專利名稱：梅花鹿igf-1多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說是梅花鹿IGF-I多肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
鹿茸是鹿的第二性征，是在鹿額骨部長出的骨質(zhì)性組織。由于每年周期性地生長，它的生長發(fā)育可能受特殊的分子機理調(diào)控。即鹿茸的獨特之處就在于它的每年更新， 這在哺乳動物中絕無僅有，因而其成為理想的研究組織器官再生的生物模型。鹿茸生長速度之快也是其它任何哺乳動物組織無法比擬的，可達(dá)每天l-2cm。因此人們推測其中可能存在特殊的促進骨組織生長的活性物質(zhì)，能刺激鹿茸的快速生長。胰島素樣生長因子 (insulin-like growthfactor, IGF)是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與胰島素原類似而得名。其中IGF-I是由70個氨基酸殘基組成，具有內(nèi)分泌、自分泌及旁分泌特性的單鏈多肽，血液中的IGF-I主要由肝細(xì)胞合成和釋放。IGF-I在細(xì)胞正常生長、胚胎發(fā)育、神經(jīng)生長及能量代謝的方面起著十分重要的作用，其中比較明確的生物學(xué)效應(yīng)主要有兩大類，即促進有絲分裂作用和類胰島素作用。IGF-I是動物生長軸的中心環(huán)節(jié)，在動物生長調(diào)控中起重要作用。Suttie等的研究發(fā)現(xiàn)IGF-I與鹿茸的生長率高度相關(guān)，生長因子在生茸期鹿血漿中升高，這意味著IGF-I很可能刺激鹿茸生長。Elliott等研究表明，在鹿茸的頂部有大量IGF-I受體，進一步間接證明IGF-I參與了鹿茸生長發(fā)育調(diào)節(jié)的可能性。目前，已從人和許多動物體組織中分離得到IGF-1，如在人、豬、雞上關(guān)于IGF-I促進生長的研究較多。但是，類似東北梅花鹿IGF-I成熟肽的表達(dá)與活性研究在國內(nèi)外比較少。目前，人IGF-l(hlGF-l)在臨床上已用于治療糖尿病、胰島素抵綜合征、侏儒癥及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病，并取得了良好的效果。國內(nèi)外已有通過哺乳動物細(xì)胞及大腸桿菌表達(dá)獲得hIGF-Ι的報道，但存在表達(dá)量較低和純化較困難等問題。本發(fā)明人根據(jù)GenBank已發(fā)表的相關(guān)序列設(shè)計梅花鹿IGFl基因特異引物并克隆 IGFl基因，將梅花鹿IGFl基因DNA序列已遞交GenBank，并利用相對熒光定量Real-time PCR法檢測IGFl在鹿茸頂端不同部位組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)豐度。成功獲得了梅花鹿鹿茸組織 IGFI基因全長編碼區(qū)cDNA (GenBank登錄號為HQ890468)，該基因長465bp，編碼154aa長度的多肽，與馬鹿、牛、羊、馬、豬、人和小鼠IGFl基因進行同源性分析顯示，IGFl基因與馬鹿、牛和羊同源性最高，核苷酸序列分別為99. 78%,98. 28%和97. 85% ;氨基酸序列分別為99. 35 %、98· 05%和97. 40 %。相對熒光定量PCR差異分析發(fā)現(xiàn)，IGFl基因在鹿茸頂端不同部位組織均有表達(dá)。其中，在前軟骨和軟骨組織的表達(dá)水平明顯高于真皮和間充質(zhì)組織(見《東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報》2011第39卷第11期，梅花鹿IGFl全長cDNA克隆及在鹿茸組織的表達(dá))。pET系列載體是目前原核表達(dá)中，應(yīng)用較為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。pET系列載體中連有 T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，其mRNA的合成速度是大腸桿菌的5倍，進而實現(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)。 其中，pET-32a載體含有一個硫氧還蛋白的堿基序列，連接目的片段后，以融合蛋白的方式與目的蛋白一同表達(dá)，不但可以促進目的蛋白二硫鍵的形成，使目的蛋白恢復(fù)正確的三維結(jié)構(gòu)，而且還可以保護目的蛋白免受大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解。此外，該載體中還含有組氨酸標(biāo)簽，能夠特異地與鈷或鎳等金屬離子結(jié)合，提高蛋白純化效率。盡管pET_32a表達(dá)產(chǎn)物中含有腸激酶和凝血酶的特異切割位點，但是酶試劑價格昂貴，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，而且切割后目的蛋白上游會帶有十幾個到幾十個額外的氨基酸序列，對于小分子量蛋白的復(fù)性影響很大，直接影響蛋白活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種梅花鹿IGF-I成熟肽的基因、成熟肽及其梅花IGF-I成熟肽制備方法。梅花鹿IGF-I成熟肽的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示；梅花鹿IGF-I成熟肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。梅花IGF-I成熟肽的制備方法，該方法包括I)用引物PI:TTCGAATTCAACGGACCCGAGACCCTCTGP2 CGCAAGCTTCTAGGCCGCCTTGGTGG ；提取梅花鹿鹿茸組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，為模板擴增；2)擴增產(chǎn)物插入表達(dá)載體pET_32a中，獲得表達(dá)載體pET-32a-IGF_l，將其轉(zhuǎn)染大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；收集純化融合蛋白；3)用羥胺裂解液裂解融合蛋白，蛋白復(fù)性液復(fù)性，去雜，得梅花IGF-I成熟肽；所述的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)為濃度為O. 6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)4小時；所述的羥胺裂解液為2mol/L 羥胺，200mmol/L CHES，8mol/L 尿素，pH9. 5 ；所述的蛋白復(fù)性液為O. 5mmol/L NaCl, Immol /T, EDTA, 20mmol/L Tris-HCl, I % Gly,lmmol/LGSH,3mmol/L GSSG, pH 8.0。本發(fā)明提供了一種梅花鹿IGF-I成熟肽的基因，并在上游引物5端添加EcoRI酶切位點和編碼Asn的堿基序列，下游引物5’端添加Hind III酶切位點和終止密碼子序列， 克隆了表達(dá)梅花鹿IGF-I成熟肽的堿基序列234bp基因，構(gòu)建了表達(dá)載體pET-32a-IGF-l， 在大腸桿菌Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了梅花鹿IGF-I成熟肽。引入EcoRI、Hind III酶切位點，利用梅花鹿IGF-I第一個氨基酸為Gly的特點，在天然的IGF-I前面添加一個Asn，形成一個羥胺的特異裂解部位(Asn-Gly肽鍵)，降低了蛋白切割成本，減少額外氨基酸序列對蛋白復(fù)性的影響，保持蛋白在天然條件下的狀態(tài)；采用pET-32a作表達(dá)載體在大腸桿菌 Rosetta中表達(dá)，蛋白含量可達(dá)菌體可溶蛋白的50%以上，通過MTT法檢測顯示，隨著IGF-I 濃度的增加，NIH3T3細(xì)胞增殖速度呈遞增趨勢，在Ong/ml 200ng/ml之間呈現(xiàn)濃度依賴性，通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)IGF-I處理的細(xì)胞比較，Gtl期和G1期細(xì)胞數(shù)有所減少，S期細(xì)胞數(shù)有所增加，證明梅花鹿IGF-I對鹿茸的快速生長具有重要的作用， IGFl與鹿茸的再生存在密切的關(guān)系。


圖I 為 IGF-I 基因 PCR 擴增產(chǎn)物的檢測，I. DNA Marker (DL2000) ;2，3. PCR 產(chǎn)物。圖2pET32a-IGF-l 表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 電泳分析，1-6.分別為 O. 1,0. 2,0. 4,O. 6,0. 8,1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；7.未誘導(dǎo)的pET32a_IGF_l ；8.蛋白質(zhì)相對分子
量標(biāo)準(zhǔn)。圖3pET32a-IGF_l裂解及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析，I.蛋白質(zhì)相對分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.羥胺裂解產(chǎn)物；3.純化產(chǎn)物。圖4IGF-1處理48h后NIH3T3細(xì)胞周期變化分析。圖5未經(jīng)IGF-I處理的NIH3T3細(xì)胞周期變化分析。
具體實施例方式實施例I梅花鹿IGF-I成熟肽基因的克隆提取梅花鹿(來自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗鹿場)鹿茸組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈 cDNA,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中梅花鹿IGF-I基因序列(登錄號HQ890468)，設(shè)計IGF-I成熟肽引物。上游引物TTCGAATTCAACGGACCCGAGACCCTCTG,在5端添加EcoRI酶切位點和編碼Asn的堿基序列；下游引物CGCAAGCTTCTAGGCCGCCTTGGTGG,在5端添加Hind III酶切位點和終止密碼子序列；以梅花鹿鹿茸組織的cDNA為模板進行PCR擴增；PCR反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s進行35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收片段連接到pMD_18T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，涂板并于37°C培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒并將鑒定正確的重組質(zhì)粒送TaKaRa公司測序。IGF-I成熟肽基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳得到234bp左右的一條特異條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖I)。提取重組質(zhì)粒，用EcoRI和Hind III雙酶切質(zhì)粒pMD-18T-IGF_l，可獲得與目的帶大小相符的電泳條帶234bp，表明克隆成功。經(jīng)BLAST分析顯示，IGF-I成熟肽基因測序正確。實施例2重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定用EcoRI和Hind III雙酶切pET_32a載體和測序正確的pMD_IGF_I質(zhì)粒，分別回收后，用T4DNA連接酶于16°C連接過夜，獲得重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中后涂布于LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。挑選陽性克隆進行雙酶切鑒定，鑒定正確后送 TaKaRa公司測序，測序正確的克隆命名為pET-32a-IGF_l。用EcoR I和Hind III雙酶切原核表達(dá)載體pET-32a_IGF_l，獲得大小約為234bp 特異性條帶，與預(yù)期大小一致。結(jié)果顯示，梅花鹿IGF-I基因成功插入pET-32a載體，原核表達(dá)載體pET32a-IGF-l構(gòu)建成功。實施例2重組子的誘導(dǎo)表達(dá)及融合蛋白的純化將鑒定正確的pET-32a-IGF_l重組子接種于LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600為 O. 4 O. 6 后，37°C下用不同 IPTG 濃度(終濃度分別為 O. I、O. 2、O. 4、O. 6、O. 8、I. OmmoI/L) 進行誘導(dǎo)表達(dá),4h后收集菌液，進行SDS-PAGE電泳檢測，未誘導(dǎo)的重組Rosetta為對照，確定最佳IPTG濃度。將重組表達(dá)菌接種于LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600為O. 4 O. 6后，用確定的最佳濃度IPTG誘導(dǎo)4h。12000g、4°C離心lmin，收集菌體，加入適量的細(xì)菌裂解液，超聲波破碎 2min,沉淀用 Tris-HCl (20mmol/L)，咪唑(IOmmoI/L)，NaCl (O. 5mol/L)溶液沖洗2次，12000g離心20min后所得沉淀即為包涵體。將包涵體溶于Tris-HCl (20mmol/L)，尿素(8mol/L)，咪唑(5mmol/L)，NaCl (O. 5mol/L)溶液，于冰水浴中溶解包涵體lh，IOOOOg 離心20min,取上清液用O. 45 μ m濾膜過濾。再經(jīng)平衡后的Ni-Agarose柱親和層析后,用 Tris-HCl (20mmol/L)，尿素(8mol/L)，咪唑(O. 5mol/L)，NaCl (O. 5mol/L)溶液洗脫，根據(jù) 280nm紫外吸收值收集洗脫峰。用pET32a_IGF_l質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta表達(dá)菌株,誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測結(jié)果顯示，在約28kDa處有特異蛋白帶出現(xiàn)，與預(yù)測融合蛋白分子質(zhì)量大小相符 (圖2);同時當(dāng)IPTG終濃度為O. 6mmol/L時，蛋白表達(dá)量最高。重組蛋白純化后SDS-PAGE 電泳檢測顯示，在約28kDa處有I條蛋白條帶，與融合蛋白pET32a-IGF-l分子質(zhì)量一致，目標(biāo)蛋白含量均可達(dá)到菌體可溶蛋白的50 %以上，且純度較高。Western blotting 雜交分析將待檢測樣品SDS-PAGE電泳后，60V、0. 5h電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%的脫脂奶粉進行封閉2h。TBST洗滌干凈后，使用兔抗人IGF-I —抗(I 200稀釋)，37°C孕育I. 5h， TBST洗滌3次；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗(I 500稀釋)，37°C孕育lh，最后用TBST 洗漆干凈，DAB顯色后分析結(jié)果。Western blotting檢測結(jié)果,在約28kDa處可檢測到特異蛋白條帶，與表達(dá)結(jié)果相符，說明表達(dá)的融合蛋白序列正確且具有IGF-I的抗原活性。實施例3融合蛋白的切割、純化與蛋白復(fù)性用羥胺裂解液(2mol/L羥胺，200mmol/LCHES，8mol/L尿素，pH9. 5)將上述獲得的融合蛋白稀釋到濃度為I. 0mg/ml，45°C反應(yīng)5h以裂解融合蛋白。用HCl將溶液調(diào)節(jié)至 pH8. O終止反應(yīng),再經(jīng)Ni-Agarose柱親和層析后,根據(jù)280nm紫外吸收值收集流出液。將收集的流出液緩慢加入到復(fù)性液(O. 5mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA, 20mmol/L Tris-HCI, I % Gly, lmmol/L GSH,3mmol/L GSSG, pH 8.0)中，使重組蛋白濃度為 0. 15mg/ml，4°C復(fù)性 12h 后透析，去除其它雜質(zhì)。羥胺裂解液切割后的重組蛋白pET32a-IGF-l經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示在約7. 5kDa處可檢測到特異蛋白條帶；重新經(jīng)親和層析純化后，SDS-PAGE檢測顯示，純化產(chǎn)物在約7. 5kDa處有I條蛋白帶，與表達(dá)結(jié)果相符，純度近100% (圖3)。實施例4重組蛋白的生物學(xué)活性檢測用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)復(fù)蘇后的NIH3T3細(xì)胞，待生長到80%后， 傳于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用含2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞24h 后，加入IGF-I重組蛋白，使其終濃度分別為0、100、200、400ng/ml。繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h，72h 后，MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況。根據(jù)MTT結(jié)果選擇重組蛋白最佳作用時間和濃度，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化。經(jīng)MTT法檢測分析顯示加入不同濃度IGF-I后，NIH3T3細(xì)胞增殖速度有所增加。 且隨著IGF-I濃度的遞增，增殖程度越明顯(表I)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明 IGF-I (濃度為200ng/ml)處理NIH3T3細(xì)胞48h后，與未經(jīng)IGF-I處理的對照組比較，G1和 Gtl期細(xì)胞百分比由76. O %減少至45. 4% (P < O. 05)，而S期細(xì)胞百分比由16. 1%增加至 31. 9% (P < O. 05)(圖 4 和圖 5)。表IMTT法檢測IGF-I對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響Tablel The influence of cell proliferation by IGF-1Ong/mllOOng/ml增殖率200ng/ml增殖率400ng/ml增殖率24h0 25±0 0I3O 278±0 025*11 0%0 299±0 019**19 6%0 301±0 017**19 8%48hO 387+0 022041710013*7 6%0 439+0 017**13 2%0 445±0 018**14 7%72h0 431±0 0250 454±0 012*5 4%0 46710 018*8 3%O 469±0 020*8 9%注*P < O 05，**P <001。
權(quán)利要求
1.梅花鹿IGF-I成熟肽的基因，其核苷酸序列如序列表SEQID NO. I所示。
2.梅花鹿IGF-I成熟肽，其氨基酸序列如序列表SEQID NO. 2所示。
3.梅花IGF-I成熟肽的制備方法，該方法包括1)用引物PITTCGAATTCAACGGACCCGAGACCCTCTG P2 CGCAAGCTTCTAGGCCGCCTTGGTGG ；以梅花鹿鹿茸組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，為模板擴增；2)擴增產(chǎn)物插入表達(dá)載體pET-32a中，獲得表達(dá)載體pET-32a-IGF_l，將其轉(zhuǎn)染大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；收集純化融合蛋白；3)用羥胺裂解液裂解融合蛋白，蛋白復(fù)性液復(fù)性，去雜，得梅花IGF-I成熟肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的梅花IGF-I成熟肽的制備方法，其特征在于所述的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)為濃度為O. 6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)4小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的梅花IGF-I成熟肽的制備方法，其特征在于所述的羥胺裂解液為 2mol/L 羥胺，200mmol/L CHES，8mol/L 尿素，pH9. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的梅花IGF-I成熟肽的制備方法，其特征在于所述的蛋白復(fù)性液為 O. 5mmol/L NaCKlmmol/L EDTA、20mmol/L Tris_HCl、l% Gly、lmmol/L GSH、 3mmol/L GSSG、pH 8. 0o
全文摘要
本發(fā)明公開了一種梅花鹿IGF-1成熟肽的基因，并在上游引物5端添加EcoR I酶切位點和編碼Asn的堿基序列，下游引物5端添加Hind III酶切位點和終止密碼子序列，克隆了表達(dá)梅花鹿IGF-1成熟肽的堿基序列234bp基因，構(gòu)建了表達(dá)載體pET-32a-IGF-1，在大腸桿菌Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了梅花鹿IGF-1成熟肽。引入EcoR I、Hind III酶切位點，在天然的IGF-1前面添加一個Asn，形成一個羥胺的特異裂解部位，降低了蛋白切割成本，減少額外氨基酸序列對蛋白復(fù)性的影響，保持蛋白在天然條件下的狀態(tài)；采用pET-32a作表達(dá)載體在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，蛋白含量可達(dá)菌體可溶蛋白的50％以上，通過MTT法檢測，能提高NIH3T3細(xì)胞增殖速度。
文檔編號C07K14/475GK102586257SQ20121001800
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者劉寧, 孟星宇, 李婷, 李沐, 李雨婷, 王健, 田玉華, 胡薇, 胡銳 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)