專利名稱：Bt殺蟲蛋白Cry1Ac-a的表達體系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學和生物技術領域，具體涉及一種人工合成的Bt殺蟲蛋白 Cry I Ac-a的表達體系，包括人工合成的Si殺蟲蛋白的基因，含有這種基因的表達載體和該基因表達的產物。
背景技術：
蘇云金芽孢桿菌(ifeci77i/5· thur ingiens , Si)殺蟲晶體蛋白對農業(yè)上許多重要害蟲都具有高特異的殺蟲活性，但是對人、脊椎動物、植物都完全無害，在自然界中可以被完全降解，因此被廣泛用于蟲害防治。轉Bt作物的應用為害蟲防治開辟了新途徑，降低了化學殺蟲劑的使用量。隨著水稻轉基因技術研發(fā)和轉基因品種培育的開展，我國目前培育出了多個轉Si基因的水稻品種，這些品種在通過生物安全評價后將被環(huán)境釋放而推廣應用，以滿足不斷增長的糧食需求。轉Bt作物新品種在被大量應用于農業(yè)生產前，必須對其進行生物安全性評價，以確保轉基因品種的使用安全和環(huán)境安全。轉基因生物安全評價主要是對轉入的異源蛋白釋放后產生的影響進行評估，因此進行轉基因生物安全評價就必須獲得大量與轉基因作物表達一致的蛋白。CrylAc蛋白是價殺蟲晶體蛋白中的一種,對鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲具有特異性的高毒殺能力，是目前轉基因水稻中普遍使用的的一種殺蟲晶體蛋白。轉入水稻的 CrylAc蛋白通常經過修飾激活。蛋白質的生物活性表現出與其氨基酸序列的高度相關性， 氨基酸序列決定蛋白質的高級結構，而高級結構是蛋白質生物活性的基礎，氨基酸序列的微小差別可能導致生物活性的完全不同，因此，轉Si基因品種中的CrylAc蛋白與其在蘇云金芽孢桿菌中原始的大小、結構和活性均有差別。本發(fā)明之前，CrylAc蛋白的獲得一直依賴于進口。進口的高純CrylAc蛋白價格十分昂貴，而且也與轉入水稻中的編碼基因產生的殺蟲蛋白有差異。而利用蘇云金芽孢桿菌提取得到的蛋白與轉入水稻的CrylAc蛋白存在結構上的差異，并且作為原毒素，不能在宿主體外表現出生物活性。使用酶切激活后又引入雜蛋白，因此不能夠直接利用其進行科學的評價實驗。由于雜蛋白的存在需要再次進行分離提純才能保證蛋白純度，操作繁瑣復雜。除此之外，Bt毒蛋白占植物總可溶性蛋白中的比例很小，從轉基因植物體中直接分離難度較大，很難從轉基因作物中直接獲得足夠的該殺蟲蛋白。普通的蛋白質原核表達體系由于存在密碼子偏好性的問題，也難以得到CrylAc蛋白的高效表達。本發(fā)明對CrylAc編碼框和編碼序列進行了改造和優(yōu)化，使之能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定表達得到CrylAc-a，CrylAc_a與轉入水稻中的編碼序列表達的殺蟲蛋白在氨基酸序列和結構上保持一致。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種人工合成的Bt殺蟲蛋白CrylAc-a的表達體系，包括人工合成的Si殺蟲蛋白的基因，含有這種基因的表達載體和該基因表達的產物，以克服上述技術缺陷，使得該蛋白在大腸桿菌中高表達，高效、低成本獲得CrylAc-a蛋白。本發(fā)明提供的人工合成的Si殺蟲蛋白的基因，是對CrylAc編碼框和編碼序列進行了改造和優(yōu)化而獲得，即對CrylAc蛋白編碼框優(yōu)化后再進行大腸桿菌密碼子偏好優(yōu)化， 并在5’端和3’端分別引入與表達載體一致的I和^0/ I酶切位點，氨基酸序列末端加入終止密碼子TAA而獲得。該基因序列見序列表SEQ ID No. 1，記為CrylAc-a。編碼表達的的CrylAc-a蛋白氨基酸序列與轉入水稻的殺蟲蛋白氨基酸序列一致，具有殺蟲活性，氨基酸序列見序列表SEQ ID No. 2。改造后的CrylAc-a蛋白由615個氨基酸組成，分子量為68. 7KD，等電點為5. 42。本發(fā)明提供的上述基因的表達載體，是將化學合成的上述基因CrylAc-a的DNA 片段通過I和及^7 I雙酶切后連接到同樣酶切PET43. Ia載體上(pET43. Ia質粒載體可由市售，本實驗室保藏)而獲得，記為PET43. Ia-Bt0同本發(fā)明還提供利用上述含該基因表達載體生產的重組CrylAc-a殺蟲蛋白。其方法是將獲得的重組載體轉入表達宿主BL21菌株中，得到表達菌，記為BL21 (pET43. Ia-Bt), 發(fā)酵重組表達菌株，加入IPTG誘導高效表達，即獲得有活性的CrylAc-a殺蟲蛋白。綜上，CrylAc-a蛋白的表達方法,其步驟可歸納如下
(1)CrylAc蛋白的密碼子優(yōu)化,人工合成核酸片段,得到CrylAc-a ；
(2)步驟(I)中CrylAc-a編碼序列與所述表達載體的連接，獲得重組質粒 pET43. Ia-Bt ；
(3)Cry lAc-a蛋白質粒轉化受體菌并誘導表達,獲得CrylAc-a蛋白；
(4)Cry lAc-a蛋白的鑒定。本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于
一、通過密碼子優(yōu)化的辦法，既克服了大腸桿菌密碼子偏好的缺點，又顯著降低了 mRNA 的二級結構，使蛋白獲得高表達。二、成功獲得BL21 (pET43. Ia-Bt)表達菌株，并能夠通過該表達菌株誘導表達獲得與轉基因水稻表達的異源蛋白氨基酸序列一致的蛋白，即CrylAc-a殺蟲蛋白。


圖I.本發(fā)明構建的重組表達載體ρΕΤ43· Ia-Bt示意圖(在pET43. Ia載體中加入 Cry lAc-a 基因)。圖2. pET43. Ia-Bt重組質粒酶切鑒定圖譜。其中，1，DNA2000 marker ;2，未酶切質粒；3，Nde I單酶切；4，EcoR I單酶切；5，Nde I + EcoR I雙酶切。圖3. pET43. Ia-Bt表達菌SDS-PAGE。其中，1，未誘導表達菌體；2，誘導表達后菌體；3，誘導表達破菌上清；4，誘導表達破菌沉淀。
具體實施例方式I、Cry lAc-a核苷酸序列優(yōu)化、合成與表達重組質粒的構建。在保證殺蟲活性的前提下，為促進Cry lAc-a蛋白在大腸桿菌中的表達，對殺蟲基因CrylAc編碼框和密碼子進行改造和優(yōu)化。按大腸桿菌密碼子偏好優(yōu)化CrylAc-a蛋白基因中的堿基序列，優(yōu)化后的序列見序列表SEQ ID NO. 1，其序列長度為1857bp，此外還包括起始密碼子ATG，終止密碼子TAA，以及5’ NdeI和3’ EcoRI酶切位點。將基因片段通過Λ汝I和及I連接到同樣酶切處理的pET43. Ia載體中(見附圖I)。目的片段兩端分別加上了限制性內切酶NdeI、EcoR I的酶切位點，經相應酶切后與載體相連接。酶切體系如表3-1，37°C恒溫水浴4小時。酶切體系I
enzymatic system I
權利要求
1.人工合成的Si殺蟲蛋白的基因，其特征在于是對CrylAc編碼框和編碼序列進行改造和優(yōu)化而獲得，即對CrylAc蛋白編碼框優(yōu)化后再進行大腸桿菌密碼子偏好優(yōu)化，并在5’ 端和3’端分別引入與表達載體一致的I和I酶切位點，氨基酸序列末端加入終止密碼子TAA而獲得；其氨基酸序列為SEQ. ID. No. I所示，記為CrylAc_a ;編碼表達的殺蟲蛋白氨基酸序列為SEQ. ID. No. 2所示。
2.一種如根據權利要求I所述的人工合成的Si殺蟲蛋白的基因的表達載體，其特征在于，是將化學合成的基因CrylAc-a的DNA片段通過I和I雙酶切后連接到同樣酶切pET43. Ia載體上而獲得，記為pET43. Ia-Bt。
3.—種重組CrylAc-a殺蟲蛋白，其特征在于由下述步驟獲得利用權利要求2所述的表達載體轉入表達宿主BL21菌株中，得到表達菌，記為BL21 (pET43. Ia-Bt)，發(fā)酵該表達菌，加入IPTG誘導高效表達，即獲得有活性的重組CrylAc-a殺蟲蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學和生物技術領域，具體為一種人工合成的Bt殺蟲蛋白Cry1Ac-a的表達體系。該表達體系包括表達載體和Cry1Ac-a蛋白基因片段，所述基因片段根據大腸桿菌密碼子偏愛性進行優(yōu)化而獲得，優(yōu)化后的Cry1Ac-a蛋白由615個氨基酸組成，分子量為68.7KD，等電點為5.42。本發(fā)明還包括利用重組菌株經IPTG誘導獲得蛋白高效表達的方法。本發(fā)明克服了大腸桿菌表達密碼子偏好的缺點，顯著降低了mRNA的二級結構，使得該蛋白在大腸桿菌中高表達，為高效、低成本獲得Cry1Ac-a蛋白提供了切實可行的解決方案。
文檔編號C07K14/325GK102586286SQ20121005757
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權日2012年3月7日
發(fā)明者馮延葉, 宋志平, 楊忠, 肖滿秋, 覃曉萍 申請人:復旦大學