国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種植酸酶及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:524624閱讀:327來源:國知局
      一種植酸酶及其應(yīng)用的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種新型植酸酶及其應(yīng)用,其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發(fā)明的重組植酸酶作為飼料添加劑,能顯著提高肉雞的日采食、日增重,降低料肉比,增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。此外,在日糧中添加本發(fā)明的重組植酸酶可使肉雞的磷排泄量比對照組降低13.8%,說明本發(fā)明的植酸酶能有效提高肉雞對飼料中磷的吸收率,減少含磷廢物的排泄,有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
      【專利說明】一種植酸酶及其應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于功能基因篩選【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種植酸酶及其應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002]植酸酶(Phytase)即肌醇六磷酸水解酶(EC3.1.3.8),是催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱。
      [0003]植酸酶作為一種優(yōu)良的飼料添加劑目前被廣泛地應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中,它能夠提高動物對磷元素的利用率,以及蛋白質(zhì)、氨基酸、各種礦物元素的利用率,解除動物植物性飼料中植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用,提高植物性飼料的營養(yǎng)價值,同時降低動物排泄物對環(huán)境的污染,在動物生產(chǎn)以及在環(huán)境保護(hù)中,是極為有效的一種添加劑,具有重要的應(yīng)用價值。另外,農(nóng)業(yè)部、環(huán)保部聯(lián)合印發(fā)的《全國畜禽養(yǎng)殖污染防治“十二五”規(guī)劃》中指出,將重點治理畜禽養(yǎng)殖污染,這也給植酸酶應(yīng)用提供了更有利的機(jī)遇。
      [0004]目前研究的植酸酶主要來源于Saccharomyces cerevisiae (Bajwa etal.,1984;Meyhack et al., 1982) > Aspergillus niger(MacRae, 1998) > A.terreus 和Myceliophthora thermophila(Van Loon, 1995)>A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt etal., 1993;Ehlich et al., 1993;Bin Y et al.,1998)等。不同來源的植酸酶具有不同的酶學(xué)性質(zhì),但目前的植酸酶普遍存在耐熱性不高,表達(dá)量低的問題,制約了植酸酶在飼料領(lǐng)域更為廣泛的應(yīng)用。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005]本發(fā) 明的目的是提供一種新型植酸酶及其應(yīng)用,本發(fā)明從黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)中得到一個編碼植酸酶的基因,并將該基因進(jìn)行克隆,在黑曲霉(Aspergillus niger)中表達(dá),篩選得到高效表達(dá)植酸酶的基因工程菌株,從而為高密度發(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
      [0006]本發(fā)明一方面提供了一種來源于黑葡萄穗霉的植酸酶,其特征在于:
      [0007]I)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的植酸酶;
      [0008]2)在I)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的,具有I)中植酸酶活性的酶。
      [0009]本發(fā)明另一方面提供了編碼上述植酸酶的基因,其一種核苷酸序列為SEQ IDN0:2。
      [0010]本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體,其包含上述編碼植酸酶基因的核苷酸序列。
      [0011]本發(fā)明另一方面提供了一種表達(dá)宿主細(xì)胞,其攜帶有表達(dá)上述植酸酶基因的表達(dá)載體。
      [0012]上述表達(dá)宿主細(xì)胞為黑曲霉(Aspergillus niger)。
      [0013]本發(fā)明的植酸酶用于制備飼料添加劑。
      [0014]本發(fā)明構(gòu)建的黑曲霉工程菌能高效表達(dá)植酸酶,搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示其酶活為434U/mL。本發(fā)明的植酸酶作為飼料添加劑,能顯著提高肉雞的日采食、日增重,降低料肉t匕,增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。此外,在日糧中添加本發(fā)明的重組植酸酶可使肉雞的磷排泄量比對照組降低13.8%,說明本發(fā)明的植酸酶能有效提高肉雞對飼料中磷的吸收率,減少含磷廢物的排泄,有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0015]圖1:本發(fā)明構(gòu)建的pGm-Scphy重組表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜。
      [0016]圖2:黑曲霉WLScphy發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖,其中箭頭所指59kD處為
      重組表達(dá)的植酸酶。
      [0017]圖3:重組表達(dá)的植酸酶相對酶活-溫度曲線圖。
      [0018]圖4:重組表達(dá)的植酸酶相對酶活-pH曲線圖。
      【具體實施方式】
      [0019]下面結(jié)合實例對本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通??砂闯R?guī)條件,如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件運行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是,本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不僅限于所提供的具體案例,而應(yīng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員 在本說明書基礎(chǔ)上,不需經(jīng)過創(chuàng)造性勞動就能擴(kuò)展的保護(hù)范圍。
      [0020]實施例1:植酸酶基因的克隆
      [0021]使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從黑葡萄穗霉過夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。
      [0022]以黑葡萄穗霉基因組DNA為擴(kuò)增模板擴(kuò)增黑葡萄穗霉中的植酸酶基因,其中所用到的正向引物P-F序列為(下劃線所示序列為AflII酶切位點);
      [0023]5' -AAACTTAAGATCATGGCCTGCGTCGCCTTCCTGCTCG-3'
      [0024]反向引物P-R序列為(下劃線所示序列為XbaI酶切位點):
      [0025]5' ~TCGTCTAGATCAAGCGGGTGCGCCGTCCGTCACAGTG_3'
      [0026]將該基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)從黑葡萄穗霉基因組DNA中擴(kuò)增出來。
      [0027]使用凝膠純化試劑盒(Fermentas)將上述PCR產(chǎn)物純化。用限制性內(nèi)切酶AflII和XbaI (Fermentas)對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切;同時,用限制性內(nèi)切酶Af III和XbaI對質(zhì)粒pGm進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化,并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確,對若干克隆進(jìn)行測序(InvitiOgen)。測序結(jié)果顯示,黑葡萄穗霉植酸酶的基因序列為SEQ ID NO: 2,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1;多個克隆的測序結(jié)果都一致。
      [0028]通過NCBI中的BLAST進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對發(fā)現(xiàn),本發(fā)明的植酸酶為一新的等位基因,與現(xiàn)有的植酸酶序列有明顯的區(qū)別。
      [0029]使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(Axygen)從測序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。所得I個重組質(zhì)粒為pGm-Scphy (見圖1),
      [0030]實施例2:黑曲霉工程菌株構(gòu)建及驗證
      [0031]吸取黑曲霉Gl孢子懸浮液于CMA平板中心(9cm培養(yǎng)皿),待菌落長滿整個培養(yǎng)皿,切1/4大小的培養(yǎng)基于200mL CMA液體培養(yǎng)基中,在30°C、200rpm的條件培養(yǎng)14~16h。
      [0032]用無菌Miracloth濾布收集菌絲體,并用溶液A清洗一次,在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉(zhuǎn)移到40mL原生質(zhì)體化溶液,在30°C、200rpm的條件下溫浴I~2h,用顯微鏡觀察檢測原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化進(jìn)展。
      [0033]用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體,所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生質(zhì)體溶液分裝于兩個50mL無菌的一次性離心管中,并將每管的體積用溶液B定容至45mL,在4000rpm條件下離心8min以獲得沉淀并棄去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmL溶液B中,并用血球計數(shù)板對原生質(zhì)體計數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心并棄去上清液,根據(jù)血球計數(shù)板計數(shù)結(jié)果,加入適量溶液B重懸沉淀,使得原生質(zhì)體數(shù)目在I X IO7個/mL左右。
      [0034]在冰上,將100 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的無菌15mL離心管中,每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)用I管,加入10 μ g重組質(zhì)粒pGm-Scphy,加入12.5 μ L溶液C,溫和混勻后再冰上放置20mino
      [0035]將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管,并向管中加入ImL溶液C和2mL溶液B,溫和混勻各管,所得混合物即為原生質(zhì)體混合物。向3個頂層瓊脂試管中的每一個中加入ImL上述原生質(zhì)體混合物,并立即傾倒與MMSA平板上,并將平板在30°C下培養(yǎng)7~IOd至有轉(zhuǎn)化子長出。
      [0036]按照實施例1中的方法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA,以此為模板,利用實施例1中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。PCR擴(kuò)增條件為98°C 30S ;98°C 10S,60°C 30S,72°C 120S,30個循環(huán);72°C IOmin0利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測序分析,經(jīng)過PCR反應(yīng)選育和測序驗證陽性轉(zhuǎn)化子。將所獲得的陽性工程菌命名為黑曲霉WLScphy (Aspergillusniger WLScphyX
      [0037]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLIM KH2PO4,48.156g MgSO4,加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
      [0038]溶液B:5mLlM Tris (ρΗ7.5),2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇,加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
      [0039]溶液C:250g PEG4000,2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5),加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
      [0040]原生質(zhì)體化溶液:將0.6g裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum,Sigma)溶解于40mL溶液A中,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
      [0041]MMSA 平板:0.59g 乙酰胺(Sigma) ,3.4g CsCl (Sigma),0.52g KCl,1.52gKH2P04,218.5g山梨醇,Iml微量元素(見下),20g瓊脂,加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
      [0042]MMSA 頂層瓊脂試管:0.59g 乙酰胺(Sigma), 3.4g CsCl (Sigma), 0.52g KCl,
      1.52g KH2PO4, 218.5g山梨醇,Iml微量元素(見下),IOg低熔點瓊脂糖,加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后,在培養(yǎng)基未凝固時,加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04,之后立即分裝于無菌試管中,每管10mL。
      [0043]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20,8.8g ZnSO4.7Η20,0.4gCuSO4.5Η20,0.15g MnSO4.4Η20,0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20,0.2mL 濃 HC1,完全溶解后用dlH20定容至1L,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
      [0044]CMA平板:20g葡萄糖,20g麥芽浸出物,Ig蛋白胨,15g瓊脂,加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
      [0045]CMA液體培養(yǎng)基:20g葡萄糖,20g麥芽浸出物,Ig蛋白胨,加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
      [0046]實施例3:黑曲霉工程菌的發(fā)酵和植酸酶的表達(dá)
      [0047]挑取實施例2獲得的陽性轉(zhuǎn)化子黑曲霉WLScphy,接種于30mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30°C,200rpm的條件下培養(yǎng)5d ;所得發(fā)酵液用8層紗布過濾,濾液在14000g條件下離心IOmin,收集上清液;將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖2所示,泳道2所示為黑曲霉宿主蛋白表達(dá)情況;泳道I所示為本發(fā)明黑曲霉WLScphy蛋白表達(dá)情況,其中箭頭所指59kDa處有目的蛋白條帶,與預(yù)期相符,說明本發(fā)明的植酸酶在黑曲霉中得到成功表達(dá)。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio)測定顯示其表達(dá)量約為1.Sg/L0
      [0048]實施例4:植酸酶酶活測定
      [0049]1.檢測方法
      [0050]取甲、乙兩支25mL比色管,各加入1.8mL乙酸緩沖液(PH5.0),0.2mL樣品反應(yīng)液,混勻,37°C預(yù)熱5min。在甲管中加入4mL底物溶液,乙管中加入4mL終止液,混勻,37°C反應(yīng)30min,反應(yīng)結(jié)束后甲管中加入4mL終止液,乙管中加入4mL底物溶液,混勻。靜置lOmin,分別在415nm波長處測定吸光值,通過`標(biāo)準(zhǔn)曲線用回歸直線方程計算植酸酶活性。
      [0051]酶活X = FXC/(mX 30)
      [0052]其中:X——酶活力單位,U/g (mL);
      [0053]F—試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù);
      [0054]C—根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的酶活性,U;
      [0055]m-試樣質(zhì)量或體積,g/mL;
      [0056]30——反應(yīng)時間;
      [0057]2.酶活檢測
      [0058]按照上述測定方法,取Iml上述發(fā)酵上清液進(jìn)行酶活測定。結(jié)果顯示其酶活為434U/mL,說明植酸酶基因在黑曲霉中得到高效表達(dá)。
      [0059]實施例5:植酸酶酶學(xué)性質(zhì)分析
      [0060]在ΡΗ5.0條件下,分別在30°C、40°C、50°C、55°C、6(rC條件下測定上述發(fā)酵上清液的酶活,以最高酶活為100%,計算相對酶活。結(jié)果如圖3所示,本發(fā)明的植酸酶的最適作用溫度為55°C。
      [0061]在37°C條件下,分別用 pH為 2.0,2.5,3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5、7.0 的緩沖
      液稀釋上述發(fā)酵上清液,測定酶活,以最高酶活為100%,計算相對酶活。結(jié)果如圖4所示,本發(fā)明的植酸酶的最適作用pH為5.5。
      [0062]實施例6:重組植酸酶在飼料中的應(yīng)用[0063]1、材料
      [0064]植酸酶:本發(fā)明重組表達(dá)的植酸酶,3000U/g。
      [0065]試驗動物:山東六和集團(tuán)種雞場羅斯肉雞。
      [0066]2、試驗方法
      [0067]試驗選擇健康、體重均勻的AA肉雛雞300只,共分3個處理組,每個處理組100只肉雞,每個處理組5個重復(fù),每個重復(fù)20只雞。試驗分O~18d、18~35d兩個飼養(yǎng)階段,分別飼喂處理A (正對照組)、處理B (負(fù)對照組)、處理C (添加本發(fā)明重組表達(dá)的植酸酶)。各處理組日糧配方及營養(yǎng)成分見表1、表2。
      [0068]表1;基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)水平
      [0069]
      【權(quán)利要求】
      1.一種植酸酶,包含有: 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的植酸酶; 2)在I)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的,且具有I)中植酸酶活性的酶。
      2.一種核苷酸,所述的核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的植酸酶。
      3.如權(quán)利要求2所述核苷酸,其特征在于所述核苷酸序列為SEQID N0:2。
      4.一種表達(dá)載體,所述的表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求2所述的核苷酸。
      5.—種表達(dá)宿主細(xì)胞,所述的表達(dá)宿主細(xì)胞為攜帶有權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
      6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)宿主細(xì)胞,其特征在于所述的宿主細(xì)胞為里氏木霉。
      7.權(quán)利要求1所述的植酸酶在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
      8.—種飼料添加劑,所述的`飼料添加劑包含有權(quán)利要求1所述的植酸酶。
      【文檔編號】C12N15/80GK103589700SQ201310567641
      【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
      【發(fā)明者】王華明, 徐娟, 黃亦鈞 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1