專利名稱：一種山莨菪中生物堿的前處理方法
技術領域：
本發(fā)明涉及天然藥物的前處理，具體的說是山莨菪中生物堿的前處理方法，主要涉及山莨菪中生物堿的提取和SPE過程。
背景技術：
藏藥山莨菪為爺科東莨菪屬植物山莨菪Scopolia tangutica Maxim.的根.具有解痙、鎮(zhèn)痛、催眠作用的功效(郭鵬舉等，青海地道地產(chǎn)藥材.西安陜西科學技術出版社，1996)。主產(chǎn)于甘肅、青海、西藏、四川、云南等省區(qū)。其中，以東莨菪堿、莨菪堿和樟柳堿等為代表的托品烷類生物堿是山莨菪的主要活性成分(周云龍，植物生物學，2004)。藥理研究表明，山直菪中的托品燒類生物喊具有解疫、鎮(zhèn)痛等功效，(許環(huán)琪等，分析試驗室，2009,12)。由于托品烷類生物堿的多種藥理學活性，山莨菪中托品烷類生物堿的研究一直是人們的研究熱點。但生物堿在天然產(chǎn)物中往往含量較低，如果不利用有效的前處理方法對生物 堿進行富集，很難實現(xiàn)天然產(chǎn)物中生物堿的分離分析和分離制備。所以，天然產(chǎn)物中生物堿的前處理方法一直都是研究者關注的熱點。在已有的報道中，生物堿類化合物的前處理方法研究頗受青睞。在這些前處理方法中，液液萃取由于具有處理樣品量大等優(yōu)點而被廣泛應用(J. Zhang等，Journal ofSeparation Science，2009，32，1401)，但液液萃取也存在有機溶劑消耗大，容易乳化，選擇性低等缺點。因此除液液萃取外，其它的前處理方法也受到很大程度的重視，如固相萃取。固相萃取有效的克服了液液萃取有機溶劑消耗大，容易乳化等缺點，為生物堿的前處理開辟了新的有力途徑。同時，材料的多祥性也是固相萃取的一大優(yōu)勢。多祥的固相萃取材料可供研究者選擇，以應對不同樣品處理的需要，為快速、有效的處理樣品提供了有力保證。在眾多的固相萃取材料中，C18是廣泛使用的ー種材料(L. Kursinszki等,Journal ofChromatography A, 2005, 32,1091)。在利用C18處理生物堿的過程中，可以采用不同的洗脫劑，根據(jù)分析物極性的差異，將提取物分成若干片段。相比傳統(tǒng)的液液萃取，利用C18的固相萃取方法在選擇性上已經(jīng)有很大的改進，而且具有溶劑消耗少，可避免乳化現(xiàn)象等優(yōu)點，但C18固相萃取材料所提供的選擇性仍然不能滿足生物堿高選擇性富集的需要。為了進ー步提高生物堿選擇性富集的效果，研究者們提出將陽離子交換材料用于生物堿的前處理(T. Mroczek 等，Journal of Chromatography A, 2002, 29,949)。生物喊在酸性甚至中性及弱堿性條件下以陽離子形式存在，而非生物堿以不帶電荷或者陰離子形式存在，當用陽離子交換材料處理提取物時，僅生物堿被離子交換作用保留下來，而非生物堿被除去。傳統(tǒng)的固相萃取方法通常在水溶液下進行，而生物堿中往往存在ー些疏水性較強的生物堿化合物，這些化合物很難在水溶液中溶解，所以傳統(tǒng)的固相萃取方法較難實現(xiàn)這類生物堿的選擇性富集。疏水性較強的生物堿在有機溶劑中較容易溶解，發(fā)展有機溶劑下進行的固相萃取方法以富集這類生物堿，對這類生物堿的藥物開發(fā)及分離分析工作十分重要
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種山莨菪中生物堿的前處理方法，主要涉及生物堿的提取以及固相萃取選擇性富集生物堿過程。其利用硅膠基質(zhì)的強陽離子交換高效地從山莨菪提取物選擇性的富集生物堿，該方法可廣泛用于山莨菪中生物堿的分離分析和分離制備。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為ー種山莨菪中生物堿的前處理方法，I)提取稱取山莨菪原藥材，加入其重量8-12倍的重量濃度70% -95%こ醇于70-100攝氏度提取，過濾，并于濾渣中加入こ醇溶液重復上述提取、過濾過程0-3次，毎次提取1-3小時，合并提取液并濃縮至相對密度為I. 0-1. 2的浸膏，得到山莨菪醇提物組分； 2)固相萃取SPE過程a.將山莨菪醇提物溶解到純甲醇中，配成粗堿溶液；b.取硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX)SPE柱，用純甲醇活化、平衡，取粗堿溶液上樣；c.用3-10倍柱體積甲醇清洗SPE柱以除去粗堿中的非生物堿；d.最后用3-10柱體積高氯酸銨-甲醇溶液洗脫獲得生物堿；其中高氯酸銨于甲醇溶液濃度為150-250mM。所述浸膏至生物堿富集片段的獲得過程是指于浸膏中加入甲醇，使其于甲醇體積濃度達到20-80% (最好為20-50% )上SPE柱；或，使其于甲醇體積濃度達到20-80% (最好為20-50% )，如果加入浸膏后甲醇液混濁時，需室溫靜置1-3小時，過濾，取濾液上SPE柱；取硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX) SPE柱，用純甲醇活化、平衡，取粗堿溶液上樣；用3-10倍柱體積甲醇清洗SPE柱以除去粗堿中的非生物堿；最后用3-10柱體積高氯酸銨-甲醇溶液洗脫獲得生物堿，以得到生物堿富集片段，用于山莨菪中生物堿的分離分析和分離制備。所獲得生物堿的定量分析過程以粒徑3-5微米的C18硅膠鍵合固定相為色譜填料，以こ腈(A)和水(B)和離液鹽系統(tǒng)(C)為流動相，將山莨菪生物堿富集片段于色譜上進行梯度洗脫；洗脫梯度(V/V)為:0-20分鐘，10% -30%六，20%(;20-30分鐘，30-50%八，20% C ；其中離液鹽系統(tǒng)由以下成分組成，50-150毫摩爾每升高氯酸鈉、30-100毫摩爾每升磷酸ニ氫鈉和1-3毫升高氯酸，通過液相色譜分析對生物堿中的成份進行定量。本發(fā)明的優(yōu)點I、對生物堿的選擇性富集效果好。本發(fā)明采用了先進的固相萃取填料和處理方法。利用硅膠基質(zhì)強陽離子交換固相萃取柱提供的對生物堿的高選擇性，可以保證幾乎所有非生物堿的除去以及生物堿的富集。2、強大的疏水性生物堿的富集能力。本發(fā)明中采用的硅膠基質(zhì)的強陽離子交換固相萃取材料相對于聚合物基質(zhì)的強陽離子交換材料，具有在有機溶劑中高穩(wěn)定性的特點。所以，硅膠基質(zhì)強陽離子交換SPE材料可用于本發(fā)明中，發(fā)展非水SPE方法，用于疏水性生物堿的富集，疏水性粗堿的處理，以及醇提生物粗堿的無稀釋SPE處理。此外，硅膠基質(zhì)的SCX也可以用在傳統(tǒng)的固相萃取方法中，用于極性生物堿的富集。
3.重現(xiàn)性好。本發(fā)明利用硅膠基質(zhì)的強陽離子交換固相萃取材料穩(wěn)定的性能，以及該材料良好的批次重現(xiàn)性，可以保證樣品前處理方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。4.能極大的方便了山莨菪中生物堿的分離分析和分離制備。本發(fā)明對生物堿所具備的高選擇性，可有效的去除山莨菪粗堿中的非生物堿，極大的方便了山莨菪中生物堿的分離分析及分離制備。


圖I本發(fā)明實施例I和2用于東莨菪堿和莨菪堿的選擇性富集色譜圖(λ =204nm)；圖2本發(fā)明實施例I用于山莨菪中生物堿的選 擇性富集質(zhì)譜圖；圖3本發(fā)明實施例I用莨菪堿和東莨菪堿做SPE方法驗證(λ = 204nm)；圖4本發(fā)明中實施例2所涉及山莨菪中東莨菪堿和莨菪堿的定量分析(λ =204nm)。
具體實施例方式實施例I :山莨菪中生物堿的選擇性富集以托品烷類生物堿為代表的生物堿在山莨菪中廣泛存在，并因其高的活性受到普遍關注。但山莨菪的提取物中存在大量的非生物堿，對生物堿的分離分析和分離制備存在極大的干擾。尤其是需要在低波長下檢測的托品烷類生物堿，非生物堿的干擾非常嚴重。為了除去提取物中非生物堿并對生物堿，尤其是ー些低豐度的生物堿進行富集，生物堿的前處理方法尤為重要。為了驗證該前處理方法的可行性，選取具有代表性的托品烷類生物堿一東莨菪堿和莨菪堿標準品進行了方法驗證。分別取10毫克莨菪堿和東莨菪堿溶于甲醇，配成I毫克每毫升的莨菪堿-甲醇溶液和東莨菪堿-甲醇溶液。取IOOmg硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX)SPE柱，用純甲醇活化、平衡，取I毫升莨菪堿-甲醇溶液和I毫升東莨菪堿-甲醇溶液上樣。用3毫升甲醇清洗SPE柱。最后用3毫升250毫摩爾每升的高氯酸銨-甲醇溶液洗脫生物堿。經(jīng)過液相分析發(fā)現(xiàn)(圖I)，生物堿富集在了高氯酸銨-甲醇洗脫液中，由此可知，該方法能用于生物堿的有效富集。從理論分析可知，非生物堿由于缺乏陽離子交換作用的保留，在甲醇洗脫部分即可被除去，從圖I可以看出，生物堿并未在上樣和甲醇洗脫部分出現(xiàn)，由此可以推測，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)生物堿和非生物堿的分離。驗證了前處理方法對生物堿的富集的有效性之后，將該方法應用到山莨菪提取物的前處理中。首先，稱取山莨菪原藥材95克，加入I升95%こ醇80攝氏度回流提取、過濾，濾渣重復上述提取過程I次，每次提取3小時，將提取液合并濃縮，得浸膏I. 65毫升(相對密度I. 05);然后，將上述發(fā)展的SPE方法用于山莨菪浸膏的簡化。將I毫升山莨菪醇浸膏溶解到純甲醇中，配成5毫升粗堿溶液。取硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX)SPE柱(100毫克，3毫升)，用3毫升純甲醇活化、平衡，取O. 2毫升粗堿溶液上樣。用3毫升甲醇清洗SPE柱以除去粗堿中的非生物堿。最后用3毫升250毫摩爾每升的高氯酸銨-甲醇溶液洗脫生物堿。最后，我們得到了山莨菪的生物堿富集片段，該片段所含的非生物堿極少，極大的簡化了山莨菪中生物堿的分離分析和分離制備工作。
以粒徑5微米的C18硅膠鍵合固定相為色譜填料，以含O. 08% TFA的こ腈(A)和O. 1% TFA⑶為流動相，將山莨菪生物堿富集片段和SPE處理前的樣品進行分析比較。洗脫梯度(V/V)為0-20min,5% -50% A ；20-30min, 50-90% A。為了檢驗該前處理方法對生物堿選擇性富集的有效選那個，對SPE過程中得到的生物堿富集片段進行了質(zhì)譜分析。采用電噴霧離子(ESI)源正離子掃描，電噴霧電壓為3200伏，掃描范圍m/zlOO-lOOO，霧化氣壓カ霧化溫度350攝氏度，加熱毛細管溫度120攝氏度。從圖3分析可知，該片段中化合物的[M+H]+幾乎都是偶數(shù)。根據(jù)氮規(guī)則可知，從SPE洗脫下來的生物堿富集片段幾乎都是含氮化合物。主要化合物的[M+H] +列于表I。由此可知，本發(fā)明對山莨菪中的生物堿具有很好的選擇性富集效果。綜合圖1，圖2及表I可看出，經(jīng)過SPE之后的樣品得到極大的簡化，為山莨菪中生物堿尤其是托品烷類生物堿的分離分析及分離制備提供了極大的方便。表ISPE洗脫下來的生物堿富集片段中主要化合物的[M+H] + 峰編號[Μ+ΗΓ峰質(zhì)荷峰編號[Μ+ΗΓ峰質(zhì)_比_荷比_
1320. 15019356. 1859
2304. 154310
3588. 4106
4306. 167611
5356.1861
6474. 257012 340. 1523Γ 7472.2421 13 396. 7946
8276.157614
370. 2009
290. 174215
509. 8804
502. 289616332. 0913實施例2 山莨菪中東莨菪堿和莨菪堿的定量分析東莨菪堿和莨菪堿是山莨菪中常見的兩種生物堿，由于具有高的活性和藥用價值，受到普遍的關注。因此，山莨菪藥材中東莨菪堿和莨菪堿的定量分析對山莨菪藥材的質(zhì)量控制具有重要的意義。本實施案例中，將我們開發(fā)的生物堿前處理方法，用于山莨菪中這兩種生物堿的定量分析，為它們的定量分析開發(fā)ー種簡單可行的新方法。為了驗證該前處理方法處理東莨菪堿和莨菪堿的可行性，在處理實際樣品之前，先用東莨菪堿和莨菪堿標準品進行了驗證。首先，分別取10毫克莨菪堿和東莨菪堿溶于甲醇，配成I毫克每毫升的莨菪堿-甲醇溶液和東莨菪堿-甲醇溶液。取IOOmg硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX)固相萃取柱，用純甲醇活化、平衡，取I毫升莨菪堿-甲醇溶液和I毫升東莨菪堿-甲醇溶液上樣。用3毫升甲醇清洗SPE柱。最后用3毫升250毫摩爾每升的高氯酸銨-甲醇溶液洗脫SPE柱上富集的生物堿。收集上述SPE洗脫片段，并進行了色譜分析(如圖I)。色譜分析方法如下以粒徑5微米的C18硅膠鍵合固定相為色譜填料，以含O. 08% TFA的こ腈(A)和O. 1% TFA⑶為流動相，將山莨菪生物堿富集片段和SPE處理前的樣品進行分析比較。洗脫梯度(V/V)為0-20min，5% -50% A ;結果發(fā)現(xiàn)，只在鹽甲醇洗脫片段有東莨菪堿和莨菪堿存在。此結果說明，該前處理方法能對東莨菪堿和莨菪堿進行很好的保留、富集。該前處理方法在處理標準品得到較好的效果之后，我們將它應用到山莨菪提取物得處理當中。首先，稱取山莨菪原藥材95克，加入I升95%こ醇80攝氏度回流提取3小吋，過濾，并對藥渣重復上述提取過程I次，合并提取液并濃縮，得浸膏I. 65毫升(相對密度I. 0-1. 2);然后，用上述開發(fā)的SPE方法處理所的浸膏。將I毫升山莨菪醇浸膏溶解到純甲醇中，配成5毫升粗堿溶液。取硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX)SPE柱(100毫克，3毫升)，用3毫升純甲醇活化、平衡，取O. 2毫升粗堿溶液上樣。用3毫升甲醇清洗SPE柱以除去粗堿中的非生物堿。最后用3毫升250毫摩爾 每升的高氯酸銨-甲醇溶液洗脫生物堿。最后，我們得到了山莨菪的生物堿富集片段，該片段所含的非生物堿極少，極大的簡化了山莨菪中生物堿的定量分析過程并提高了定量的準確度。雖然山莨菪的提取物在前處理過程中已經(jīng)得到了很好的簡化，但現(xiàn)有的分離分析方法仍然無法將待分析物及其干擾峰分離。因此，在已有的分離分析方法基礎上我們發(fā)展了新的液相分析方法。以粒徑5微米的C18硅膠鍵合固定相為色譜填料，以こ腈(A)和水(B)和離液鹽系統(tǒng)(C)為流動相，將山莨菪生物堿富集片段進行梯度洗脫。其中離液鹽系統(tǒng)由以下成分組成，100毫摩爾每升高氯酸鈉、50毫摩爾每升磷酸ニ氫鈉和2毫升高氯酸。洗脫梯度(V/V)為0-20 分鐘，10% -30% A,20% C ；20-30 分鐘，30-50% A,20% C。有效地前處理方法結合適當?shù)纳V分離方法，原本在提取物中很難確定的東莨菪堿和莨菪堿色譜峰被明顯的顯現(xiàn)了出來，如圖4所示，在該方法中，實現(xiàn)了東莨菪堿和莨菪堿與它們干擾峰的基線分離，為山莨菪中這兩種生物堿的定量分析提出了一種簡單而有效的新方法。利用東莨菪堿和莨菪堿標準品對山莨菪藥材中的東莨菪堿和莨菪堿進行定量分祈。實驗過程中，所得的相關參數(shù)如下表2線性范圍
名稱X范圍(mg/mL)ABr2
η
山莨菪堿 0.01-0.86071. 6 18. 689η為線性曲線的取點數(shù)表3方法的重現(xiàn)性
權利要求
1.一種山莨菪中生物堿的前處理方法，其特征在于 1)提取稱取山莨菪原藥材，加入其重量8-12倍的重量濃度70%— 95%乙醇于70-100攝氏度提取，過濾，并于濾渣中加入乙醇溶液重復上述提取、過濾過程0-3次，每次提取1-3小時，合并提取液并濃縮至相對密度為I. 0-1. 2的浸膏，得到山莨菪醇提物組分； 2)SPE過程 a.將山莨菪醇提物溶解到純甲醇中，配成粗堿溶液； b.取硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX)SPE柱，用純甲醇活化、平衡，取粗堿溶液上樣； c.用3-10倍柱體積甲醇清洗SPE柱以除去粗堿中的非生物堿； d.最后用3-10柱體積高氯酸銨-甲醇溶液洗脫獲得生物堿；其中高氯酸銨于甲醇溶液濃度為150-250mM。
2.按照權利要求I所述的方法，其特征在于所述浸膏至生物堿富集片段的獲得過程是指于浸膏中加入甲醇，使其于甲醇體積濃度達到20-80%上SPE柱；或，使其于甲醇體積濃度達到20-80%，如果加入浸膏后甲醇液混濁時，需室溫靜置1-3小時，過濾，取濾液上SPE柱； 取硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX) SPE柱，用純甲醇活化、平衡，取粗堿溶液上樣；用3-10倍柱體積甲醇清洗SPE柱以除去粗堿中的非生物堿；最后用3-10柱體積高氯酸銨-甲醇溶液洗脫獲得生物堿，以得到生物堿富集片段，用于山莨菪中生物堿的分離分析和分離制備。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于 所述浸膏至生物堿富集片段的獲得過程是指于浸膏中加入甲醇，使其于甲醇體積濃度達到20-50%上SPE柱；或，使其于甲醇體積濃度達到20-50%，如果加入浸膏后甲醇液混濁時，需室溫靜置1-3小時，過濾，取濾液上SPE柱。
4.按照權利要求I或2所述的方法，其特征在于 所獲得生物堿的定量分析過程以粒徑3-5微米的C18硅膠鍵合固定相為色譜填料，以乙腈(A)和水(B)和離液鹽系統(tǒng)(C)為流動相，將山莨菪生物堿富集片段于色譜上進行梯度洗脫；洗脫梯度(V/V)為0-20 分鐘，10%-30%A，20%C ；20-30 分鐘，30_50%A，20%C ； 其中離液鹽系統(tǒng)由以下成分組成，50-150毫摩爾每升高氯酸鈉、30-100毫摩爾每升磷酸二氫鈉和1-3毫升高氯酸，通過液相色譜分析對生物堿中的成份進行定量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種山莨菪中生物堿的前處理方法，該方法適用于山莨菪中生物堿的分離制備及定性定量工作中的樣品前處理。方法內(nèi)容主要有是將山莨菪藥材粉碎后加乙醇溶液提取，然后收集提取液，濃縮得浸膏，取浸膏用硅膠基質(zhì)的強陽離子交換(SCX)固相萃取(SPE)材料對粗堿中的生物堿進行選擇性富集，以得到生物堿富集片段，用于山莨菪中生物堿的分離分析及分離制備。本發(fā)明選擇性好、所得餾分生物堿含量高，且能大大提高山莨菪中生物堿的分離分析及分離制備效率。前處理方法運行過程重復性高和可操作性好，易于實現(xiàn)標準化和產(chǎn)業(yè)化，對高效選擇性獲取山莨菪中生物富集堿餾分具有一定的指導意義。
文檔編號C07D451/10GK102850343SQ20111017991
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權日2011年6月29日
發(fā)明者梁鑫淼, 龍珍, 張秀莉, 王超然, 郭志謀 申請人:中國科學院大連化學物理研究所