本發(fā)明涉及生物蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有抗菌效果的梅花鹿角盤抗菌肽/蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鹿角盤指的是雄性鹿在鋸茸后殘留在角柄上的骨化物，到了第二年新茸長出前自動脫落的盤狀物質(zhì)，也命名為“鹿花盤”、“鹿角帽”，主要含有多種必需氨基酸及多種礦物質(zhì)元素。鹿角盤呈盔狀或扁盔狀，直徑2-5cm，高2-4.5cm，表面為灰黃色或灰褐色，呈蜂窩狀，底面較平并富有一定光澤，上部呈現(xiàn)出不規(guī)則的半球形形狀，質(zhì)地較為堅硬，顏色呈灰白色。近些年來，對于鹿角盤的成分主要從以下幾個部分進行研究，主要是氨基酸、無機元素、蛋白多肽類物質(zhì)等等，同時也有少量報道稱鹿角盤中含有甾體類、多糖類等物質(zhì)。

相比于分子量較大的蛋白，小分子蛋白及多肽更容易被機體所吸收從而具有更加明顯的醫(yī)療保健效果，而蛋白質(zhì)或多肽單體的研究及氨基酸序列的獲得可以為蛋白質(zhì)工程研究與基因工程研究之間搭建橋梁并為蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展做出貢獻，因此，近年來，越來越多的人把對梅花鹿角盤研究的目光集中在了小分子多肽、蛋白多肽單體上。姜薇用5mM的預(yù)冷醋酸鈉溶液對梅花鹿角盤粉末中的可溶性蛋白進行攪拌提取，并通過醇沉、旋蒸、凍干、葡聚糖凝膠除鹽、離子交換層析和高效液相法得到純化的蛋白單體，電泳檢測(SDS-PAGE)顯示其相對分子質(zhì)量大小為17.2kDa，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定，確定其為肽聚糖識別蛋白1(PGRP 1)，匹配的序列為RLYEIIQ KWPHYRA，將其命名為cnPGRP1，并通過抑菌試驗證明其具有明顯的抑菌活性(志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、大腸桿菌、枯草桿菌)。黃鳳杰等人通過pH3.5稀醋酸緩沖液勻漿提取、色譜柱Resource S純化、Superdex 75凝膠柱層析、反相高效液相等方法得到相對分子質(zhì)量大小為7.1276kDa的梅花鹿角盤多肽單體，將其給藥于KK-ay小鼠觀察其降糖活性，并建立胰島素抵抗模型(利用高胰島素誘發(fā)HepG2細胞)，研究該多肽對胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗的影響，結(jié)果顯示，該多肽既可降低KK-ay小鼠血糖水平，又可顯著促進胰島素抵抗模型的糖消耗，說明該蛋白單體具有一定的降糖活性。唐任能通過超濾(中空纖維膜)、離子交換層析、凝膠過濾層析等手段純化出一個相對分子質(zhì)量大小為17.0kDa的小分子蛋白單體，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析發(fā)現(xiàn)其與哺乳動物的肽聚糖識別蛋白同源性較高，并發(fā)現(xiàn)該小分子蛋白單體對L929等細胞的增殖有顯著影響。王志兵等人通過酶解得到梅花鹿角盤蛋白CPP，電泳檢測(SDS-PAGE)其相對分子質(zhì)量在8-15kDa之間，活性試驗證明CPP能夠抗大鼠乳腺增生，并對小鼠的吞噬功能產(chǎn)生顯著影響。邱芳萍等人將梅花鹿角盤低溫粉碎成粒度0.01mm的微粉后，45℃蒸餾水浸提并抽濾浸提液，上清液進行鹽析得到蛋白沉淀并對蛋白沉淀進行復(fù)性，再通過透析及層析(Sephadex G-100)手段得到鹿角盤蛋白APPB，電泳檢測(SDS-PAGE)其相對分子質(zhì)量在20.1-31.0kDa之間，并對其進行醋酸致小鼠扭體實驗，結(jié)果顯示其具有鎮(zhèn)痛作用。

抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用對病原菌感染性疾病治療的巨大貢獻是不可否認的，然而，抗生素濫用所導(dǎo)致的細菌耐藥性、環(huán)境污染、過敏反應(yīng)及家畜產(chǎn)品中殘留等問題迫使我們不得不尋找一種新的良性抗菌替代物，可以說，抗菌肽和抗菌蛋白就是這樣應(yīng)運而生的不二之選?？咕暮涂咕鞍拙哂袕V譜的抗細菌能力，部分抗菌肽和抗菌蛋白還能抵抗寄生蟲、病毒及真菌。抗菌肽和抗菌蛋白受基因編碼，廣泛存在于昆蟲、動植物及人體中，是人體先天性免疫系統(tǒng)中重要的免疫分子，因此在應(yīng)用于人體的同時不會產(chǎn)生毒副作用，是比抗生素更加健康的抗菌物質(zhì)，其開發(fā)和利用具有良好的前景，也是近年來科學(xué)研究者關(guān)注的焦點。

目前，針對鹿角盤水溶性總肽的活性研究多集中在動物實驗及抗腫瘤細胞的研究上，有關(guān)抑菌作用的報道甚少出現(xiàn)；而針對鹿角盤酶解產(chǎn)物(本發(fā)明制得的酶解產(chǎn)物為膠原水解肽)的活性研究則大部分集中在抗氧化作用方面；有關(guān)梅花鹿角盤抑菌作用的研究僅集中于部分分離純化獲得的蛋白質(zhì)及多肽單體上，而由于這些抑菌實驗研究所用的菌大都不超過4種從而無法全面、客觀的反映梅花鹿角盤蛋白質(zhì)及多肽的實際抑菌情況，因此，本發(fā)明對梅花鹿角盤蛋白多肽的抑菌活性進行了初步的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了對梅花鹿角盤蛋白多肽的抑菌活性進行研究，本發(fā)明提供一種具有抗菌效果的梅花鹿角盤抗菌肽/蛋白及其應(yīng)用。

一種具有抗菌效果的梅花鹿角盤抗菌肽/蛋白，包括梅花鹿角盤小分子多肽、梅花鹿角盤膠原水解肽和梅花鹿角盤小分子蛋白單體。

優(yōu)選的，所述的梅花鹿角盤小分子多肽，按照下述步驟進行提取：

A、鹿角盤總肽的提?。?/p>

稱取450-550g鹿角盤粉末，加入3000mL于4℃冰箱充分預(yù)冷的pH為3.2-3.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，磁力攪拌器充分攪拌后，對勻漿液進行離心，取上清；向其中緩慢加入4℃冰箱充分預(yù)冷的95％乙醇直至上清液終濃度達到55％后，4℃冰箱放置并每隔1h攪拌一次，3.5-5h后離心，取上清；以上操作除旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)外均在4℃條件下進行；

上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃-45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至濃縮液體積為400mL左右；

濃縮液過濾后置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機凍干，得梅花鹿角盤總肽粗提物，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

兩次離心的速度為5000-6500rpm，時間為25min；

B、總肽粗提物的除鹽：

取梅花鹿角盤總肽粗提物1.2-1.8g，用10mL去離子水溶解充分后，過0.45μm濾器，為上樣液；

用膠頭滴管將上樣液沿柱內(nèi)壁緩緩滴入層析柱內(nèi)并注意不要沖擊膠面，用去離子水洗脫，并通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速控制流速穩(wěn)定在0.8-1.2mL/min，核酸蛋白檢測儀在280nm處檢測吸光值，出峰后用干凈燒杯收集，待吸光值回歸基線時停止收集，并繼續(xù)用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫后關(guān)閉出水口；

收集液凍干，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

C、總肽的分級分離：

取梅花鹿角盤總肽除鹽品80-125mg，用2mL去離子水溶解充分后，過0.45μm微孔濾器，為上樣液；

用膠頭滴管將上樣液沿柱內(nèi)壁緩緩滴入層析柱內(nèi)并注意不要沖擊膠面，用去離子水洗脫，并通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速控制流速穩(wěn)定在0.3-0.6mL/min，核酸蛋白檢測儀在215nm處檢測吸光值，自動收集器收集并標記收集各峰的試管，待吸光值回歸基線時停止收集，并繼續(xù)用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫后關(guān)閉凝膠柱出水口；

D、冷凍干燥：將收集液置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機凍干，得梅花鹿角盤小分子蛋白多肽。

優(yōu)選的，所述的梅花鹿角盤膠原水解肽，按照下述步驟進行提?。?/p>

稱取梅花鹿角盤粉末置于燒杯中，加入蒸餾水，在沸水浴中加熱，加熱過程中用玻璃棒不斷攪拌，且不斷用蒸餾水補充使提取勻漿體積維持恒定，4-6h后離心，離心條件為7000rpm，25℃，20min，取上清液4℃冰箱保存，沉淀置于燒杯中加入蒸餾水繼續(xù)水浴提取，共提取4次，合并4次上清液，合并時水浴加熱5min并不斷攪拌，即為梅花鹿角盤明膠提取液；

B、取梅花鹿角盤明膠提取液，按酶與梅花鹿角盤粉末1∶1250的比例加入適量的胰蛋白酶解液，37℃水浴條件下酶解50-70min，期間不斷用玻璃棒輕輕攪拌使酶與梅花鹿角盤粉末充分接觸，酶解后的明膠提取液馬上于100℃沸水浴中煮沸3-8min使胰蛋白酶失活，沸水浴后的酶解液離心，離心條件為8000rpm，25℃，10min，取上清，即獲得梅花鹿角盤膠原水解肽；

C、將梅花鹿角盤膠原水解肽液置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機凍干，得梅花鹿角盤膠原水解肽凍干品，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用。

優(yōu)選的，所述的梅花鹿角盤小分子蛋白單體，按照下述步驟進行提取：

A、鹿角盤總肽的提?。?/p>

稱取450-550g鹿角盤粉末，加入3000mL于4℃冰箱充分預(yù)冷的pH為3.2-3.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，磁力攪拌器充分攪拌后，對勻漿液進行離心，取上清；向其中緩慢加入4℃冰箱充分預(yù)冷的95％乙醇直至上清液終濃度達到55％后，4℃冰箱放置并每隔1h攪拌一次，3.5-5h后離心，取上清；以上操作除旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)外均在4℃條件下進行；

上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃-45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至濃縮液體積為400mL左右；

濃縮液過濾后置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機凍干，得梅花鹿角盤總肽粗提物，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

所述的兩次離心的速度為5000-6500rpm，時間為25min；

B、總肽粗提物的除鹽：

取梅花鹿角盤總肽粗提物1.2-1.8g，用10mL去離子水溶解充分后，過0.45μm濾器，為上樣液；

用膠頭滴管將上樣液沿柱內(nèi)壁緩緩滴入層析柱內(nèi)并注意不要沖擊膠面，用去離子水洗脫，并通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速控制流速穩(wěn)定在0.8-1.2mL/min，核酸蛋白檢測儀在280nm處檢測吸光值，出峰后用干凈燒杯收集，待吸光值回歸基線時停止收集，并繼續(xù)用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫后關(guān)閉出水口；

收集液凍干，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

C、反相高效液相層析分離鹿角盤蛋白單體：取梅花鹿角盤除鹽品100mg，溶解于2mL 15％乙腈溶液中，過0.22μm微孔濾器，為進樣液，流動相分為A、B兩相，A相為：1mL色譜純?nèi)宜?TFA)+1000mL脫氣超純水，B相為：0.85ml色譜純?nèi)宜?TFA)+1000mL脫氣乙腈，洗脫的梯度設(shè)置為：乙腈濃度0％，0-5min；0％-70％，5-35min；70％-100％，35-50min；進樣量為每次梯度80μL進樣液，進樣液濃度為50mg/ml；檢測波長為280nm；柱溫22℃；流速1mL/min；每次梯度結(jié)束后，用20％乙腈平衡色譜柱40min，流速仍為1.0mL/min，收集各峰并保存于-20℃冰箱中；

D、SDS-PAGE電泳檢測：

電泳所用玻璃板夾層寬度為1.0mm，用清水清洗玻璃板并用蒸餾水及去離子水潤洗，將玻璃板固定于電泳槽中，坐于制膠夾上：

分離膠的配制：向干凈的小燒杯中依次加入1.620mL去離子水、1.675mL凝膠緩沖液、1.675mL膠貯備液II、25μL 10％過硫酸銨和2.5μL TEMED，移液槍吹打均勻后灌膠，灌膠高度為4cm左右時停止灌膠，用移液槍向膠面上層灌入1mL異丙醇，室溫下凝固1h；

間層膠的配制：濾紙除去異丙醇：向干凈的小燒杯中依次加入1.149mL去離子水、0.838mL凝膠緩沖液、0.500mL膠貯備液I、12.5μL 10％過硫酸銨和1.25μL TEMED，移液槍吹打均勻后灌膠，灌膠高度為1.5cm左右時停止灌膠，用移液槍向膠面上層灌入1mL異丙醇，室溫下凝固1h；

濃縮膠的配制：濾紙除去異丙醇：向干凈的小燒杯中依次加入1.677mL去離子水、0.620mL凝膠緩沖液、0.200mL膠貯備液I、30μL 10％過硫酸銨和1.20μL TEMED，移液槍吹打均勻后灌膠，拆入制膠梳子，室溫下凝固1h；

取分級分離收集峰液體20μL，加入等體積2×電泳上樣緩沖液，移液槍吹打混勻10s：樣品同電泳Marker共同沸水浴處理5min后，上樣；電泳起始電壓為60V，當溴酚藍指示線遷移至濃縮膠與間層膠分界線時將電壓調(diào)至100V，待溴酚藍指示線遷移至距離分離膠底0.2cm處時，關(guān)閉電泳儀，停止電泳：電泳過程中緩沖液保持冰浴：

將膠片轉(zhuǎn)移至干凈大培養(yǎng)皿中，加入適量固定液，于搖床上固定1h：固定完畢后，倒掉固定液并用蒸餾水清洗膠片，加入染色液染色5h：染色完畢后，倒去染色液并用蒸餾水清洗膠片，脫色液脫色至背景干凈為止：膠片于紫外成像儀中拍照并保存E、電噴霧質(zhì)譜檢測：

F、目標小分子蛋白的富集：選擇液相出峰時間為28.93min的的峰為目標進行富集；

G、冷凍干燥：將保存于-20℃冰箱的小分子蛋白富集液取出，待其融化后置于青瓶內(nèi)，真空冷凍干燥，即獲得梅花鹿角盤蛋白單體，于-20℃冰箱保存待用。

對梅花鹿角盤抗菌肽/蛋白進行抑菌試驗，具體分組如下：

1.A組：取梅花鹿角盤總肽除鹽品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.B組：取梅花鹿角盤小分子蛋白單體凍干品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝于后，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.C組：取梅花鹿角盤小分子多肽凍干品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.D組：取梅花鹿角盤膠原肽凍干品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.AMP陽性對照組：取氨芐青霉素10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

6.陰性對照組：去離子水。

本發(fā)明采用紙片擴散法對梅花鹿角盤各蛋白多肽制備品的抑菌活性進行初步探討，試驗評定結(jié)果通過測量各抑菌劑產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑來進行，可初步判斷各制備品抑菌能力的強弱。具體步驟如下：

將小培養(yǎng)皿、鑷子、去離子水、圓形濾紙片、移液槍等抑菌試驗所用物品放入超凈工作臺中，開啟紫外滅菌30min。紫外照射后，點燃酒精燈并用酒精棉反復(fù)擦拭臺面及試驗所用器具。取六個干凈小培養(yǎng)皿置于酒精燈附近，分別標記為陽性對照組、陰性對照組(陰性對照組為去離子水)、A組、B組、C組、D組，并向各組培養(yǎng)皿中放入圓形濾紙片若干。按照分組，用移液槍取對應(yīng)的抑菌劑浸潤到對應(yīng)的濾紙片上，平均每個濾紙片浸潤10μL對應(yīng)的抑菌劑，待濾紙片干燥后才可進行貼片。在等待濾紙片干燥的過程中，融化固體培養(yǎng)基并分裝于若干干凈小培養(yǎng)皿中(每個小培養(yǎng)皿中20mL培養(yǎng)基)。待固體培養(yǎng)基充分凝固且溫度接近于室溫后，取活化后的菌液200μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基中，待涂布均勻后貼片。貼片后的各固體培養(yǎng)基用封口膜封住周邊且做好標記，倒置培養(yǎng)。白色念珠菌需在30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～20h，其余革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16～18h。倒置培養(yǎng)完畢后，用游標卡尺測量各抑菌劑的抑菌環(huán)直徑并記錄，并拍照保存。

本發(fā)明所提供的具有抗菌效果的梅花鹿角盤抗菌肽/蛋白，包括梅花鹿角盤小分子多肽、梅花鹿角盤膠原水解肽和梅花鹿角盤小分子蛋白單體。對其進行抑菌環(huán)試驗，包括對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌的抑制效果。其中，革蘭氏陰性菌包括：產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形菌、綠膿桿菌和大腸桿菌；革蘭氏陽性菌包括：緩慢葡萄球菌、格氏乳球菌、木糖葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和中間葡萄球菌；真菌為白色念珠菌。在各抑菌劑的作用下，產(chǎn)氣腸桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、中間葡萄球菌、木糖葡萄球菌皆出現(xiàn)不同程度的抑制效果，而白色念珠菌、格氏乳球菌、奇異變形菌、緩慢葡萄球菌則未被抑制。

附圖說明

圖1為實施例1中產(chǎn)氣腸桿菌抑菌圖1。

圖2為實施例1中產(chǎn)氣腸桿菌抑菌圖2。

圖3為實施例1中綠膿桿菌抑菌圖1。

圖4為實施例1中綠膿桿菌抑菌圖2。

圖5為實施例1中大腸桿菌抑菌圖1。

圖6為實施例1中大腸桿菌抑菌圖2。

圖7為實施例1中枯草芽孢桿菌抑菌圖1。

圖8為實施例1中枯草芽孢桿菌抑菌圖2。

圖9為實施例1中中間葡萄球菌抑菌圖1。

圖10為實施例1中中間葡萄球菌抑菌圖2。

圖11為實施例1中木糖葡萄球菌抑菌圖1。

圖12為實施例1中木糖葡萄球菌抑菌圖2。

具體實施方式

實施例1

一種具有抗菌效果的梅花鹿角盤抗菌肽/蛋白，包括梅花鹿角盤小分子多肽、梅花鹿角盤膠原水解肽和梅花鹿角盤小分子蛋白單體。

所述的梅花鹿角盤小分子多肽，按照下述步驟進行提取：

A、鹿角盤總肽的提?。?/p>

稱取500g鹿角盤粉末，加入3000mL于4℃冰箱充分預(yù)冷的pH為3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，磁力攪拌器充分攪拌后，對勻漿液進行離心，取上清；向其中緩慢加入4℃冰箱充分預(yù)冷的95％乙醇直至上清液終濃度達到55％后，4℃冰箱放置并每隔1h攪拌一次，4h后離心，取上清；以上操作除旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)外均在4℃條件下進行；

上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在42℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至濃縮液體積為400mL左右；

濃縮液過濾后置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機凍干，得梅花鹿角盤總肽粗提物，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

兩次離心的速度為5000-6500rpm，時間為25min；

B、總肽粗提物的除鹽：

取梅花鹿角盤總肽粗提物1.5g，用10mL去離子水溶解充分后，過0.45μm濾器，為上樣液；

用膠頭滴管將上樣液沿柱內(nèi)壁緩緩滴入層析柱內(nèi)并注意不要沖擊膠面，用去離子水洗脫，并通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速控制流速穩(wěn)定在1.0mL/min，核酸蛋白檢測儀在280nm處檢測吸光值，出峰后用干凈燒杯收集，待吸光值回歸基線時停止收集，并繼續(xù)用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫后關(guān)閉出水口；

收集液凍干，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

C、總肽的分級分離：

取梅花鹿角盤總肽除鹽品100mg，用2mL去離子水溶解充分后，過0.45μm微孔濾器，為上樣液；

用膠頭滴管將上樣液沿柱內(nèi)壁緩緩滴入層析柱內(nèi)并注意不要沖擊膠面，用去離子水洗脫，并通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速控制流速穩(wěn)定在0.45mL/min，核酸蛋白檢測儀在215nm處檢測吸光值，自動收集器收集并標記收集各峰的試管，待吸光值回歸基線時停止收集，并繼續(xù)用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫后關(guān)閉凝膠柱出水口；

D、冷凍干燥：將收集液置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機凍干，得梅花鹿角盤小分子蛋白多肽。

所述的梅花鹿角盤膠原水解肽，按照下述步驟進行提?。?/p>

A、稱取梅花鹿角盤粉末置于燒杯中，加入蒸餾水，在沸水浴中加熱，加熱過程中用玻璃棒不斷攪拌，且不斷用蒸餾水補充使提取勻漿體積維持恒定，5h后離心，離心條件為7000rpm，25℃，20min，取上清液4℃冰箱保存，沉淀置于燒杯中加入蒸餾水繼續(xù)水浴提取，共提取4次，合并4次上清液，合并時水浴加熱5min并不斷攪拌，即為梅花鹿角盤明膠提取液；

B、取梅花鹿角盤明膠提取液，按酶與梅花鹿角盤粉末1∶1250的比例加入適量的胰蛋白酶解液，37℃水浴條件下酶解60min，期間不斷用玻璃棒輕輕攪拌使酶與梅花鹿角盤粉末充分接觸，酶解后的明膠提取液馬上于100℃沸水浴中煮沸5min使胰蛋白酶失活，沸水浴后的酶解液離心，離心條件為8000rpm，25℃，10min，取上清，即獲得梅花鹿角盤膠原水解肽；

C、將梅花鹿角盤膠原水解肽液置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機凍干，得梅花鹿角盤膠原水解肽凍干品，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用。

所述的梅花鹿角盤小分子蛋白單體，按照下述步驟進行提?。?/p>

A、鹿角盤總肽的提?。?/p>

稱取500g鹿角盤粉末，加入3000mL于4℃冰箱充分預(yù)冷的pH為3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，磁力攪拌器充分攪拌后，對勻漿液進行離心，取上清；向其中緩慢加入4℃冰箱充分預(yù)冷的95％乙醇直至上清液終濃度達到55％后，4℃冰箱放置并每隔1h攪拌一次，4h后離心，取上清；以上操作除旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)外均在4℃條件下進行；

上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在42℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至濃縮液體積為400mL左右；

濃縮液過濾后置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機凍干，得梅花鹿角盤總肽粗提物，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

所述的兩次離心的速度為5000-6500rpm，時間為25min；

B、總肽粗提物的除鹽：

取梅花鹿角盤總肽粗提物1.5g，用10mL去離子水溶解充分后，過0.45μm濾器，為上樣液；

用膠頭滴管將上樣液沿柱內(nèi)壁緩緩滴入層析柱內(nèi)并注意不要沖擊膠面，用去離子水洗脫，并通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速控制流速穩(wěn)定在1.0mL/min，核酸蛋白檢測儀在280nm處檢測吸光值，出峰后用干凈燒杯收集，待吸光值回歸基線時停止收集，并繼續(xù)用三倍柱體積去離子水洗脫，洗脫后關(guān)閉出水口；

收集液凍干，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

C、反相高效液相層析分離鹿角盤蛋白單體：取梅花鹿角盤除鹽品100mg，溶解于2mL 15％乙腈溶液中，過0.22μm微孔濾器，為進樣液，流動相分為A、B兩相，A相為：1mL色譜純?nèi)宜?TFA)+1000mL脫氣超純水，B相為：0.85ml色譜純?nèi)宜?TFA)+1000mL脫氣乙腈，洗脫的梯度設(shè)置為：乙腈濃度0％，0-5min；0％-70％，5-35min；70％-100％，35-50min；進樣量為每次梯度80μL進樣液，進樣液濃度為50mg/ml；檢測波長為280nm；柱溫22℃；流速1mL/min；每次梯度結(jié)束后，用20％乙腈平衡色譜柱40min，流速仍為1.0mL/min，收集各峰并保存于-20℃冰箱中；

D、SDS-PAGE電泳檢測：

電泳所用玻璃板夾層寬度為1.0mm，用清水清洗玻璃板并用蒸餾水及去離子水潤洗，將玻璃板固定于電泳槽中，坐于制膠夾上：

分離膠的配制：向干凈的小燒杯中依次加入1.620mL去離子水、1.675mL凝膠緩沖液、1.675mL膠貯備液II、25μL 10％過硫酸銨和2.5μL TEMED，移液槍吹打均勻后灌膠，灌膠高度為4cm左右時停止灌膠，用移液槍向膠面上層灌入1mL異丙醇，室溫下凝固1h；

間層膠的配制：濾紙除去異丙醇：向干凈的小燒杯中依次加入1.149mL去離子水、0.838mL凝膠緩沖液、0.500mL膠貯備液I、12.5μL 10％過硫酸銨和1.25μL TEMED，移液槍吹打均勻后灌膠，灌膠高度為1.5cm左右時停止灌膠，用移液槍向膠面上層灌入1mL異丙醇，室溫下凝固1h；

濃縮膠的配制：濾紙除去異丙醇：向干凈的小燒杯中依次加入1.677mL去離子水、0.620mL凝膠緩沖液、0.200mL膠貯備液I、30μL 10％過硫酸銨和1.20μL TEMED，移液槍吹打均勻后灌膠，拆入制膠梳子，室溫下凝固1h；

取分級分離收集峰液體20μL，加入等體積2×電泳上樣緩沖液，移液槍吹打混勻10s：樣品同電泳Marker共同沸水浴處理5min后，上樣；電泳起始電壓為60V，當溴酚藍指示線遷移至濃縮膠與間層膠分界線時將電壓調(diào)至100V，待溴酚藍指示線遷移至距離分離膠底0.2cm處時，關(guān)閉電泳儀，停止電泳：電泳過程中緩沖液保持冰?。?/p>

將膠片轉(zhuǎn)移至干凈大培養(yǎng)皿中，加入適量固定液，于搖床上固定1h：固定完畢后，倒掉固定液并用蒸餾水清洗膠片，加入染色液染色5h：染色完畢后，倒去染色液并用蒸餾水清洗膠片，脫色液脫色至背景干凈為止：膠片于紫外成像儀中拍照并保存E、電噴霧質(zhì)譜檢測：

F、目標小分子蛋白的富集：選擇液相出峰時間為28.93min的的峰為目標進行富集；

G、冷凍干燥：將保存于-20℃冰箱的小分子蛋白富集液取出，待其融化后置于青瓶內(nèi)，真空冷凍干燥，即獲得梅花鹿角盤蛋白單體，于-20℃冰箱保存待用。

對梅花鹿角盤抗菌肽/蛋白進行抑菌試驗，具體分組如下：

1.A組：取梅花鹿角盤總肽除鹽品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.B組：取梅花鹿角盤小分子蛋白單體凍干品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝于后，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.C組：取梅花鹿角盤小分子多肽凍干品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.D組：取梅花鹿角盤膠原水解肽凍干品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.AMP陽性對照組：取氨芐青霉素10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

6.陰性對照組：去離子水。

本發(fā)明采用紙片擴散法對梅花鹿角盤各蛋白多肽制備品的抑菌活性進行初步探討，試驗評定結(jié)果通過測量各抑菌劑產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑來進行，可初步判斷各制備品抑菌能力的強弱。具體步驟如下：

將小培養(yǎng)皿、鑷子、去離子水、圓形濾紙片、移液槍等抑菌試驗所用物品放入超凈工作臺中，開啟紫外滅菌30min。紫外照射后，點燃酒精燈并用酒精棉反復(fù)擦拭臺面及試驗所用器具。取六個干凈小培養(yǎng)皿置于酒精燈附近，分別標記為陽性對照組、陰性對照組(陰性對照組為去離子水)、A組、B組、C組、D組，并向各組培養(yǎng)皿中放入圓形濾紙片若干。按照分組，用移液槍取對應(yīng)的抑菌劑浸潤到對應(yīng)的濾紙片上，平均每個濾紙片浸潤10μL對應(yīng)的抑菌劑，待濾紙片干燥后才可進行貼片。在等待濾紙片干燥的過程中，融化固體培養(yǎng)基并分裝于若干干凈小培養(yǎng)皿中(每個小培養(yǎng)皿中20mL培養(yǎng)基)。待固體培養(yǎng)基充分凝固且溫度接近于室溫后，取活化后的菌液200μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基中，待涂布均勻后貼片。貼片后的各固體培養(yǎng)基用封口膜封住周邊且做好標記，倒置培養(yǎng)。白色念珠菌需在30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～20h，其余革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16～18h。倒置培養(yǎng)完畢后，用游標卡尺測量各抑菌劑的抑菌環(huán)直徑并記錄，并拍照保存。

本發(fā)明所提供的具有抗菌效果的梅花鹿角盤抗菌肽/蛋白，包括梅花鹿角盤小分子多肽、梅花鹿角盤膠原水解肽和梅花鹿角盤小分子蛋白單體。對其進行抑菌環(huán)試驗，包括對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌的抑制效果。

革蘭氏陰性菌的抑菌試驗結(jié)果

1.產(chǎn)氣腸桿菌

如表1、圖1和圖2所示，當試驗菌為產(chǎn)氣腸桿菌時，陽性對照的抑菌環(huán)直徑為4.87mm，其余蛋白多肽根據(jù)抑菌環(huán)直徑由大到小順序依次為B組(蛋白單體)6.13mm，A組(總肽)5.11mm，C組(小分子多肽)5.03mm，D組(膠原水解肽)4.56mm。

2.綠膿桿菌

如表1、圖3和圖4所示，當試驗菌為綠膿桿菌時，陽性對照的抑菌環(huán)直徑為3.62mm，其余蛋白多肽根據(jù)抑菌環(huán)直徑由大到小順序依次為B組(蛋白單體)3.37mm，D組(膠原水解肽)3.05mm，C組(小分子多肽)2.75mm，A組(總肽)2.21mm。

3.大腸桿菌

如表1、圖5和圖6所示，當試驗菌為大腸桿菌時，陽性對照的抑菌環(huán)直徑為1.51mm，其余蛋白多肽根據(jù)抑菌環(huán)直徑由大到小順序依次為B組(蛋白單體)2.02mm，C組(小分子多肽)1.41mm，D組(膠原水解肽)1.26mm，A組(總肽)1.15mm。

革蘭氏陽性菌的抑菌試驗結(jié)果

1.枯草芽孢桿菌

如表1、圖7和圖8所示，當試驗菌為枯草芽孢桿菌時，陽性對照的抑菌環(huán)直徑為4.99mm，其余蛋白多肽根據(jù)抑菌環(huán)直徑由大到小順序依次為C組(小分子多肽)8.89mm，D組(膠原水解肽)8.04mm，B組(蛋白單體)7.01mm，A組(總肽)0mm。

2.中間葡萄球菌

如表1、圖9和圖10所示，當試驗菌為中間葡萄球菌時，陽性對照的抑菌環(huán)直徑為3.88mm，其余蛋白多肽根據(jù)抑菌環(huán)直徑由大到小順序依次為B組(蛋白單體)3.94mm，C組(小分子多肽)3.18mm，D組(膠原水解肽)2.36mm，A組(總肽)2.27mm。

3.木糖葡萄球菌

如表1、圖11和圖12所示，當試驗菌為木糖葡萄球菌時，陽性對照的抑菌環(huán)直徑為5.77mm，其余蛋白多肽根據(jù)抑菌環(huán)直徑由大到小順序依次為B組(蛋白單體)8.93mm，C組(小分子多肽)6.02mm，D組(膠原水解肽)4.91mm，A組(總肽)3.44mm。

表1 各菌抑菌環(huán)直徑

注：A組：總肽，B組：蛋白單體，C組：小分子多肽，D組：膠原水解肽

在研究抗菌肽和抗菌蛋白的抑菌活性時，選擇菌種很重要，所選用的菌種盡可能的要包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌，因為選擇單一的或個別幾個菌并不能客觀地反映該抑菌物質(zhì)的抑菌情況。本發(fā)明共選擇了10種菌，其中，革蘭氏陰性菌包括：產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形菌、綠膿桿菌和大腸桿菌；革蘭氏陽性菌包括：緩慢葡萄球菌、中間葡萄球菌、木糖葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和格氏乳球菌；真菌為白色念珠菌。所有實驗用菌都要保證其傳代次數(shù)必須在5代以下。本發(fā)明中設(shè)定的陽性對照為氨芐青霉素，實驗中各試驗組的抑菌劑濃度均為10mg/mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)梅花鹿角盤總肽、鹿角盤蛋白單體、鹿角盤小分子多肽及鹿角盤膠原水解肽均能在不同程度上抑制部分實驗所用的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，而對實驗所用真菌(白色念珠菌)未產(chǎn)生抑制作用；綜合抑菌能力由大到小依次為小分子蛋白單體＞小分子多肽＞膠原水解肽＞總肽組，小分子蛋白單體、小分子多肽及膠原水解肽的抑菌作用要強于總肽組，而小分子蛋白單體的抑菌活性最強；梅花鹿角盤四種蛋白多肽對革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的抑制效果明顯強于對革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的抑菌效果。本發(fā)明結(jié)果將為梅花鹿角盤蛋白抗菌譜的研究提供具有重要參考價值的理論依據(jù)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。