專利名稱：黃牛腸激酶催化亞基基因及其基因工程生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因工程中的融合表達(dá)，即將所要表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)和一些具有特定生化性質(zhì)的融合蛋白或短肽標(biāo)簽，如大腸桿菌硫氧還蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、金黃色葡萄球菌蛋白A、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白或六組氨酸短肽等融合、構(gòu)成為一個蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)、生產(chǎn)。借助于融合蛋白或短肽的生化特征和性質(zhì)，融合表達(dá)能大大簡化、方便產(chǎn)物的檢測，性質(zhì)研究和分離純化，因此目前在基因工程中，從原核表達(dá)體系(如大腸桿菌)到真核表達(dá)體系(如哺乳動物細(xì)胞)都經(jīng)常采用融合表達(dá)方法進(jìn)行重組目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。但這同時也帶來了新的問題，即融合蛋白的特異性去除問題。當(dāng)重組蛋白質(zhì)作為基因工程藥品及其它一些用途時，目標(biāo)產(chǎn)物必須是像天然蛋白質(zhì)一樣的完整產(chǎn)物，而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表達(dá)產(chǎn)物必須進(jìn)行產(chǎn)物后加工即融合蛋白在體外實施特定氨基酸序列的切割或斷裂，才能獲得完整的目標(biāo)產(chǎn)物。目前最為常用的裂解方法為1.化學(xué)法用溴化氫斷裂；2.蛋白酶法用凝血酶，活化的X因子或腸激酶特異性裂解。由于溴化氰為劇毒化合物，而且其切割識別位點為Met，因此實用性不強(qiáng)。而用蛋白酶進(jìn)行切割時，要求工具蛋白酶1.能夠識別并裂解特定的的氨基酸序列，而且要求特異性好；2.為避免雜質(zhì)蛋白酶引發(fā)的不必要的裂解反應(yīng)發(fā)生，需要高純度的工具蛋白酶。目前國際上最常用的工具蛋白酶為凝血酶(識別位點Leu-Val-Pro-Arg↓Gly--Ser)，因子Xa(識別位點Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓)和腸激酶(識別位點Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓)，其中腸激酶和Xa切割后的產(chǎn)物和天然產(chǎn)物完全一致，而凝血酶切割后的產(chǎn)物比天然產(chǎn)物分別多二個氨基酸。目前使用的這些蛋白酶都是從天然來源(動物血液或腸)分離、純化的，得率低，純度高，因此價格昂貴，而且全部為進(jìn)口產(chǎn)品，因此在大規(guī)模生產(chǎn)運(yùn)用時，無疑會大大增加成本，而且由于痕量天然雜質(zhì)蛋白酶的存在，會導(dǎo)致產(chǎn)物的降解。因此用基因工程方法生產(chǎn)這些工具蛋白酶已成為生物工程制藥業(yè)及基因工程研究人員的急需。用基因工程方法生產(chǎn)腸激酶不僅能極大地降低成本，而且有效去除雜質(zhì)蛋白酶、提高純度，這一點對國內(nèi)的生物工程制藥業(yè)及基因工程研究人員尤為重要，因為國內(nèi)使用的這些工具蛋白酶全部來源于進(jìn)口。
在凝血酶，因子Xa，腸激酶中，凝血酶和因子Xa都需要經(jīng)其它凝血反應(yīng)中的蛋白酶激活(從無活性的單鏈形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘膯捂溞问?后，才具有蛋白酶活性，而且分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此不利于用基因工程方法作為工具酶生產(chǎn)。而牛腸激酶為一異二聚體(在人則為異三聚體)的絲氨酸蛋白酶，體內(nèi)主要產(chǎn)生部位為十二指腸，主要生理作用是將胰蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橐鹊鞍酌?，它具有切割特異性好，裂解產(chǎn)物與天然產(chǎn)物一致(不殘留任何識別序列氨基酸)，溫度及PH適應(yīng)范圍寬，穩(wěn)定性好，而且科學(xué)家們已知其輕鏈(即小亞基)為催化亞基，分離的輕鏈即具有腸激酶的酶活性和特異性。因此用基因工程方法生產(chǎn)腸激酶催化亞基，成為最為可行和簡便的生產(chǎn)工具蛋白酶的路線和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利的目的是克隆黃牛十二指腸腸激酶催化亞基cDNA，并在大腸桿菌中實現(xiàn)黃牛腸激酶催化亞基的高效表達(dá)和分離、純化，使之達(dá)到可以實際應(yīng)用的水平，為基因工程下游過程中重組融合蛋白質(zhì)的切割提供一個有效、價廉的工具酶，本發(fā)明具有重要的實用意義，尤其是對國內(nèi)的生物工程制藥業(yè)及基因工程研究人員具有重要的實用價值。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到從新鮮的小黃牛十二指腸中提取RNA，用含多聚T逆轉(zhuǎn)錄引物和逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。設(shè)計含兼并堿基的引物，以所合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將所獲得的編碼黃牛腸激酶催化亞基的基因克隆在質(zhì)粒中，進(jìn)行DNA序列分析。其DNA序列及氨基酸序列如下ATT GTC GGA GGA AGT GAC TCC AGA GAA GGA GCC TGG CCT TGG GTC GTTTAA CAG CCT CCT TCA CTG AGG TCT CTT CCT CGG ACC GGA ACC CAG CAAI V G G S D S RE GA W P W V VCCT CTG TAT TTC GAC GAT CAA CAG GTC TGC GGA GCT TCT CTG GIG AGCCGA GAC ATA AAG CTG CTA GTT GTC OAG ACG CCT CGA AGA GAC CAC TCGA LY F D D Q QV CGA S L V SAGG GAT TGG CTG GTG TCG GCC GCC CAC TGC GTG TAC GGG AGA AAT ATGTCC CTA ACC GAC CAC AGC CGG CGG GTG ACG CAC ATG CCC TCT TTA TACR DW L V S AA H CVY G R N M
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本發(fā)明同已有的商業(yè)化的腸激酶不同之處在于，本發(fā)明克隆了黃牛的腸激酶催化亞基基因，通過基因工程方法生產(chǎn)并獲得具有腸激酶生物活性的重組黃牛腸激酶催化亞基，分子量低，但保留了腸激酶的絲氨酸蛋白酶的活性；而現(xiàn)有的商業(yè)化的腸激酶皆為從天然牛腸道中提取獲得的全酶，分離、純化困難，得率低，價格昂貴。而且由于牛腸道中有許多性質(zhì)類似的絲氨酸蛋白酶存在，因此很難免有痕量天然雜質(zhì)蛋白酶的存在，這些雜質(zhì)蛋白酶在長時間作用時會導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的降解，降低目標(biāo)產(chǎn)物的收率，并增加副產(chǎn)物。
本發(fā)明的用途能夠作為蛋白酶特異性地識別并切割含腸激酶切割位點的底物，具有高效、價廉的特點，能夠作為工具蛋白酶用于蛋白質(zhì)多肽及重組融合蛋白質(zhì)的特異性斷裂，適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。
四

圖1.重組黃牛腸激酶催化亞基表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析圖譜。
1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；2.未誘導(dǎo)的pET32/BL21(DE3)菌體總蛋白；3.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32/BL21(DE3)菌體總蛋白；4.未誘導(dǎo)的pET32-EK/BL21(DE3)菌體總蛋白；5.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32-EK/BL21(DE3)菌體總蛋白；6.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的pET32-EK/BL21(DE3)裂解上清液；7.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的pET32-EK/BL21(DE3)裂解沉淀；8.純化后的重組黃牛腸激酶催化亞基。
圖2.重組黃牛腸激酶催化亞基酶反應(yīng)動力學(xué)分析五具體實施方式
1.取100毫克新鮮的小黃牛十二指腸與1毫升Trizol混合，碾磨粉碎后，室溫放置5分鐘，加200微升氯仿，混合振搖30秒，11000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，吸取水相，加0.5毫升異丙醇，室溫放置10分鐘，棄上清，沉淀部分用1毫升75％乙醇洗滌，7500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后，將RNA沉淀在空氣中干燥，然后溶于30微升DEPC處理過的水中。
2.合成逆轉(zhuǎn)錄引物[5’taatacgactcactataggg(t)173’]，以上述RNA為模板，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3.合成下述PCR引物引物1∶5’cgggatccacattgttgg(t/a)gg(t/a)tctgactccgag 3’；引物2∶5’taatacgactcactataggg 3’；引物3∶5’ggaattctaatgtagaaaactttgtatccactctgt 3’以步驟2.中的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以引物1和引物2為PCR引物，用高保真pfu DNA聚合酶進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)。以獲得的PCR產(chǎn)物為模板，以引物1和引物3為PCR引物進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，將所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和EcoRI消解，克隆在質(zhì)粒pET32a的BamHI和EcoRI位點之間。獲得的陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析測定。
4.獲得的陽性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE(分離膠12％，濃縮膠為5％，考馬斯亮藍(lán)R250染色)(見附圖1)。表達(dá)菌體經(jīng)超聲破碎細(xì)胞，離心分離細(xì)胞裂解上清液。裂解上清液中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過30％硫酸銨沉淀，將沉淀溶于20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl緩沖液中，對20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl緩沖液透析后，進(jìn)行DEAE-纖維素柱層析，用20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl緩沖液洗脫雜蛋白，用0.1M-0.5M NaCl線性梯度洗脫目的蛋白。收集活性峰，對20mM Tris-HCl，pH8.0緩沖液透析后，上Sephadex G-75層析柱，用20mM Tris-HCl，pH8.0緩沖液洗脫，收集活性峰，從而最終獲得具有腸激酶生物活性的重組黃牛腸激酶催化亞基產(chǎn)物。用腸激酶小分子熒光底物進(jìn)行的酶反應(yīng)動力學(xué)分析測定表明純化獲得的重組黃牛腸激酶催化亞基具有很好的腸激酶的蛋白酶活性，30-40秒內(nèi)即完成小分子熒光底物的水解(見附圖2)。
權(quán)利要求
1.一種黃牛腸激酶催化亞基的基因，其特征在于該基因編碼了黃牛腸激酶的催化亞基，該亞基具有腸激酶的絲氨酸蛋白酶識別和切割特定氨基酸序列的活性。其DNA序列和氨基酸序列如下ATT GTC GGA GGA AGT GAC TCC AGA GAA GGA GCC TGG CCT TGG GTC GTTTAA CAG CCT CCT TCA CTG AGG TCT CTT CCT CGG ACC GGA ACC CAG CAAI V G G S DS R E GA W P W V VGCT CTG TAT TTC GAC GAT CAA CAG GTC TGC GGA GCT TCT CTG GTG AGCCGA GAC ATA AAG CTG CTA GTT GTC CAG ACG CCT CGA AGA GAC CAC TCGA L Y FD D Q Q V C GA S L V SAGG GAT TGG CTG GTG TCG GCC GCC CAC TGC GTG TAC GGG AGA AAT ATGTCC CTA ACC GAC CAC AGC CGG CGG GTG ACG CAC ATG CCC TCT TTA TACR D W LV S A A H CV Y G R N MGAG CCG TCT AAG TGG AAA GCA GTG CTA GGC CTG CAT ATG GCA TCA AATCTC GGC AGA TTC ACC TTT CGT CAC GAT CCG GAC GTA TAC CGT AGT TTAE P SK W K A V L G LH M A S NCTG ACT TCT CCT CAG ATA GAA ACT AGG TTG ATT GAC CAA ATT GTC ATAGAC TGA AGA GGA GTC TAT CTT TGA TCC AAC TAA CTG GTT TAA CAG TATL T SP Q I E T R L I D QI V IAAC CCA CAC TAC AAT AAA CGG AGA AAG AAC AAT GAC ATT GCC ATG ATGTTG GGT GTG ATG TTA TTT GCC TCT TTC TGG TTA CTG TAA CGG TAC TACN P HY NK R R K N N D IA M MCAT CTT GAA ATG AAA GTG AAC TAC ACA GAT TAT ATA CAG CCT ATT TGTGTA GAA CTT TAC TTT CAC TTG ATG TGT CTA ATA TAT GTC GGA TAA ACAH L EM K V N Y T D Y I QP I CTTA CCA GAA GAA AAT CAA GTT TTT CCC CCA GGA AGA ATT TGT TCT ATTAAT GGT CTT CTT TTA GTT CAA AAA GGG GGT CCT TCT TAA ACA AGA TAAL P E EN Q V F P P G R IC S IGCT GGC TGG GGG GCA CTT ATA TAT CAA GGT TCT ACT GCA GAC GTA CTGCGA CCG ACC CCC CGT GAA TAT ATA GTT CCA AGA TGA CGT CTG CAT GACA G W GA L I Y Q G S TA D V LCAA GAA GCT GAC GTT CCC CTT CTA TCA AAT GAG AAA TGT CAA CAA CAGGTT CTT CGA CTG CAA GGG GAA GAT AGT TTA CTC TTT ACA GTT GTT GTCQ E A DV P L L S N E K CQ Q QATG CCA GAA TAT AAC ATT ACG GAA AAT ATG GTG TGT GCA GGC TAT GAATAC GGT CTT ATA TTG TAA TGC CTT TTA TAC CAC ACA CGT CCG ATA CTTM P E YN I T E N M V C AG Y EGCA GGA GGG GTA GAT TCT TGT CAG GGG GAT TCA GGC GGA CCA CTC ATGCGT CCT CCC CAT CTA AGA ACA GTC CCC CTA AGT CCG CCT GGT GAG TACA G G V DS C Q G DS G G P L MTGC CAA GAA AAC AAC AGA TGG CTC CTG GCT GGC GTG ACG TCA TTT GGAACG GTT CTT TTG TTG TCT ACC GAG GAC CGA CCG CAC TGC AGT AAA CCTC Q E N NR W L L AG VT S F GATA GTT ACA CGT GAG GGA TTA GCG GGT CCC CAC ATA CGG GCC CAG GGTY Q CA L P N R P G V YA R V PAGG TTC ACA GAG TGG ATA CAA AGT TTT CTA CAT TAGTCC AAG TGT CTC ACC TAT GTT TCA AAA GAT GTA ATCR F TE W I Q S F LH *
2.一種黃牛腸激酶催化亞基的基因克隆方法，其特征在于該黃牛腸激酶催化亞基的基因可以通過從牛腸道組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過PCR反應(yīng)，克隆獲得。
3.一種黃牛腸激酶催化亞基的基因工程生產(chǎn)方法，其特征是克隆獲得的黃牛腸激酶催化亞基基因，可以通過重組DNA技術(shù)即基因工程方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒、經(jīng)表達(dá)、純化，制各獲得重組黃牛腸激酶催化亞基。
4.一種重組黃牛腸激酶催化亞基，其特征是重組黃牛腸激酶催化亞基能夠作為蛋白酶特異性地識別并切割含腸激酶切割位點的底物，具有高效、價廉的特點?？梢宰鳛楣ぞ叩鞍酌赣糜诘鞍踪|(zhì)多肽及重組融合蛋白質(zhì)的特異性斷裂，適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域,所述黃牛腸激酶催化亞基的基因:1.該基因編碼了黃牛腸激酶的催化亞基,它具有腸激酶的絲氨酸蛋白酶識別和切割特定氨基酸序列的活性;2.該基因可以通過從牛腸道組織中用基因克隆技術(shù)獲得;3.該黃牛腸激酶催化亞基可以通過基因工程方法生產(chǎn)制備;4.它能夠作為蛋白酶特異性地識別并切割含腸激酶切割位點的底物,其應(yīng)用之一是作為工具蛋白酶用于重組融合蛋白質(zhì)的特異性斷裂,尤其適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。
文檔編號C12N15/09GK1332248SQ01113770
公開日2002年1月23日 申請日期2001年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月10日
發(fā)明者華子春, 袁榴娣 申請人:南京大學(xué)