專利名稱：雙生病毒復(fù)制抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對植物病毒有效的防除感染的手段。更具體地說，涉及針對植物病毒雙生病毒的復(fù)制抑制劑以及對雙生病毒感染具有抗性的植物等。
背景技術(shù)：
鋅指與螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序、亮氨酸拉鏈基序同為DNA結(jié)合基序的一種，其是在氨基末端一側(cè)具有2個半胱氨酸和在羧基末端一側(cè)具有2個組氨酸，在這些殘基上配位有鋅(Zn)而成的立體結(jié)構(gòu)。鋅指對DNA具有非常強的結(jié)合力，因此有人利用該基序提出了與DNA牢固結(jié)合的人工DNA結(jié)合蛋白(以下在本說明書中有時稱為“AZP”)，并報道了使用識別密碼表(Nondegenerate Recognition Code Table (非簡并識別密碼表))設(shè)計的AZP,其 可識別特定的堿基序列(日本特表2004-519211號公報biochemistry，41，7074-7081頁，2002)。一個鋅指基序可識別3bp或4bp并結(jié)合，通過用肽接頭連接鋅指來調(diào)節(jié)希望特異性結(jié)合的堿基序列的長度。鋅指基序的第4號的識別堿基序列是反義鏈，與下一個鋅指基序的第I號的識別喊基序列重置，因此，N個鋒指基序識別3N+lbp的喊基序列并結(jié)合(參照

圖1)。有報道稱，使用該AZP可實現(xiàn)對植物DNA病毒感染的防除(J. Virology，79，2614-2619頁，2005)。該出版物中報道了在擬南芥中AZP防除植物DNA病毒甜菜嚴(yán)重曲頂病毒(Beet Severe Curly Top Virus) (BSCTV)感染的效果，該方法采用通過AZP來抑制病毒復(fù)制起始所需的復(fù)制蛋白(Itep)與復(fù)制起點上的Rep結(jié)合位點(同向重復(fù)序列)結(jié)合的手段，是基于復(fù)制起點的同向重復(fù)序列設(shè)計具有比R印高的DNA結(jié)合能力的AZP來抑制病毒復(fù)制的方法。但是，在用AZP阻斷R印的同向重復(fù)序列的該方法中，復(fù)制起點具有病毒特有的堿基序列，因此，為了與各種植物病毒對應(yīng)，存在必須使用分別不同的AZP的問題。從上述角度出發(fā)，人們希望提供用單一的AZP實現(xiàn)對多種植物病毒感染的防除效果的手段。番爺黃化曲葉病是感染番爺?shù)牟《静。ㄟ^煙粉風(fēng)傳播的番爺黃化曲葉病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus TYLCV)感染而發(fā)病。番爺黃化曲葉病一旦發(fā)病，新葉自葉緣褪色、黃化，呈現(xiàn)曲葉癥狀，然后葉萎縮，植株全體矮化，生長停止。番茄黃化曲葉病在地中海沿岸、非洲、中近東、亞洲、中南美等地帶來嚴(yán)重的災(zāi)害。TYLCV存在很多分離株，目前為止在日本國內(nèi)報道的有TYLCV以色列株(急性型長崎株和土佐株)以及TYLCV溫和株(溫和型靜岡株和愛知株)等。TYLCV屬于雙生病毒科(Geminiviridae)，雙生病毒是感染植物、具有I個或2個單鏈環(huán)狀DNA的病毒的總稱。雙生病毒包括馬鈴薯黃色花葉病毒(Potato yellow mosaicvirus)和菜豆金色花葉病毒(Bean golden mosaic virus)等各種植物病毒,期待的是,如果可以提供以雙生病毒中高度保守的堿基序列為靶標(biāo)的病毒復(fù)制抑制手段，則不僅限于TYLCV感染，也可有效地防除多種植物病毒感染。關(guān)于具有雙生病毒持續(xù)抗性的轉(zhuǎn)化植物的制作方法，已知有國際公開W02004/101798中公開的方法等，但與本發(fā)明的方法完全不同。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特表2004-519211號公報專利文獻(xiàn)2 :國際公開W02004/101798非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I =Biochemistry, 41, 7074-7081 頁，2002非專利文獻(xiàn)2 J. Virology，79，2614-2619 頁，2005。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供對雙生病毒有效的防除感染的手段。更具體地說，本發(fā)明的課題是提供抑制雙生病毒復(fù)制的藥物以及對雙生病毒具有抗性的植物等。雙生病毒一旦進(jìn)入到植物內(nèi)，首先通過植物內(nèi)源性的因子形成雙鏈環(huán)狀DNA。接著，來自病毒的復(fù)制蛋白(Rep)與位于基因間區(qū)(IR)的莖環(huán)上游的Rep結(jié)合位點結(jié)合。Rep是具有多功能的蛋白質(zhì)，與Rep結(jié)合位點結(jié)合，在莖環(huán)的環(huán)部分的9個堿基的序列中加入切口后，與加入了切口的DNA的5’末端共價結(jié)合。之后，以-鏈作為模板，由3’末端開始DNA合成，在合成了 I個拷貝的基因組時，通過Rep再一次在新合成的9個堿基的序列中加入切口。同時切出的I個拷貝的基因組份的DNA通過R印連接，復(fù)制單鏈環(huán)狀DNA，Rep與新合成的5’末端共價結(jié)合。通過該重復(fù)來進(jìn)行雙生病毒的復(fù)制，Rep以外的復(fù)制所必需的材料全部來自植物(參照圖2以及，化學(xué)i生物，41，311-317頁，2003等)。已知R印只切斷單鏈DNA，為了使Rep切斷病毒DNA，病毒DNA必須采取莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在雙生病毒中，已知形成該莖環(huán)的堿基序列極為高度保守。通常莖區(qū)由9個GC對和2個AT對組成，環(huán)區(qū)由11個堿基或12個堿基組成，在TT、TTT、TA或ATA之后存在TAATATTAC的堿基序列(參照化學(xué)i生物，41，311-317頁，2003中313頁的圖2等)。本發(fā)明人著眼于該莖環(huán)部分，為了提供可普遍抑制屬于雙生病毒的多種病毒復(fù)制的手段而進(jìn)行了深入研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使AZP與莖環(huán)部分的DNA特異性結(jié)合，使病毒DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，抑制其向莖環(huán)結(jié)構(gòu)變化，由此可以抑制只切斷單鏈DNA的Rep對病毒DNA的切斷。還確認(rèn)了該病毒復(fù)制抑制作用實際在植物體中發(fā)揮作用。本發(fā)明基于上述認(rèn)識完成。S卩，本發(fā)明提供復(fù)制抑制劑，其是針對雙生病毒的復(fù)制抑制劑，含有鋅指蛋白，且可以抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，其中，該鋅指蛋白可以與雙生病毒的莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合。該發(fā)明的優(yōu)選方案提供上述復(fù)制抑制劑，其含有可與選自雙生病毒莖區(qū)的全長DNA的I處(I個)的部分DNA結(jié)合的單一鋅指蛋白；上述復(fù)制抑制劑，其含有可與選自雙生病毒莖區(qū)的全長DNA的2處以上的部分DNA結(jié)合的單一鋅指蛋白；上述復(fù)制抑制劑，其中上述鋅指蛋白為含有10個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白；上述復(fù)制抑制劑，其含有鋅指蛋白，該鋅指蛋白是通過接頭將2個以上可分別與選自雙生病毒莖區(qū)的全長DNA的2處以上的部分DNA結(jié)合的鋅指蛋白連接而成；上述復(fù)制抑制劑，其含有2個鋅指蛋白；上述復(fù)制抑制劑，其
中，2個鋅指蛋白為含有3個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白和含有6個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。本發(fā)明也提供編碼上述鋅指蛋白的核酸，以及是針對雙生病毒的復(fù)制抑制劑的、含有編碼上述鋅指蛋白的核酸的復(fù)制抑制劑。根據(jù)上述發(fā)明的優(yōu)選方案，提供上述復(fù)制抑制劑，其中，雙生病毒為屬于菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)的病毒；上述復(fù)制抑制劑,其中,雙生病毒為番爺黃化曲葉病毒。從另一角度出發(fā)，本發(fā)明提供抗雙生病毒劑，其含有上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸；針對雙生病毒的感染預(yù)防劑，其含有上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸；用于防除雙生病毒感染的農(nóng)藥，該農(nóng)藥含有上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸。進(jìn)一步從其它角度出發(fā)，本發(fā)明提供預(yù)防植物的雙生病毒感染的方法，該方法包括對植物施用預(yù)防有效量的上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸的步驟；防除雙生病 毒感染的方法，該方法包括對植物施用防除有效量的上述鋅指蛋白或編碼上述鋅指蛋白的核酸的步驟。本發(fā)明還提供基因重組植物,其是對雙生病毒具有抗性的植物,可表達(dá)上述鋅指蛋白；轉(zhuǎn)化植物，其是對雙生病毒具有抗性的植物，導(dǎo)入了編碼上述鋅指蛋白的基因；使植物獲得雙生病毒抗性的方法，該方法包括用編碼上述鋅指蛋白的基因轉(zhuǎn)化植物的步驟。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有編碼上述鋅指蛋白的核酸的重組載體，以及用于將植物轉(zhuǎn)化為對雙生病毒具有抗性的植物的上述重組載體。載體可使用植物用的病毒載體等。本發(fā)明的復(fù)制抑制劑是以在雙生病毒中高度保守的莖環(huán)區(qū)作為靶標(biāo)，因此可作為針對多種雙生病毒感染的通用復(fù)制抑制劑起作用。因此，本發(fā)明的復(fù)制抑制劑不僅對于雙生病毒中所包含的代表性病毒TYLCV感染，而且對于其它雙生病毒也可發(fā)揮高有效性，因此，作為多種雙生病毒的防除手段極為有用。附圖簡述圖1是表示鋅指基序與DNA結(jié)合方式的圖。圖2是雙生病毒的復(fù)制步驟的示意圖。圖3是表示雙生病毒與TYLCV的包含關(guān)系的圖。 圖4是表示TYLCV的莖環(huán)區(qū)的圖。圖5是表示包含在雙生病毒中的數(shù)種病毒的莖環(huán)區(qū)同源性的圖。圖6是表示只以TYLCV為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑的實例(上半部分)以及以多種雙生病毒為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑的實例(下半部分)的圖。圖7是表示TYLCV專用的AZP-2的制作步驟的方案。圖8是表示雙生病毒通用的AZP-3的制作步驟的方案。圖9是表示通過凝膠移位試驗評價TYLCV專用的AZP-2與靶DNA序列結(jié)合的能力的結(jié)果的圖。圖10是表示通過凝膠移位試驗評價雙生病毒通用的AZP-3與靶DNA序列結(jié)合的能力的結(jié)果的圖。圖11是表示為了進(jìn)行比較，通過凝膠移位試驗評價R印N與靶DNA序列結(jié)合的能力的結(jié)果的圖。圖12是表示GST-AZP (AZP-2)抑制Rep切斷復(fù)制起點的活性的圖。泳道I表示底物DNA，泳道2表示切斷產(chǎn)物標(biāo)志物，泳道3表示用2 μ M GST-Rep進(jìn)行切斷。
圖13是表示GST-AZP (AZP-3)抑制Rep切斷復(fù)制起點的活性的圖。表示GST-Rep濃度2 μ Μ、反應(yīng)溫度25°C、反應(yīng)時間30分鐘下的切斷物。圖14是表示pUC35S0-TYLCV3/4/6的制作方法的圖。35S:來自花椰菜花葉病毒的啟動子；NLS :核定位信號；Ω :用于提高翻譯效率的5’ -前導(dǎo)序列；N0ST :終止子；TYLCV3/4/6 :與所有TYLCV中的共有堿基序列結(jié)合的AZP (識別序列為5’-GGCCATCCGTATAATATTACCGGATGGCCGC-3，)。圖15是表示轉(zhuǎn)化用的AZP表達(dá)質(zhì)粒的制作方法的圖。NOS :正纈氨酸合成啟動子(來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)) ;NPT2 :卡那霉素抗性基因；GUS β -半乳糖苷酶基因；RB(右邊界)和LB(左邊界):約25bp的重復(fù)序列(該序列之間的 DNA區(qū)被轉(zhuǎn)移至植物基因組中)。
圖16是表示轉(zhuǎn)化體Tl的插入基因的結(jié)構(gòu)以及用于檢測卡那霉素抗性基因和AZP基因的PCR引物組的圖。圖17是表示檢測轉(zhuǎn)化體Tl的卡那霉素抗性基因和AZP基因的結(jié)果的圖。泳道1-4表示使用由各Tl植物提取的DNA、N表示使用由野生型番茄提取的DNA、P表示使用轉(zhuǎn)化中使用的雙元載體(binary vector),分別進(jìn)行PCR的結(jié)果。圖18是表示AZP表達(dá)盒全部區(qū)中的插入基因的結(jié)構(gòu)、以及用于確認(rèn)插入基因組中的引物組的圖。圖19是表示通過PCR確認(rèn)AZP基因插入在導(dǎo)入AZP-2所得的T2植物中的結(jié)果的圖。為了檢測AZP表達(dá)盒，泳道1-8表示使用由各Tl植物提取的DNA、P表示使用在轉(zhuǎn)化中使用的雙元載體，分別進(jìn)行PCR的結(jié)果。圖20是表示對于導(dǎo)入了 AZP-2得到的T2植物，通過PCR鑒定AZP插入基因的拷貝數(shù)的結(jié)果的圖。泳道1-18表示使用由來自特定的轉(zhuǎn)化體Tl的T2植物提取的DNA、N表示使用由野生型番茄提取的DNA、P表示使用在轉(zhuǎn)化中使用的雙元載體，分別進(jìn)行PCR的結(jié)
果O圖21是表示確認(rèn)AZP在導(dǎo)入AZP-2得到的T2植物中的表達(dá)的結(jié)果的圖。通過利用抗HA抗體的蛋白質(zhì)印跡法，由圖20所示的T2植物葉提取液中檢出了 AZP。圖中的泳道編號與圖20對應(yīng)。圖22表示對于導(dǎo)入AZP-2得到的T3植物，通過PCR鑒定AZP插入基因的純合T2系的結(jié)果的圖。泳道1-16表示使用由來自特定的T2系的T3植物提取的DNA進(jìn)行PCR的結(jié)果。將在全部的T3個體中確認(rèn)了 AZP插入基因的該T2植物作為純合進(jìn)行篩選。圖23是表示確認(rèn)AZP在導(dǎo)入AZP-2得到的T3植物中的表達(dá)的結(jié)果的圖。泳道1_4是使用來自T3植物的葉的提取液、N是使用來自野生型番茄葉的提取液、以及P是使用來自所使用的系的T2植物的葉的提取液，分別通過利用抗HA抗體的蛋白質(zhì)印跡檢出了 AZP。圖24是表示通過土壤桿菌接種法(Agro-1noculation)向野生型Micro-Tom番爺注入具有TYLCV基因組的土壤桿菌，使TYLCV感染成立的結(jié)果的圖。在生長后的個體(右)中明確觀察到TYLCV感染的特征性癥狀一葉卷曲或黃化，同時可見明顯的生長抑制。圖25是表示對導(dǎo)入AZP-2得到的T3植物進(jìn)行TYLCV感染試驗的結(jié)果的圖。轉(zhuǎn)化體中未見感染癥狀。圖26是表示從感染病毒30天后的AZP-2轉(zhuǎn)化番茄回收葉，使用TYLCV檢測用引物進(jìn)行PCR的結(jié)果的圖。圖27是表示用TYLCV感染由導(dǎo)入AZP-3制作的Tl植物的I個個體得到的T3植物的結(jié)果的圖。圖28是表示在AZP-3的轉(zhuǎn)化體中未檢出病毒DNA的圖。
具體實施例方式本發(fā)明的復(fù)制抑制劑是針對雙生病毒的復(fù)制抑制劑，其特征在于，含有鋅指蛋白，且可抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，其中，該鋅指蛋白可以與雙生病毒莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合。本說明書中使用的“雙生病毒”的術(shù)語是指感染植物的DNA病毒，其是具有I個或2個單鏈的環(huán)狀DNA的病毒，該術(shù)語的含義例如在化學(xué)i生物，41，311-317頁，2003等中有 具體說明。根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、宿主范圍以及昆蟲媒介的種類，雙生病毒分類為以下4個屬，即，玉米線條病毒屬(Mastrevirus)、甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus)、番爺偽曲頂病毒屬(Topocuvirus)和菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),本發(fā)明的復(fù)制抑制劑可以以屬于其中任一屬的任意病毒作為靶標(biāo)。屬于各屬的病毒的基因組構(gòu)成在上述出版物(化學(xué)i生物，41,311-317頁，2003)的圖2中具體給出。另外，屬于雙生病毒的病毒及其簡寫符號例如在國際公開W02004/101798中公開了詳細(xì)的表格。通過參照，將國際公開W02004/101798的公開的全部內(nèi)容包含作為本說明書的公開。雙生病毒中除已知的雙生病毒之外，當(dāng)然也包含未知的雙生病毒和已知的雙生病毒變異而成的新種雙生病毒等。例如可舉出MSV(玉米條紋病毒(maize streak virus))、WDV(小麥矮縮病毒(Wheat dwarf virus))、BeYDV(菜豆黃矮病毒(Bean yellow dwarf virus))等屬于玉米線條病毒屬的病毒，BCTV(甜菜曲頂病毒(Beet cury top virus))等屬于甜菜曲頂病毒屬的病毒，TPCTV(番爺偽曲頂病毒(Tomato pseudo-cury top virus))等屬于番爺偽曲頂病毒屬的病毒，以及BGMV (菜豆金色花葉病毒(Bean golden mosaic virus))、ACMV (非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic virus))、SLCV (南瓜曲葉病毒(Squash leaf curlvirus))、TGMV (番爺金色花葉病毒(Tomato golden mosaic virus))、以及 TYLCV (番爺黃化曲葉病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus))等，但并不限于這些。從為復(fù)制抑制劑的結(jié)合部位的莖環(huán)區(qū)的同源性角度出發(fā)，優(yōu)選屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒?？蓛?yōu)選舉出TYLCCNV、TYLCGV, TYLCMalV, TYLCSV, TYLCTHV、TYLCV, ACMV,BGMV、CaLCuV、ToCMo V、TGMV、ToGMo V、ToMHV、ToMoTV、ToMo V、ToRMV、To SLCV、To SRV、棉花曲葉(CLCrV, CLCuAV, ClCuGV, CLCuKV, CLCuMV, CLCuRV)、東非木薯花葉(EACMCV、EACMMV, EACMV,EACMZV)、馬鈴薯黃花葉(PYMPV、PYMTV, PYMV)、南瓜曲葉(SLCCNV、SLCV, SLCYV)、甘薯曲葉(SPLCGV、SPLCV)、煙草曲葉(TbLCJV、TbLCKoV, TbLCYNV, TbLCZV)、番茄曲葉(ToLCBV、ToLCBDV、ToLCGV、ToLCKV、ToLCLV、ToLCMV、ToLCNDV、ToLCSLV、ToLCTffV, ToLCW、ToLCV)等，但并不限于它們。特別是屬于菜豆金色花葉病毒屬的TYLCV等是本發(fā)明的復(fù)制抑制劑的適合的適用對象。圖3表示雙生病毒與TYLCV的包含關(guān)系。本發(fā)明的復(fù)制抑制劑含有鋅指蛋白，且具有抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成的作用，所述鋅指蛋白可與雙生病毒莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合。關(guān)于雙生病毒的“莖環(huán)區(qū)”的術(shù)語，例如若以TYLCV為例進(jìn)行說明，則莖環(huán)區(qū)是由彼此互補地結(jié)合的兩個莖區(qū)(分別由11個堿基組成的區(qū))，和存在于兩者之間形成環(huán)的環(huán)區(qū)(由11個堿基組成的區(qū))組成的33個堿基的區(qū)。已知TYLCV存在多種株，在所有TYLCV中，莖環(huán)區(qū)的堿基序列很保守。圖4表示TYLCV的莖環(huán)區(qū)。本說明書中，莖環(huán)區(qū)的堿基序列“很保守”是指所比較的堿基序列的同源性在80%以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，進(jìn)一步優(yōu)選97%以上，特別優(yōu)選99%以上。該莖環(huán)區(qū)在屬于菜豆金色花葉病毒屬的其它病毒中也高度保守，例如在兩種BGMV的DNA的CR(共同區(qū))上存在由34個堿基組成的莖環(huán)區(qū)，該堿基序列與屬于菜豆金色花葉病毒屬的其它病毒莖環(huán)區(qū)的堿基序列同源性極高。并且，對于屬于雙生病毒其它屬的病毒，莖環(huán)區(qū)也高度保守。圖5表示有關(guān)包含在雙生病毒中的多種病毒的莖環(huán)區(qū)的同源性。本發(fā)明的復(fù)制抑制劑可設(shè)計成，與如上所述高度保守的雙生病毒莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合，該特異性結(jié)合的結(jié)果是可抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。本發(fā)明的復(fù)制抑制劑還可設(shè)計成，除了與莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合的性質(zhì)之外，還與連接至莖環(huán)區(qū)DNA的上 游和/或下游的DNA特異性結(jié)合。為了通過特異性結(jié)合來抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，只要本發(fā)明的抑制劑可與莖環(huán)區(qū)結(jié)合而使病毒DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定即可，基于莖環(huán)區(qū)的堿基序列選擇適當(dāng)?shù)匿\指結(jié)構(gòu)域，由此可以設(shè)計抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成的鋅指蛋白。鋅指蛋白中包含的鋅指結(jié)構(gòu)域可使用識別密碼表(非簡并識別密碼表)，設(shè)計成可識別特定的堿基序列。本說明書中，鋅指結(jié)構(gòu)域是指構(gòu)成存在于鋅指蛋白上的DNA結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)域，有時也簡稱為“指”。代表性的鋅指蛋白具有2個、3個、4個、6個或10個左右的鋅指結(jié)構(gòu)域。識別密碼表、以及識別特定的堿基序列而特異性結(jié)合的鋅指蛋白的設(shè)計方法例如記載于日本特表2004-519211號公報。通過參照，將上述專利公報公開的全部內(nèi)容包含在本說明書的公開中。還可以參照Biochemistry，41，7074-7081頁，2002等。如上所述，關(guān)于雙生病毒基因組DNA莖環(huán)區(qū)堿基序列的信息可容易獲得，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計制造至少可與莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自全長DNA的I或2處以上的部分DNA特異性結(jié)合的鋅指蛋白。例如，為了設(shè)計只以TYLCV為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑，設(shè)計可與包含在TYLCV之間很保守的莖環(huán)區(qū)DNA (33個堿基)的全長或幾乎全長的DNA結(jié)合的鋅指蛋白即可，通過使用選自這樣的鋅指蛋白的I種鋅指蛋白作為本發(fā)明的復(fù)制抑制劑，可以抑制全部的TYLCV的復(fù)制。作為這樣的鋅指蛋白，例如可設(shè)計含有10個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。能夠?qū)⑸鲜龇椒ㄟm當(dāng)應(yīng)用于以TYLCV以外的雙生病毒科為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑的設(shè)計，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。為了設(shè)計以TYLCV之外的多種雙生病毒為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑，例如可從莖區(qū)的全長DNA中選擇作為靶雙生病毒中的共有序列的2處以上的部分DNA，設(shè)計與這些部分DNA結(jié)合的單一的鋅指蛋白，或者設(shè)計分別與這些部分DNA結(jié)合的2個以上的鋅指蛋白，將這些2個以上的鋅指蛋白用適當(dāng)?shù)慕宇^、例如肽接頭等分別連接即可。接頭除了使用氨基酸殘基數(shù)為1-40個、優(yōu)選1-20個、進(jìn)一步優(yōu)選1-10個左右的肽接頭之外，例如還可以使用亞烷基鏈或聚乙二醇鏈等的合成接頭或糖鏈等。在從莖區(qū)的全長DNA中選擇2處以上的部分DNA時，優(yōu)選選擇不含有在作為靶標(biāo)的多種雙生病毒的莖區(qū)中為非共有序列的部分DNA，通常希望選擇位于該非共有序列的上游和下游的共有序列的DNA作為部分DNA。
只以TYLCV為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑的實例、以及以多種雙生病毒為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑的實例分別示于圖6。圖中，上側(cè)是只以TYLCV為靶標(biāo)的情形的實例，下側(cè)是以多種雙生病毒為靶標(biāo)的情形的實例。作為本發(fā)明的復(fù)制抑制劑的優(yōu)選實例，(a)只以TYLCV為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑可舉出具有序列表的SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的復(fù)制抑制劑，以及以多種雙生病毒為靶標(biāo)的復(fù)制抑制劑可舉出具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的復(fù)制抑制劑。另外，(b)作為由在SEQ ID NO :1或2所限定的氨基酸序列中具有I至數(shù)個、優(yōu)選1_5個左右氨基酸缺失、置換和/或添加的氨基酸序列組成的復(fù)制抑制劑，與由SEQ ID NO :1或2所限定的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)實質(zhì)上具有同樣的復(fù)制抑制作用的蛋白質(zhì)也可作為本發(fā)明的復(fù)制抑制劑使用，包含在本發(fā)明的范圍中。并且，(c)與SEQ ID NO :1或2所限定的氨基酸序列具有 70%、優(yōu)選80%、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上的同源性，與由SEQ ID NO :1或2所限定的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)實質(zhì)上具有同樣的復(fù)制抑制作用的蛋白質(zhì)也可作為本發(fā)明的復(fù)制抑制劑使用，包含在本發(fā)明的范圍中。作為用于制備本發(fā)明的復(fù)制抑制劑的核酸，除了編碼上述(a)的蛋白質(zhì)的DNA(由序列表的SEQ ID NO :3或4所不的喊基序列限定的DNA)之外,還可以使用含有編碼上述(b)或(c)的蛋白質(zhì)的DNA的核酸。作為編碼上述(b)或(c)所示的蛋白質(zhì)的DNA，例如包括可在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO :3或4所示堿基序列限定的DNA雜交的DNA等。這樣的DNA例如可舉出使用DNA作為探針，在集落雜交法、噬菌斑雜交法或DNA印跡雜交法中，使用固定有來自集落或噬菌斑的DNA或DNA片段的濾器，在O. 7-1. OM左右的NaCl存在下、在65°C下進(jìn)行雜交，然后用O. 1-2 X SSC溶液(I X SSC溶液含有150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)，在65°C條件下洗滌濾器，可由此鑒定的DNA等。例如，可優(yōu)選使用與作為探針使用的DNA的堿基序列具有70 %以上、優(yōu)選80 %以上、進(jìn)一步優(yōu)選90 %以上、特別優(yōu)選95 %以上、最優(yōu)選98%以上的同源性的DNA。本發(fā)明的復(fù)制抑制劑以上述鋅指蛋白或編碼該鋅指蛋白的核酸的形式提供，通過將本發(fā)明的復(fù)制抑制劑直接作為農(nóng)藥施用于植物，可以防除雙生病毒感染。本發(fā)明的復(fù)制抑制劑的施用方法沒有特別限定，例如可以使用本領(lǐng)域周知的制劑用添加物制備作為農(nóng)藥用組合物。含有蛋白質(zhì)或核酸作為有效成分的農(nóng)藥用組合物在本領(lǐng)域是已知的，可采用適當(dāng)?shù)氖侄沃苽滢r(nóng)藥用組合物。例如可舉出使用摻入了上述核酸的質(zhì)粒等載體，將上述核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)化植物的方法；或者使用載體將上述核酸摻入植物基因組中的方法等，但并不限于這些方法。可在本發(fā)明的方法中利用的載體也包括感染植物的病毒載體。農(nóng)藥用組合物的形態(tài)沒有特別限定，只要是本領(lǐng)域可利用的形態(tài)，就可采用任何形態(tài)。例如可以使用乳劑、液體劑、油劑、水溶性劑、水合劑、流動劑(7 口 7 )、粉劑、微粒劑、顆粒劑、煙霧劑、熏蒸劑或糊劑等形態(tài)的組合物。農(nóng)藥用組合物的制造方法也沒有特別限定，可適當(dāng)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的方法。還可以將其它抗病毒劑、殺蟲劑、殺菌劑、殺蟲殺菌劑、除草劑等其它農(nóng)藥的有效成分摻混于農(nóng)藥用組合物中。本發(fā)明提供可表達(dá)上述復(fù)制抑制劑的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明中，作為轉(zhuǎn)化對象的植物沒有特別限定，除了完整植物體之外，還可以是植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質(zhì)部、維管束、柵欄組織、海綿組織等)或植物培養(yǎng)細(xì)胞的任意一種。植物的種類沒有特別限定，可以以任意的植物為對象，優(yōu)選以雙生病毒感染成立的植物種類作為對象。更具體地說，植物種類例如可舉出屬于錦葵科(秋葵等)、藜科(甜菜、菠菜等)、十字花科(蕪菁、花椰菜、青花椰菜、卷心菜、油菜(- 7 f )、紫羅蘭、蘿卜、青梗菜、大白菜、山菜等)、鳶尾科(鳶尾、唐菖蒲、小蒼蘭等)、白花丹科(不凋花(Statice)等)、禾本科(水稻、結(jié)縷草、玉米、麥等)、苦苣苔科(Gesneriaceae)(非洲堇等)、五·加科(土當(dāng)歸等)、葫蘆科(南瓜、黃瓜、越瓜、西瓜、甜瓜等)、柿樹科(柿子等)、菊科(非洲菊、菊、金盞花、秋英屬、牛蒡、瓜葉菊、苘蒿、大麗花、向日葵、蜂斗菜、雛菊、六月菊、萵苣等)、胡桃科(胡桃等)、桑科(無花果、桑樹、蛇麻草等)、罌粟科(冰島罌粟等)、玄參科(金魚草等)、報春花科(仙客來、報春花等)、天南星科(、芋頭等)、仙人掌科(仙人掌等)、唇形科(一串紅、紫蘇等)、秋海棠科(秋海棠屬等)、姜科(姜、荷等)、睡蓮科(蓮藕等)、堇菜科(三色堇等)、傘形科(水芹、旱芹、胡蘿卜、歐芹、鴨兒芹等)、金粟蘭科(草珊瑚等)、杜鵑花科(漿果類等)、山茶科(茶等)、大戟科(一品紅等)、茄科(馬鈴薯、煙草、番茄、茄子、柿子椒、獅子菜椒等)、石竹科(康乃馨、多年生滿天星等)、薔薇科(杏、草莓、梅、櫻桃、李、梨、薔薇、枇杷、桃、珍珠繡線菊、蘋果、西洋梨等)、旋花科(牽牛花、甘薯等)、牛兒苗科(天竺葵等)、葡萄科(葡萄等)、山毛櫸科(栗等)、牡丹科(牡丹、芍藥等)、獼猴桃科(獼猴桃等)、豆科(紅豆、扁豆、菜豆、毛豆、豌豆、香豌豆、蠶豆、大豆、花生等)、蕓香科(柑橘等)、薯蕷科(山藥等)、虎耳草科(蘭花等)、百合科(蘆筍、洋蔥、郁金香、韭菜、蒜、蔥、風(fēng)信子、百合、頭、冬蔥等)、蘭科(卡特蘭屬、繡球花、蝴蝶蘭等)、龍舌蘭科(龍血樹類等)、龍膽科(洋桔梗、龍膽等)的植物，但并不限于這些。優(yōu)選例如可舉出番茄、胡椒、煙草、南瓜、木薯(manioc)、番薯、棉花、甜瓜、馬鈴薯、大豆、葡萄、玉米、小麥、甘蔗、豆、甜菜、西瓜、秋葵、木薯(cassava)等，但并不限于這些。進(jìn)一步優(yōu)選的植物是番茄、棉花、馬鈴薯等，特別優(yōu)選的植物是番茄。作為要轉(zhuǎn)化的植物源，可舉出原生質(zhì)體、種子、萌芽、苗、愈傷組織、培養(yǎng)細(xì)胞、植物體等，但并不特別限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)對象植物的種類，選擇適當(dāng)?shù)牟课贿M(jìn)行轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化的載體的種類沒有特別限定，優(yōu)選載體中含有用于使編碼上述鋅指蛋白的基因表達(dá)的啟動子和/或增強子序列。啟動子和增強子序列只要是在植物細(xì)胞中可使上述基因表達(dá)即可，其種類沒有特別限定，可使用任意的啟動子和增強子序列。例如可使用含有如土壤桿菌或根瘤菌的植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因、來自植物體、植物病毒或細(xì)菌的啟動子等。啟動子例如可使用來自根癌土壤桿菌的T-DNA的啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子、NOS啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisc0)啟動子、GRP1-8啟動子、來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子、來自植物的肌動蛋白或組蛋白等的啟動子/增強子等，但并不限于它們。載體中可以含有編碼各種抗生素抗性基因或其它標(biāo)記基因作為選擇性標(biāo)記基因的序列。標(biāo)記基因的實例例如可舉出抗大觀霉素基因、鏈霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、遺傳霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、抗抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)的除草劑的抗性基因、抗抑制谷氨酰胺合成酶的除草劑的抗性基因(例如bar基因)、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、熒光素酶基因等，但并不限于這些。為了提高基因表達(dá)效率，例如也可優(yōu)選在基因的編碼區(qū)的多核苷酸編碼區(qū)的3’末端包含Poly (A) +序列。Poly (A) +序列可以使用來自各種植物基因或T-DNA的序列，但并不限于它們。也可以將對于使基因高水平表達(dá)有用的其它序列、例如特定的基因的內(nèi)含子序列、5’非翻譯區(qū)的序列等導(dǎo)入載體。為了促進(jìn)向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運，還優(yōu)選摻入核定位信號(NLS)
坐寸ο對于高等植物的基因表達(dá)有用的載體是本領(lǐng)域所周知的，可使用任意的載體。例如將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞時，作為可將載體DNA的一部分摻入宿主植物的基因組的載體，除了來自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒的載體之外，還可舉出來自Ti質(zhì)粒的KYLX6、pKYLX7、pBI101、pBH2113、pBI121等，但并不限于這些。
對于表達(dá)載體，可采用用于將外源性基因?qū)胫参锛?xì)胞的公知的方法，例如基因槍法、電穿孔法、聚乙二醇(PEG)法、磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染法、以及土壤桿菌法等微生物媒介轉(zhuǎn)染法等，導(dǎo)入所需的植物細(xì)胞中。其中優(yōu)選基因槍法、電穿孔法、聚乙二醇法和土壤桿菌法等，可特別優(yōu)選米用土壤桿菌法(Methods Mol. Biol, 82, 259-266頁，1998)。有時也可以通過采用雙成分載體(雙元載體)法高效率地進(jìn)行基因重組。表達(dá)載體的構(gòu)建方法以及植物的轉(zhuǎn)化方法在本說明書的實施例中進(jìn)一步具體說明，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照上述一般說明和實施例的具體說明，通過將載體的種類或要導(dǎo)入載體中的序列、轉(zhuǎn)化法等進(jìn)行適當(dāng)變化或改變，可以轉(zhuǎn)化所需植物，使其表達(dá)本發(fā)明的復(fù)制抑制劑。實施例以下通過實施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。例I1.材料和方法(I)AZP 的設(shè)計基于日本特表2004-519211號公報所記載的識別密碼表設(shè)計分別識別以下兩種DNA區(qū)的鋅指蛋白(以下，在實施例中簡稱為“AZP”)。a. TYLCV中保守的莖環(huán)區(qū)b.雙生病毒中保守的莖環(huán)區(qū)在圖6的上半部分所示的AZP(TYLCV專用)中，連續(xù)地連接10個鋅指結(jié)構(gòu)域。圖6的下半部分所示的AZP(雙生病毒通用)中，是將識別在莖環(huán)區(qū)內(nèi)的雙生病毒中保守的兩個區(qū)的2種AZP用短肽連接。(2) AZP表達(dá)質(zhì)粒的制作按照圖7所示方案制作TYLCV專用AZP (以下稱為“AZP-2”)。首先通過PCR合成分別連接有3個鋅指的基因，將各基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-21a(NoVagen制造)的BamH I/Hind III位點，然后確認(rèn)所得質(zhì)粒的堿基序列，由此獲得pET_TYLCV_3、pET-TYLCV-4 和 pET-TYLCV-5。接著，通過 PCR 擴增 pET_TYLCV_3 和 pET_TYLCV_4 內(nèi)的 3 指AZP的基因并連接，最終得到pET-TYLCV3/4。制作識別5’ -TATA-3’的鋅指基因，按照上述方法與PET-TYLCV5內(nèi)的3指AZP基因連接，由此制作pET_TYLCV6。最后，通過PCR，由PET-TYLCV3/4和pET_TYLCV6分別擴增6指AZP基因和4指AZP基因并連接，由此制作識別在形成莖環(huán)區(qū)的序列的33個堿基中的31個堿基的AZP-2表達(dá)用質(zhì)粒(pET-TYLCV3/4/6)。按照圖8所示方案制作雙生病毒通用AZP(以下稱為“AZP-3”)。首先，為了摻入識別在莖環(huán)區(qū)內(nèi)的雙生病毒中保守的2個區(qū)的2種AZP基因和接頭肽基因，首先制作前體質(zhì)粒(pET-MCS)。通過PCR，由pET-TYLCV3/4擴增識別雙生病毒中保守的較長區(qū)的6指AZP基因，克隆到pET-MCS上，由此制作pET-TYLCV3/4-MCS。接著，通過PCR，由pET_TYLCV5擴增識別雙生病毒中保守的較短區(qū)的3指AZP基因，克隆到pET-TYLCV34-MCS上，由此制作表達(dá)具有6個氨基酸作為接頭肽的AZP-3的質(zhì)粒(pET-TYLCV3/4-MCS-TYLCV5)。(3) AZP 的表達(dá)用AZP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，將所得轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)，在0D_達(dá)到O. 6-0. 7時添加IPTG，使終濃度為ImM，誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步培養(yǎng)3小時，然后通過離心回收大腸桿菌，在蛋白質(zhì)純化之前在-80°C下保存。(4) AZP 的純化
各AZP按照基本相同的方法純化。向在_80°C下保存的大腸桿菌中加入IOml裂解緩沖液(IOOmM Trs-HclUOOmM NaCUO.1mM ZnCl2、5mM DTT，pH8. O)，重復(fù) 3 次冷凍和融解，使大腸桿菌的細(xì)胞壁容易破壞。接著加入到超聲波破碎機中，破碎大腸桿菌，然后通過離心回收含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的上清。將該上清加載于陽離子交換樹脂的Biorex-70 (Bio-Rad制造)中，使目標(biāo)蛋白質(zhì)吸附于樹脂上，然后用洗滌緩沖液(50mM Trs-HCl、50mM NaCl,O.1mMZnCl2,0. 2mM DTT、pH8. 0)充分洗滌。接著用洗脫緩沖液(50mM Trs_HCl、300mM NaCl、0.1mMZnCl2,0. 2mM DTT、pH8. 0)洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)。只收集含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的級分，用超濾膜濃縮，然后加入等量的甘油，攪拌，然后在_80°C下保存。AZP純度通過SDS-PAGE上的考馬斯藍(lán)染色的條帶的量判斷。各蛋白質(zhì)濃度使用Protein Assay ESL(Roche制造)確定。(5) RepN表達(dá)質(zhì)粒的制作RepN是病毒復(fù)制蛋白R印的N末端區(qū)(191個氨基酸殘基)，具有DNA結(jié)合能力。為了應(yīng)用于AZP抑制Rep與同向重復(fù)序列結(jié)合的試驗，按照以下方法制備R印N。使用從受感染的番茄中回收的TYLCV基因組，通過PCR，由TYLCV基因組擴增R印N基因，與AZP的情形同樣，克隆到pET-21a的BamH I/Hind III位點。通過確認(rèn)所得質(zhì)粒的堿基序列來制作RepN表達(dá)用的質(zhì)粒(pET-RepN)。(6) RepN蛋白的表達(dá)和純化RepN的表達(dá)與AZP表達(dá)的情形同樣進(jìn)行，獲得足夠量的表達(dá)。所得大腸桿菌在進(jìn)行蛋白質(zhì)純化之前保存于_80°C。R印N的純化與AZP的情形同樣進(jìn)行。在使用Biorex-70的離子交換色譜中，用洗脫緩沖液(50mM Tris-HCl、250mM NaCl,O. 2mM DTT、pH8. O)洗脫，由此獲得純度高的R印N。(7) AZP和R印N與復(fù)制起點結(jié)合的能力的評價各蛋白質(zhì)與靶DNA序列結(jié)合的能力的評價是通過凝膠移位試驗進(jìn)行。制作含有靶DNA序列的DNA寡聚物，將5’末端用32P標(biāo)記。接著，在含有標(biāo)記DNA的結(jié)合緩沖液(IOmMTris-HCl、IOOmM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM ZnCl2,0. 05% BSA、10%甘油，ρΗ7· 5)中添加規(guī)定量的蛋白質(zhì)，在冰上反應(yīng)I小時。將該反應(yīng)物施加于6%非改性丙烯酰胺凝膠上,在4°C下電泳2小時(電泳緩沖液45mM Tris-硼酸)。電泳后將凝膠置于色譜紙上進(jìn)行干燥。在充分干燥后使其感光到X射線膠片，檢測標(biāo)記DNA的條帶。游離DNA和與蛋白質(zhì)的DNA復(fù)合體的量比為1:1時的蛋白質(zhì)濃度相當(dāng)于與靶DNA序列的解離常數(shù)。根據(jù)該蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行AZP和R印N的結(jié)合能力的比較。(8) AZP抑制病毒復(fù)制蛋白切斷的能力的評價
(a) Rep表達(dá)質(zhì)粒的制作-1在抑制切斷的能力的評價中，具有切斷活性的全長的Rep是必需的，因此進(jìn)行了Rep表達(dá)質(zhì)粒的制作。與R印N表達(dá)質(zhì)粒的制作同樣，Rep基因是通過PCR由TYLCV基因組擴增，克隆到pET-21a的BamH I/Hind III位點。確認(rèn)所得質(zhì)粒的堿基序列，由此制作了 Rep表達(dá)用的質(zhì)粒(pET-Rep)。(b)Rep表達(dá)質(zhì)粒的制作_2如果是單獨的R印，在大腸桿菌破碎后可能無法以溶解的狀態(tài)檢測，因此，以與促進(jìn)難溶的蛋白質(zhì)溶解且純化簡便的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合體的形式制作R印。通過PCR，由GST融合蛋白表達(dá)用質(zhì)粒(pET-41a，Novagen制造)擴增含有T7啟動子和GST基因的DNA區(qū)，克隆到pET-R印的BamH I/Sph I位點。確認(rèn)DNA堿基序列，由此制作GST-R印蛋白表達(dá)用的質(zhì)粒(pET-GST-R印)。
(C) GST-Rep融合蛋白的表達(dá)用pET-GST-Rep 分別轉(zhuǎn)化三種大腸桿菌 BL21 (DE3)、Rosetta2 (DE3) pLysS 和BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL，與R印N蛋白表達(dá)時同樣，在37°C下用ImM IPTG誘導(dǎo)所得各克隆表達(dá)。在各大腸桿菌中的表達(dá)量相同，但大腸桿菌破碎后的GST-Rep的溶解量是在BL21(DE3)中最高。因此，使用BL21(DE3)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行30°C下的蛋白質(zhì)表達(dá)。(d) GST-Rep 蛋白的純化將大腸桿菌沉淀懸浮于3mL裂解緩沖液(4. 3mM Na2HPO4、1. 47mM KH2P04、137mMNaCl,2. 7mM KCl, pH7. 3,0.1mM ZnCl2、5mM DTT)中，進(jìn)行超聲處理。通過 SDS-PAGE 確認(rèn)GST-Rep蛋白的溶解，然后離心，只取出上清。將預(yù)先用20倍量的IXGST-結(jié)合洗滌緩沖液(GST-Bind Wash Buffer)洗滌的GST結(jié)合樹脂轉(zhuǎn)移至15mL錐形管中，進(jìn)一步用5mLIXGST-結(jié)合洗滌緩沖液(4. 3mM Na2HPO4U. 47mM KH2P04、137mM NaCl、2. 7mM KC1、ρΗ7· 3)洗滌，以400Xg、25°C離心5分鐘，小心除去上清。將含有超聲處理后的GST-R印蛋白的上清用O. 45 μ m膜濾器過濾，將所得濾液添加于進(jìn)行了上述前處理的樹脂中。在4°C下振蕩過夜，使GST-AZP蛋白吸附于樹脂上。將該樹脂過柱，用洗滌緩沖液(4. 3mM Na2HPO4、1. 47mMKH2PO4U37mM NaCl、2. 7mM KC1、0.1mM ZnCl2)洗滌，然后用洗脫緩沖液(50mM Tris · HCl，pH8.0、0.1mM ZnCl2、IOmM還原型谷胱甘肽)洗脫。通過SDS-PAGE確認(rèn)洗脫的各級分，收集含有GST-Rep蛋白的級分，通過超濾膜濃縮至總量為300 μ L。蛋白質(zhì)濃度通過市售的試劑盒(Protein Assay ECL)確定。(e) GST-AZP融合蛋白的表達(dá)制作AZP與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合體，使該GST-AZP基因位于T7啟動子下游，將這樣的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌。將該大腸桿菌在120mL LB-Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_達(dá)到O. 65-0. 75。培養(yǎng)后添加IPTG，使終濃度為ImM，進(jìn)一步培養(yǎng)3小時，由此誘導(dǎo)GST-AZP蛋白表達(dá)。將誘導(dǎo)后的大腸桿菌離心后回收，保存于_80°C。GST-AZP蛋白的純化按照與GST-Rep蛋白純化同樣的方法進(jìn)行。(f) AZP抑制病毒復(fù)制蛋白切斷的能力的評價在含有由含Rep結(jié)合位點的200個堿基對組成的標(biāo)記DNA (5nM)的反應(yīng)溶液(25mMTris-HCl，pH7. 5、75mM NaCl、2. 5mM DTT)中添加GST-AZP (或者為了進(jìn)行性能比較試驗而添加GST-RepN，或者為了進(jìn)行對照試驗而添加GST)，混合，在冰上靜置30分鐘。然后分別添加GST-R印和MgCl2,使終濃度為2 μ M和5mM，然后在25°C下反應(yīng)。30分鐘后添加2 μ LO. 5Μ EDTA,使反應(yīng)終止，進(jìn)行苯酚處理和乙醇沉淀。用3 μ L加樣緩沖液(80%甲酰胺、IOmMEDTA)溶解，將制作的樣品在8%改性丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。2.結(jié)果(I)AZP與靶DNA序列結(jié)合的能力的評價通過凝膠移位試驗評價純化的AZP和RepN與祀DNA序列結(jié)合的能力。該試驗中，在用32P標(biāo)記的DNA中，以各種濃度添加蛋白質(zhì)，進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，然后將游離DNA和與蛋白質(zhì)的DNA復(fù)合體在非改性凝膠上分離。求出游離DNA和與蛋白質(zhì)的DNA復(fù)合體的條帶比為I I時的蛋白質(zhì)濃度(相當(dāng)于解離常數(shù))，此時可知，TYLCV專用的ΑΖΡ-2的解離常數(shù)為O. 3-lnM(圖9)，雙生病毒通用的ΑΖΡ-3的解離常數(shù)為< IOnM (圖10)。而R印N的解離常數(shù)為30ηΜ(圖11)。通過該試驗確認(rèn)所設(shè)計的ΑΖΡ-2和ΑΖΡ-3與靶DNA序列結(jié)合的強度均 比RepN強ο⑵AZP抑制病毒復(fù)制蛋白切斷的能力的評價如圖12的泳道4-7所示，純化的TYLCV專用的GST-AZP (ΑΖΡ-2)可有效地抑制R印對復(fù)制起點的切斷。其抑制效果依賴于AZP濃度，可見在20 μ M下完全抑制。而在R印的顯性失活體R印N中完全未見對切斷的抑制(圖12的泳道8-11)。R印N具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，當(dāng)然DNA結(jié)合與要抑制的Rep的完全相同。對于GST，如泳道12所見，完全未見切斷抑制，由此也可確認(rèn)在泳道4-7中確認(rèn)的GST-AZP的切斷抑制活性全部來自于ΑΖΡ。另外，對于GST-AZP(ΑΖΡ-3)也同樣地評價了切斷抑制能力。其結(jié)果如圖13所示。例21.材料和方法(I)AZP轉(zhuǎn)化番茄的制作(a) AZP的植物用穩(wěn)定表達(dá)載體的制作將編碼AFP-2的基因插入到植物基因組中是通過土壤桿菌法進(jìn)行。在原生質(zhì)體試驗中，按照圖 14 的方法，由 pUC35S0-MCS 制備 pUC35S0-TYLCV3/4/6，用 EcoR I 和 Hind III從該質(zhì)粒中切出含有35S啟動子-AZP基因-NOS終止子的區(qū)。將片段在瓊脂糖凝膠上純化，然后克隆到雙元質(zhì)粒PBI121的EcoR I/Hind III位點，得到pBI_0TYLCV3/4/6。通過測序確認(rèn)堿基序列正確。對于AZP-3也進(jìn)行同樣的操作。(b)Micro-Tom 的育種在72孔塑料托盤中裝入栽培土，用噴壺輕輕打濕土壤，然后一個一個地播種Micro-Tom種子,在其上輕輕覆蓋濕潤的土,將全體用Saran Wrap覆蓋。將該托盤在人工氣候室(光期25°C，16小時；暗期22°C，8小時)中培養(yǎng)。在確認(rèn)發(fā)芽時除去Saran Wrap，在同一條件下繼續(xù)培養(yǎng)。播種后經(jīng)過約2周后，將苗移栽至直徑12cm的塑料花盆中，培養(yǎng)至回收種子。(c)Micro-Tom 的種的制備回收紅色成熟的Micro-Tom的果實，在其赤道線上用刀分成兩部分，用抹刀將所有的種子回收至50ml塑料管中。用水輕輕洗滌，然后用I %鹽酸水洗滌10分鐘，使種子周圍的明膠層溶解。接著用流水將種子洗滌10分鐘，將多余的水分用紙巾吸取，然后在室溫下風(fēng)干2天。干燥的種子在4°C下保存。
(d)基因?qū)隡icro-Tom子葉將10-20粒Micro-Tom種子用10%稀釋的Haiter (花王制造)殺菌，然后用無菌水洗漆4次。將該種子播種于固定有播種用培養(yǎng)基(I X Murashige-Skoog (MS)培養(yǎng)基、15g/L蔗糖、3g/L脫乙酰吉蘭糖膠)的苗木箱中，在25°C、16小時晝長條件下生長6天。將真葉達(dá)到數(shù)毫米左右的個體用于轉(zhuǎn)化。在進(jìn)行土壤桿菌感染的前一天，將20 μ L用pB1-0TYLCV3/4/6轉(zhuǎn)化的土壤桿菌C58ClRifR(GV2260)的甘油貯液接種于 2mL 的 LB 培養(yǎng)基(Kan 100mg/L、Amp 50mg/L)，在30°C下培養(yǎng)24小時。在感染當(dāng)天，將ImL 土壤桿菌菌液取至Eppendorf管中，以5，OOOrpm離心5分鐘，收集菌體。將該菌體懸浮于40mL含有100 μ M乙酰丁香酮、10 μ M的巰基乙醇的MS培養(yǎng)基中。用刀片切取Micro-Tom的子葉，自前端至一半附近切成兩段。將這些子葉切片浸泡于上述土壤桿菌懸浮液中，靜置10分鐘使其感染。放在滅菌后的Kim紙巾(々A夕才 ^ )上，吸取多余的懸浮液，將葉置于共培培養(yǎng)基(1父15培養(yǎng)基、3(^/1蔗糖、38/1脫乙酰吉蘭糖膠、1. 5mg/L反式玉米素、40 μ M乙酰丁香酮、O. l%MES,pH5. 7)。將蓋子用外科膠帶密封，用鋁箔遮光，在25°C下培養(yǎng)。3-4天后，將感染的子葉切片轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1XMS培養(yǎng)基、3g/L脫乙酰吉蘭糖膠、1. 5mg/L反式玉米素、100mg/L Kan、667mg/L安美汀(Augmentin)、O.1 % MES, pH 5.7)。由感染了約2周的一部分切片中形成愈傷組織,也可見形成枝條。每隔2周移種在新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。由愈傷組織中切除形成了 3-4片葉的個體的子葉切片部分，轉(zhuǎn)移至枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SIM培養(yǎng)基，將CIM培養(yǎng)基的反式玉米素濃度降至1. Omg/L),促進(jìn)枝條的生長。在枝條生長至l_2cm長度時,在枝條最下端將其從愈傷組織上切離，移種于生根培養(yǎng)基(RM培養(yǎng)基，1/2 XMS培養(yǎng)基、3g/L脫乙酰吉蘭糖膠、50mg/L Kan、375mg/L安美汀、O. 1% MES, ρΗ5· 7)。將在生根培養(yǎng)基中2周以內(nèi)生根的個體的根切除，移種在苗木箱內(nèi)固化的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根的二次篩選。將在苗木箱中生根的個體轉(zhuǎn)移至以下的馴化步驟。對于在最初的生根培養(yǎng)基(平板)中2周以內(nèi)未生根的個體，薄薄地切除切口，移種于新的生根培養(yǎng)基中，再次誘導(dǎo)生根。對于在苗木箱的生根培養(yǎng)基中可見生根的個體，為了使其結(jié)實獲得種子而植于土壤。此時，要緩慢地降低濕度進(jìn)行馴化，使植物不會因濕度環(huán)境等變化而枯死。具體來說，在苗木箱中加入濕潤的土壤，在其中種植生根個體，最初是高濕度狀態(tài)，漸漸將蓋子松開，緩慢降低濕度。將在苗木箱內(nèi)用約I個月進(jìn)行充分馴化的植物種植于盆中生長。對于第二次的生根篩選之后的植物，通過PCR確認(rèn)是否導(dǎo)入了目標(biāo)基因。切取約5mm的I片真葉，通過CTAB法提取基因組DNA。最終使用300 μ L懸浮于TE中的基因組DNA溶液中的I μ L，通過PCR法檢查基因?qū)?。作為引物，設(shè)計使用使卡那霉素抗性基因(ΝΡΤ2基因)得到擴增的引物組、和使含有人工轉(zhuǎn)錄基因和NOS終止子的區(qū)得到擴增的引物組。(e)從轉(zhuǎn)化體中提取蛋白質(zhì)將轉(zhuǎn)化植物的l_2cm的葉采集至微量管中。向其中加入液氮使其冷凍，使用勻漿杵細(xì)細(xì)粉碎。液氮氣化后加入200 μ L SDS樣品緩沖液(O. 125Μ Tris-HCl (pH6. 8)、4% SDS、20%甘油、0. 01% ΒΡΒ、10 % 2-ΜΕ)，進(jìn)一步磨碎。在95°C下保溫10分鐘，離心，然后將上清轉(zhuǎn)移至新的微量管中。將其作為植物提取蛋白質(zhì)的樣品。(f)蛋白質(zhì)印跡使用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠對提取的蛋白質(zhì)中的I μ L進(jìn)行電泳。同時對作為分子量標(biāo)記的Perfect Protein Western Marker (Novagen制造)進(jìn)行電泳。將蛋白質(zhì)由丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜，然后使用麗春紅S確認(rèn)蛋白質(zhì)。將膜在封閉液(5%脫脂乳、O. 05%吐溫20，PBS)中振蕩，然后使其與過氧化物酶標(biāo)記-抗HA抗體反應(yīng)。作為抗分子量標(biāo)記的抗體，也同時使S-蛋白HRP反應(yīng)。使用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)使X射線膠片感光，檢測信號。由該信號的大小和信號強度驗證在轉(zhuǎn)化植物內(nèi)是否有AZP表達(dá)。(2)病毒感染試驗(a)病毒感染用質(zhì)粒的制作
病毒感染是利用土壤桿菌的感染性進(jìn)行。為了將具有2個復(fù)制起點的病毒基因組拷貝導(dǎo)入雙元質(zhì)粒，對于TYLCV和TYLCV-mild這兩種，按照以下所示2個階段進(jìn)行目標(biāo)質(zhì)粒的制作。TYLCV-mild與TYLCV的不同在于Rep所結(jié)合的同向重復(fù)序列不同，為了研究對雙生病毒的通用性而使用。通過PCR，由TYLCV的病毒基因組DNA擴增包含復(fù)制起點的O. 5個拷貝份的DNA片段，克隆到雙元質(zhì)粒PBI121的EcoR I/Hind III位點，得到pBI_TYLCV(0. 5)。通過測序確認(rèn)堿基序列正確。在導(dǎo)入TYLCV的I個拷貝份的DNA片段時，如果對用PCR擴增的DNA進(jìn)行克隆，則必須確認(rèn)所制作的質(zhì)粒的喊基序列，但是，目標(biāo)質(zhì)粒含有1. 5個拷貝的病毒基因組，因此一定有重復(fù)的DNA區(qū)，無法通過測序確認(rèn)堿基序列正確。這里，一旦在克隆質(zhì)粒pBluescript II KS+中摻入I個拷貝份的病毒基因組，確認(rèn)全部堿基序列后，不進(jìn)行PCR，將用限制酶切出的DNA片段導(dǎo)入pBI_TYLCV(0. 5)。通過PCR，由TYLCV的病毒基因組DNA擴增包含復(fù)制起點的I個拷貝份的DNA片段，克隆到pBluescript II KS+的Pst I/Hind III位點,得到pBS-TYLCV。通過測序確認(rèn)全部堿基序列正確。接著用BsrG I和Hind III從pBS-TYLCV切出病毒基因組I個拷貝份的DNA片段，在瓊脂糖凝膠上純化，然后克隆到pBI_TYLCV(0. 5)的BsrG I/Hind III位點上，最終得到目標(biāo)質(zhì)粒pB1-TYLCV(l. 5)。對于TYLCV-mild也進(jìn)行同樣的操作，最終可得到目標(biāo)質(zhì)粒 pB1-TYLCV-mild(l. 5)。(b)病毒感染用質(zhì)粒的感染能力的確認(rèn)制作土壤桿菌C58ClRifR(GV2260)的感受態(tài)細(xì)胞。在該感受態(tài)細(xì)胞中導(dǎo)入所制作的具有1. 5個拷貝的TYLCV基因組或TYLCV-mild基因組的雙元載體，制作土壤桿菌接種法用的土壤桿菌的甘油貯液，保存于_80°C。在對野生型番茄進(jìn)行感染的前一天，將該甘油貯液接種于6mL的LB培養(yǎng)基(Kan 100mg/L、Amp 50mg/L)，在30°C下培養(yǎng)一晝夜。接著收集土壤桿菌，懸浮于ImL緩沖液中。將該懸浮液注入到播種后約10天的苗的子葉中，使其感染。感染后定期進(jìn)行植物個體的觀察以及葉中病毒DNA的檢測。用于此目的的DNA樣品的制作如上所述進(jìn)行，通過對使用對各TYLCV特異性的引物組進(jìn)行PCR所得產(chǎn)物的分析，在分子水平上評價病毒感染。(3) TYLCV感染抗性的評價在來自轉(zhuǎn)化體T3的苗中注入保有病毒雙元載體的土壤桿菌的懸浮液，隨時間變化用肉眼確認(rèn)感染癥狀。另外，從感染的番茄的葉中提取DNA，按照前項的方法，通過PCR驗證植物體內(nèi)病毒是否增殖。2.結(jié)果(I)AZP轉(zhuǎn)化番茄的制作分別通過土壤桿菌向Micro-Tom番茄中導(dǎo)入AZP基因。將用圖15所示的具有各AZP表達(dá)盒的雙元載體轉(zhuǎn)化的土壤桿菌感染子葉切片，導(dǎo)入基因。接著，使用含有卡那霉素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織、枝條，接著誘導(dǎo)根。選擇生根較深地伸入瓊脂培養(yǎng)基的個體，由此，在誘導(dǎo)生根時進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化體，馴化，然后移栽于土壤中，從而得到轉(zhuǎn)化體。通過PCR法確認(rèn)了這些轉(zhuǎn)化體Tl具有AZP基因。為了檢測卡那霉素抗性基因和AZP基因，使用圖16所示的PCR引物組(各圖中以橙色和藍(lán)色的箭頭表示)進(jìn)行PCR。通過圖17所得到的轉(zhuǎn)化體檢測兩者的基因，確認(rèn)轉(zhuǎn)化操作順利進(jìn)行。為防止萬一，還用其它的引物組確認(rèn)了 AZP表達(dá)盒全部區(qū)插入到番茄基因組中(圖18 :用粉色箭頭表示)。如圖19所示，確認(rèn)了從35S啟動子至NOS終止子，AZP表達(dá)盒全部區(qū)均導(dǎo)入到植物基因組中。(2)T2和Τ3植物的制作以及各系的分析對于所得Tl植物中的AZP基因的拷貝數(shù)，調(diào)查Τ2植物中插入了 AZP基因的個體的比例，通過卡方檢驗來鑒定。即，由各Tl系回收Τ2種子，播種這些種子，通過PCR鑒定所得各Τ2個體中的AZP基因的有無。在導(dǎo)入ΑΖΡ-2得到的Τ2植物中，各以一個系為例表示于圖19。以圖19為例，在由通過PCR法確定的Tl系得到的Τ2植物的18個個體中，13個個體具有AZP基因，分離比為13 5。如果該Tl系具有I個拷貝的AZP基因，則其分離比應(yīng)該為3 I。因此，如果通過卡方檢驗假定為I個拷貝，則卡方值為O. 074，P = O. 01的臨界值為6. 63，因此該虛假設(shè)不能放棄。另一方面，如果假定插入了 2個拷貝，則卡方值為14. 2，比臨界值大，該虛假設(shè)可放棄。由以上驗證結(jié)果可知，該Tl系是單拷貝插入體。對其它的Tl個體也同樣進(jìn)行了單拷貝插入體的篩選(圖20)。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)各方法的轉(zhuǎn)化體中AZP的表達(dá)。在各方法用的AZP表達(dá)盒中，預(yù)先加有HA附加表位，使得通過使用抗HA抗體的蛋白質(zhì)印跡法，可以驗證轉(zhuǎn)化體中AZP蛋白的表達(dá)。如圖21所示，對于導(dǎo)入了 AFP-2的Τ2植物，也可確認(rèn)AZP蛋白質(zhì)強烈表達(dá)。由確認(rèn)了有I個拷貝的AZP基因插入的Tl植物得到的各Τ2系是純合或雜合，這通過來自各Τ2植物的Τ3苗的PCR分析確定。通過由來自各Τ2系的Τ3苗(各系使用約20個個體的苗)的葉中提取的DNA樣品的PCR分析，如果確認(rèn)所有的苗中均保有AZP基因，則可以斷定其親本Τ2系為純合(如果分離比為1: 3，則其親本Τ2系為雜合)。在來自同一Τ2系的所有的Τ3植物中均保有AZP基因，因此可知該Τ2系為純合(圖22)。也通過統(tǒng)計處理確認(rèn)為純合。還通過蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)了 Τ3植物中AZP的表達(dá)(圖23)。對于使用AFP-3轉(zhuǎn)化的植物，對于來自各Τ2植物的Τ3苗也進(jìn)行同樣的操作，得到了同樣的結(jié)果。[表 I]
權(quán)利要求
1.復(fù)制抑制劑，所述復(fù)制抑制劑含有鋅指蛋白，且可以抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，其中，所述鋅指蛋白可以與雙生病毒莖環(huán)區(qū)的全長DNA或選自該全長DNA的I或2處以上的部分 DNA特異性結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的復(fù)制抑制劑，所述復(fù)制抑制劑含有可與選自雙生病毒莖區(qū)的全長DNA 的I處的部分DNA結(jié)合的單一的鋅指蛋白，或者可與選自該全長DNA的2處以上的部分DNA 結(jié)合的單一的鋅指蛋白。
3.權(quán)利要求1的復(fù)制抑制劑，所述復(fù)制抑制劑含有鋅指蛋白，所述鋅指蛋白是通過接頭將2個以上可分別與選自雙生病毒莖區(qū)的全長DNA的2處以上的部分DNA結(jié)合的鋅指蛋白質(zhì)連接而成。
4.權(quán)利要求3的復(fù)制抑制劑，其中，2個鋅指蛋白為含有3個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白以及含有6個鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。
5.權(quán)利要求3或4的復(fù)制抑制劑，其中，接頭為妝接頭。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的復(fù)制抑制劑,其中，雙生病毒為屬于菜豆金色花葉病毒屬的病毒。
7.權(quán)利要求6的復(fù)制抑制劑，其中，雙生病毒為番茄黃化曲葉病毒。
8.編碼權(quán)利要求1-7中任一項的鋅指蛋白的核酸。
9.植物轉(zhuǎn)化用的重組載體，所述重組載體含有權(quán)利要求8的核酸。
10.含有權(quán)利要求1-7中任一項的鋅指蛋白或編碼該鋅指蛋白的核酸作為有效成分的農(nóng)藥。
11.預(yù)防植物的雙生病毒感染的方法，所述方法包括對植物施用預(yù)防有效量的權(quán)利要求1-7中任一項的鋅指蛋白或編碼該鋅指蛋白的核酸的步驟。
12.基因重組植物，所述基因重組植物對雙生病毒具有抗性，可表達(dá)上述鋅指蛋白。
13.通過導(dǎo)入編碼權(quán)利要求1-7中任一項的鋅指蛋白的核酸轉(zhuǎn)化的植物。
14.使植物獲得雙生病毒抗性的方法，所述方法包括將編碼權(quán)利要求1-7中任一項的鋅指蛋白的核酸導(dǎo)入該植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的步驟。
15.植物轉(zhuǎn)化用載體，所述植物轉(zhuǎn)化用載體含有編碼權(quán)利要求1-7中任一項的鋅指蛋白的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及復(fù)制抑制劑，其為抑制雙生病毒的復(fù)制的藥物，含有鋅指蛋白，該鋅指蛋白至少可與雙生病毒的莖環(huán)區(qū)DNA的全長或其一部分特異性結(jié)合，且可抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。
文檔編號C07K14/00GK103003425SQ20118003022
公開日2013年3月27日 申請日期2011年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月7日
發(fā)明者世良貴史 申請人:世良貴史