專利名稱：一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在金屬結(jié)合蛋白的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)分析中，往往需要應(yīng)用到無(wú)金屬蛋白。在 ESI-MS蛋白質(zhì)譜分析中，若蛋白中存在金屬離子會(huì)導(dǎo)致信號(hào)壓制，影響分析結(jié)果；在銅脅迫下銅結(jié)合蛋白的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，若存在過量的銅在細(xì)胞內(nèi)積累，蛋白質(zhì)中的銅結(jié)合位點(diǎn)會(huì)與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的銅結(jié)合，從而導(dǎo)致有些銅結(jié)合蛋白不能被分離或分離不完全。 因此在進(jìn)行固定金屬親和層析前，對(duì)蛋白質(zhì)溶液中的金屬離子進(jìn)行去除是非常重要的，可以大大增加銅結(jié)合蛋白的純化效率?，F(xiàn)有獲得脫金屬蛋白的方法是加入高濃度的低分子量螯合劑，如EDTA和EGTA等。 過量的螯合劑和螯合的金屬離子在隨后的步驟中去除，往往采用透析的方法。由于透析非常耗時(shí)，而且在移除螯合劑金屬?gòu)?fù)合物的同時(shí)緩沖液中的金屬離子也會(huì)重新與蛋白質(zhì)結(jié)合，影響蛋白質(zhì)脫金屬效果。在透析中采用的離子交換劑也不是對(duì)所有的蛋白都適用，如市場(chǎng)上的chelex 100可應(yīng)用于分離蛋白溶液中的金屬離子，但分子量大于1000的蛋白完全被排阻在chelex 100的顆?？障吨?。瓊脂糖是一種從海藻中提取的天然多糖，具有高親水性、高度多孔性，含較多的可活化羥基，且不與生物大分子發(fā)生特異性吸附等特征，因此被廣泛應(yīng)用于蛋白、 肽類和糖類等分離?，F(xiàn)已知連有NTA(氮川三乙酸)的瓊脂糖凝膠可有效移除蛋白中的重金屬，如 Carrer 等于 2006 年在第 385 期的 “Analytical and Bioanalytical ChemiStry”(1409-1413頁(yè))上公開了采用NTA (氮川三乙酸)的瓊脂糖凝膠移除Ca-ATPase 中的鈣離子，NTA為4配位體，結(jié)合容量略顯不足。中國(guó)專利申請(qǐng)“四配位體金屬螯合層析填料乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法”(申請(qǐng)?zhí)朇N200910196910.0)公開了一種方法，采用結(jié)合了乙二胺二乙酸的瓊脂糖凝膠進(jìn)行金屬離子的螯合，該方法制得的瓊脂糖凝膠金屬螯合能力一般，只有4個(gè)配位體，仍不能滿足現(xiàn)在蛋白質(zhì)純化的要求。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法及用該方法制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠，用于建立基于EDDS的新型金屬螯合瓊脂糖凝膠，制備出金屬結(jié)合能力強(qiáng)，結(jié)合容量大的金屬螯合瓊脂糖凝膠；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述方法制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠在移除蛋白質(zhì)中重金屬的應(yīng)用。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法，包括如下步驟(1)活化將瓊脂糖凝膠、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液混合后加入 NaBH4,緩慢攪拌下再分次加入氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷，于27 35°C下緩慢攪拌過夜后洗至中性，吸干后得到吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖；(2)偶聯(lián)向步驟(1)得到的吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖中加入碳酸鈉、乙二胺二琥珀酸三鈉(EDDS-Na3) ,NaBH4, 30 50°C下緩慢攪拌10 15小時(shí)、洗至中性后吸干，得到金屬螯合瓊脂糖凝膠。所述步驟(1)中瓊脂糖凝膠、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉的體積比為 1 1 0. 5 4，其中，氫氧化鈉濃度為0. 8mol/L。所述步驟(1)中NaBH4的加入量為所述瓊脂糖凝膠的2% (w/v)，再次加入的氫氧化鈉濃度為2mol/L，加入量為所述瓊脂糖凝膠體積的4 5倍，再次加入的環(huán)氧氯丙烷為所述瓊脂糖凝膠體積的2 3倍。所述步驟(1)中氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷再次加入時(shí)在10小時(shí)內(nèi)緩慢加入。具體地說，是將氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷在10小時(shí)內(nèi)分5次緩慢加入攪拌中的瓊脂糖凝膠中。所述步驟( 中每毫升所述吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖中加入2ml碳酸鈉溶液，0. 1
0.2gEDDS-Na3,1 ^ig NaBH4,所述碳酸鈉溶液的濃度為0. 5 3mol/L。所述步驟(1)中采用的瓊脂糖凝膠選用瓊脂糖4FF、瓊脂糖6FF、瓊脂糖CL-4B、瓊脂糖CL-6B、瓊脂糖4B和瓊脂糖6B中的任意一種。作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述步驟⑴采用s印har0Se-6B瓊脂糖，所述步驟 O)中每毫升所述吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖中加入anl 2mol/LNa2C03,0. 15g EDDS. Na3,
1.5mgNaBH4，在 50°C下緩慢攪拌 12h。所述步驟(1)和步驟(2)中將瓊脂糖凝膠吸干采用經(jīng)布氏漏斗真空吸濾干燥。所述步驟(1)和步驟O)中將瓊脂糖凝膠洗至中性具體包括先采用水洗，再用稀醋酸洗，最后進(jìn)行水洗。該方法以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，經(jīng)環(huán)氧活化后，與乙二胺二琥珀酸三鈉(S， S) -Ethylenediamine-N, N' -disuccinic acid, EDDS-Na3)偶聯(lián)，制得連接有 EDDS 的金屬螯合瓊脂糖凝膠。該金屬螯合瓊脂糖凝膠在4°C小保存在30%乙醇中備用。目前鮮有報(bào)道6配位體的金屬螯合瓊脂糖凝膠，EDTA也未見連接有瓊脂糖凝膠。 本發(fā)明乙二胺二琥珀酸瓊脂糖凝膠中的EDDS可以提供四個(gè)羧基和二個(gè)氮原子形成六配位體，螯合能力強(qiáng)，結(jié)合容量大，可以與過渡金屬穩(wěn)定螯合。如EDDS對(duì)銅的螯合常數(shù)位18.4， 而NTA僅為13.0。本發(fā)明的金屬螯合瓊脂糖凝膠可以為Ni、CU、Mn、Co和Si配位層上的所有空軌道提供孤對(duì)電子，形成的配合物更穩(wěn)定。有益效果本發(fā)明的一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法其制備工藝簡(jiǎn)單，易于放大，使用方便，可更好地應(yīng)用在復(fù)合重金屬污染環(huán)境下生長(zhǎng)的植物蛋白質(zhì)研究中重金屬離子的移除，也可應(yīng)用于其它需要移除金屬離子的蛋白質(zhì)科學(xué)研究上。本發(fā)明提供的金屬螯合瓊脂糖凝膠可應(yīng)用于移除蛋白溶液中Cu、Zn、Mn、Cd等金屬離子，結(jié)合能力強(qiáng)，結(jié)合容量大，移除率達(dá)93%。


圖1是本發(fā)明瓊脂糖凝膠活化，并與EDDS偶聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(1)活化將瓊脂糖凝膠(kphar0Se-6B)、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和0. 8mol/L氫氧化鈉溶液按照體積比1 1 0.5 4混合，然后加入后加入瓊脂糖凝膠2% (w/v)的 NaBH4,置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，然后再加入瓊脂糖凝膠體積4 5倍的2mol/L的NaOH 和2 3倍的環(huán)氧氯丙烷，(在緩慢攪拌下10小時(shí)內(nèi)分次加入，每次間隔2小時(shí))，于27 35°C下緩慢攪拌過夜后過夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸濾吸干膠體，得到吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖；(2)偶聯(lián)將吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖放入三角瓶中，每毫升加入aiil 2mol/L碳酸鈉、0. 15EDDS-Na3、l. 5mg NaBH4,在 50°C下緩慢攪拌 12 小時(shí)。將連接了 EDDS 的 Sapharose_6B 在布氏漏斗上真空吸濾吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金屬螯合瓊脂糖凝膠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。本發(fā)明制備金屬螯合瓊脂糖凝膠涉及到的化學(xué)反應(yīng)如圖1所示。該實(shí)施例制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠每毫升吸干膠能吸收59 μ molCu2+。實(shí)施例2(1)活化將瓊脂糖凝膠(kphar0Se-6B)、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和0. 8mol/L氫氧化鈉溶液按照體積比1 1 0.5 4混合，然后加入后加入瓊脂糖凝膠2% (w/v)的 NaBH4,置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，然后再加入瓊脂糖凝膠體積4 5倍的2mol/L的NaOH 和2 3倍的環(huán)氧氯丙烷，(在緩慢攪拌下10小時(shí)內(nèi)分次加入，每次間隔2小時(shí))，于27 35°C下緩慢攪拌過夜后過夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸濾吸干膠體，得到吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖；(2)偶聯(lián)將吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖放入三角瓶中，每毫升加入aiil 3mol/L碳酸鈉、0. 2g EDDS-Na3>2mg NaBH4,在 50°C下緩慢攪拌 10 小時(shí)。將連接了 EDDS 的 Sapharose_6B 在布氏漏斗上真空吸濾吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金屬螯合瓊脂糖凝膠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。本發(fā)明制備金屬螯合瓊脂糖凝膠涉及到的化學(xué)反應(yīng)如圖1所示。該實(shí)施例制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠每毫升吸干膠能吸收陽(yáng)U molCu2+。實(shí)施例3(1)活化將瓊脂糖凝膠(kphar0Se-6B)、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和0. 8mol/L氫氧化鈉溶液按照體積比1 1 0.5 4混合，然后加入后加入瓊脂糖凝膠2% (w/v)的 NaBH4,置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，然后再加入瓊脂糖凝膠體積4 5倍的2mol/L的NaOH 和2 3倍的環(huán)氧氯丙烷，(在緩慢攪拌下10小時(shí)內(nèi)分次加入，每次間隔2小時(shí))，于27 35°C下緩慢攪拌過夜后過夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸濾吸干膠體，得到吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖；(2)偶聯(lián)將吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖放入三角瓶中，每毫升加入aiil 2mol/L碳酸鈉、0. 15g EDDS-Na3>2mg NaBH4,在 30°C下緩慢攪拌 15 小時(shí)。將連接了 EDDS 的 Sapharose_6B 在布氏漏斗上真空吸濾吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金屬螯合瓊脂糖凝膠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。本發(fā)明制備金屬螯合瓊脂糖凝膠涉及到的化學(xué)反應(yīng)如圖1所示。該實(shí)施例制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠每毫升吸干膠能吸收48 μ molCu2+。
實(shí)施例4(1)活化將瓊脂糖凝膠(kphar0Se-4B)、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和0. 8mol/L氫氧化鈉溶液按照體積比1 1 0.5 4混合，然后加入后加入瓊脂糖凝膠2% (w/v)的 NaBH4,置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，然后再加入瓊脂糖凝膠體積4 5倍的2mol/L的NaOH 和2 3倍的環(huán)氧氯丙烷，(在緩慢攪拌下10小時(shí)內(nèi)分次加入，每次間隔2小時(shí))，于27 35°C下緩慢攪拌過夜后過夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸濾吸干膠體，得到吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖；(2)偶聯(lián)將吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖放入三角瓶中，每毫升加入aiil 0. 5mol/ L碳酸鈉、0. Ig EDDS-Na3Umg NaBH4,在40 °C下緩慢攪拌12小時(shí)。將連接了 EDDS的 Sapharose-6B在布氏漏斗上真空吸濾吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金屬螯合瓊脂糖凝膠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。本發(fā)明制備金屬螯合瓊脂糖凝膠涉及到的化學(xué)反應(yīng)如圖1所示。該實(shí)施例制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠每毫升吸干膠能吸收50 μ molCu2+。實(shí)施例5(1)活化將瓊脂糖凝膠(kpharose-CL-6B)、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和0. 8mol/L 氫氧化鈉溶液按照體積比1 1 0.5 4混合，然后加入后加入瓊脂糖凝膠2% (w/v)的 NaBH4,置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，然后再加入瓊脂糖凝膠體積4 5倍的2mol/L的NaOH 和2 3倍的環(huán)氧氯丙烷，(在緩慢攪拌下10小時(shí)內(nèi)分次加入，每次間隔2小時(shí))，于27 35°C下緩慢攪拌過夜后過夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸濾吸干膠體，得到吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖；(2)偶聯(lián)將吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖放入三角瓶中，每毫升加入aiil 2mol/ L碳酸鈉、0. 2g EDDS-Na3U. 5mg NaBH4，在40°C下緩慢攪拌15小時(shí)。將連接了 EDDS的 Sapharose-6B在布氏漏斗上真空吸濾吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金屬螯合瓊脂糖凝膠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。本發(fā)明制備金屬螯合瓊脂糖凝膠涉及到的化學(xué)反應(yīng)如圖1所示。該實(shí)施例制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠每毫升吸干膠能吸收51 μ molCu2+。實(shí)施例6利用本發(fā)明提供的制備金屬螯合瓊脂糖凝膠的方法制得的瓊脂糖凝膠，金屬螯合力強(qiáng)，結(jié)合容量大，可移除蛋白質(zhì)中的CU2+、ai2+、Mn2+、Cd2+等重金屬離子，相對(duì)于同類產(chǎn)品具有更優(yōu)秀的重金屬移除效果。下面通過對(duì)比試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行證明。取實(shí)施例1的方法制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠(簡(jiǎn)稱為kpharose-EDDS)作為試驗(yàn)組，與kpharose-IDA、S印harose-NTA和kpharose-TED進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證對(duì)蛋白中重金屬離子Cu2+、Zn2\ Mn2+、Cd2+的移除能力。生長(zhǎng)7d的水稻采用8 μ mol/L Cu2+處理三天，取新鮮水稻根，用液氮充分研磨，然后加入4倍體積含lmmol/LPMSF的平衡緩沖液QOmmo 1/L磷酸鈉，pH 5. 8，500mmol/LNaCl、 0. l%w/v Triton X-100)。充分混勻后放在4°C下提取 30min，在4°C下、15000g離心30min， 收集上清，蛋白濃度測(cè)定參照Bradf0rd(1976)方法，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)。準(zhǔn)確稱取0. 2g吸干過的上述四種瓊脂糖凝膠，置于1. 5ml eppendof管中，加入 Iml平衡緩沖液平衡％iin，在4°C下9000g離心5min棄上清，加入0. 5ml提取的蛋白，混勻后在冰浴下301^11，并不斷混懸，然后在41下9，00(^ 5min，收集上清。加入600 μ 1平衡緩沖液，冰浴下混懸5min，在4°C下9，OOOg 5min,收集上清，此步驟重復(fù)5次。合并收集的上清，終體積為3. 5ml，測(cè)定其金屬和蛋白含量測(cè)定。四種金屬螯合瓊脂糖凝膠對(duì)蛋白中Cu2+、Si2+、Mn2+和Cd2+的移除率(% )如表1所示。經(jīng)8μπι01/1 Cu2+處理的水稻根蛋白溶液中Cu為3.68 μ g/mgprot，四種金屬螯合層析膠都顯著去除了蛋白溶液中的Cu2+，移除率為94. 7 97. 95%，效果最好的是 Sepharose-EDDS ；S印harose-IDA、kpharose_NTA 和 S印harose-EDDS 都很顯著的移除了銅脅迫蛋白溶液中的Si2+移除率，分別為90.7^^91.84%和93%，且三者差異不顯著。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Sepharose-TED對(duì)Si2+的移除效果較差，僅移除61 %的Si2+ ；而kpharose-EDDS 對(duì)Mn2+的去除效果最好，能去除蛋白中96%的Mn2+，Sepharose-NTA能去除89%的Mn2+。 Sepharose-IDA對(duì)Mn2+的去除效果最差，僅能去除59% ;S印harose-EDDS和IDA對(duì)50 μ mol Cd2+處理三天的水稻根蛋白中的Cd2+去除效果較好，分別移除了蛋白中93和90%的Cd2+， 兩者差異不顯著。表1 四種金屬螯合瓊脂糖凝膠對(duì)蛋白中重金屬離子的移除率(％ )
金屬離子Sepharose-IDASepharose-NTASepharose-TEDSepharose-EDDSCu2+96.07 b94.76 c95.67 b97.65 aZn2+90.74 a91.84 b61.32 b93.97 aMn2+59.37 b89.16 a66.20 b96.80 aCd2+90.70 a72.15 b78.59 b93.83 a從以上的分析可以看出，kpharose-EDDS對(duì)蛋白中的Cu2+、Zn2\ Mn2+和Cd2+的去除效果最好，可去除93%以上的以上重金屬離子。kpharose-EDDS可以同時(shí)去除以上四種重金屬，可應(yīng)用于幾種重金屬?gòu)?fù)合污染植物蛋白研究的重金屬離子去除。實(shí)施例7本實(shí)施例對(duì)結(jié)合EDDS的瓊脂糖凝膠的應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步說明。固定金屬親和層析是應(yīng)用到脫金屬蛋白，對(duì)蛋白金屬去除率具有一定要求，這里針對(duì)植物中含有的銅進(jìn)行親和層析并進(jìn)行分析說明。本實(shí)施例采用的蛋白純化方法參照Kimg等在2006年《蛋白質(zhì)組學(xué)》期刊上發(fā)表的《對(duì)擬南芥根中銅結(jié)合蛋白的螯合金屬親和層析和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)調(diào)查》 (Proteomic survey of copper-binding proteins inArabidopsis roots by immobilized metal affinity chromatography and mass spectrometry)米用的方法，對(duì)水禾S根銅結(jié)合蛋白進(jìn)行純化。1.裝柱將 2ml 床體積的 Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, USA) 沿管壁加入到玻璃管中，待膠沉淀后將活塞推到合適的位置，后用蒸餾水洗，流速為0. 5ml/ min，直到紫外檢達(dá)到穩(wěn)定基線。2.結(jié)合Cu2+ 加入1倍床體積的0. 2M CuSO4溶液，室溫下放置30min，要間歇晃動(dòng)， 使Cu2+充分結(jié)合到填料上。然后以0. 5ml/min的流速用ddH20洗至紫外檢測(cè)達(dá)到穩(wěn)定基線。
3.組裝將連接好的固定金屬親和層析柱分別在柱前串聯(lián)kpharose-EDDS，以不連接其它柱子的Cu固定金屬親和層析柱為對(duì)照。4.平衡用平衡緩沖液洗柱子30min，流速為0. 5ml/min,紫外檢測(cè)基線穩(wěn)定。5.上樣以0. 25ml/min的流速上樣，循環(huán)兩次，最大限度增加蛋白結(jié)合到銅結(jié)合柱子上，上樣時(shí)間取決于蛋白溶液體積。上樣完成后用平衡緩沖液洗30min，流速為0. 5ml/
mirio6.非特異性洗脫用含lOmmol/L咪唑的平衡緩沖液洗脫，洗脫至15min時(shí)，紫外檢測(cè)示數(shù)開始增加，開始采集圖像，收集非特異洗脫峰。圖像采集至?xí)r，紫外檢測(cè)基線已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定，開始進(jìn)行特異性洗脫。7.特異性洗脫用含40mmol/L咪唑的洗脫液(lOmmol/L醋酸鈉，500mmol/LNaCl， pH5. 5)進(jìn)行特異性洗脫，IOmin后開始出現(xiàn)特異性洗脫峰，同時(shí)收集樣品，15min后達(dá)到紫外檢測(cè)基線，停止收集樣品。特異洗脫和非特異性洗脫的流速均為0. 5ml/min.將kpharose-EDDS串連在Cu-IMAC柱前面，水稻根蛋白首先經(jīng)過金屬螯合柱去銅，然后再經(jīng)Cu-IMAC分離銅結(jié)合蛋白。以未串Kkpharose-EDDS的Cu-IMAC柱直接進(jìn)行銅結(jié)合蛋白純化為對(duì)照。去除金屬離子的水稻根蛋白(8ymol/L Cu2+處理)與未經(jīng)過去除金屬離子的水稻根蛋白(8ymol/L Cu2+處理)相比，特異性銅結(jié)合蛋白洗脫峰的峰面積顯著增加。特異性銅結(jié)合蛋白的峰面積由1743250增加到2762483，因與蛋白結(jié)合的銅離子的移除，使銅結(jié)合蛋白有可利用的銅結(jié)合位點(diǎn)與Cu-IMAC柱上的銅離子結(jié)合而被分離，銅結(jié)合蛋白產(chǎn)率增加了 58%。從以上的分析可以看出經(jīng)過偶聯(lián)EDDS的金屬螯合瓊脂糖柱去除與蛋白結(jié)合的過多的銅，釋放出了銅結(jié)合蛋白與銅結(jié)合的位點(diǎn)，更有利于對(duì)銅結(jié)合蛋白的純化，增加了銅結(jié)合蛋白的純化效率。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)活化將瓊脂糖凝膠、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液混合后加入NaBH4，緩慢攪拌下再分次加入氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷，于27 35°C下緩慢攪拌過夜后洗至中性，吸干后得到吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖；(2)偶聯(lián)向步驟(1)得到的吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖中加入碳酸鈉、乙二胺二琥珀酸三鈉(EDDS-Na3)、NaBH4，3(T5(rC下緩慢攪拌1(Γ 5小時(shí)、洗至中性后吸干，得到金屬螯合瓊脂糖凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中瓊脂糖凝膠、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉的體積比為1:1:0.5:4， 其中，氫氧化鈉濃度為0. 8mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中NaBH4的加入量為所述瓊脂糖凝膠的m (w/v)，再次加入的氫氧化鈉濃度為2mol/L，加入量為所述瓊脂糖凝膠體積的4飛倍，再次加入的環(huán)氧氯丙烷為所述瓊脂糖凝膠體積的2 3倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷再次加入時(shí)在10小時(shí)內(nèi)緩慢加入。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中每毫升所述吸干的環(huán)氧活化瓊脂糖中加入2ml碳酸鈉溶液，0. Γ0. 2g EDDS-Na3, r2mg NaBH4，所述碳酸鈉溶液的濃度為0. 5 3mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中采用的瓊脂糖凝膠選用瓊脂糖4FF、瓊脂糖6FF、瓊脂糖CL-4B、瓊脂糖CL-6B、瓊脂糖4B和瓊脂糖6B中的任意一種。
7.—種如權(quán)利要求1所述的方法制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠。
8.—種如權(quán)利要求1所述的方法制得的金屬螯合瓊脂糖凝膠在移除蛋白質(zhì)中重金屬的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法及其應(yīng)用，屬于蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明制備金屬螯合瓊脂糖凝膠的方法包括活化和偶聯(lián)兩大步驟，通過將乙二胺二琥珀酸連接到交聯(lián)瓊脂糖凝膠(Sepharose)上形成具有6配位體的瓊脂糖螯合介質(zhì)。該金屬螯合瓊脂糖凝膠可應(yīng)用于移除蛋白溶液中Cu、Zn、Mn、Cd等金屬離子，結(jié)合能力強(qiáng)，結(jié)合容量大，移除率達(dá)93%。其制備工藝簡(jiǎn)單，易于放大，使用方便，可更好地應(yīng)用在復(fù)合重金屬污染環(huán)境下生長(zhǎng)的植物蛋白質(zhì)研究中重金屬離子的移除，也可應(yīng)用于其它需要移除金屬離子的蛋白質(zhì)科學(xué)研究上。
文檔編號(hào)C07K1/22GK102432696SQ201110329239
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者夏妍, 宋玉峰, 張紅曉, 沈振國(guó), 王桂萍, 陳亞華 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)