ.等人 1998 EMBO J 17:3512-3520。駱駝抗體和抗體片段的改造文庫是例如從Ablynx，(ihent，比利時(shí)商業(yè)可獲得的。與其他非人來源的抗體一樣，也可以重組改變駱駝抗體的氨基酸序列以獲得更近似人序列的序列，即可以“人源化”納米抗體。因此，可以進(jìn)一步降低駱駝抗體對(duì)人的天然低抗原性。駱駝抗體具有大約人IgG分子十分之一的分子量，并且該蛋白質(zhì)僅具有幾納米的物理直徑。小尺寸的一個(gè)結(jié)果是，駱駝納米抗體結(jié)合對(duì)于較大抗體蛋白而言為功能上不可識(shí)別的抗原性位點(diǎn)的能力，即駱駝科納米抗體可用作檢測(cè)抗原的試劑，而所述抗原對(duì)于利用經(jīng)典免疫技術(shù)而言是隱蔽的，駱駝科納米抗體還可用作可能的治療劑。因此，小尺寸的又一結(jié)果是，由于駱駝納米抗體結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)凹槽或狹縫中特異位點(diǎn)而產(chǎn)生抑制性結(jié)果制，因此能夠形成這樣的能力，其比經(jīng)典高分子量抗體更近似地模仿經(jīng)典低分子量藥物的功能。低分子量和緊湊形式進(jìn)一步產(chǎn)生了極端熱穩(wěn)定的、對(duì)極端pH和對(duì)蛋白水解消化穩(wěn)定的、和低抗原性的駱駝納米抗體。另一結(jié)果是，駱駝納米抗體可以容易地從循環(huán)系統(tǒng)移動(dòng)到組織中，甚至可以穿過血腦屏障，并且可以治療影響神經(jīng)組織的疾病。納米抗體還方便藥物穿過血腦屏障運(yùn)輸。見2004年8月19號(hào)公布的美國專利申請(qǐng)20040161738。這些特點(diǎn)連同對(duì)人類的低抗原性顯示了極大的治療性潛能。此外，這些分子可以在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中完全表達(dá)，并且可以與噬菌體一起表達(dá)為融合蛋白質(zhì)且是具備功能的。因此，本發(fā)明的特點(diǎn)是具有對(duì)IL12Ri3 1高親和性的駱駝抗體或納米抗體。在本文中的一些實(shí)施方案中，駱駝抗體或納米抗體是在駱駝動(dòng)物中天然產(chǎn)生的，即通過用 IL12Ri3 1或其肽片段使用本文中所述的用于其他抗體的技術(shù)免疫駱駝后產(chǎn)生的。備選地，對(duì)抗IL12Ri3 1駱駝納米抗體進(jìn)行改造，即如在本文實(shí)施例中所述，以IL12Ri3 1作為靶標(biāo)， 使用淘選法，例如從展示合適的誘變處理的駱駝納米抗體蛋白的噬菌體文庫中選擇產(chǎn)生的。例如，使用實(shí)施例中所述的相應(yīng)測(cè)定法，從抑制IL12和IL23結(jié)合IL12Ri3 1和/或抑制人血細(xì)胞中IL12誘導(dǎo)的IFNy產(chǎn)生、和/或抑制人血細(xì)胞中IL23誘導(dǎo)的IFNY產(chǎn)生的那些中選擇抗IL12Ri3 1駱駝納米抗體?？梢赃M(jìn)一步通過基因改造定制經(jīng)改造的納米抗體，以在受試者中具有45分鐘至兩周的半衰期。在特定的實(shí)施方案中，通過將本發(fā)明的人抗體的重鏈或輕鏈的CDR序列嫁接到納米抗體或單域抗體構(gòu)架序列中獲得駱駝抗體或納米抗體，如例如在PCT/EP93/02214 中所述。非抗體支架已知的非免疫球蛋白構(gòu)架或支架包括但不限于，Adnectin(纖連蛋白)(Compound Therapeutics, Inc. , ffaltham, MA)、ankyr in (Molecular Partners AG, Zurich,瑞士)、 結(jié)構(gòu)域抗體(Domantis 有限公司(Cambridge，ΜΑ)和 Ablynx ην(Zwijnaarde,比利時(shí)))、脂籠蛋白(Anticalin) (Pieris Proteolab AG, Freising，德國)、小模塊免疫藥物 (small modular immuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc. ， Seattle, WA), maxybodies (Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、蛋白 A(Affibody AG,瑞典)和 affilin(y晶體蛋白或泛素)(kil蛋白質(zhì)GmbH，Halle，德國)、蛋白質(zhì)表位模擬物 (Polyphor 有限公司，AlIsctiwi 1，瑞士 )。(i)纖連蛋白支架纖連蛋白支架優(yōu)選基于纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域(如纖連蛋白III型的第十組件 (l(Fn3結(jié)構(gòu)域))。纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域具有分布于兩個(gè)β片層之間的7個(gè)或8個(gè)β 鏈，其自身相互包裝以形成蛋白質(zhì)的核心，并還含有將β鏈相互連接的環(huán)(類似于⑶R)，且是溶劑暴露的。在β片層多層結(jié)構(gòu)的每一邊緣存在至少3個(gè)此類環(huán)，其中所述邊緣是蛋白質(zhì)垂直于β鏈的方向的界限。(US 6，818，418)。這些基于纖連蛋白的支架不是免疫球蛋白，但是總體的折疊與最小的功能抗體片段(重鏈的可變區(qū))的折疊密切相關(guān)，所述最小的功能抗體片段包含駱駝(camel) IgG和美洲駝(llama) IgG中的整個(gè)抗原識(shí)別單位。因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)，非免疫球蛋白抗體模仿類似于天然的抗原結(jié)合特性和抗體對(duì)那些抗原的親和性。這些支架可用于與體內(nèi)的抗體親和性成熟過程相似的體外環(huán)隨機(jī)化和改組策略。這些基于纖連蛋白的分子可用作支架，其中分子的環(huán)區(qū)可使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)用本發(fā)明的CDR替代。(ii) Ankyrin-分子配偶體這種技術(shù)是基于使用具有ankyrin衍生的重復(fù)組件的蛋白質(zhì)作為用于支撐可變區(qū)的支架，所述可變區(qū)可用于結(jié)合不同目標(biāo)。Ankyrin重復(fù)組件是33個(gè)氨基酸多肽，由兩個(gè)反平行α-螺旋和一個(gè)β-轉(zhuǎn)角組成?？勺儏^(qū)的結(jié)合主要通過使用核糖體展示來最優(yōu)化。(iii)Maxybodies/Avimers-AvidiaAvimers衍生自天然的含有A-結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)如LRP-1。這些結(jié)構(gòu)域本質(zhì)上用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，并且在人中，超過250個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是基于A-結(jié)構(gòu)域的。 Avimers由許多通過氨基酸接頭連接的不同“A-結(jié)構(gòu)域”單體Q-10)組成。使用描述于如 20040175756 ；20050053973 ；20050048512 ；和 20060008844 中的方法，可產(chǎn)生能與目標(biāo)抗原結(jié)合的Avimers。(iv)蛋白 A-AffibodyAffibody 親和配體是包含基于蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的支架的三螺旋束的小的簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)。蛋白A是來自細(xì)菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的表面蛋白質(zhì)。這種支架結(jié)構(gòu)域由58個(gè)氨基酸組成，其中將13個(gè)氨基酸隨機(jī)地產(chǎn)生具大量配體變體的Affibody 文庫(見如US 5，831，012)。Affibody⑧分子模仿抗體，與150kDa分子量的抗體比較，它們具有6kDa的分子量。盡管其小型，但是AfTibody 分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗體的結(jié)合位點(diǎn)相似。(v)Anticalins-PierisAnticalins .是由Pieris ProteoLab AG公司研發(fā)的產(chǎn)品。它們衍生自脂籠蛋白， 一類廣泛分布的小且堅(jiān)固的蛋白質(zhì)，所述脂籠蛋白通常參與生理轉(zhuǎn)運(yùn)或化學(xué)敏感的或者不溶的化合物的存儲(chǔ)。幾種天然的脂籠蛋白存在于人組織或體液中。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)暗示為免疫球蛋白，在剛性構(gòu)架頂部具有高變環(huán)。然而，與抗體或其重組片段不同，脂籠蛋白包含具有160個(gè)至180個(gè)氨基酸殘基的單一多肽鏈，這僅比單一的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域略大。構(gòu)成結(jié)合袋的4個(gè)環(huán)的集合顯示出意義深遠(yuǎn)的結(jié)構(gòu)可塑性并耐受多種側(cè)鏈。因此，為了高親和力和高特異性地識(shí)別不同形狀的指定目標(biāo)分子，結(jié)合部位可用專利方法進(jìn)
行重塑。通過誘變處理4個(gè)環(huán)的集合，已將脂籠蛋白家族的一種蛋白質(zhì)，即Pieris Brassicae的后膽色素結(jié)合蛋白(BBP)用于研發(fā)anticalins。描述“anticalins”的專利申請(qǐng)的一個(gè)例子是PCT WO 199916873。(Vi)Affilin-Scil 蛋白質(zhì)Affilin 化合物是經(jīng)設(shè)計(jì)的對(duì)蛋白質(zhì)和小分子具有特異親和力的小非免疫球蛋白蛋白質(zhì)。新Affilin 分子可非常快地選自兩個(gè)文庫，其中每一個(gè)文庫基于不同的人來源的支架蛋白質(zhì)。Affilin 化合物與免疫球蛋白蛋白質(zhì)不顯示出任何結(jié)構(gòu)同源性。kil蛋白質(zhì)使用兩種Affilin 支架，其中一種Affilin 支架是、晶體蛋白(人結(jié)構(gòu)性眼晶狀體蛋白質(zhì))和另一種是“泛素”超家族蛋白質(zhì)。兩種人支架都非常小，顯示出高的溫度穩(wěn)定性且?guī)缀跄蚉H變化和變性劑。這種高穩(wěn)定性主要由于蛋白質(zhì)的展開的β片層結(jié)構(gòu)。Y晶體蛋白衍生的蛋白質(zhì)的例子描述于W0200104144中，且“泛素樣”蛋白質(zhì)描述于W02004106368中。(vii)蛋白質(zhì)表位模擬物(PEM)PEM是中等大小的、環(huán)狀、模仿蛋白質(zhì)的β發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽樣分子(MW l-2kDa)，該β發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)是主要的涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)。改造的構(gòu)架或Fc本發(fā)明的經(jīng)改造的抗體包括這樣的抗體，其中已經(jīng)對(duì)Vh和/或&內(nèi)的構(gòu)架殘基進(jìn)行修飾以例如改善抗體的性質(zhì)。通常，進(jìn)行此類構(gòu)架修飾以降低抗體的免疫原性。例如， 一種方法是“回復(fù)突變” 一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基成對(duì)應(yīng)的種系序列。更具體地，已經(jīng)經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可以含有與該抗體所來源的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過比較抗體構(gòu)架序列與該抗體所來源的種系序列可以鑒定此類殘基。為了使構(gòu)架區(qū)序列回復(fù)到它們的種系構(gòu)型，可以例如通過定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變將體細(xì)胞突變“回復(fù)突變”成種系序列。此類 “回復(fù)突變”抗體也意在被本發(fā)明包括。另一類型的構(gòu)架修飾涉及突變構(gòu)架區(qū)內(nèi)，或者甚至一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基，以除去T細(xì)胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。該方法也稱作“去免疫”并且在Carr等人的美國專利公布號(hào)20030153043中進(jìn)一步詳細(xì)描述。除了在構(gòu)架或⑶R區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾之外或備選地，可以改造本發(fā)明的抗體以包括Fc 區(qū)內(nèi)的修飾，通常改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，如血清半壽期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合， 和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，本發(fā)明的抗體可以被化學(xué)修飾(例如，一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以連接到抗體)或經(jīng)修飾而改變它的糖基化，再次改變?cè)摽贵w的一種或多種功能性質(zhì)。這些實(shí)施方案的每一個(gè)都在下面詳細(xì)描述。Fc區(qū)內(nèi)的殘基編號(hào)為Kabat的EU索引編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)使得改變，例如，增加或減少鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目。該方法在Bodmer等人的美國專利號(hào)5，677，425中進(jìn)一步描述。改變CHl 的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基數(shù)目以例如方便輕鏈和重鏈的裝配或增加或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，將抗體的Fc鉸鏈區(qū)突變以降低該抗體的生物學(xué)半壽期。更具體地，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變導(dǎo)入Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)，使得該抗體相對(duì)于天然Fc鉸鏈結(jié)構(gòu)域SpA結(jié)合具有受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)結(jié)合。該方法在Ward 等人的美國專利號(hào)6，165，745中進(jìn)一步詳細(xì)描述。在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以增加其生物學(xué)半壽期。多種方法是可能的。例如， 可以導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)下面的突變T252L、T2MS、T256F，如Ward的美國專利號(hào)6，277，375所述。備選地，為了延長生物學(xué)半壽期，可以在抗體的CHl或CL區(qū)內(nèi)改變以含有從IgG的Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)得到的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如I^resta等人的美國專利號(hào)5，869，046 和6，121，022中描述。在其他實(shí)施方案中，通過將至少一個(gè)氨基酸殘基用不同的氨基酸殘基置換以改變抗體的效應(yīng)功能來改變Fc區(qū)。例如，一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以用不同的氨基酸殘基置換，使得該抗體對(duì)于效應(yīng)配體具有改變的親和力但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。改變親和力的效應(yīng)配體可以是例如，F(xiàn)c受體或補(bǔ)體的Cl組分。該方法在Winter等人的美國專利號(hào) 5，624，821 和 5，648，260 中進(jìn)一步詳述。在另一實(shí)施方案中，選自氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以用不同氨基酸殘基置換使得該抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或減小或消除的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。該方法在Idusogie等人的美國專利號(hào)6，194，551中進(jìn)一步詳述。在另一實(shí)施方案中，改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基以改變?cè)摽贵w固定補(bǔ)體的能力。 該方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中進(jìn)一步描述。在再一個(gè)實(shí)施方案中，通過修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾Fc區(qū)以增加該抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗體對(duì)Fc γ受體的親和力。該方法在 Presta的PCT公布號(hào)WO 00/42072中進(jìn)一步描述。此外，已經(jīng)為人IgGl對(duì)Fc y Rl、Fc yRII, Fc y RIII和Fcfoi的結(jié)合位點(diǎn)作圖并且已經(jīng)描述了具有提高的結(jié)合的變體(見Siields， R.L.等人，2001 J. Biol. Chen. 276 :6591-6604)。
在一些實(shí)施方案中，使用IgGl同種型的Fc結(jié)構(gòu)域。在一些特定的實(shí)施方案中，使用IgGl Fc片段的突變變體，例如降低或去除融合多肽介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)和 /或與Fc γ受體結(jié)合的能力的沉默IgGl Fe。在Hezareh等人的J. Virol 2001年12月； 75(24) :12161-8中描述了 IgGl同種型沉默突變的實(shí)例，其中將在氨基酸位置234和235處的亮氨酸殘基用丙氨酸殘基取代。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域是在Fc結(jié)構(gòu)域的位置297殘基處阻止糖基化的突變體。例如，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域含有在位置297處天冬酰胺殘基的氨基酸替代。該氨基酸替代的實(shí)例是將N297用甘氨酸或丙氨酸取代。在再一個(gè)實(shí)施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化抗體(即，缺少糖基化的抗體)。可以改變糖基化以例如，增加抗體對(duì)“抗原”的親和力。此類糖類修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)完成。例如，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，其導(dǎo)致去除一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)，從而去除該位點(diǎn)的糖基化。此類無糖基化可以增加抗體對(duì)抗原的親和性。這種方法在Co等人的美國專利號(hào)5，714，350和 6，350，861中進(jìn)一步詳細(xì)描述。額外或備選地，可以制備具有改變類型的糖基化的抗體，如具有減少量的巖藻糖殘基的低巖藻糖基化抗體或者具有增加的等分GlcNac結(jié)構(gòu)的抗體。已經(jīng)表明此類改變的糖基化模式增加抗體的ADCC能力。通過例如在具有改變的糖基化機(jī)制的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體完成此類糖類修飾。具有改變的糖基化機(jī)制的細(xì)胞已經(jīng)在本文中描述并且可以用作宿主細(xì)胞，在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。例如，Hang等人的EP 1，176，195描述了具有功能被破壞的FUT8基因的細(xì)胞系，所述FUT8基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使得在這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體顯示出低巖藻糖化。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體通過在表現(xiàn)出低巖藻糖模式的細(xì)胞系，例如具有編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的 FUT8基因缺陷表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中重組表達(dá)產(chǎn)生。I^resta的PCT公布WO 03/035835 描述了變體CHO細(xì)胞系Lecl3細(xì)胞，其將巖藻糖連接到Asn (297)-連接的糖類的能力降低， 也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體的低巖藻糖化(也見aiields，R.L.等人，2002 J.Biol. Chem. 277 :26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342描述了細(xì)胞系，其被改造而表達(dá)修飾糖蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，β (1，4)4乙?；咸前坊D(zhuǎn)移酶111(&11111)，使得在該改造細(xì)胞系中表達(dá)的抗體顯示出增加的等分GlcNac結(jié)構(gòu)，其導(dǎo)致抗體增加的ADCC 活性(也見Umana等人，1999Nat. Biotech. 17 :176-180)。備選地，本發(fā)明抗體可以在酵母或絲狀真菌中產(chǎn)生，所述酵母或絲狀真菌被改造成哺乳動(dòng)物樣糖基化模式，并能產(chǎn)生缺少作為糖基化模式的巖藻糖的抗體(見例如EP1297172B1)。本發(fā)明涵蓋的本文抗體的另一種修飾是聚乙二醇化?？梢詫⒖贵w聚乙二醇化，例如，以延長該抗體的生物學(xué)(例如，血清)半壽期。為了聚乙二醇化抗體，通常將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)，如PEG的活性酯或醛衍生物在這樣的條件下反應(yīng)，在所述條件下， 一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)變得附著到抗體或抗體片段。通過用反應(yīng)性PEG分子(或其類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)進(jìn)行?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)，可以進(jìn)行聚乙二醇化。如本文所用的，術(shù)語“聚乙二醇”意在包括任一種形式的PEG，其已經(jīng)被用于衍生其他蛋白質(zhì)，如單(Cl-ClO) 烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或者聚乙二醇-馬來酰亞胺。在一些實(shí)施方案中，待聚乙二醇化的抗體是無糖基化的抗體。聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。見例如,Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。本發(fā)明涵蓋的抗體的另一種修飾是將本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)與血清蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白或其片段綴合或蛋白質(zhì)融合，以增加得到的分子的半衰期。該方法例如描述于Balance等人EP0322094。另一可能是將本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)與能結(jié)合血清蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白的蛋白質(zhì)融合，以增加得到的分子的半衰期。該方法例如描述于Nygren等人，EP 0 486 525。改造改變的抗體的方法如上面討論，具有本文所示的Vh和\序列或全長重鏈和輕鏈序列的抗IL12Ri3 1 抗體可以用于通過修飾全長重鏈和/或輕鏈序列、Vh和/或\序列或其連接的恒定區(qū)而產(chǎn)生新的抗IL12Ri3 1抗體。從而，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的抗IL12Ri3 1抗體的結(jié)構(gòu)特征用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗IL12Ri3 1抗體，其保留本發(fā)明抗體的至少一種功能性質(zhì)，如結(jié)合人IL12Ri3 1以及抑制IL12Ri3 1的一種或多種功能性質(zhì)(例如，抑制IL12和/或IL23與 IL12Ri3 1結(jié)合、抑制血細(xì)胞中IL12誘導(dǎo)的IFNy產(chǎn)生等等)。例如，本發(fā)明抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他 ⑶R重組組合，以產(chǎn)生如上文討論的額外的重組改造的抗IL12Ri3 1抗體。其他類型的修飾包括前面部分中描述的那些修飾。用于改造方法的起始材料是本文提供的一種或多種％和 /或\序列，或者其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。為了產(chǎn)生改造的抗體，不必實(shí)際上制備(即，作為蛋白質(zhì)表達(dá))具有本文提供的一個(gè)或多個(gè)Vh和/或\序列或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的抗體。 相反，將序列中所含的信息用作起始材料產(chǎn)生來自最初序列的“第二代”序列，然后制備“第二代”序列并表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備抗IL12Ri3 1抗體的方法，所述抗 IL12Ri3 1抗體由重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列組成，所述重鏈可變區(qū)抗體序列具有選自SEQ ID NO 1-4的CDRl序列、選自SEQ ID NO :5_8的CDR2序列和/或選自SEQ ID NO 9-12的⑶R3序列；所述輕鏈可變區(qū)抗體序列具有選自SEQ ID NO :13-16的⑶Rl序列、選自SEQ ID NO 17-20的CDR2序列和/或選自SEQ ID NO 21~24的CDR3序列；改變所述重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；并將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中優(yōu)化表達(dá)的抗 IL12Ri3 1抗體的方法，所述抗IL12Ri3 1抗體由全長重鏈抗體序列和全長輕鏈抗體序列組成，所述全長重鏈抗體序列包含選自SEQ ID NO :29-32的可變序列；和所述全長輕鏈抗體序列包含選自SEQ ID NO 25-28的可變序列；改變所述全長重鏈抗體序列和/或全長輕鏈抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；并將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。改變的抗體序列也可以通過篩選抗體文庫制備，所述抗體文庫具有分別選自SEQ ID NO 9-12和SEQ ID NO :21-24的獨(dú)特重鏈和輕鏈CDR3序列、或如在US20050255552中所述的最小基本結(jié)合決定簇和CDRl和CDR2序列的多樣性。篩選可以根據(jù)適合于從抗體文庫篩選抗體的任一篩選技術(shù)，例如噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)改變的抗體序列。所改變的抗體序列編碼的抗體是保留本文所述的抗IL12Ri3 1抗體的一種、一些或所有功能性質(zhì)的抗體，其功能性質(zhì)包括，但不限于，特異結(jié)合IL12Ri3 1 ；和/或該抗體抑制IL12和IL23蛋白質(zhì)與IL12R3 1 多肽結(jié)合；和/或該抗體抑制人血細(xì)胞中IL12誘導(dǎo)的IFNy產(chǎn)生；該抗體抑制人血細(xì)胞中 IL23誘導(dǎo)的IFNy產(chǎn)生；和/或該抗體抑制靈長類動(dòng)物血細(xì)胞中IL12離體IFNY產(chǎn)生。所改變的抗體可以顯示出一種或多種、兩種或多種，或三種或多種上面討論的功能性質(zhì)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中可得的和/或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法，如實(shí)施例中給出的那些 (例如，ELISA)評(píng)估改變的抗體的功能性質(zhì)。在改造本發(fā)明抗體的方法的一些實(shí)施方案中，可以沿著抗IL12Ri3 1抗體編碼序列的全部或者部分隨機(jī)或者選擇性導(dǎo)入突變，并可以對(duì)得到的經(jīng)修飾的抗IL12Ri3 1抗體篩選如本文所述的結(jié)合活性和/或其他功能性質(zhì)。突變方法已經(jīng)在本領(lǐng)域描述。例如， Siort的PCT公布WO 02/092780描述了使用飽和誘變、合成連接裝配，或者其組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。備選地，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679描述了使用計(jì)算機(jī)篩選方法優(yōu)化抗體的理化性質(zhì)的方法。編碼本發(fā)明抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明抗體的核酸分子。可變的輕鏈核苷酸序列的實(shí)例顯示于SEQ ID N0:33-36?？勺兊闹劓満塑账嵝蛄械膶?shí)例顯示于SEQ ID NO :37-40。本發(fā)明也涉及來源于SEQ ID NO :33-40的序列的核酸分子，所述核酸分子已經(jīng)優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞系中蛋白質(zhì)表達(dá)。核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或者可以是部分純化或者基本上純的形式。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化核酸以除去其他細(xì)胞組分或其他污染物，例如，其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，核酸是“分離的”或“使得基本上純的”，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括堿/SDS處理、CsCl分帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)。見F. Ausubel，等人， 編著，1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有內(nèi)含子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于載體，如噬菌體展示載體，或者重組質(zhì)粒載體中。可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)得到本發(fā)明的核酸。對(duì)于雜交瘤(例如，如下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼通過雜交瘤制備的抗體的重鏈和輕鏈的cDNA可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)得到。對(duì)于從免疫球蛋白基因文庫(例如，使用噬菌體展示技術(shù))得到的抗體，可以從作為文庫成員的多種噬菌體克隆回收編碼所述抗體的核酸。一旦得到編碼Vh和\區(qū)段的DNA片段，就可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如，以將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因，或者scFv基因。在這些操作中，編碼或Vh的DNA片段有效連接到另一 DNA分子，或者編碼另一蛋白質(zhì)的片段，如抗體恒定區(qū)或柔性接頭。該上下文中使用的術(shù)語“有效連接”意指兩個(gè)DNA片段以功能方式連接，例如，使得這兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合讀框，或者使得該蛋白質(zhì)在所希望的啟動(dòng)子控制下表達(dá)?？梢詫⒕幋aVh區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)變成全長重鏈基因，通過將Vh編碼DNA有效連接到編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和OK)的另一 DNA分子實(shí)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)變。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(見例如，Kabat, E.A.，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增得到包含這些區(qū)域的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中， 重鏈恒定區(qū)選自IgGl同種型。對(duì)于Fab片段重鏈基因，可以將編碼Vh WDNA有效連接到編碼僅僅重鏈CHl恒定區(qū)的另一 DNA分子。通過將Vl編碼DNA有效連接到編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一 DNA分子，可以將分離的編碼\區(qū)的DNA轉(zhuǎn)變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域己知的(見例如，Kabat，E. A.，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)并且包含這些區(qū)的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA擴(kuò)增得到。輕鏈恒定區(qū)可以是 κ或入恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，可以將編碼Vh和Vl的DNA片段有效連接到編碼柔性接頭，例如，編碼氨基酸序列(Gly4-kr)3的另一片段，使得Vh和\序列可以作為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)表達(dá)，通過柔性接頭連接\和VHg (見，例如，Bird等人，1988 Science 242 =423-426 ； Huston 等人，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 ；McCafferty 等人，1990 Nature348 :552-554)。產(chǎn)牛本發(fā)明的單克降抗體可以通過多種技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)，所述技術(shù)包括常規(guī)的單克隆抗體方法， 例如，Kohler和Milstein，1975 Nature 256 :495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)?？梢允褂枚喾N用于產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)，例如，B淋巴細(xì)胞的病毒或癌基因轉(zhuǎn)化。用于制備雜交瘤的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中的雜交瘤產(chǎn)生是成熟的方法。用于分離用于融合的經(jīng)免疫的脾細(xì)胞的免疫方案和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合配偶體(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合步驟也是已知的?？梢曰谌缟鲜鲋苽涞氖髥慰寺】贵w的序列制備本發(fā)明的嵌合或人源化抗體。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目的鼠雜交瘤得到并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)改造成含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)(見，例如，Cabilly等人的美國專利號(hào)4，816，567)。 為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠CDR區(qū)插入到人構(gòu)架區(qū)，見例如， Winter的美國專利號(hào)5，225，539和Queen.等人的美國專利號(hào)5，530，101 ；5，585,089 ； 5，693，762 和 6；180 ；370。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體?？梢允褂脭y帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生針對(duì)IL12Ri3 1的此類人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文中分別稱作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且它們?cè)诒疚闹薪y(tǒng)稱為“人Ig小鼠”。 HuMAb小鼠 (Medarex, Inc.)含有人免疫球蛋白基因小基因座，其編碼未重排的人重鏈(μ和Y)和κ輕鏈免疫球蛋白序列，以及定向突變，其失活內(nèi)源μ和κ鏈基因座(見例如，Lonberg，等人，1994 Nature 368(6474) :856-859)。因此，小鼠顯示出小鼠IgM或κ的降低的表達(dá)，并且在應(yīng)答免疫時(shí)，所導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變以產(chǎn)生高親和性人IgGK單克隆抗體(Lonberg，N.等人，1994上文；Lonberg， N. ,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101 ；Lonberg,N.禾口 Huszar, D.,1995 Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93, 禾口 Harding, F.and Lonberg, N. ,1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 :536-546中綜述)。HuMAb小鼠的制備和用途，和此類小鼠攜帶的基因組修飾在Taylor，L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20 :6287-6295 ；Chen, J.等人，1993 International Immunology 5 :647-656 ；Tuaillon 等人’1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :3720-3724 ;Choi 等人，1993 Nature Genetics 4 :117-123 ；Chen, J.等人，1993 EMBO J. 12 :821-830 ；Tuaillon 等人，1994 J. Immunol. 152 :2912-2920 ；Taylor, L.等人，1994 International Immunology 579-591 ；禾口 Fishwild, D.等人，1996 Nature Biotechnology 14 :845-851中進(jìn)一步描述，將它們的內(nèi)容都完整引入本文作為參考。還見，Lonberg和 Kay 的美國專利號(hào) 5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，789，650 ；5，877，397 ； 5，661，016 ；5，814，318 ；5，874，299 ；和 5，770，429 ；Surani 等人的美國專利號(hào) 5，545，807 ； 和 Lonberg 和 Kay 的 PCT 公布號(hào) WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、 WO 98/24884 和 WO 99/45962 ；和 Korman 等人的 PCT 公布號(hào) WO 01/14424。在另一實(shí)施方案中，使用在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠， 如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。此類小鼠在本文中稱作“KM小鼠”，在Ishida等人的PCT公布號(hào)WO 02/43478中詳細(xì)描述。此外，表達(dá)人免疫球蛋白基因的備選的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)可以在本領(lǐng)域中得到并且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗IL12R β 1抗體。例如，可以使用稱作Xenomouse (Abgeniχ， Inc.)的備選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)；此類小鼠在例如Kucherlapati等人的美國專利號(hào)5，939，598 ； 6，075，181 ；6，114，598 ；6，150，584 和 6，162，963 中描述。此外，表達(dá)人免疫球蛋白基因的備選的轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)可以在本領(lǐng)域中獲得并且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗IL12RM抗體。例如，可以使用稱作“TC小鼠”的攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠；此類小鼠在iTomizuka等人，2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722-727中描述。此外，攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的奶牛已經(jīng)在本領(lǐng)域描述 (Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20:889-894)并且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗 IL12R^ 1 抗體。也可以使用篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備本發(fā)明的人重組抗體。此類用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中建立或描述于下文的實(shí)施例中。見例如:Ladner 等人的美國專利號(hào) 5，223，409 ；5，403，484 ；和 5，571,698 ；Dower 等人的美國專利號(hào)5，427，908和5，580，717 ；McCafferty等人的美國專利號(hào)5，969，108 和 6，172，197 ；和 Griffiths 等人的美國專利號(hào) 5，885，793 ；6，521，404 ；6，544，731 ； 6，555，313 ；6，582，915 和 6，593，081。也可以使用其中已經(jīng)重建了人免疫細(xì)胞的SCID小鼠制備本發(fā)明的人單克隆抗體，從而當(dāng)免疫時(shí)可以產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。此類小鼠在例如Wilson等人的美國專利號(hào) 5，476，996 和 5，698，767 中描述。產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤的制備為了制備可以產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，可以將脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞從免疫的小鼠中分離并與合適的永生化細(xì)胞系，例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。得到的雜交瘤可以篩選抗原特異性抗體的產(chǎn)生。例如，可以用50% PEG將來自經(jīng)免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)的P3)(63-Ag8. 653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC， CRL 1580)融合。將細(xì)胞以大約h 145接種于平底微量滴定板中，然后在含有20%胎?？寺⊙?、18% “653”條件培養(yǎng)基、5% origen (IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、ImM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0. 055mM 2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和IX HAT (Sigma;將HAT在融合后M小時(shí)加入)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。大約兩周后，將細(xì)胞培養(yǎng)在用HT取代了 HAT的培養(yǎng)基中。然后，通過ELISA篩選各個(gè)孔的人單克隆IgM和 IgG抗體。一旦發(fā)生了大量的雜交瘤生長，那么通?？梢栽?0-14天后觀察培養(yǎng)基?？梢灾匦陆臃N分泌抗體的雜交瘤，再次篩選，并且如果對(duì)于人IgG還是陽性，那么可以通過有限稀釋至少兩次亞克隆該單克隆抗體。然后可以將穩(wěn)定的亞克隆體外培養(yǎng)，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生用于表征的少量抗體。為了純化人單克隆抗體，可以將選擇的雜交瘤培養(yǎng)在兩升旋轉(zhuǎn)燒瓶中用于單克隆抗體純化?？梢栽谟玫鞍譇瓊脂糖(Pharmacia，Piscataway, N. J.)親和層析前，過濾并濃縮上清液。可以通過凝膠電泳和高效液相層析檢查洗脫的IgG以確保純度。可以將緩沖液改成PBS，并通過OD28tl使用1. 43消光系數(shù)測(cè)定濃度?？梢詫慰寺】贵w分成等份并儲(chǔ)存于-80"C。產(chǎn)牛單克降抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備還可以在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，使用例如，本領(lǐng)域公知的重組DNA 技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison，S. (1985) Science 229 :1202) 例如，為了表達(dá)抗體，或者其抗體片段，可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，PCR 擴(kuò)增或cDNA克隆，使用表達(dá)目的抗體的雜交瘤)可以得到編碼部分或全長輕鏈和重鏈的 DNA,并且可以將DNA插入到表達(dá)載體中，使得基因有效連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在該上下文中，術(shù)語“有效連接”意指抗體基因連接到載體中，從而載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)控制序列以與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容。可以將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入到單獨(dú)的載體，或者更典型地，可以將兩種基因插入到相同的表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法向表達(dá)載體中插入抗體基因(例如，在抗體基因片段或載體上連接互補(bǔ)限制性位點(diǎn)，或者如果不存在限制性位點(diǎn)，那么為平末端連接)。本文所述抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可以用于產(chǎn)生任何抗體同種型的全長抗體基因，通過將所述基因插入到已經(jīng)編碼所希望同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得Vh區(qū)段有效連接載體內(nèi)的CH區(qū)段并且\區(qū)段有效連接載體內(nèi)的CL區(qū)段，可以實(shí)現(xiàn)所述產(chǎn)生。額外或備選地，重組表達(dá)載體可以編碼信號(hào)肽，其方便抗體鏈從宿主細(xì)胞的分泌。可以將抗體鏈基因克隆到載體中使得信號(hào)肽與抗體鏈基因的氨基末端符合讀框地連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。除了抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶控制抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件 (例如，多聚腺苷酸化信號(hào))，其控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。此類調(diào)節(jié)序列描述于例如 Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego, CA 1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，可以依賴于此類因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所希望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，等等。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，其來自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))，和多瘤。備選地，可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列，如泛蛋白啟動(dòng)子或P 珠蛋白啟動(dòng)子。此外，由不同來源的序列組成的調(diào)節(jié)元件，如SRa啟動(dòng)子系統(tǒng)，其含有來自 SV40早期啟動(dòng)子的序列和人T細(xì)胞白血病病毒1型的長末端重復(fù)的序列(Takebe，Y.等人， 1988 Mol. Cell. Biol. 8 :466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以攜帶額外的序列，如調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中載體復(fù)制的序列(如復(fù)制原點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因方便已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞的選擇(見，例如，Axel等人的美國專利號(hào)4，399，216，4，634，665 和5，179，017)。例如，通常，選擇標(biāo)記基因?qū)σ呀?jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞賦予對(duì)藥物(如 G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于 dhfr-宿主細(xì)胞，使用氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。對(duì)于輕鏈和重鏈的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的多種形式意在包括常用于向原核或真核宿主細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA的多種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。在理論上可能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體。討論了抗體在真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、酵母或絲狀真菌中的表達(dá)，因?yàn)榇祟愓婧思?xì)胞，尤其哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能裝配和分泌正確折疊的和免疫活性抗體。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)抗體基因的原核表達(dá)對(duì)于產(chǎn)生高產(chǎn)量的活性抗體是無效的(Boss, Μ. Α.禾口 Wood，C. R.，1985 Immunology Today 6 :12-13)。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(包括 dhfr-CHO 細(xì)胞，描述于 Urlaub 和 Chasin，1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4216-4220，使用 DH FR 選擇標(biāo)記，如 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159 601-621中描述)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。具體而言，對(duì)于使用NSO骨髓瘤細(xì)胞，另一表達(dá)系統(tǒng)是顯示于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338，841的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括，例如如在 US6, 946，292B2中所述的FUT8基因表達(dá)缺陷的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞足夠允許抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間或者將抗體分泌到宿主細(xì)胞所生長的培養(yǎng)基中來產(chǎn)生抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基回收抗體。免疫綴合物另一方面，本發(fā)明描述了綴合到治療部分的抗IL12Ri3 1抗體，或其片段，所述治療部分如細(xì)胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素。此類綴合物在本文中被稱作 “免疫綴合物”。包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒素的免疫綴合物被稱作“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對(duì)細(xì)胞有害(例如，殺死)的任何物質(zhì)。實(shí)例包括taxon、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、 阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素類、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和其類似物或同系物。治療劑還包括例如，抗代謝物(例如，氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，腐蝕劑(例如，氮芥、噻替哌(thio印a)、chlorambucil、美法侖、卡莫司汀 (BSNU)和羅氮芥(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C，和順-二氯二胺鉬(II) (DDP)、順鉬、蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(以前道諾霉素)和阿霉素)，抗生素 (例如，更生霉素(以前放線菌素)、博來霉素、光輝霉素、和氨茴霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)?？梢跃Y合到本發(fā)明抗體的治療性細(xì)胞毒素的其他實(shí)例包括多卡米星、加利車霉素、美登素和auristatins，和其衍生物。加利車霉素抗體綴合物的實(shí)例可通過商業(yè)途徑獲得(MylotargTm ；Wyeth-Ayerst)。使用本領(lǐng)域中可獲得的接頭技術(shù)，可以將細(xì)胞毒素綴合到本發(fā)明的抗體。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素綴合到抗體的接頭類型的實(shí)例包括，但不限于，腙類、硫醚、酯、二硫化物和含有肽的接頭?？梢赃x擇例如對(duì)溶酶體隔室內(nèi)的低PH切割敏感或者對(duì)蛋白酶敏感的接頭，所述蛋白酶為諸如優(yōu)先在腫瘤組織中表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶類(例如，組織蛋白酶B、 C、D)。關(guān)于細(xì)胞毒素類型、用于將治療劑綴合到抗體的接頭和方法的進(jìn)一步討論，也見 Saito, G.等人，2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55 :199-215 ；Trail, P. Α.等人，2003 Cancer Immunol. Immunother. 52 :328-337 ；Payne, G.,2003 Cancer Cell 3 :207-212 ；Allen, Τ. M. ，2002 Nat. Rev. Cancer 2 :750-763 ；Pastan, I.禾口 Kreitman，R. J. ，2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3 :1089-1091 ；Senter，P. D.禾口 Springer，C. J.，2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53 :247-264o還可以將本發(fā)明的抗體綴合到放射性同位素以產(chǎn)生細(xì)胞毒性放射性藥物，也稱作放射免疫綴合物?？梢跃Y合到診斷或治療應(yīng)用的抗體的放射性同位素的實(shí)例包括，但不限于，碘131、銦“1、釔9°和镥177。制備放射免疫綴合物的方法是本領(lǐng)域中成熟的。放射性免疫綴合物的實(shí)例可以通過商業(yè)途徑獲得，包括kvalin (DEC Pharmaceuticals)和 Bexxar (Corixa Pharmaceuticals)，并且可以用類似的方法用本發(fā)明的抗體制備放射性免疫綴合物。本發(fā)明的抗體綴合物可以用于修飾給定生物應(yīng)答，并且藥物部分將不被理解為局限于典型的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有所希望的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。此類蛋白質(zhì)可以包括，例如，酶促活性毒素，或者其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、 假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或Y干擾素；或生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，如淋巴因子、白介素-1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素-6( “IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其他生長因子。用于將此類治療部分綴合到抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，見例如，Amon等人，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，，， Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld% 243-56 M (Alan R. Liss, Inc. 1985) ；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery，，，Controlled Drug Delivery 第二版，Robinson 等人編輯，第 623-53 頁(Marcel Dekker, Inc. 1987) ；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review”，Monoclonal Antibodies ' 84 :Biological And Clinical Applications，Pinchera 等人編輯，第475-506 頁(1985) ；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy，，，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin等人編輯，第 303-16 頁(Academic Press 1985), 禾口 Thorpe 等人，‘‘The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，，，Inmuno 1. Rev. ,62 :119-58(1982)。雙特異件分子另一方面，本發(fā)明描述了雙特異性或多特異性分子，其包含本發(fā)明的抗IL12R3 1 抗體。本發(fā)明的抗體可以被衍生或連接到另一功能分子，例如，另一肽或蛋白質(zhì)(例如，另一抗體或受體的配體)以產(chǎn)生雙特異性分子，其結(jié)合至少兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)或靶分子。 實(shí)際上可以將本發(fā)明的抗體衍生或連接到一個(gè)以上的功能分子以產(chǎn)生結(jié)合兩個(gè)以上不同的結(jié)合位點(diǎn)和/或靶分子的多特異性分子；此類多特異性分子也意在被本文使用的術(shù)語 “雙特異性分子”包括。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，可以將本發(fā)明的抗體功能連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)結(jié)合或其他方法)到一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合分子，如另一抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物，從而產(chǎn)生雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括雙特異性分子，其包含至少對(duì)IL12Ri3 1的第一種結(jié)合特異性和對(duì)第二種目標(biāo)表位的第二種結(jié)合特異性。例如，第二種目標(biāo)表位是不同于第一目標(biāo)表位的 IL12Ri3 1另一表位。另一實(shí)例是包含至少對(duì)IL12Ri3 1的第一種結(jié)合特異性和對(duì)IL12R3 2 或IL23Ra內(nèi)表位的第二種結(jié)合特異性的雙特異性分子。此外，對(duì)于雙特異性分子是多特異性的本發(fā)明，分子除了第一種和第二種目標(biāo)表位外，還包含第三種結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含作為結(jié)合特異性的至少一種抗體，或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv或單鏈Fv。抗體還可以是輕鏈或重鏈二聚體，或者其任何最小部分，如Ladner等人的美國專利號(hào)4，946，778中描述的Fv或輕鏈構(gòu)建體?？梢杂糜诒景l(fā)明的雙特異性分子的其他抗體是鼠的、嵌合和人源化的單克隆抗體。使用本領(lǐng)域已知的方法，通過綴合組分結(jié)合特異性，可以制備本發(fā)明的雙特異性分子。例如，可以單獨(dú)產(chǎn)生雙特異性分子的每種結(jié)合特異性，然后將它們相互連接。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，多種偶聯(lián)或交聯(lián)劑可以用于共價(jià)連接。交聯(lián)劑的實(shí)例包括蛋白A、 碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5' -二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯二馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺基_3_(2_吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，和硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)丙烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC) (見例如 Karpovsky 等人，1984 J. Exp. Med. 160 :1686 ；Liu，MA等人，1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括 Paulus，1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132 ； Brennan 等人，1985 Science 229 :81-83),和 Glennie 等人，1987 J. Immunol. 139 2367-2375)中描述的那些。綴合劑是SATA和硫代SMCC，它們都可以從Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)得到。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(shí)，它們可以通過兩個(gè)重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合結(jié)合。在具體實(shí)施方案中，修飾鉸鏈區(qū)以在綴合前含有奇數(shù)個(gè)巰基，例如，一個(gè)巰基。
備選地，可以在相同載體中編碼兩種結(jié)合特異性并在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。當(dāng)雙特異性分子是mAb X mAb.mAb χ Fab,Fab χ F(ab' )2或配體χ Fab融合蛋白時(shí)， 該方法尤其有用。本發(fā)明的雙特異性分子可以是單鏈分子，其包含一個(gè)單鏈抗體和結(jié)合決定簇，或者包含兩個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個(gè)單鏈分子。制備雙特異性分子的方法在例如美國專利號(hào)5，260, 203 ；美國專利號(hào)5，455，030 ； 美國專利號(hào)4，881，175;美國專利號(hào)5，132，405;美國專利號(hào)5，091，513;美國專利號(hào) 5，476，786 ；美國專利號(hào)5，013，653 ；美國專利號(hào)5，258，498 ；和美國專利號(hào)5，482，858中描述。雙特異性分子與它們的特定靶標(biāo)的結(jié)合可以通過例如，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)、放射免疫測(cè)定法(REA) ,FACS分析、生物測(cè)定法(例如，生長抑制)，或者蛋白質(zhì)印跡測(cè)定法證實(shí)。這些測(cè)定法的每一種通常通過使用對(duì)目的復(fù)合體特異的標(biāo)記試劑(例如， 抗體)檢測(cè)具體目的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體的存在。多價(jià)抗體在另一方面，本發(fā)明提供了多價(jià)抗體，其包含與IL12Ri3 1結(jié)合的本發(fā)明抗體的至少兩個(gè)相同的或不同的抗原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)抗體提供抗體的至少兩個(gè)、 三個(gè)或四個(gè)抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合部分可以通過蛋白質(zhì)融合或共價(jià)或非共價(jià)鍵合連接在一起。備選地，已經(jīng)描述了鍵合雙特異性分子的方法?？梢岳缤ㄟ^將本發(fā)明抗體的抗體與結(jié)合本發(fā)明抗體的恒定區(qū)(例如Fc或鉸鏈區(qū))的抗體交聯(lián)，獲得四價(jià)化合物。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供了組合物，例如，藥物組合物，其含有本發(fā)明的抗體之一或組合，與可藥用載體一起配制。此類組合物可以包括本發(fā)明的抗體或免疫綴合物或雙特異性分子之一或組合(例如，兩種或多種不同抗體的組合)。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以包含結(jié)合靶抗原上不同表位或者具有互補(bǔ)活性的抗體的組合。也可以以組合療法，即與其他藥劑相組合來施用本發(fā)明的藥物組合物。例如，組合療法可以包括與至少一種其他抗炎劑或另一種化療劑(例如免疫抑制劑)組合的本發(fā)明的抗IL12Ri3 1抗體?？梢杂糜诮M合療法的治療劑的實(shí)例在下面關(guān)于本發(fā)明抗體用途的章節(jié)中更詳細(xì)地描述。如本文所用的，“可藥用載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。載體應(yīng)該適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(例如，通過注射或灌輸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體應(yīng)當(dāng)適合于皮下途徑。取決于施用途徑，活性化合物，即抗體、免疫綴合物，或雙特異性分子可以用材料包衣以保護(hù)化合物免于酸和可以失活該化合物的其他自然條件的作用。本發(fā)明的藥物化合物可以包括一種或多種可藥用鹽。“可藥用鹽”指保留親本化合物的所希望的生物活性并且不賦予任何不希望的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽(見例如，Berge, S. M.， 等人，1977 J. Pharm. Sci. 66 :1_19)。此類鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括來自無毒無機(jī)酸的鹽，如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸的鹽，等等，以及來自無毒有機(jī)酸的鹽，所述無毒有機(jī)酸為如脂肪族一或二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸，等等。堿加成鹽包括來自堿土金屬如鈉、鉀、鎂、鈣等等的那些鹽，以及來自無毒有機(jī)胺的鹽，所述無毒有機(jī)胺為如N，N' -二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因，等等。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括可藥用抗氧化劑。可藥用抗氧化劑的實(shí)例包括 水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等等；油可溶的抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、 卵磷脂、沒食子酸丙酯、α生育酚，等等；和金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、 山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。可以用于本發(fā)明的藥物組合物中的合適的水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)，和其合適的混合物，植物油，如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。例如，通過使用包衣材料，如卵磷脂，對(duì)于分散體的情況通過保持所需的顆粒大小，和通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。微生物存在的防止可以通過如上消毒程序，和通過包括多種抗細(xì)菌和抗真菌劑來確保，所述抗細(xì)菌和抗真菌劑為例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等。還希望在組合物中包括等滲劑，如糖、氯化鈉等等。此外，通過包括延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠可以引起可注射藥物形式的延長吸收?？伤幱幂d體包括無菌水溶液或分散體和無菌粉劑，其用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散體。此類介質(zhì)和試劑在藥學(xué)活性物質(zhì)中的用途是本領(lǐng)域已知的。除了與活性化合物不相容的任一常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，預(yù)期其用于本發(fā)明的藥物組合物。還可以將補(bǔ)充性活性化合物摻入組合物中。治療組合物通常必須是在生產(chǎn)和保存條件下是無菌的和穩(wěn)定的。可以將組合物配制成溶液劑、微乳劑、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇，等等)，和其合適的混合物?？梢员３诌m當(dāng)流動(dòng)性，例如，通過使用包衣，如卵磷脂，對(duì)于分散體的情況通過保持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑。在許多情況中，可以在組合物中包括等滲劑，例如， 糖、多元醇，如甘露醇，山梨醇，或者氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可以通過在組合物中包括延遲吸收的物質(zhì)，如單硬脂酸鹽和明膠來實(shí)現(xiàn)。通過將活性化合物以所需的量在合適的溶劑中與上面列舉的成分之一或者組合摻和，如果需要，接著無菌微量過濾來制備無菌注射溶液。通常，通過將活性化合物摻入無菌載體制備分散體，所述載體含有基本分散介質(zhì)和來自上面列舉的那些成分的所需的其他成分。對(duì)于用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況，制備方法是真空干燥和冷凍干燥 (凍干)，其產(chǎn)生活性成分加上來自其之前無菌過濾溶液的任何額外的所需成分的粉末?？梢耘c載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將取決于被治療的受試者、 具體施用方式而變?？梢耘c載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將通常是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以百分比計(jì)，該量將為約0.01%到約99%活性成分、約0. 1% 到約70%，或約到約30%活性成分與可藥用載體組合。調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的目的應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。例如，可以施用單次快速濃注，可以隨時(shí)間施用幾個(gè)分份劑量，或者可以根據(jù)治療情況的緊迫性成比例地減小或增加劑量。特別有利的是以劑量單位形式配制腸胃外組合物以容易施用和劑量統(tǒng)一。如本文所用的劑量單位形式指適宜作為待治療受試者的單一劑量的物理上分離的單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性成分，所述量經(jīng)計(jì)算以與所需的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生所希望的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由如下決定并且直接依賴于活性化合物的獨(dú)特特征和待實(shí)現(xiàn)的具體治療效果，和本領(lǐng)域中配制用于治療個(gè)體中敏感性的這種活性化合物的固有局限性。對(duì)于抗體施用，劑量為約0. 0001到100mg/kg，更通常0. 01到5mg/kg宿主體重。 例如，劑量可以為0. 3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或l-10mg/kg的范圍內(nèi)。示例性治療方案需要每周施用一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3到6月一次。本發(fā)明的抗IL12Ri3 1抗體的劑量方案可以包括通過靜脈內(nèi)施用lmg/kg體重或;3mg/kg體重，用下面的給藥方案之一施用抗體 每四周施用6個(gè)劑量，然后每3月；每3周；;3mg/kg體重一次，接著每3周lmg/kg體重。在一些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在這種情況下施用的每種抗體的劑量落入所指出的范圍內(nèi)。通常在多個(gè)時(shí)機(jī)施用抗體。單次劑量之間的間隔可以是例如每周、每月、每3月或每年。間隔也可以是不規(guī)則的，通過測(cè)量患者中針對(duì)靶抗原的抗體的血液水平來指示。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以實(shí)現(xiàn)血漿抗體濃度為約1-1000 μ g/ml并且在一些方法中為約25-300 μ g/ml。備選地，可以作為持續(xù)釋放制劑施用抗體，在該情況中，需要較低頻率的施用。劑量和頻率取決于抗體在患者中的半壽期而變。通常，人抗體顯示出最長的半壽期，其次是人源化抗體、嵌合抗體，和非人抗體。劑量和施用頻率可以隨著治療是預(yù)防性還是治療性的而變。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長時(shí)間期間內(nèi)以相對(duì)不頻繁的間隔施用相對(duì)低的劑量。一些患者終生持續(xù)接受治療。在治療應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)較短的間隔施用相對(duì)高劑量直到疾病的進(jìn)展減慢或者終止或者直到患者顯示出疾病癥狀的部分或完全減輕。之后，可以對(duì)患者施用預(yù)防方案。本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變，只要活性成分的量對(duì)于具體患者、組合物和施用方式實(shí)現(xiàn)所希望的治療應(yīng)答，而對(duì)該患者無毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明的具體組合物或者其酯、鹽或酰胺的活性，施用途徑，施用時(shí)間，使用的具體化合物的排泄速率，治療持續(xù)時(shí)間，與所用的具體組分組合使用的其他藥物、化合物和/或物質(zhì)、被治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、 一般健康和以前的醫(yī)療史，和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的其他因素。本發(fā)明抗IL12Ri3 1抗體的“治療有效劑量”可以導(dǎo)致疾病癥狀嚴(yán)重性的降低、無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間的增加，或者由于疾病折磨而引起的病損或殘疾的預(yù)防?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的一種或多種方法，通過一種或多種施用途徑施用本發(fā)明的組合物。如技術(shù)人員將理解，施用途徑和/或方式將取決于所希望的結(jié)果而變。本發(fā)明抗體的施用途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外施用途徑，例如，通過注射或灌注。如本文使用的短語“腸胃外施用”指不同于經(jīng)腸和局部施用的施用方式， 通常通過注射，并且包括但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、 腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下腔、脊柱內(nèi)、硬膜外和intrastemal 注射和灌注。備選地，本發(fā)明的抗體可以通過非腸胃外途徑施用，如局部、表皮或粘膜施用途徑，例如，鼻內(nèi)、口腔、陰道、直腸、舌下或局部。
可以用保護(hù)活性化合物免于快速釋放的載體制備活性化合物，如控釋制劑，包括植入物、經(jīng)皮貼劑，和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳莸木酆衔铮缫蚁┮宜嵋蚁?、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類制劑的許多方法被申請(qǐng)專利或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson Marcel Dekker, Inc. ，M.^, 1978?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置施用治療組合物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用無針頭的皮下注射裝置施用本發(fā)明的治療組合物，如美國專利號(hào)5，399，163 ；5, 383，851 ； 5，312，335 ；5，064，413 ；4，941,880 ；4，790，824 或 4，596，556 中所示的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物或組件的實(shí)例包括美國專利號(hào)4，487，603，其說明了用于以受控速率分配藥物的可植入的微量輸液泵；美國專利號(hào)4，486，194，其說明了用于通過皮膚施用藥物的治療裝置；美國專利號(hào)4，447，233，其說明了用于以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸液泵；美國專利號(hào)4，447，224，其說明了用于連續(xù)藥物遞送的變速流可植入輸液器；美國專利號(hào)4，439，196，其說明了具有多個(gè)腔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；和美國專利號(hào)4，475，196， 其說明了滲透藥物遞送系統(tǒng)。許多其他此類植入物、遞送系統(tǒng)，和組件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一些實(shí)施方案中，可以配制本發(fā)明的人單克隆抗體以確保在體內(nèi)適當(dāng)分配。例如，血腦屏障(BBB)排除許多高親水性化合物。為了確保本發(fā)明的治療化合物穿過BBB(如果希望)，可以將它們用例如脂質(zhì)體配制。關(guān)于生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，見例如，美國專利4，522，811 ；5，374，548 ；和5，399，331。脂質(zhì)體可以包含一種或多種部分， 其被選擇性運(yùn)輸?shù)教囟?xì)胞或器官中，從而增強(qiáng)定向藥物遞送(見，例如，V. V. Ranade, 1989 J.Cline Pharmacol. 29 :685)。示例性定向部分包括葉酸或生物素(見，例如，Low 等人的美國專利 5，416，016)；甘露糖苷類(Umezawa 等人，1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 :1038)；抗體(P. G. Bloeman 等人，1995 FEBS Lett. 357 140 ;M. Owais 等人， 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39 180)；表面活性劑蛋白 A 受體(Briscoe 等人， 1995 Am. J. Physiol. 1233 :134) ；pl20 (Schreier 等人，1994 J. Biol. Chem. 269 :9090)；也見 K. Keinanen ；M. L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346 :123 J. J. Killion ；I. J. Fidler, 1994 Immnunomethods 4 :273。本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的抗體具有體外和體內(nèi)診斷性和治療性應(yīng)用。例如，可以將這些分子例如體外或體內(nèi)施用給培養(yǎng)的細(xì)胞或者例如體內(nèi)施用給受試者，以治療、預(yù)防或診斷多種疾病。該方法特別適合于治療、預(yù)防或診斷IL12Ri3 1相關(guān)的疾病和/或自身免疫和炎癥疾病，例如，銀屑病或炎性腸病。本發(fā)明也提供了通過施用包含本發(fā)明治療有效劑量的抗體，在人血細(xì)胞中降低或抑制IL12或IL23誘導(dǎo)的信號(hào)應(yīng)答的方法。如本文中所用，“IL12Ri3 1相關(guān)的疾病”包括與異常的IL12和/或IL23水平相關(guān)或者以異常的IL12和/或IL23水平為特征的疾病和/或能通過在人血細(xì)胞中降低或抑制 IL12和/或IL23誘導(dǎo)的信號(hào)應(yīng)答治療的疾病或病癥，所述IL12和/或IL23誘導(dǎo)的信號(hào)應(yīng)答例如在血漿中測(cè)量的IFNy或IL17的產(chǎn)生或者由流式細(xì)胞術(shù)方法或蛋白質(zhì)印跡測(cè)量的STAT4蛋白質(zhì)磷酸化的程度。這些疾病包括炎癥疾病和自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和炎性腸病。這些疾病還包括過敏癥和過敏性疾病、超敏反應(yīng)和器官或組織移植排斥。例如，可以將本發(fā)明的抗體用于治療心、肺、組合的心-肺、肝、腎、胰、皮膚或角膜移植，包括同種異體移植排斥或異種移植排斥的接受者，并用于例如在骨髓移植后預(yù)防移植物抗宿主疾病，和器官移植相關(guān)的動(dòng)脈硬化。本發(fā)明的抗體對(duì)于治療、預(yù)防或改善自身免疫和炎癥疾病，特別是具有包括自身免疫組分的病原學(xué)的炎癥疾病是有用的，所述疾病例如關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 arthritis chronica progrediente和變形性關(guān)節(jié)炎)和風(fēng)濕性疾病，包括炎癥疾病和涉及骨質(zhì)流失、炎癥疼痛的風(fēng)濕性疾病、脊椎關(guān)節(jié)病(spondyloarhropathie)包括ankolsing 脊椎炎、賴特爾綜合癥、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和致腸病性關(guān)節(jié)炎(enterophathis arthritis)、超敏反應(yīng)(包括呼吸道超敏反應(yīng)和皮膚超敏反應(yīng))和過敏癥?？梢允褂帽景l(fā)明抗體的具體自身免疫疾病包括自身免疫性血液疾病(包括例如溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞貧血和特發(fā)性血小板減少)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎性肌肉疾病、多軟骨炎、硬皮病(sclerodoma)、Wfegener肉芽腫、皮肌炎、慢性活動(dòng)型肝炎、重癥肌無力、銀屑病、 Steven-Johnson綜合征、特發(fā)性口炎性腹瀉、自身免疫炎性腸病(包括例如潰瘍性結(jié)腸炎、 Crohns病和腸易激惹綜合征)、內(nèi)分泌性眼病、格雷夫斯病、結(jié)節(jié)病、多發(fā)性硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、幼年型糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎(前房和后房)、干性角膜結(jié)膜炎和春季角膜結(jié)膜炎、肺間質(zhì)纖維化、銀屑病關(guān)節(jié)炎和腎小球性腎炎(患和未患腎病綜合征，例如包括特發(fā)性腎病綜合征或微小病變性腎病)、腫瘤、多發(fā)性硬化、皮膚和角膜的炎癥疾病、肌炎、骨植入體松動(dòng)(loosening of bone implant)、代謝性疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病禾口 dislipidemia。本發(fā)明抗體對(duì)于治療、預(yù)防或改善哮喘、支氣管炎、肺塵埃沉著病、肺氣腫和呼吸道的其他梗阻性或炎癥疾病也是有用的。本發(fā)明抗體對(duì)于治療骨代謝疾病包括骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和其他炎癥性關(guān)節(jié)炎， 以及一般骨質(zhì)損失包括年齡相關(guān)的骨質(zhì)損失，和特別地牙周病也是有用的。可以將本發(fā)明抗體作為單一活性組分施用或例如作為其他藥物的佐劑或與其它藥物組合來共同施用例如免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑或其它抗炎藥或其他細(xì)胞毒性或抗癌劑，例如用于治療或預(yù)防前面提及的疾病。例如，本發(fā)明抗體可以與如下活性組分聯(lián)用DMARD，例如金鹽、柳氮磺吡啶、抗瘧藥(antimalarias)、甲氨喋呤、D-青霉胺、硫唑嘌呤、麥考酚酸、環(huán)孢菌素A、他克莫司、西羅莫司、二甲胺四環(huán)素、來氟米特、糖皮質(zhì)激素 (glococorticoids)；鈣神經(jīng)素抑制劑，例如環(huán)孢菌素A或506 ；淋巴細(xì)胞再循環(huán)的調(diào)節(jié)劑，例如FTY720和FTY720類似物；mTOR抑制劑，例如雷帕霉素，40-0-(2-羥基乙基)_雷帕霉素，CCI779，ABT578, AP23573，TAFA-93 ；具有免疫抑制特性的子囊霉素，例如ABT481， ASM981等；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；來氟米特；咪唑立賓；麥考酚酸； 麥考酚酸嗎乙酯；15-脫氧精胍菌素或其免疫抑制同源物、類似物或衍生物；免疫抑制單克隆抗體，例如白細(xì)胞受體的單克隆抗體，例如，MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8,⑶25，CD28, ⑶40，⑶45，⑶58，⑶80，⑶86或其配體；其它免疫調(diào)節(jié)化合物，例如具有CTLA4的至少部分胞外域的重組結(jié)合分子或其突變體，例如與非CTLA4蛋白質(zhì)序列相連的CTLA4的至少胞外部分或其突變體，例如CTLA4Ig (例如命名為ATCC 68629)或其突變體，例如LEA29Y ；黏著分子抑制劑，例如LFA-I拮抗劑，ICAM-I或-3拮抗劑，VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或化療劑，例如紫杉醇，吉西他濱，順鉬，多柔比星或5-氟尿嘧啶；或抗TNF劑，例如TNF的單克隆抗體，例如英夫利西單抗、阿達(dá)木單抗、⑶P870或者TNF-RI或TNF-RII的受體構(gòu)建體， 例如依那西普、PEG-TNF-RI ；促炎癥細(xì)胞因子的阻斷劑、ILl阻斷劑，例如阿那白滯素或ILl trap、AAL160、IL17阻斷劑、IL13阻斷劑、IL4阻斷劑、IL6阻斷劑；趨化因子阻斷劑，例如蛋白酶例如金屬蛋白酶的抑制劑或活化劑、抗IL15抗體、抗IL6抗體、抗IL17抗體、抗IL4抗體、抗IL13抗體、抗⑶20抗體、抗Blys或抗BAFFR抗體、NSAID，例如阿司匹林或抗感染劑 (名單不僅限于提及的藥劑)。根據(jù)上述內(nèi)容，本發(fā)明的再一方面提供如上定義的方法，包括共施用(例如同時(shí)或者依次)治療有效量的IL12Ri3 1拮抗劑(例如本發(fā)明的抗體)，和至少一種第二藥物，所述第二藥物是免疫抑制性/免疫調(diào)節(jié)性藥物、消炎化學(xué)治療藥物或者抗感染藥物，例如如上公開的?；蛘?，一種治療組合(例如試劑盒)，其包含治療有效量的a) IL12Ri3 1拮抗劑，例如本發(fā)明的抗體，和b)至少一種選自免疫抑制性/免疫調(diào)節(jié)性藥物、消炎化學(xué)治療藥物或者抗感染藥(例如如上公開的)的第二物質(zhì)。該試劑盒可以包含其施用的說明書。當(dāng)本發(fā)明的抗體聯(lián)合其它免疫抑制性/免疫調(diào)節(jié)性、消炎化學(xué)治療性或者抗感染性治療施用時(shí)，共施用的聯(lián)合化合物的劑量將肯定取決于所使用的共-藥物的類型(例如其是否是DMARD，抗TNF，IL-I阻斷劑或者其它)、使用的具體藥物、正在治療的病癥等等而變化。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與抗TNF劑組合施用。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體僅施用給這樣的患者群體，其選自患SLE或RA 并且表現(xiàn)出異常的IL12分別依賴地IFN γ或IL17血清水平或者在血細(xì)胞中磷酸STAT4水平和頻率升高的患者。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體僅施用給選自對(duì)抗IL12或抗p40 治療起反應(yīng)的患者的患者群體。鑒定對(duì)抗IL12(或抗p40)治療應(yīng)答增加的可能性的患者的生物標(biāo)志物可以是任何不限于以下這些生物標(biāo)志物的血清IL12的升高水平、一些T細(xì)胞亞集的升高水平、來自分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的IFN γ、TNFa、IL12R3 2或STAT4 的mRNA水平、在皮膚活組織檢查或PBMC中分別的磷酸STAT4表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以用于檢測(cè)IL12Ri3 1的水平，或者含有 IL12Ri3 1的細(xì)胞水平。這可以例如，通過將樣品(如體外樣品)和對(duì)照樣品與抗IL12Ri3 1 抗體在允許抗體和IL12Ri3 1之間形成復(fù)合體的條件下接觸來實(shí)現(xiàn)。在樣品和對(duì)照中檢測(cè)抗體和IL12Ri3 1之間形成的任何復(fù)合體并比較。例如，可以使用本發(fā)明的組合物進(jìn)行本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，如ELISA和流式細(xì)胞測(cè)定法。因此，一方面，本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中IL12Ri3 1(例如人IL12Ri3 1抗原)的存在，或測(cè)量IL12Ri3 1的量的方法，其包括將樣品和對(duì)照樣品與本發(fā)明的抗體或其特異結(jié)合IL12Ri3 1的抗原結(jié)合部分在允許所述抗體或其部分與IL12Ri3 1之間形成復(fù)合體的條件下接觸。然后檢測(cè)復(fù)合體的形成，其中樣品與對(duì)照樣品相比復(fù)合體形成的差異表明在該樣品中存在IL12R3 1。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括試劑盒，其由本發(fā)明的組合物(例如，抗體、人抗體和雙特異性分子)和使用說明書組成。試劑盒可以還含有至少一種其他試劑，或者一種或多種本發(fā)明的其他抗體(例如，具有互補(bǔ)活性的抗體，其結(jié)合靶抗原上不同于第一種抗體的表位)。試劑盒通常包括標(biāo)簽，指出該試劑盒內(nèi)含物的預(yù)期用途。術(shù)語標(biāo)簽包括在試劑盒上提供或試劑盒提供或附隨該試劑盒的任何書面或記載的材料。試劑盒還可以包含用于診斷患者是否屬于對(duì)抗ILURi^ 1抗體治療起反應(yīng)(如上所定義)的組的患者的工具。已經(jīng)完全描述了本發(fā)明，通過下面的實(shí)施例和權(quán)利要求進(jìn)一步闡明本發(fā)明，所述實(shí)施例是說明性的并且不意在進(jìn)一步限定。
實(shí)施例方法1.篩選測(cè)定法將HuCAL GOLD噬菌粒文庫用于篩選本發(fā)明的抗體。該文庫基于HuCAL 原理 (Knappik, A.等人 2000，J Mol Biol 296,57-86)并應(yīng)用 CysDisplay 技術(shù)將 Fab 抗體片
段展示在絲狀噬菌體的表面上(Liihning，c. 2001. wo 01/05950)。以下描述的篩選策略
可以適用于其他類型的文庫和支架，包括非免疫球蛋白支架的文庫，從而允許鑒定具有與本發(fā)明抗體類似的顯著性能但具有不同支架的IL12Ri3 1結(jié)合體。1. 1在直接包被重組人IL12Ri3 1/Fc融合蛋白質(zhì)上針對(duì)IL12Ri3 1的標(biāo)準(zhǔn)固相淘選對(duì)于抗體選擇，將HuCAL GOLD 抗體-噬菌體在直接包被于Maxisorp 板(F96 Nunc-Immunoplate)的人重人IL12Rβ Ι/Fc融合蛋白質(zhì)上進(jìn)行3輪固相淘選。詳細(xì)地，在 22°C，用各300 μ 1的10μ g/ml人ILl^^ 1/Fc融合蛋白質(zhì)過夜(ο/η)包被Maxisorp 板上的兩孔。將包被的孔用350 μ 1 PBS洗滌2次，并用350 μ 1 5% MPBS在微量滴定板振蕩器上室溫(RT)封閉2小時(shí)。對(duì)于每一淘選，將大約&1013 HuCAL GOLD 噬菌體用等體積包含終濃度的人Y球蛋白的PBST/5%乳粉(MP)室溫封閉2小時(shí)。封閉后，用350 μ 1 PBS 洗滌包被孔2次。將300 μ 1預(yù)封閉的HuCAL GOLD 噬菌體加入每一抗原包被的孔中，并在振蕩器上室溫溫育2小時(shí)。通過添加5次350 μ 1 PBS/0. 05% Tween-20 (Sigma, St. Louis, M0，美國)進(jìn)行洗滌，然后用PBS洗滌5次。用每孔300μ 1在IOmM Tris/HCl中的20mM DTT PH8進(jìn)行從板洗脫噬菌體10分鐘。將DTT噬菌體洗脫物加入到15ml大腸桿菌TGl (其在 37 0C hYT培養(yǎng)基中生長至0.6-0.8的00600)中，并在37 °C，在沒有振蕩的情況下，在50ml 塑料管中溫育45分鐘用于噬菌體感染。進(jìn)行噬菌體感染的大腸桿菌TGl的滴定，以測(cè)定噬菌體的產(chǎn)量滴度，并隨后以5000轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行離心10分鐘。將細(xì)菌沉淀逐一重懸在500 μ 1 2χΥΤ培養(yǎng)基中，接種在hYT-CG瓊脂板上并在30°C溫育過夜。然后從平板上刮去克隆，并且如上所述復(fù)蘇噬菌體，并進(jìn)行擴(kuò)增。除增加了洗滌步驟的嚴(yán)格性外，根據(jù)第一輪的方案進(jìn)行第二和第三輪的在直接包被的人IL12Ri3 1/Fc融合蛋白質(zhì)上的固相淘選。1. 2在通過抗人Fc捕獲的包被人IL12Ri3 1/Fc融合蛋白質(zhì)上的固相淘選對(duì)于固相淘選，除抗原的包被條件外，與上述的步驟相同。此處，用10yg/ml AffiniPure山羊抗人IgG (Fe γ片段特異的)捕獲2. 5 μ g/ml抗原。將每次淘選的兩孔在 Maxisorp 板(F96 Nunc-Immunoplate)上包被。額外地用終濃度的小鼠或以終濃度(取決于所使用的捕獲抗體，對(duì)于淘選的第一和第三輪，使用山羊抗人IgG，和淘選的第二輪使用小鼠抗人IgG)的山羊Y球蛋白和的人Y球蛋白封閉噬菌體。用350μ 1的 5%MPBS,室溫封閉捕獲抗體1小時(shí)，用PBS洗滌2次，并隨后將預(yù)封閉的噬菌體混合物加入到捕獲的抗原中室溫溫育2小時(shí)。進(jìn)行全部后續(xù)步驟，如上對(duì)于直接包被的抗原所述。1. 3用Ba/F3/IL12Ri3 1表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞淘選，包括在Ba/F3親本細(xì)胞上的吸附步驟對(duì)于抗體選擇，將HuCAL GOLD 抗體-噬菌體單獨(dú)地在Ba/F3/IL12R β 1表達(dá)細(xì)胞上進(jìn)行3輪全細(xì)胞淘選。詳細(xì)地，用Iml 2% PBS/BSA(=封閉緩沖液)預(yù)封閉切106個(gè)至IxlO7個(gè)細(xì)胞，并且每次淘選使用各5xl06個(gè)細(xì)胞。對(duì)于每次淘選，將約hlO13個(gè)HuCAL GOLD 噬菌體在4°C用等體積的PBS/4% BSA封閉1. 5小時(shí)。將預(yù)封閉的HuCAL GOLD 噬菌體加入到預(yù)封閉的靶細(xì)胞中，并在回轉(zhuǎn)輪上4°C孵育2小時(shí)。在回轉(zhuǎn)輪上用1. 5ml2% PBS/ BSA在4°C洗滌5min，進(jìn)行3次，然后在4°C用PBS洗滌一次5分鐘。在4°C，以2000轉(zhuǎn)/分鐘在1分鐘內(nèi)離心細(xì)胞。用Iml的0. IM甘氨酸、0. 5M NaCl, pH 2. 2，在室溫通過酸性洗脫進(jìn)行噬菌體的洗脫10分鐘。將未緩沖的30 μ 1 2Μ Tris加入到離心的噬菌體洗脫物中，以中和該洗脫物。隨后，在4°C，在回轉(zhuǎn)輪上，用每一淘選洗脫物1E+7個(gè)細(xì)胞進(jìn)行Ba/F3親本細(xì)胞的后吸附3次，每次20分鐘。在4°C，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心細(xì)胞1分鐘。通過添加9ml 的大腸桿菌TGl (其在37°C，2xYT培養(yǎng)基中生長至0. 6-0. 8的0D600)，使用最后的SN感染大腸桿菌TG-1，并在37°C，在沒有振蕩的情況下，在50ml塑料管中水浴孵育30分鐘用于噬菌體感染。進(jìn)行感染的噬菌體的滴定，并隨后以5000轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行離心10分鐘，將細(xì)菌沉淀逐一重懸在500 μ 1 2χΥΤ培養(yǎng)基中，接種在hYT-CG瓊脂板上并30°C孵育過夜。然后從平板上刮去克隆，并且復(fù)蘇噬菌體，并如上所述進(jìn)行擴(kuò)增。除增加了洗滌步驟的嚴(yán)格性外， 根據(jù)第一輪的方案進(jìn)行第二和第三輪的用表達(dá)Ba/F3/IL12Ri3 1的細(xì)胞的全細(xì)胞淘選。1. 4用Ba/F3/IL12R β 1表達(dá)細(xì)胞和重組人IL12R β 1/Fc的差異細(xì)胞淘選通過借助于小鼠單克隆抗人IL12Ri3 1對(duì)照抗體(R&D Systems)的FACS分析驗(yàn)證細(xì)胞表面表達(dá)。如上對(duì)于全細(xì)胞淘選的第一輪和第三輪淘選所述進(jìn)行淘選，包括在細(xì)胞淘選期間在Ba/F3親本細(xì)胞上的吸附步驟。如上對(duì)于在直接包被的重組人IL12Ri3 1/Fc 融合蛋白質(zhì)(rh IL12Ri3 1)上針對(duì)IL12Ri3 1的標(biāo)準(zhǔn)固相淘選所述，在直接包被的重組人 IL12Ri3 1/Fc融合蛋白質(zhì)上進(jìn)行第二輪。1. 5通過ELISA (直接或捕獲模式)對(duì)IL12Ri3 1特異的Fab的初級(jí)篩選對(duì)于直接篩選模式，在22°C，將10μ g/ml在PBS中的重組人IL12Ri3 1/Fc融合蛋白質(zhì)(R&D Systems)過夜包被在384孔Maxisorp 板上。對(duì)于捕獲模式的篩選，在4°C， 將384孔Maxisorp 板的孔用20 μ 1在PBS中特異的10 μ g/ml的Affini Pure山羊抗人IgGFc γ包被過夜。包被后，用PBST洗滌孔5次。然后，用5% MPBST室溫封閉孔2小時(shí)。平行地，在22°C，用15μ 1 12. 5% MPBST封閉15 μ 1 BEL提取物。對(duì)于直接篩選模式， 在將20 μ 1已封閉的BEL提取物加入到孔中并室溫孵育2小時(shí)前，用PBST洗滌已封閉的 Maxisorp⑧板5次。對(duì)于捕獲模式，加入2. 5 μ g/ml重組人IL12R3 1/Fc融合蛋白質(zhì)(R&D Systems)并室溫孵育1小時(shí)，并隨后用已封閉的BEL提取物孵育。對(duì)于一級(jí)Fab抗體的檢測(cè)，應(yīng)用以下第二抗體加入堿性磷酸酶(AP)-綴合的AffiniPure F(ab' )2片段、山羊抗人和抗小鼠或抗綿羊IgGCJackson Immuno Research)用于對(duì)應(yīng)的對(duì)照抗體。對(duì)于檢測(cè)AP 綴合物，根據(jù)廠商說明書，使用熒光底物Att0W10s(R0Che)。在所有孵育步驟之間，用PBST 洗滌微量滴定板的孔3次，并在用第二抗體的最后孵育步驟后，用TBST洗滌3次。用Tecan GENios Pro平板讀數(shù)器測(cè)量熒光。
2.從篩選測(cè)定法鑒定的抗體的親和測(cè)定2. 1使用表面等離振子共振的親和測(cè)定建立了抗人Fc捕獲(Dianova)測(cè)定法。將捕獲的Fc融合體用作為配體，并將Fab 用作為分析物。詳細(xì)地使用標(biāo)準(zhǔn)的EDC-NHS胺偶聯(lián)化學(xué)，在所有4個(gè)流動(dòng)池中用5000-6000RU抗 Fc (Dianova,山羊抗人IgG，F(xiàn)c片段特異的；在IOmM乙酸緩沖液中的80ug/ml，pH4. 5)包被 CM5芯片(Biacore，瑞典)。流動(dòng)池2用IL12R1_/Fc融合蛋白質(zhì)捕獲(20 μ 1的以5 μ 1/ml 的流速，300-400RU的IOOnM配體)。隨后，以15. 6nM至500nM之間的濃度范圍注射(20 μ 1， 流速20 μ 1/分鐘)分析物。運(yùn)行條件PBS pH7. 2。每一循環(huán)后，用pHl. 5的IOmM甘氨酸再生流動(dòng)池。從特異信號(hào)值人工減去得到的緩沖液感應(yīng)值(sensogram)用于兩次參考(緩沖液注射)。使用BIA評(píng)價(jià)軟件3. I(Biacore)將所有感應(yīng)值作圖并評(píng)價(jià)。通過該方法測(cè)定總結(jié)的親本Fab抗體對(duì)IL12R0 1的親和性在2_450nM之間。2. 2用于檢測(cè)細(xì)菌裂解物中IL12Ri3 1結(jié)合的Fab的基于電化學(xué)發(fā)光(BioVeris) 的結(jié)合分析為了檢測(cè)大腸桿菌裂解物(BEL提取物)中親和性改進(jìn)的IL12Ri3 1特異性抗體片段，通過BioVeris M-384 SERIES Workstation分析結(jié)合。在96孔聚丙烯微量滴定板中實(shí)施BioVeris篩選。將BEL提取物稀釋于測(cè)定緩沖液(補(bǔ)充了 0. 5% BSA和0. 05% Tween-20的PBS)。根據(jù)廠商說明書，將生物素化的IL12Ri3 1與鏈霉親和素包被的順磁性珠子(M480，Dynal)偶聯(lián)。在Heidolph振蕩器(1000轉(zhuǎn)/分鐘)上，將BEL提取物和用生物素化IL12R3 1包被的鏈霉親和素珠子室溫孵育過夜。對(duì)于檢測(cè)，使用具有釕化合物 (BV-tag )標(biāo)記的抗人(Fab)，2 (Dianova)。2. 3使用溶液平衡滴定(SET)測(cè)定皮摩爾親和性對(duì)于通過溶液平衡滴定(SET)的Kd測(cè)定，使用Fab蛋白質(zhì)的單體部分(通過分析 SEC分析的至少90%的單體含量；Superdex75，Amersham Pharmacia)。應(yīng)用的Fab濃度類似于或低于期望的KD。溶液中基于電化學(xué)發(fā)光(ECL)的親和性測(cè)定和數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)基本上按照之前針對(duì)溶液中重組人 IL12R0 l/Fc(lnM 起始濃度)所述(Haenel，C.，等人 Q005)Anal Biochem 339,182-184)進(jìn)行。將與順磁性珠子(M480Str印tavidin，Dynal)偶聯(lián)的生物素化人 IL12R3 1/Fe 和含銣的 BV-tag (BioVeris Europe)標(biāo)記的抗人(Fab) ‘ 2 (Dianova)加入， 并孵育30分鐘。隨后，通過ECL檢測(cè)，使用M-SERIES (R) 384分析儀(BioVeris Europe)定量未結(jié)合的Fab的濃度。對(duì)于Kd測(cè)定的Fab分子的數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)，使用以下的擬合模型(根據(jù)Abraham等人J Mol Recognit. 9,456-461(1996)修改)y = Bmax-(Bmax/(2*cFab)氺(x+cFab+KD-sqrt((x+cFab+KD)氺(x+cFab+KD)_4氺χ氺c Fab)))cFab 應(yīng)用的Fab濃度clgG:應(yīng)用的IgG濃度，完整分子(非結(jié)合位點(diǎn))χ 應(yīng)用的總可溶性抗原濃度(結(jié)合位點(diǎn))sqrt 平方根
使用上述測(cè)定條件，在溶液中測(cè)定親和性優(yōu)化的抗IL12R β 1 Fab的(單體)親和性。2. 4 IL12R0 1-IL12/IL23體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制測(cè)定法對(duì)于IL12和IL23結(jié)合抑制測(cè)定，將25 μ g重組人IL12和20 μ g IL23 (R&D Systems)與 250 μ 1 羧酸 M_270Dynal 磁珠 Qx 109 個(gè)珠子 /ml)直接偶聯(lián)(NHS/EDC 偶聯(lián))。在96孔板(Nunc)中，將每孔50 μ 1 Fab抗體(20ηΜ儲(chǔ)液)以1 4稀釋梯度(Fab 濃度0. 6pM-10nM)與50 μ 1的40_100pM IL12R3 1/Fc融合蛋白質(zhì)一起孵育2小時(shí)。根據(jù)供應(yīng)商說明書(BioVeris Europe)，將25 μ 1 IL12或IL23包被的珠子和1 500稀釋的用 BV-tagTM標(biāo)記的鏈霉親和素檢測(cè)抗體加入到每孔中并孵育1. 5小時(shí)。通過BioVeris M-384 SERIES Workstation (BioVeris Europe)進(jìn)行檢測(cè)。通過 4 參數(shù)邏輯擬合模型(XLfit， IDBS)評(píng)價(jià)獲得的數(shù)據(jù)，進(jìn)行EC50測(cè)定。3.體外表征抗體，包括基于細(xì)胞的功能性測(cè)定法3. 1抑制人紅細(xì)胞的IL12依賴性的IFN γ產(chǎn)生如上所述，通過Histopaque梯度分離來自供體血液的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在 X-Vivo 15培養(yǎng)基中，將細(xì)胞調(diào)整至2E+6個(gè)細(xì)胞/ml。將50 μ 1細(xì)胞(1Ε+5)轉(zhuǎn)移到96孔U 型底平板中，并且以想要的濃度用抑制抗體，例如抗人IL12Ri3 1 Fab或IgG4或者對(duì)照mAb 或?qū)φ辗跤?，并在振蕩器上室溫預(yù)孵育30分鐘。在37°C，在5% C02恒溫箱中，用2μ g/ml 抗⑶3和抗OT^mAb和2ng/ml重組人細(xì)胞因子IL12進(jìn)行過夜刺激20小時(shí)。第二天，通過室溫250g離心細(xì)胞5分鐘收集上清液，并且轉(zhuǎn)移到新鮮的96孔板并用于ELISA測(cè)定或者儲(chǔ)存于-20°C直到進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于IFN γ ELISA，將以上收集的上清液稀釋于X_Vivol5培養(yǎng)基，并根據(jù)廠商方案 BenderMed Systems #BMS228HS 或 Biozol/Biolegend#BLD-430105 進(jìn)行 ELISA。根據(jù) IFN γ 標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線測(cè)定IFNy產(chǎn)生。3. 2抑制人血細(xì)胞的IL23依賴性的IFN γ產(chǎn)生使用PHA刺激的PBMC研究另一測(cè)定系統(tǒng)。在該細(xì)胞群體中，T細(xì)胞在凝集素暴露后增殖，并因此增加群體中T細(xì)胞的比例。在初步的實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了這些細(xì)胞對(duì)單獨(dú)的或組合的IL12、IL23、IL18和LPS的反應(yīng)性，并建立了最佳刺激條件。IL-12+IL-18和IL-23+IL-18 對(duì)IFNy分泌的作用是分別在約7ng/ml和800pg/ml誘導(dǎo)。3. 3抑制全血中IL12依賴性的IFN γ產(chǎn)生將等分的200 μ 1抗凝血液分配給頂行和底行都裝滿了 PBS的U型底96孔板 (Costar，3799)的各個(gè)孔。以20倍期望的終濃度在X-Vivo 15培養(yǎng)基(Bio-Whitaker， BE04-418F)中制備并滴定化合物，并且每一情況加入重復(fù)的3孔(10 μ 1)。單獨(dú)地制備細(xì)胞因子IL12_ Systems, 219-IL)和IL-18_，B001-5)和以20倍濃度組合，并加在上部(10μ1)，得到了 220μ1的總培養(yǎng)體積。沒有刺激或抑制化合物的重復(fù)3孔僅用合適的培養(yǎng)基填滿。在37°C，5% C02孵育20_24小時(shí)后，將含有全血的平板以650g離心10分鐘，并小心地從上部收集血漿。為了獲得在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)的測(cè)量值，將血漿用PBS/2mM EDTA稀釋1 5。在誘導(dǎo)更強(qiáng)的情況下，以1 10-1 20的更高稀釋進(jìn)行另外的測(cè)定。3. 4通過FACS分析測(cè)定表達(dá)IL12R β 1的Ba/F3細(xì)胞的特異性細(xì)胞結(jié)合
計(jì)數(shù)各個(gè)細(xì)胞系(用獼猴和人IL12Ri3 1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BaF3細(xì)胞；用獼猴IL12R3 1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK EBNA和Jurkat細(xì)胞)的細(xì)胞，并在PBS/3 % FCS/0. 02 % NaN3 (FACS緩沖液)中調(diào)整至&107個(gè)細(xì)胞/ml。在V型底的96孔微量滴定板(NUNCTM，Wiesbaden，德國) 中進(jìn)行FACS染色，并且將每孔IxlO5個(gè)細(xì)胞與稀釋于FACS緩沖液中的a)純化的Fab片段或 b)純化的IgG4或者c)陽性對(duì)照抗體(小鼠抗IL12R3 1，R&D Systems,目錄號(hào):MAB839)混合并在40°C孵育1小時(shí)。然后用200 μ 1 FACS緩沖液/孔洗滌細(xì)胞2次，并加入100 μ 1已經(jīng)1 200稀釋于FACS緩沖液中的藻紅蛋白綴合的山羊抗人IgG(H+L)第二抗體(Jackson ImmunoResearch)。在4°C孵育45分鐘后，用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，重懸于100 μ 1的 FACS緩沖液中，并在FACSCaliburTM(Becton Dickinson)中通過細(xì)胞的FL2熒光強(qiáng)度測(cè)量 IL12Ri3 1特異性抗體的細(xì)胞表面結(jié)合。4.體內(nèi)/離體功能性測(cè)定法4. 1獼猴藥效學(xué)(PD)測(cè)定法將肝素化的血液樣品分配在96U型孔板(190μ 1/孔)中。將重組人IL12(R&D Systems ；終濃度100ng/ml)和IL18(MBL ；終濃度50ng/ml)加入到每孔中，并輕輕混合平板 3分鐘。在37°C，6% CO2中孵育M小時(shí)后，將平板2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。收集血漿并保存于_80°C直到進(jìn)一步處理。如由生產(chǎn)商(UcyiTechBiosciences, Utrecht)所述，用 NHP 特異性 ELISA 試劑盒 (CT711、CT148 和 CT141)進(jìn)行 IL2、TNFa 和 INFy 評(píng)估。對(duì)于PD讀出，通過在每一樣品中發(fā)現(xiàn)的淋巴細(xì)胞數(shù)校正以pg計(jì)的INFY/ml結(jié)果，最終表示為pg/ΙΟ6淋巴細(xì)胞。對(duì)于檢測(cè)循環(huán)的IL2/TNF a /INF γ水平，將結(jié)果表示為pg細(xì)胞因子/ml。4. 2大鼠體內(nèi)相容性測(cè)定用定義劑量的mAb注射大鼠，并在幾個(gè)間隔獲取血液樣品來監(jiān)測(cè)最大血漿濃度和清除速率，以測(cè)定血漿半衰期時(shí)間。因?yàn)轭A(yù)期與大鼠目標(biāo)沒有交叉反應(yīng)，所以也預(yù)期沒有與目標(biāo)相關(guān)的作用(內(nèi)化、轉(zhuǎn)換)影響結(jié)果。4.3 CD45RBhi移植的炎性腸病小鼠模型為了誘發(fā)以重量損失為特征的疾病，通過FACS分選術(shù)從BALB/c小鼠脾分離 CD4+CD45RBHi T淋巴細(xì)胞，并注射(2xl05個(gè)細(xì)胞/小鼠，靜脈內(nèi))到10周齡雌性SCID小鼠中(第0天)。陰性對(duì)照小鼠靜脈內(nèi)接受PBS，并且將在每一籠中的一只上述小鼠作為標(biāo)記以監(jiān)測(cè)在該免疫缺陷群體中可能的感染。在第1天、第7天、第14天和第21天，通過皮下注射mAb (抗IL12p40克隆C17. 8或抗IL12Ri3 1抗體或同種型對(duì)照)或PBS使每組小鼠接受治療。在研究期間和最后監(jiān)測(cè)每只小鼠的體重。結(jié)果實(shí)施例1 拮抗物抗人IL12R β 1抗體候選物的鑒定1. 1在直接包被的IL12R0 Ι/Fc上的噬菌體淘選在直接包被于Maxisorp的IL12R3 Ι/Fc上的淘選產(chǎn)生了在直接包被IL12R3 1/ Fc上篩選中的353個(gè)一級(jí)命中。序列分析產(chǎn)生30個(gè)唯一的Fab序列。一個(gè)Fab在HCDR2、 IXDRl和IXDR2中具有幾個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，并因此將其排除于進(jìn)一步分析之外。1. 2在通過抗Fc抗體捕獲的IL12Ri3 1上的淘選
在通過山羊抗人IgG Fcy特異性抗體捕獲的IL12Ri3 1/Fc上的淘選和隨后在 IL12Ri3 1/Fc捕獲的抗原上的一級(jí)篩選產(chǎn)生了 75個(gè)一級(jí)命中。序列分析顯示8個(gè)唯一的 Fab序列。1. 3在Baf3/IL12R3 1表達(dá)的細(xì)胞上的全細(xì)胞淘選包括在Baf3/IL12R0 1表達(dá)的細(xì)胞上3輪選擇的全細(xì)胞淘選(WCP)包括在Baf3 親本細(xì)胞上的吸附步驟。在直接包被的抗原上鑒定了 112個(gè)一級(jí)命中，并在捕獲的抗原上鑒定了 122個(gè)一級(jí)命中。對(duì)于差異細(xì)胞淘選(DCP)，第一輪淘選在細(xì)胞上進(jìn)行，而第2輪在 IL12Ri3 1/Fc直接包被的Maxisorp上進(jìn)行，然后再在細(xì)胞上進(jìn)行第3輪。DCP的一級(jí)篩選顯示了在直接包被的抗原上的50個(gè)命中和在捕獲的抗原上的51個(gè)命中。總共鑒定了 14 個(gè)另外的唯一 Fab，ll個(gè)來自WCP和3個(gè)來自DCP。在細(xì)胞淘選中再次鑒定了來自以前在 ILURii 1/Fc (直接和捕獲)上淘選的4個(gè)Fab。在ELISA中，總共鑒定了 52個(gè)識(shí)別人IL12R0 1/Fc的Fab。1.4在ELISA中表征Fab，包括與人IL4Ra/Fc的交叉反應(yīng)在ELISA中測(cè)試了與人ILURβ 1/Fc和人IL4Ra/Fe的結(jié)合。將1 μ g/ml和 10 μ g/ml的每一 Fc融合蛋白質(zhì)直接包被于Maxisorp上，平行地，通過抗Fc捕獲1 μ g/ml 和10 μ g/ml的每一 Fc融合蛋白。一個(gè)Fab在抗原捕獲模式中顯示出與IL4Ra /Fe的一些交叉反應(yīng)，但與直接包被的IL4Ra/Fe未顯示出結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。將該Fab排除于進(jìn)一步分析之外。全部其他經(jīng)測(cè)試的Fab在直接包被的和捕獲的抗原二者上的都顯示與人 IL12Ri3 1/Fc的特異結(jié)合，并不與人IL4Ra /Fe結(jié)合。1. 5 FACS分析在IL12R0 1轉(zhuǎn)染的Baf3細(xì)胞上的!^ab通過FACS分析與Baf3細(xì)胞上表達(dá)的人IL12Ri3 1/Fc的結(jié)合。首先檢測(cè)了人 IL12Ri3 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的兩種細(xì)胞群體，所述兩種細(xì)胞群體具有人IL12Ri3 1的不同表達(dá)水平。 兩輪FACS分選導(dǎo)致了均一性細(xì)胞群體的檢出。52個(gè)ELISA陽性Fab中的48個(gè)顯示出與人 IL12Ri3 1轉(zhuǎn)染的BaF3細(xì)胞的FACS結(jié)合，并將其用于進(jìn)一步分析。1. 6使用Fab抗體的IL12和IL23結(jié)合抑制測(cè)定法(BioVeris)分析FACS陽性Fab對(duì)于IL12和IL23受體結(jié)合的抑制。26個(gè)Fab在BioVeris 中顯示出IL12/IL12R^ 1結(jié)合抑制，而僅14個(gè)Fab在BioVeris 中顯示出IL23/IL12R^ 1 結(jié)合抑制。不同的大小、稍微不同的結(jié)合表位或者簡(jiǎn)單地不同配體受體親和性都可能造成這種差異。明顯地，12個(gè)Fab檢測(cè)到了平行的IL12和IL23/IL12R^ 1結(jié)合抑制。一般地， 與IL23抑制比較，從IL12抑制獲得的EC50值要稍低(表1)。12個(gè)Fab中的1個(gè)由于在 ELISA中與rh IL4Ra/Fc交叉反應(yīng)結(jié)合，所以將其排除。最后，選擇了 52個(gè)Fab中的11 個(gè)用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)。11個(gè)Fab中的3個(gè)來源于細(xì)胞淘選，而8個(gè)來自直接或捕獲模式的在 IL12R3 1/Fc上的淘選。EC50值范圍為低nM至幾百nM(見表1)。表1 在Bioveris中IL12和IL23受體結(jié)合抑制
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權(quán)利要求
1.分離的抗體或包含針對(duì)靶標(biāo)IL12Rβ1多肽(SEQ ID NO 41)的抗體的抗原結(jié)合部分的蛋白質(zhì)，其特征在于所述抗體或蛋白質(zhì)以IOOnM或更小的Kd與IL12Ri3 1多肽結(jié)合，并且如在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法中測(cè)量的，其抑制IL12和/或IL23與IL12Ri3 1多肽結(jié)合。
2.權(quán)利要求1所述的分離的抗體或蛋白質(zhì)，其中所述抗體或蛋白質(zhì)另外地以約InM或更小的IC5tl抑制人血細(xì)胞中IL12依賴性的IFNy產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其是完全人抗體或人源化的抗體。
4.權(quán)利要求1或2所述的抗體，其包含突變的或化學(xué)修飾的氨基酸Fc區(qū)，其中所述突變的或化學(xué)修飾的Fc區(qū)與野生型Fc區(qū)比較，沒有ADCC活性或者提供了降低的ADCC活性。
5.權(quán)利要求4所述的抗體，其中所述突變的或化學(xué)修飾的氨基酸Fc區(qū)是沉默的IgGl Fc區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其基本上由針對(duì)IL12Ri31多肽(SEQ ID NO 41)的抗體的聚乙二醇化抗原結(jié)合部分組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，其至少包含具有與選自SEQ ID NO 9-12的重鏈區(qū)CDR3序列至少60、70、80、90、95或100百分比序列同一性的重鏈區(qū) CDR3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含具有與SEQID NO :29-32的至少一個(gè)至少60、70、80、90、95或100百分比序列同一性的Vh多肽序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含具有與SEQID NO 25-28的至少一個(gè)至少60、70、80、90、95或100百分比序列同一性的\多肽序列。
10.抗體，其包含以下之一(a)SEQ ID NO :29的重鏈序列和SEQ ID NO 25的輕鏈序列；(b)SEQID NO 30的重鏈序列和SEQ ID NO 26的輕鏈序列；(c)SEQID NO 31的重鏈序列和SEQ ID NO 27的輕鏈序列；或(d)SEQID NO 32的重鏈序列和SEQ ID NO 28的輕鏈序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含具有與權(quán)利要求10 的至少一個(gè)抗體的Vh和Vl對(duì)應(yīng)序列至少60、70、80、90、95或100百分比序列同一性的Vh和Vl序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含包含選自SEQID NO :1-4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；包含選自SEQ ID NO :5_8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； 包含選自SEQ ID NO 9-12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R3 ；包含選自SEQ ID NO :13-16 的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ；包含選自SEQ ID NO :17-20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū) ⑶R2 ；和包含選自SEQ ID NO 21~24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R3。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，其與IL12Ri31的結(jié)合受權(quán)利要求10的至少一個(gè)抗體交叉阻斷。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，其交叉阻斷權(quán)利要求10的至少一個(gè)抗體與IL12Ri3 1的結(jié)合或者其與IL12Ri3 1的結(jié)合受權(quán)利要求10的至少一個(gè)抗體交叉阻斷。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，用作藥物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，用于治療受IL12Ri31調(diào)節(jié)的或者可以通過抑制IFNy產(chǎn)生而得到治療的病理疾病。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，用于治療自身免疫和炎癥疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病或炎性腸病。
18.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)，所述抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)與一種或多種可藥用賦形劑、稀釋劑或載體組合。
19.分離的核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)。
20.克隆或表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求19所述的一個(gè)或多個(gè)核酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述克隆或表達(dá)載體，其包含選自SEQID No 33-40的至少一個(gè)核酸或者編碼至少一個(gè)⑶R區(qū)的片段。
22.宿主細(xì)胞，其包含一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求20-21所述的克隆或表達(dá)載體。
23.用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求22所述的宿主細(xì)胞，并分離所述抗體或功能性蛋白質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的抗體在制備用于治療自身免疫疾病和炎癥疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病或炎性腸病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及與IL12Rβ1(異二聚IL12受體(連同IL12Rβ2鏈)的非信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈)以及IL23受體(連同IL23Rα鏈)特異結(jié)合的抗體。本發(fā)明更具體地涉及能抑制T細(xì)胞IL12/IL18誘導(dǎo)的IFNγ產(chǎn)生，是IL12和IL23受體拮抗劑的具體抗體，以及將所述抗體用于治療可以通過抑制IFNγ產(chǎn)生來治療的病理疾病的組合物和方法，所述病理疾病為例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病或炎性腸病或者其他自身免疫和炎癥疾病。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102414223SQ201080018648
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者C·厄塞, C·施韋爾茨勒, D·德拉杜卡塔, 埃雷拉 J·M·卡瓦利多, M·巴德羅夫, U·杰格 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司