專利名稱：調(diào)控植物中色素生產(chǎn)的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物中色素發(fā)育(development)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
花青素色素的積累是水果質(zhì)量的重要決定因素。色素為用戶提供了基 本的品種區(qū)別并涉及到蘋果的健康屬性(Boyer and Liu, 2004)。花青素色素屬于遍在的統(tǒng)稱為黃酮類化合物的二級(jí)代謝產(chǎn)物的不同組。在植物中，黃酮類化合物涉及到包括防御在內(nèi)的無數(shù)生物學(xué)功能，同時(shí)，被著色的花青素化合物尤其在植物/動(dòng)物相互作用中作為引誘劑扮演了重要的生理學(xué)角色。包括花青素在內(nèi)的全部黃酮類化合物的主要前體是丙二酸單酰輔酶A和對(duì)-香豆酰輔酶A。從這些前體查耳酮合成酶(CHS)合成出查耳酮，這是花青素生產(chǎn)和C15骨架建立的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。查耳酮然后被查耳酮異構(gòu)酶(CHI)異構(gòu)化來生產(chǎn)查耳酮柑橘黃素，并且從那里，經(jīng)由黃烷酮3[ 3]-羥化酶(F3H)的羥基化步驟轉(zhuǎn)化柑橘黃素到二氫黃酮醇(dihydrofIavonon)。二氫黃酮醇被二氫黃酮醇(dihydrofIavonon) 4_還原酶(DFR)還原，產(chǎn)生白花色苷，然后白花色苷被白花色苷元加雙氧酶(LDOX)轉(zhuǎn)化成有色化合物anthocyanindin,同時(shí)最終的糖基化步驟被尿卩密唳二磷酸鹽(UDP)-葡萄糖類黃酮3-鄰-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)所介導(dǎo)?；ㄇ嗨仡伾牟町惸軞w因于包括分子結(jié)構(gòu)和羥基的類型和數(shù)目以及連接的糖和酸以及諸如PH值或超微結(jié)構(gòu)的細(xì)胞環(huán)境在內(nèi)的大量因素。在許多的花青素色素中，主要負(fù)責(zé)蘋果皮中紅色著色的色素是花青苷3-鄰-半乳糖苷形式的花青素，并且在蘋果的這個(gè)生物合成途徑中的酶類已經(jīng)被很好的描述(Kimet al.,2003,Plant Science 165，403-413;Honda et al.,2002,Plant Physiology andBiochemistry 40,955-962)。長(zhǎng)久以來已經(jīng)觀察到,花青素類被升高來響應(yīng)特定的環(huán)境、發(fā)育和病原刺激。在蘋果中的研究已經(jīng)證實(shí)了花青素積累的環(huán)境和發(fā)育調(diào)控。當(dāng)水果遭受白光，或更顯著地，UV光時(shí)，色素生物合成能被誘導(dǎo)，在其它物種中也觀察到這個(gè)現(xiàn)象。而且，通過將所述水果進(jìn)行低溫儲(chǔ)存，花青素水平能被提高。存在在蘋果的發(fā)育方式中具有明顯的花青素酶活性的花青素酶的同等誘導(dǎo)的證據(jù)，并且，依賴于品種，相關(guān)的著色在不熟的水果中增加并在成熟時(shí)再次增加。研究顯示，在花青素途徑中，存在通過同啟動(dòng)子元件復(fù)合的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的特定結(jié)合進(jìn)行的高度特異的基因調(diào)控(Holton and Cornish, 1995，Plant Cell 7,1071-1083)。這個(gè)調(diào)控可能也擴(kuò)展到諸如花青素運(yùn)輸?shù)鞍椎姆峭緩交颉YB TFs已經(jīng)被顯示在花青素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演重要的角色。植物MYBs已經(jīng)被牽涉到像二級(jí)代謝(包括所述花青素途徑)、發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)和疾病抵抗力一樣多樣的控制途徑(Jin and Martin, 1999，Plant Mol Biol, 41，577-585)。它們被包含單個(gè)或多個(gè)缺陷重復(fù)的結(jié)構(gòu)保守DNA結(jié)合區(qū)域賦予特色；那些花青素途徑相關(guān)的區(qū)域趨向于二重復(fù)(two-repeat) (R2R3)類別。調(diào)控也能在花青素生物合成途徑早期或晚期對(duì)基因的謹(jǐn)慎的小組(discreet groups)特異。在紫蘇(Perilla fruitescens)葉片中，TF驅(qū)動(dòng)的調(diào)控已經(jīng)在從CHS到結(jié)果的花青素蛋白運(yùn)輸基因的實(shí)際上所有的花青素生物合成的階段中觀察至1J，同時(shí)，在葡萄(Vitis vinifera)中,被MybA進(jìn)行的特定調(diào)控被限定在蛋白生產(chǎn)的終點(diǎn)(UFGT)。在擬南芥屬植物(Arabidopsis)中存在被分成24個(gè)亞組的大約140個(gè)R2R3MYBTFs (Stracke et al 2001, Current Opinion in Plant Biology,4，447-556)?；ㄇ嗨厣?I (PAPl)MYB 的生產(chǎn)(Borevitz et al.，2000，Plant Cell, 12，2383-2394)屬于亞組 10(當(dāng)Stracke et al.，2001的系統(tǒng)發(fā)育被使用時(shí))并證明了同其它已知花青素調(diào)控子相比高度的氨基酸保守。PAPl在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)導(dǎo)致了花青素生物合成途徑中從PAL到CHS 和 DFR 的大量基因的上調(diào)(Borevitz et al.，2000，Plant Cell, 12, 2383-2394; Tohgeet al. , 2005, Plant Journal, 42，218-235)。 一般地，MYBs同基礎(chǔ)的螺旋環(huán)螺旋TFs (bHLH)緊密地相互作用，并且這個(gè)作用已經(jīng)被廣泛地研究其與黃酮類化合物生產(chǎn)的關(guān)系(Mol et al.，1996; Winkel-Shirley,2001)。范例包括玉米 ZmC MYB 和 ZmB bHLH 和牽牛花 AN2MYB 和 AN1/JAF13 bHLHs(Goff et al. , 1992 Genes Dev, 6, 864-875 ; Mol et al. , 1998, Trends in PlantScience, 3，212-217)。明顯地，在不同物種中存在這個(gè)同等物的保守程度。然而，MYB_bHLH合作不總是必需的。來源于PAPl過表達(dá)的結(jié)果暗示,相似于玉米P MYB (Grotewold etal. , 2000Proc Natl Acad Sci USA, 97，13579-13584)和擬南芥 MYB12 (Mehrtens etal. , 2005 Plant Physiology，138，1083-1096)，PAPl 不需要過表達(dá)的 bHLH 共同調(diào)節(jié)因子來驅(qū)動(dòng)花青素生產(chǎn)的大量增加。然而，進(jìn)一步的研究顯示，PAPl確實(shí)同bHLHs緊密地相互作用，這在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致更強(qiáng)啟動(dòng)子(DFR)激活(Zimmermann et al. , 2004 PlantJ, 40，22-34)。更近期地，PAPl過表達(dá)線的整體的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析證實(shí)，PAPl上調(diào) bHLH TT8 (At4g09820) 18 倍(Tohge et al.，2005，Plant J, 42，218-235)。這個(gè)對(duì)共同調(diào)控因子的依賴同高度保守的R2R3結(jié)合區(qū)域中的少量氨基酸改變相關(guān)，如在不依賴bHLH的玉米P和依賴bHLH的玉米ClMYBs間的對(duì)比所證明的，并足以定向不同種類的目標(biāo)基因的激活(Grotewold et al. , 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97，13579-13584)。在本研究中，從Cl的R2R3區(qū)域到Pl的相應(yīng)位置的僅6個(gè)氨基酸的替換導(dǎo)致了具有同Cl相似的依賴bHLH的行為的突變。更近期地，它被暗示，這可能是目標(biāo)基因間允許MYBs區(qū)別的關(guān)鍵機(jī)理(Hernandez et al.，2004，J. Biol. CHem, 279，48205-48213)。這些關(guān)鍵的氨基酸在圖 I中進(jìn)行了標(biāo)識(shí)。同PAPl相比，F(xiàn)aMYBl在草莓的后期發(fā)育過程中抑制了花青素的生物合成。不管這個(gè)改變的角色，F(xiàn)aMYBl分享了激活MYBs的同源性并能同諸如牽?；ˋNl和JAF13的(激活)bHLH 相互作用(Aharoni et al.，2001，Plant J，28，319-332)。不管 PAP-樣激活子和FaMYB-樣抑制子的關(guān)鍵氨基酸殘基一樣,激活子傾向于屬于亞組10而抑制子屬于亞組17 (根據(jù) Stracke et al)。額外水平的花青素調(diào)控涉及含有同MYB和bHLH蛋白形成復(fù)合物的WD40區(qū)域蛋白的蛋白的單獨(dú)類別(如在 Ramsay and Glover, 2005, Trends in Plant Science, 10，63-70中回顧的)。范例包括牽?；ㄖ械腶nl l(de Vetten et al. , 1997Genes Dev, 11，1422-1434)和擬南芥中的 TTGl (Walker et al.，1999，Plant Cell, 11，1337-1350)?；ㄇ嗨氐霓D(zhuǎn)錄控制可能被組織特異的調(diào)控(Kubo et at, 1999, Plant Cell, 11，1217-1226)和依賴于諸如冷、光和發(fā)育線索(cues)的刺激的可能不同的調(diào)控層次(Davuluri et al. , 2005, NatureBiotechnology, 23, 890-895)進(jìn)一步并發(fā)。盡管對(duì)蘋果花青素合成的激活和抑制的研究已經(jīng)表明，截至目前，發(fā)育和環(huán)境調(diào)控，調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子在這個(gè)物種或任何其它每年落葉的水果中是不同的。蘋果中的花青素積累的控制是理解和處理水果顏色的關(guān)鍵問題。對(duì)施加這個(gè)控制的因子的鑒別提供了調(diào)節(jié)水果組織中起源于花青素的著色的程度和分布的工具。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供調(diào)控蘋果物種中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子序列和/或至少提供給公眾有用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明提供分離的多聚核苷酸，包括a)編碼具有SEQ ID NO: 1-4和9_21或其變種的任何一種氨基酸序列的多肽的序列，其中的多肽或其變種是能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子；b)具有長(zhǎng)度至少為a)的序列的15個(gè)核苷酸的片段；c) a)的序列的互補(bǔ)序列；d) b)的序列的互補(bǔ)序列；e)在嚴(yán)格條件下能同a)的序列雜交的至少長(zhǎng)15個(gè)核苷酸的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的多聚核苷酸包含a)編碼具有同SEQ ID NO: 1-4和9_21的任何一種氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中的多肽是能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子；b)具有長(zhǎng)度至少為a)的序列的15個(gè)核苷酸的片段；c) a)的序列的互補(bǔ)序列；d) b)的序列的互補(bǔ)序列；e)在嚴(yán)格條件下能同a)的序列雜交的至少長(zhǎng)15個(gè)核苷酸的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多肽具有同SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少65%的同一性。優(yōu)選地，所述多肽具有SEQ ID NO: I的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多肽具有同SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少65%的同一性。優(yōu)選地，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多肽具有同SEQ ID NO 3的氨基酸序列至少65%的同一性。優(yōu)選地，所述多肽具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多肽具有同SEQ ID NO 4的氨基酸序列至少65%的同一性。優(yōu)選地，所述多肽具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :5_8、22_47和102的任何一種的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ IDNO =5-8,22-47和102的任何一種的編碼序列至少70%的同一性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :5的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :5的編碼序列至少70%的同一性。更優(yōu)選、地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :5的序列。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ IDNO :5的編碼序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :6的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :6的編碼序列至少70%的同一性。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :6的序列。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 6的編碼序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :7的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :7的編碼序列至少70%的同一性。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :7的序列。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ IDNO :7的編碼序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :8的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :8的編碼序列至少70%的同一性。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :8的序列。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 8的編碼序列。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供分離的多聚核苷酸，其包含a)具有同SEQ ID NO :5-8、22_47和102的任何一種核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列編碼能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子；b)具有長(zhǎng)度至少為a)的序列的15個(gè)核苷酸的片段；c) a)的序列的互補(bǔ)序列；d) b)的序列的互補(bǔ)序列；e)在嚴(yán)格條件下能同a)的序列雜交的至少長(zhǎng)15個(gè)核苷酸的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :5的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 5的編碼序列至少70%的同一性。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 5的序列。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 5的編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :6的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 6的編碼序列至少70%的同一性。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 6的序列。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 6的編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :7的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 7的編碼序列至少70%的同一性。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 7的序列。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 7的編碼序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO :8的序列至少70%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 8的編碼序列至少70%的同一性。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 8的序列。更優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO 8的編碼序列。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供具有同編碼含有選自SEQ ID NO :I到4和9到21的任何一種的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少70%序列同一性的分離的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸編碼能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的多聚核苷酸具有同編碼包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少70%的序列同一性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 5的編碼序列。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供分離的多聚核苷酸，其包含a)編碼具有同SEQ ID NO :1_4和9-21的任何一種氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中所述多肽是能調(diào)控在花青素生物合成途徑中的基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子;b)具有長(zhǎng)度至少為a)的序列的15個(gè)核苷酸的片段；
c) a)的序列的互補(bǔ)序列；d) b)的序列的互補(bǔ)序列；e)在嚴(yán)格條件下能同a)的序列雜交的至少長(zhǎng)15個(gè)核苷酸的序列。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了分離的多聚核苷酸，其包含a)具有同SEQ ID NO :5-8、22_47和102的任何一種核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列編碼能調(diào)控在花青素生物合成途徑中的基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子；b)具有長(zhǎng)度至少為a)的序列的15個(gè)核苷酸的片段；c) a)的序列的互補(bǔ)序列；d) b)的序列的互補(bǔ)序列；e)在嚴(yán)格條件下能同a)的序列雜交的至少長(zhǎng)15個(gè)核苷酸的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，被調(diào)控的基因編碼二氫黃酮醇(dihydroflavolon) 4_還原酶(DFR)0在另一個(gè)實(shí)施方案中，被調(diào)控的基因編碼查耳酮合成酶(CHS)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供分離的多聚核苷酸，其包含a)編碼SEQ ID NO :1_4和9_21的任何一種氨基酸序列的多肽變種的序列，其中所述多肽是能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，并且其中所述多肽包含SEQ ID NO=IOl的序列；b)具有長(zhǎng)度至少為a)的序列的15個(gè)核苷酸的片段；c) a)的序列的互補(bǔ)序列；d) b)的序列的互補(bǔ)序列；e)在嚴(yán)格條件下能同a)的序列雜交的至少長(zhǎng)15個(gè)核苷酸的序列。優(yōu)選地，所述變種多肽衍生自薔薇科物種。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供分離多肽，其包含a)具有同選自SEQ ID NO :1_4和9_21任何之一的氨基酸序列至少65%同一性的序列，其中所述多肽是能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子；或b)具有長(zhǎng)度至少為a)的序列的15個(gè)氨基酸的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少65%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 1的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少65%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 2的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 3的氨基酸序列至少65%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ IDNO 3的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在a)中的序列具有同SEQ ID NO 4的氨基酸序列至少65%的同一性。優(yōu)選地，在a)中的序列具有SEQ ID NO :4的序列。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的多聚核苷酸。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了抗本發(fā)明的多肽的抗體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的任何一種多聚核苷酸的遺傳學(xué)構(gòu)建物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的遺傳學(xué)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了被遺傳修飾來表達(dá)本發(fā)明的任何一種多聚核苷酸的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的遺傳學(xué)構(gòu)建物的植物細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了被遺傳修飾來表達(dá)本發(fā)明的多聚核苷酸的植物細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的植物細(xì)胞的植物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)包含本發(fā)明的遺傳學(xué)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞的步驟。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了具有改變的花青素生產(chǎn)的植物細(xì)胞或植物，所述方法包含用遺傳學(xué)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物的步驟，所用的遺傳學(xué)構(gòu)建物包括a)至少一條編碼本發(fā)明的多肽的多聚核苷酸；b)至少一條包含具有長(zhǎng)度至少為a)的多聚核苷酸的15個(gè)核苷酸的片段的多聚核苷酸；或c)至少一條包含具有長(zhǎng)度至少為a)的多聚核苷酸的15個(gè)核苷酸的互補(bǔ)序列的多聚核苷酸。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有改變的花青素生產(chǎn)的植物細(xì)胞或植物的方法，所述方法包含用遺傳學(xué)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物的步驟，所用的遺傳學(xué)構(gòu)建物包括a)至少一條本發(fā)明的任何一個(gè)的多聚核苷酸。；b)至少一條包含具有長(zhǎng)度至少為a)的多聚核苷酸的15個(gè)核苷酸的片段的多聚核苷酸，或c)至少一條包含具有長(zhǎng)度至少為a)的多聚核苷酸的15個(gè)核苷酸的互補(bǔ)序列的多聚核苷酸d)至少一條能在嚴(yán)格條件下同a)或b)的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建物被設(shè)計(jì)來表達(dá)一對(duì)轉(zhuǎn)錄因子，并且所述構(gòu)建物包含i)編碼具有同SEQ ID NO :1、2和9_21的任何一條氨基酸序列至少65%同一性的MYB轉(zhuǎn)錄因子的多聚核苷酸序列；和ii)編碼具有同SEQ ID NO :1或2的氨基酸序列至少65%同一性的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的多聚核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在i)中的多聚核苷酸序列具有同SEQ ID NO :5、6、22_27和102的任何一條核苷酸序列至少70%的序列同一性；并且在ii)中的多聚核苷酸序列具有同SEQ ID NO :7或8的核苷酸序列至少70%的序列同一性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在i)中的多聚核苷酸序列具有同SEQ ID NO :5、6、22_27和102的任何一條核苷酸序列至少70%的序列同一性；并且在ii)中的編碼序列具有同SEQID NO :7或8的編碼序列至少70%的序列同一性。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的植物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了選擇花青素生產(chǎn)被改變的植物的方法，所述方法包含檢測(cè)植物中的本發(fā)明的多聚核苷酸的改變的表達(dá)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了選擇花青素生產(chǎn)被改變的植物的方法，所述方法 包含檢測(cè)植物中的本發(fā)明的多肽的改變的表達(dá)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的方法選擇的植物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了選擇被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物的方法，所述方法包含下述步驟a)用本發(fā)明的能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的多聚核苷酸或多肽轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物；b)在所述植物細(xì)胞或植物中表達(dá)所述多聚核苷酸或多肽；和c)選擇具有相對(duì)于其它植物細(xì)胞或植物而言增加了的花青素著色的植物細(xì)胞或植物，所述增加了的花青素著色表明所述植物細(xì)胞或植物已經(jīng)被轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，本發(fā)明的能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子和變種能調(diào)控選自但不限于花青素-3-葡糖苷、花青素-3-鄰-蕓香糖苷、cyanadin-3-葡糖苷或cyanadin_3-戍糖苷的花青素的生產(chǎn)。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)或選擇的具有改變的花青素生產(chǎn)的植物或植物細(xì)胞在選自但不限于cyanadin-3-葡糖苷酶、cyaniding-3-鄰-蕓香糖苷、cyanadin-3-葡糖苷或cyanadin-3-戍糖苷的花青素的生產(chǎn)中發(fā)生改變。本發(fā)明的多聚核苷酸和多聚核苷酸變種能衍生自任何物種或能通過重組或合成方法進(jìn)行生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多聚核苷酸或變種衍生自植物物種。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多聚核苷酸或變種衍生自裸子植物物種。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多聚核苷酸或變種衍生自被子植物物種。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多聚核苷酸或變種衍生自雙子葉植物物種。本發(fā)明的多肽和多肽變種能衍生自任何物種，或能通過重組或合成方法進(jìn)行生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或變種衍生自植物物種。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或變種衍生自裸子植物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或變種衍生自被子植物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或變種衍生自雙子葉植物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或變種衍生自單子葉植物。
本發(fā)明的植物細(xì)胞或植物能衍生自任何物種。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物衍生自裸子植物物種。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物衍生自被子植物物種。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物衍生自雙子葉植物物種。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物衍生自單子葉植物物種。優(yōu)選的植物物種(對(duì)于本發(fā)明的多聚核苷酸和變種、多肽和變種以及植物細(xì)胞和植物)包括選自包含但不限定于下述屬的水果植物物種蘋果屬(Malus)、梨屬(Pvrus)、李屬(Prunis)、懸鉤子屬(Rubus)、薔薇屬(Rosa)、草莓屬(Fragaria)、稱猴桃屬(Actinidia)、媼梓屬(Cydonia)、柑橘屬(Citrus)和越橘屬(Vaccinium)。特別優(yōu)選的水果植物物種是家蘋果(Malus domestica)、美味稱猴桃(Actidiniadeliciosa)、中華稱猴桃(A. chinensis)、毛花稱猴桃(A. eriantha)、軟麥稱猴桃(A. arguta)和上述四種稱猴桃物種的雜交品種、桃(Prunis persica)、嶺南梨(Pyrus L.)、懸鉤子屬(Rubus)、薔薇屬(Rosa)和草莓屬(Fragaria)。優(yōu)選的植物(對(duì)于本發(fā)明的多聚核苷酸和變種、多肽和變種以及植物細(xì)胞和植物)也包括選自包含但不限定于下述屬的蔬菜植物品種蕓苔屬(Brassica)、番茄屬(Lycopersicon)和煎屬(Solanum),特別優(yōu)選的蔬菜植物品種為西紅柿(Lycopersicon esculentum)和馬鈴薯(Solanum tuberosum)優(yōu)選的植物(對(duì)于本發(fā)明的多聚核苷酸和變種、多肽和變種以及植物細(xì)胞和植物)也包括選自包含但不限定于下述屬的農(nóng)作物植物品種大豆屬(Glycine)、玉米屬(Zea)、大麥屬(Hordeum)和稻屬(Oryza)。特別優(yōu)選的農(nóng)作物植物物種包括大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)。優(yōu)選的植物(對(duì)于本發(fā)明的多聚核苷酸和變種、多肽和變種以及植物細(xì)胞和植物)也包括那些薔薇科的物種。優(yōu)選的薔薇科的屬包括白胃I梅屬(Exochorda)、臭樓屬(Maddenia)、Oemleria、Osmaronia、扁核木屬(Prinsepia)、李屬(Prunus)、蘋果亞科(Maloideae)、唐様屬(Amelanchier)、石灰樹屬(Aria)、腺肋花楸屬(Aronia)、木瓜屬(Chaenomeles)、Chamaemespilus、棒屬(Cormus)、枸子屬(Cotoneaster)、山楂屬(Crataegus) Osmaronia、扁核木屬(Prinsepia)、李屬(Prunus)、蘋果亞科(Maloideae)、唐様屬(Amelanchier)、Aria、腺肋花揪屬(Aronia)、木瓜屬(Chaenomeles)、Chamaemespilus、棒屬(Cormus)、枸子屬(Cotoneaster)、山楂屬(Crataegus)、媼梓屬(Cydonia)、牛筋條屬(Dichotomanthes)、移屬(Docynia)、Docyniopsis^ 批杷 屬(Eriobotrya)、Eriolobus^ Heteromeles、Kageneckia、Lindleya、Malacomeles、蘋果屬(Malus)、歐楂屬(Mespilus)、小石積屬(OsteomeIes)、酸果木屬(PeraphyIlum)、石楠屬(Photinia)、假媼梓屬(Pseudocydonia)、火棘屬(Pyracantha)、梨屬(Pyrus)、石斑木屬(Rhaphiolepis)、花楸屬(Sorbus)、紅果樹屬(Stranvaesia)、Torminalis^ Vauquelinia^ 薔薇亞科(Rosoideae)、芒剌果屬(Acaena )、羽葉花屬(Acomastyl is)、龍牙草屬(Agrimonia)、羽衣草屬(Alchemi I la)、Aphanes、Aremonia、Bencomia、Chamaebatia、Cliffortia、無尾果屬(Coluria)、Cowania、Dalibarda、Dendriopoterium、仙女木 M (Dryas)^ 蛇莓屬(Duchesnea)、Erythrocoma^Fallugia、蚊子蟲草屬(Filipendula)、草莓屬(Fragaria)、路邊青屬(Geum)^ Hagenia、Horkelia、Ivesia、様棠花屬(Kerria)、Leucosidea、Marcetella、Margyricarpus、Novosieversia，Oncostylus、Polylepis、委陵菜屬(Potentilia)、薔薇屬(Rosa)、懸鉤子屬(Rubus)、地偷屬(Sanguisorba)、Sarcopoterium、山莓草屬(Sibbaldia)、五辧蓮屬(Sieversia)^ 太行花屬(Taihangia)、Tetraglochin^ 林石草屬(Waldsteinia)^ 薔薇科地位未定(Rosaceae incertae sedis)、Adenostoma、假升麻屬(Aruncus)、紫衫屬(Cercocarpus )、Chamaebatiaria、地薔薇屬(Chamaerhodos )、美吐根屬(Gillenia)、Holodiscus、Lyonothamnus、繡線梅屬(NeiIlia)、Neviusia、風(fēng)箱果屬(Physocarpus)、Purshia、雞麻屬(Rhodotypos)、珍珠梅屬(Sorbaria)、繡線菊屬(Spiraea)和小米空木屬(Stephanandra)o 優(yōu)選的薔薇科物種包括紅柄白胃I梅(Exochorda giraldii)、Exochordaracemosa、Exochorda、紅柄白鹽梅(Exochorda giraldii)、Exochorda racemosa、齒葉白鹽梅(Exochorda serratifolia)、臭樓(Maddenia hypoleuca)、Oemleria cerasiformis、Osmaronia cerasiformis、東北扁核木(Prinsepia sinensis)、齒葉扁核木(Prinsepiauni flora)、阿利根尼李子(Prunus al Ieghaniensis )、美洲李(Prunus americana)、Prunusandersonii、奇克索李(Prunus angustifolia)、Prunus apetala、Prunus argentea、山杏(Prunus armeniaca)、歐洲甜樓桃(Prunus avium)、Prunus bifrons、布里揚(yáng)松杏(Prunusbrigantina)、Prunus bucharica、憐木樓(Prunus buergeriana)、山樓花(Prunuscampanulata)、加羅林桂樓(Prunus caroliniana)、紅葉李(Prunus cerasifera)、酸樓桃(Prunus cerasus)、Prunus choreiana、那不勒斯李(Prunus cocomilia)、Prunuscyclamina^ 111 ^(Prunus davidiana)^Prunus debiIis^^(Prunus domestica)^(Prunus dulcis)、 ^ ^ (Prunus emasginata)^ Prunusfasciculata^ IM (Prunusferganensis)、Prunus fordiana、Prunus fremontii、灌木樓桃(Prunus fruticosa)、Prunus geniculata、麥李(Prunus glandulosa)、Prunus gracilis、灰葉稠李(Prunusgray ana)、郝圖蘭李(Prunus hortulana)、圣葉樓桃(Prunus i licifol ia)、豆樓(Prunusincisa)、阿富汗樓桃(Prunus jacquemontii )、郁李(Prunus japonica)、Prunuskuramica、桂樓(Prunus laurocerasus)、Prunus Ieveilleana^ 葡萄牙桂樓(Prunuslusitanica)、斑葉稠李(Prunus maackii )、圓葉樓桃(Prunus mahaleb)、山杏(Prunusmandshurica)、沙灘李(Prunus maritima)、黑樓桃(Prunus maximowiczii)、Prunusmexicana^^(Prunus microcarpa)^(Prunus mira)^^(Prunus mume)、(Prunus munsoniana)、力口拿大李(Prunus nigra)、千島樓(Prunus nipponica)、稠李(Prunus padus)、歐洲酸樓桃(Prunus pensylvanica)、碧桃(Prunus persica)、Prunuspetunnikowii、山樓桃(Prunus prostrata)、中國(guó)樓桃(Prunus pseudocerasus)、沙樓桃(Prunus pumila)、Prunus rivularis、中國(guó)李(Prunus salicina)、大山樓(Prunussargentii)、Prunus sellowii、野黑樓(Prunus serotina)、樓花(Prunus serrulata)、西伯利亞杏(Prunus sibirica)、紅李(Prunus simonii )、剌李(Prunus spinosa)、剌葉稠李(Prunus spinulosa)、奧勒同州李(Prunus subcordata)、大葉早樓(Prunussubhirtella)、Prunustakesimensis、俄羅斯矮杏(Prunus tenella)、Prunus texana、毛樓桃(Prunus tomentosa)、Prunus tschonoskii、Prunus umbellata、霞樓花(Prunusverecunda)、美國(guó)稠李(Prunus virginiana)、Prunus webbii、東京樓(Prunus xyedoensis)、大葉樓(Prunus zippeliana)、李屬 BSP-2004-1 (Prunus sp. BSP-2004-1 )、李屬 BSP-2004-2 (Prunus sp. BSP-2004-2)、李屬 EB-2002 (Prunus sp. EB-2002)、榿葉唐棣(Amelanchier alnifolia)、Amelanchier arborea、東亞唐様(Amelanchier asiatica)、巴川姆唐様(Amelanchier bartramiana)、力口拿大唐様(Amelanchier canadensis)、Amelanchier cusickii、Amelanchier fernaldii、Amelanchier florida、AmelanchierhumiIs、Amelanchier intermedia、平滑唐様(Amelanchier laevis)、Amelanchierlucida、 Amelanchier nantucketensis、 Amelanchier pumila、 Amelanchierquinti—martii、Amelanchier sanguinea、Amelanchier stolonifera、Amelanchierutahensis、Amelanchier wiegandii、Amelanchier x neglecta、巴川姆唐様 x 唐様屬‘dentata’ (Amelanchier bartramiana x Amelanchier sp. ! dentata !)、唐様屬‘dentata， (Amelanchier sp. f dentata ')、唐様屬 ‘erecta， (Amelanchiersp. f erecta f )、唐様屬 ‘erecta，x 光滑唐様(Amelanchier sp. f erecta f xAmelanchier laevis)、唐様屬 iSerotina^ (Amelanchier sp. f serotina f )、Aria alnifolia、紫果腺肋花揪(Aronia prunifolia)、毛葉木瓜(Chaenomels cathayensis)、皺皮木瓜(Chaenomeles speciosa)、Chamaemespilus alpina、家棒(Cormus domestica)、細(xì)尖枸子(Cotoneaster apiculatus)、團(tuán)花枸子(Cotoneaster lacteus)、租毛枸子(Cotoneaster pannosus)、Crataegus azarolus、Crataegus columbiana、白玉山植(Crataegus crus-galli)、Crataegus curvisepala、彩葉山植(Crataegus laevigata)、Crataegus mollis、單子山楂(Crataegus monogyna)、歐洲黑山楂(Crataegus nigra)、Crataegus rivularis、Crataegus sinaica、媼梓(Cydonia oblonga)、光葉牛筋條(Dichotomanthes tristaniicarpa)、 云南 移(Docynia delavayi)、Docyniopsistschonoskii、批杷(Eriobotrya japonica)、櫟葉批杷(Eriobotrya prinoides)、Eriolobus trilobatus^HeteromeIes abutifolia、Kageneckia angustifolia、Kageneckiaoblonga、Lindleya mespiloides、Malacomeles denticulata、Malus angustifolia、花紅(Malus asiatica)、山荊子(Malus baccata)、Malus coronaria、臺(tái)灣林擒(Malusdoumeri)、Malus florentina、Malus floribunda、Malus fusca、垂絲海棠(Malushalliana)、河南海棠(Malus honanensis)、湖北海棠(Malus hupehensis)、Malusioensis、光葉跪東海棠(Malus kansuensis)、毛山荊子(Malus mandshurica)、西府海棠(Malus micromalus)、紅肉蘋果(Malus niedzwetzkyana)、滄江海棠(Malusombrophiila)、東方蘋果(Malus oriental is)、西蜀海棠(Malus prattii )、揪子(Malusprunifolia)、蘋果(Malus pumila)、撒氏海棠(Malus sargentii)、三葉海棠(Malussieboldii )、新疆野蘋果(Malus sieversii )、野蘋果(Malus sylvestris)、變?nèi)~海棠(Malus toringoides)、長(zhǎng)圓果花葉海棠(Malus transitoria)、三裂葉海棠(MalustrilObata)、Malus tschonoskii、Malus x domestica、Malus x domestica xMalussieversii^ Malus x domestica x Pyrus communis、 小金 海棠(Malusxiaojinensis)、潰池海棠(Malus yunnanensis)、蘋果屬、西洋木瓜(Mespilusgermanica)^ 小石積(Osteomeles anthyllidifolia)、華西小石積(Osteomelesschwerinae)、Peraphyllum ramosissimum、紅葉石楠(Photinia fraseri)、Photiniapyrifolia、卵葉石楠(Photinia serrulata)、毛葉石楠(Photinia villosa)、中華假媼梓(Pseudocydonia sinensis)、歐洲火棘(Pyracantha coccinea)、火棘(Pyracanthafortuneana)、豆梨(Pyrus calleryana)、Pyrus caucasica、西洋梨(Pyru scommunis)、Pyrus elaeagrifolia、雜交梨品種(Pyrus hybrid cultivar)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、柳葉梨(Pyrus salicifolia)、秋子梨(Pyrus ussuriensis)、白梨(Pyrus xbretschneideri)、石斑木(Rhaphiolepis indiCa)、美洲花揪(Sorbus americana)、白花花揪(Sorbus aria)、歐洲花揪(Sorbus aucuparia)、Sorbus californica、克什米爾花揪(Sorbus commixta)、湖北花揪(Sorbus hupehensis)、Sorbus scopulina、西伯利亞花揪(Sorbus sibirica)、Sorbus torminalis、紅果樹(Stranvaesia davidiana)、Torminalisclusii、Vauquelinia californica、Vauquelinia corymbosa、Acaena anserinifolia、Acaena argentea、灰藍(lán)芒刺果(Acaena caesiiglauca)、Acaena cyIindristachya^Acaenadigitata、Acaena echinata、Acaena elongata、Acaena eupatoria、Acaena fisistipula、無刺芒刺果(Acaena inermis)、Acaena laevigata、Acaena latebrosa、Acaena lucida、Acaena macrocephala、Acaena magellanica、Acaena masafuerana、Acaena montana、 Acaena multif ida、新西蘭芒朿丨J 果(Acaena novaezelandiae)、Acaena oval if olia^ Acaenapinnatifida、Acaenasplendens、Acaena subincisa、Acaena x anserovina、習(xí)習(xí)葉花(Acomastylis elata)、Acomastylis rossii、Acomastylis sikkimensis、歐洲龍牙草(Agrimonia eupatoria)、曰本龍牙草(Agrimonia nipponica)、Agrimonia parviflora、龍牙草(Agrimonia pilosa)、高山習(xí)習(xí)衣草(Alchemilla alpina)、Alchemilla erythropoda、習(xí)習(xí)衣草(Alchemillajaponica)、Alchemilla mollis、Alchemilla vulgaris、Aphanesarvensis、Aremoniaagrimonioides、Bencomia brachystachya、Bencomia caudata、Bencomia exstipulata、Bencomia sphaerocarpa、Chamaebatia foliolosa、Cliffortiaburmeana、Cliffortiacuneata、Ciffortia dentata、Ciffortia graminea、Cliffortiaheterophylla、Cl iffortianitidula^ Ciffortia odorata、Ciffortia ruscifolia、Cliffortia sericea、 Coluria elegans、 Coluria geoides、 Cowania stansburiana、Dalibarda repens、Dendriopoteriummenendezii、Dendriopoterium pulidoi、德拉蒙德仙女木(Dryas drummondii)、仙女木(Dryas octopetala)、皺果蛇莓(Duchesneachrysantha)、蛇毒(Duchesnea indica)、Erythrocoma triflora、Fallugia paradoxa、多葉蚊子草(Filipendula multi juga)褲葉蚊子草(Filipendulapurpurea)、旋果蚊子草(Filipendula ulmaria)、六辧繡線菊(Filipendula vulgaris)、智利草莓(Fragariachiloensis)、裂萼草莓(Fragariadaltoniana)、細(xì)梗草莓(Fragaria gracilis)、Fragariagrandiflora、Fragaria iinumae、廣香草毒(Fragaria moschata)、黃毛草毒(Fragarianilgerrensis)、Fragarianipponica、西藏草毒(Fragaria nubicola)、東方草毒(Fragariaorientalis)、五葉草莓(Fragaria pentaphylla)、野草莓(Fragaria vesca)、弗州草莓(Fragaria virginiana)、荷蘭草毒(Fragaria viridis)、草毒(Fragaria x ananassa)、草莓屬 CFRA538 (Fragaria sp. CFRA 538)、草莓屬(Fragaria sp. )、Geum andicola、Geumborisi、保加利亞路邊青(Geum bulgaricum)、Geum calthifolium、智利路邊青(Geumchiloense)^ Geum geniculatum、Geum heterocarpum、Geum macrophyIlum、Geummontanum、Geum reptans、紫萼路邊青(Geum rivale)、Geum schofieldii、Geumspeciosum、歐亞路邊青(Geum urbanum)、Geum vernum、路邊青屬 ‘Chase 2507K’ (Geumsp. ! Chase 2507K/ )、Hagenia abyssinica、Horkelia cuneata、Horkelia fusca、Ivesiagordoni、 重辧様棠花(Kerria japonica)、Leucosidea sericea、Marcetellamaderensis、Marcetella moquiniana、Margyricarpus pinnatus、Margyricarpussetosus、Novosieversia glacials、Oncostylus cockaynei、Oncostylus liospermus、Potylepis australis、Polylepis besseri、Polylepis crista-gallic Polylepishieronymi、Polylepis incana、Polylepis lanuginosa、Polylepis multijuga、Polylepisneglecta、Polylepis pauta、Polylepis pepei、Polylepis quadrijuga、Polylepisracemosa、Polylepis reticulata、Polylepis rugulosa、Polylepis sericea、Polylepissubsericans、Polylepis tarapacana、Polylepis tomentella、Polylepis weberbaueri、無毛藤麻(Potentilla anserina)、Potentilla arguta、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、委陵菜(Potentilia chinensis)、薄葉皺葉委陵菜(Potentilla dickinsii)、Potentilla erecta、莓葉委陵菜(Potentilla fragarioides)、白毛金露梅(Potentillafruticosa)、Potentilla indica、Potentilla micrantha、多裂委陵菜(Potentillamultif ida)、雪白委陵菜(Potentilla nivea)、挪威委陵菜(Potentilla norvegica)、沼生委陵菜(Potentilla palustris)、總梗委陵菜(Potentilla peduncularis)、匍匍委陵菜(Potentilla reptans)、Potentilla salesoviana、狹葉委陵菜(Potentillastenophylla)、三齒委陵菜(Potentilla tridentata)、Rosa abietina、Rosa abyssinica、剌薔薇(Rosa acicularis)、草地玫瑰(Rosa agrestis)、白薔薇(Rosa alba)、白薔薇 x 荊剌薔薇(Rosa alba x Rosa corymbifera)、大花密剌薔薇(Rosa altaica)、阿州薔薇(Rosaarkansana)、野地玫瑰(Rosa arvensis)、本香花(Rosa banksiae)、彎剌玫瑰(Rosabeggeriana)、哈德遜灣玫瑰(Rosa blanda)、碩荀薔薇(Rosa bracteata)、復(fù)傘房薔薇(Rosa brunonii)、Rosa caesia、力口州蓄薇(Rosa californica)、犬蓄薇(Rosa canina)、卡羅萊納蓄薇(Rosa Carolna)、月季(Rosa chinensis)、Rosa cinnamomea、Rosacolumnifera、荊棘薔薇(Rosa corymbifera)、山木香(Rosa cymosa)、山剌玫(Rosadavurica)、馬爾密迪玫瑰(Rosa dumalis)、Rosa ecae^Rosaeglanteria^Rosa elliptica、腺果薔薇(Rosa fedtschenkoana)、異味薔薇(Rosa foetida)、Rosa foliolosa、法國(guó)薔薇(Rosa gallica)、Rosa gallica x Rosa dumetorum、巨花薔薇(Rosa gigantea)、瑞道特玫瑰(Rosa glauca)、卵果薔薇(Rosa heInae)、軟條七薔薇(Rosa henryi )、黃薔薇(Rosahugonis)、薔薇雜交品種(Rosa hybrid culivar)、Rosa inodora、Rosa jundzillii、金樓子(Rosa laevigata)、疏花薔薇(Rosa Iaxa)、光葉薔薇(Rosa luciae)、重辧五月玫瑰(Rosa majalis)、深山薔薇(Rosa marretii)、傘花薔薇(Rosa maximowicziana)、Rosamicrantha、毛葉廣東薔薇(Rosa mollis)、Rosa montana、射香玫瑰(Rosa moschata)、華西薔薇(Rosa moyesii)、多荀薔薇(Rosa multibracteata)、多花玫瑰(Rosa multiflora)、Rosa nitida、香水月季(Rosaodorata)、沼澤玫瑰(Rosa palustris)、高山玫瑰(Rosa pendulina)、小檗薔薇(Rosapersica)、Rosa Phoenicia、寬剌薔薇(Rosa platyacantha)、樓草薔薇(Rosa primula)、Rosa pseudoscabriuscula、繅絲花(Rosa roxburghii)、甜石南(Rosa rubiginosa)、玫瑰(Rosa rugosa)、山薔薇(Rosa sambucina)、長(zhǎng)青玫瑰(Rosasempervirens)、絹毛薔薇(Rosa sericea)、純?nèi)~薔薇(Rosa sertata)、剛毛玫瑰(Rosasetigera)、Rosa sherardii、Rosa sicula、密刺蓄薇(Rosa spinosissima)、Rosastellata、平花山地玫瑰(Rosa stylosa)、Rosa subcanina、Rosa subcollina、Rosasuffulta、Rosa tomentella、被域毛玫瑰(Rosa tomentosa)、Rosa tunquinensis、蘋果薔薇(Rosa villosa)、維吉尼亞玫瑰(Rosa virginiana)、光葉薔薇(Rosa wichurana)、小葉薔薇(Rosa willmottiae)、伍茲氏薔薇(Rosa woodsii) ；Rosa x damascena、Rosaxfortuniana、Rosa x macrantha、黃剌玫(Rosa xanthina)、薔薇屬(Rosa sp.)、粗葉懸鉤子 Rubus alceifolius、美國(guó)黑莓(Rubus allegheniensis)、Rubus alpinus、周毛懸鉤子(Rubus amphidasys)、北懸鉤子(Rubus arcticus)、Rubus argutus、西南懸鉤子(Rubusassamensis)、Rubus australis、Rubus bifrons、歐洲木莓(Rubus caesius)、歐洲木莓 x復(fù)盆子(Rubus caesius x Rubus idaeus)、無剌小黑莓(Rubus canadensis)、Rubuscanescens、Rubus caucasicus、興安懸鉤子(Rubus chamaemorus)、山莓(Rubuscorchorifolius)、牛疊肚(Rubus crataegifolius)、沙黑莓(Rubus cuneifolius)、美味懸鉤子(Rubus deliciosus)、Rubus divaricatus、捕圓懸鉤子(Rubus ellipticus)、Rubusflagellaris、 黑莓(Rubus fruticosus)、Rubus geoides、Rubus glabratus、Rubusglaucus、Rubus gunnianus、Rubus hawaiensis、Rubus hawaiensis x Rubus rosifolius、 硬毛黑莓(Rubus hispidus)、Rubus hochstetterorum、_ 草葉懸鉤子(Rubushumulifolius)、復(fù)盆子(Rubus idaeus)、高梁泡(Rubus lambertianus)、Rubuslasiococcus、白皮糖莓(Rubus leucodermis)、絹毛懸鉤子(Rubus lineatus)、Rubusmacraei、Rubus maximiforrnis、Rubus minusculus、Rubus moorei、大烏泡(Rubusmultibracteatus)、Rubus neomexicanus、Rubus nepalensis、Rubus nessensis、雪露毒(Rubus nivalis)、紅泡剌藤(Rubus niveus)、Rubus nubigenus、黑樹莓(Rubusoccidentalis)、香莓(Rubus odoratus)、Rubus palmatus、茅莓(Rubus parviflorus)、茅莓(Rubus parvifolius)、Rubus parvus、黃泡(Rubus pectinellus)、Rubus pedatus、Rubus pedemontanus、Rubuspensilvanicus、多腺懸鉤子(Rubus phoenicolasius)、Rubuspicticaulis、柔毛黑莓(Rubus pubescens)、Rubus rigidus、Rubus robustus、Rubusroseus、空心泡(Rubusrosifolius)、Rubus sanctus、Rubus sapidus、石生懸鉤子(Rubussaxatilis)、Rubussetosus、美莓(Rubus spectabilis)、Rubus sulcatus、灰白毛莓(Rubustephrodes)、三花懸鉤子(Rubus trianthus)、三色莓(Rubus tricolor)、Rubus trifidus、Rubus trilobus、南露莓(Rubus trivialis)、偷葉黑莓(Rubus ulmifolius)、黑草莓(Rubus ursinus)、Rubus urticifolius、Rubus vigorosus、懸鉤子屬 JPM-2004 (Rubussp. JPM-2004)、Sanguisorba albiflora、高山地偷(Sanguisorba alpina)、Sanguisorbaancistroides、Sanguisorba annua、美洲地偷(Sanguisorba canadensis)、矮地偷(Sanguisorba filiformis)、白山地偷(Sanguisorba hakusanensis)、Sanguisorbajaponensis、小地偷(Sanguisorba minor)、 Sanguisorba obtusa、地偷(Sanguisorbaofficinalis)、小白花地偷(Sanguisorba parviflora)、大白花地偷(Sanguisorbastiulata)、細(xì)葉地偷(Sanguisorba tenuifolia)、Sarcopoterium spinosum、山莓草(Sibbaldia procumbens)、Sieversia pentapetala、Sieversia pusilla、緣毛太行花(Taihangia rupestris)、Tetraglochin cristatum、Waldsteinia fragarioides、歐洲林石草(Waldsteinia geoides)、Adenostoma fasciculatum、Adenostoma sparsifolium、假升麻(Aruncus dioicus)、 Cercocarpus betuloides、 Cercocarpus ledifolius、Chamaebatiaria millefolium、直立地薔 薇(Chamaerhodos erecta)、Gilleniastipulata、 美吐 根(Gillenia trifoliata)、Holodiscus discolor、Holodiscusmicrophyllus、Lyonothamnus floribundus、川康繡線梅(Neillia affinis)、矮生繡線梅(Neillia gracilis)、中華繡線梅(Neillia sinensis)、疏花繡線梅(NeilliasparsifIora)、西康繡線梅(Ne illia thibetica)、毛果繡線梅(Neillia thyrsiflora)、東北繡 線梅(Neillia uekii)、Neviusia alabamensis、Physocarpus alternans、Physocarpus arnurensis、太平洋風(fēng)箱果(Physocarpus capitatus)、Physocarpusmalvaceus、山風(fēng)箱果(Physocarpus monogynus)、美國(guó)風(fēng)箱果(PhysocarpusopulifoIius)、Purshia tridentata、雞麻(Rhodotypos scandens)、高叢珍珠梅(Sorbariaarborea)> 東北珍珠梅(Sorbaria sorbifolia)、Spiraea betulifolia、麻葉繡線菊(Spiraea cantoniensis)、 Spiraea densiflora> 粉花繡線菊(Spiraea japonica)、Spiraea nipponica、菱葉繡線菊(Spiraea x vanhouttei)、繡線菊屬(Spiraea sp.)、中國(guó)小米空木(Stephanandra chinensis)、小米空木(Stephanand ra incisa)和日本小米空木(Stephanandra tanakae)。特別優(yōu)選的薔薇科的屬包括蘋果屬、梨屬、榲梓屬、李屬、枇杷屬和歐楂屬。特別優(yōu)選的薔薇科物種包括家蘋果、野蘋果、西洋梨、沙梨、白梨、榲梓、中國(guó)李、紅葉李、碧桃、枇杷、扁桃、歐洲甜櫻桃、西洋木瓜和歐洲李。更特別優(yōu)選的薔薇科的屬包括蘋果屬和李屬特別優(yōu)選的薔薇科物種包括家蘋果和紅葉李。術(shù)語“植物”包括整株植物、植物的任何部分、植物的繁殖體和后代。術(shù)語“繁殖體”指能用在有性或無性生殖或繁殖中的植物的任何部分，包括種子和插穗。


本發(fā)明參照附圖將能被更好的理解圖I :顯示了 MdMYBlO (SEQ ID NO :1)和 MdMYB9 (SEQ ID NO :2)同已知的來源于各種物種的花青素MYB調(diào)控因子在R2R3結(jié)合區(qū)域的比較。箭頭標(biāo)明有助于在擬南芥bHLH共同因子相互作用中涉及的基序的特定氨基酸殘基(Zimmermann et al.，2000);這些相同的殘基是MdMYBlO和MdMYB9中暗示相似的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的證據(jù)。圖2:顯示了顯示擬南芥和蘋果MYB TFs間關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育分析。箭頭顯示了在花青素MYB調(diào)控因子亞組10中位于AtPAPl的下一個(gè)的MdMYBlO的位置。已知的花青素調(diào)控因子用灰點(diǎn)表示，圖中包括的用黑點(diǎn)表示的其它基因是顯示MdMYBlO作用是對(duì)該MYB進(jìn)化枝特異和不是對(duì)整體MYBs特異的陰性對(duì)照。圖3 (A):顯示了紅地(Red Field)蘋果和太平洋玫瑰(Pacific Rose)蘋果的皮層、果皮和葉片中的如列在圖右手側(cè)的從CHS到UFGT的蘋果花青素生物合成基因的qPCR分析數(shù)據(jù)。X 軸數(shù)字指如下內(nèi)容；1、40DAFB，2、67DAFB，3、102DAFB，4、130DAFB, 5、146DAFB，6、紅地蘋果OP葉片和7、太平洋玫瑰蘋果葉片。
圖3 (B):顯示了貫通在如圖3 (A)中顯示的發(fā)育階段I到5的蘋果果實(shí)(紅地OP在上列，太平洋玫瑰蘋果在下列)的切片。同太平洋玫瑰蘋果相比，紅地OP蘋果的增加的著色明顯可見。圖4 :顯示了 MdMYB 10、MdbHLH3和MdbHLH33的表達(dá)分析。(A)在紅地蘋果(皮層、果皮和葉片)和太平洋玫瑰蘋果(皮層、果皮和葉片)中的MdMYBlO的RT-PCR分析和(B)MdMYB 10、MdbHLH3和MdbHLH33的相應(yīng)的qPCR數(shù)據(jù)。凝膠泳道和X軸數(shù)字如下1、40DAFB，2、67DAFB，3、102DAFB，4、130DAFB, 5、146DAFB，6、紅地蘋果葉片和7、太平洋玫瑰蘋果葉片。圖5 :顯示了雙重?zé)晒馑孛笇?shí)驗(yàn)顯示了以LUC比REN的比率表示的啟動(dòng)子活性，其中，活性的增加同MYB TFs同/不同bHLH TFs組合的相對(duì)于REN的LUC的增加進(jìn)行平均；(A)擬南芥TT4 (CHS)-Luc啟動(dòng)子，(B)擬南芥TT3 (DFR)-Luc啟動(dòng)子。0:單獨(dú)的MYB，1:MYB+AtTT8,2 MYB+MdbHLH3, 3 :MYB+MdbHLH33。圖6 :顯示了煙草中短暫實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。(A)顯示了以a7b*比率顯示的用Minolta比色計(jì)測(cè)量的顏色測(cè)量數(shù)據(jù)。朝向正值的轉(zhuǎn)變表明了從綠色到紅色的顏色變化。(i) MdMYB10+MdbHLH3, (ii)單獨(dú)的 MdMYBlO。(B)顯示了顯示用20x (左)和40x (右)的MdMyblO+MdbHLH3浸潤(rùn)的煙草葉片組織中花青素(更黑的灰色)積累模式的顯微影像。比例尺代表50微米。圖7 :顯示了顯示用MdMYB10+MdbHLH3浸潤(rùn)的(A)煙草花瓣和(B)煙草葉片的HPLC痕量(traces)。I、花青苷_3_葡糖苷，2、矮牽牛素_3_半乳糖苷，3、花青苷-3-鄰-蕓香糖苷。在對(duì)照的煙草葉片中沒有觀測(cè)到峰(數(shù)據(jù)未顯示)。圖8 :顯示了 MdMyblO多肽序列和MdMYBlO的多肽變種以及參考的AtPAPl (也稱為AtMYB75)的蛋白序列比對(duì)。AtMYB75在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登入號(hào)是CAB09230。所述比對(duì)使用Clustal W算法進(jìn)行創(chuàng)立(Thompson et al.，1994)。圖9 :顯示了 MdMyblO多肽序列、MdMYBlO的多肽變種和參考的AtPAPl間的％序列同一性。所述表格顯示了包括在圖8中的序列的所有可能的序列組合的％同一性值。圖10 :顯示了在煙草短暫轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中At-DFR基因啟動(dòng)子被同蘋果bHLH TFs組合的MdMYBlO和PcfMYBlO (PcfMYBlO的變種)的激活影響了 At-DFR基因啟動(dòng)子的活性。雙重?zé)晒馑孛笇?shí)驗(yàn)顯示了以DFR啟動(dòng)子熒光素酶(LUC)比35S海腎(REN)的比率表達(dá)的啟動(dòng)子活性，其中活性的增加同相對(duì)于REN的LUC的增加相平均。MYB轉(zhuǎn)錄因子(Md MYB10、PcfMYBlO和MdMYB8 (_ve對(duì)照)同bHLH轉(zhuǎn)錄因子Md bHLH3和MdbHLH33的組合的效應(yīng)被顯示。顯示的誤差條是6個(gè)重復(fù)反應(yīng)的均值土S.E。圖11 :顯示，MdMYBlO在蘋果細(xì)胞和/或植物中的過表達(dá)提高了花青素生產(chǎn)。(A)(i)顯示了著色的愈傷組織細(xì)胞。A (ii)顯示了用35S-MdMYB10轉(zhuǎn)化的蘋果植物(左)和空載體對(duì)照植物(右)。與空載體對(duì)照相比，用35-MdMYB10 (左)轉(zhuǎn)化的植物清楚地顯示了強(qiáng)烈的著色。(B)顯示了 35S-MdMYB10蘋果葉片(頂部的線條)和空載體對(duì)照(底部的線條)的抽提物的花青素輪廓。在520nm波長(zhǎng)處由HPLC痕量鑒定的峰；cy-gal，花青苷-3-半乳糖苷，具有更低痕量的cy-glu,花青苷-3-葡糖苷和cy-pent,花青苷_3_戍糖苷。
具體實(shí)施例方式在本說明書中作出的針對(duì)專利說明書、其它外部文檔或信息的其它來源的參考，其通常的目的是為討論本發(fā)明的特點(diǎn)提供背景知識(shí)。除非特別指明，否則對(duì)這樣的外部文檔的參考不被解釋為承認(rèn)，這樣的文檔或信息的這樣的來源，在任何權(quán)限內(nèi)，是已有技術(shù)，或形成本領(lǐng)域公知常識(shí)的部分。術(shù)語包含和其語法上的同義詞是指“至少部分由……組成”。多聚核苷酸和片段如本文所用，術(shù)語“多聚核苷酸”指任何長(zhǎng)度但優(yōu)選為至少15個(gè)核苷酸的單鏈或雙鏈脫氧核苷酸或核苷酸多聚體，并且包括，作為非限制性的范例，基因的編碼和非編碼序列、正義和反義序列互補(bǔ)序列、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、mRNA前體、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重組多肽、分離和純化的自然出現(xiàn)的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。本文提供的多聚核苷酸序列的“片段”是能同目標(biāo)靶子特異雜交的連續(xù)核苷酸的 子序列，例如，至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列。本發(fā)明的片段包含本發(fā)明的多聚核苷酸的連續(xù)核苷酸的15個(gè)核苷酸，優(yōu)選地至少20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸和最優(yōu)選地至少60個(gè)核苷酸。多聚核苷酸的片段能以反義、沉默基因、三螺旋或核酶技術(shù)或以包括在微陣中的引物、探針進(jìn)行使用，或用于本發(fā)明的基于多聚核苷酸的選擇方法。術(shù)語“引物”指通常具有游離3’OH基的同模板雜交并用于引發(fā)同目標(biāo)互補(bǔ)的多聚核苷酸的聚合的短多聚核苷酸。術(shù)語“探針”指在基于雜交的實(shí)驗(yàn)中用來檢測(cè)同所述探針互補(bǔ)的多聚核苷酸序列的短多聚核苷酸。所述探針可能包含如本文定義的多聚核苷酸的“片段”。多肽和片段如本文所用，術(shù)語“多肽”包含氨基酸殘基被共價(jià)肽鍵連接的包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的任何長(zhǎng)度的但優(yōu)選地至少5個(gè)氨基酸的氨基酸鏈。本發(fā)明的多肽可能是被純化的天然產(chǎn)物，或可能部分或完全通過使用重組或合成技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。所述術(shù)語可能指多肽、諸如二聚體或其它多聚體的多肽的聚集物、融合肽、多肽片段、多肽變種或其衍生物。多肽的“片段”是指執(zhí)行生物活性所需的和/或提供所述多肽三維結(jié)構(gòu)的功能的多肽的子序列。所述術(shù)語可能指能執(zhí)行上述酶活性的多肽、諸如二聚體或其它多聚體的多肽聚集物、融合肽、多肽片段、多肽變種或其衍生物。如本文公開的，用于所述多聚核苷酸或多肽序列的術(shù)語“分離的”是用來指從它們的天然細(xì)胞環(huán)境中移去的序列。分離的分子可能通過包括生物化學(xué)、重組和合成技術(shù)在內(nèi)的任何方法或方法的組合而獲得。術(shù)語“重組的”指從在它的天然環(huán)境中包圍它的序列移去和/或同在它的天然環(huán)境中不存在的序列重組的多聚核苷酸序列?！爸亟M的”多肽序列通過從“重組的”的多聚核苷酸序列的翻譯而生產(chǎn)。關(guān)于本發(fā)明的衍生自具體屬或種的多聚核苷酸或多肽的術(shù)語“衍生自”指，所述多聚核苷酸或多肽具有同在所述屬或種中天然發(fā)現(xiàn)的多聚核苷酸或多肽相同的序列。衍生自具體屬或種的所述多聚核苷酸或多肽因此可能被合成地或重組地生產(chǎn)。變種如本文中所用，術(shù)語“變種”指不同于具體鑒定的序列的多聚核苷酸或多肽序列，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基被刪除、取代或加入。變種可能是自然發(fā)生的等位變種或非自然發(fā)生的變種。變種可能來源于相同的種或來源于其它種并且可能包括同源物、類似物和直系同源物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽變種和多肽具有同本發(fā)明的多肽或多肽的生物活性相同或相似的活性。關(guān)于多肽和多肽的術(shù)語“變種”包括如本文定義的所有形式的多肽和多肽。多聚核苷酸變 種變種多聚核苷酸序列優(yōu)選地顯示至少50%、更優(yōu)選地至少51%、更優(yōu)選地至少52%、更優(yōu)選地至少53%、更優(yōu)選地至少54%、更優(yōu)選地至少55%、更優(yōu)選地至少56%、更優(yōu)選地至少57%、更優(yōu)選地至少58%、更優(yōu)選地至少59%、更優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少61%、更優(yōu)選地至少62%、更優(yōu)選地至少63%、更優(yōu)選地至少64%、更優(yōu)選地至少65%、更優(yōu)選地至少66%、更優(yōu)選地至少67%、更優(yōu)選地至少68%、更優(yōu)選地至少69%、更優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少71%、更優(yōu)選地至少72%、更優(yōu)選地至少73%、更優(yōu)選地至少74%、更優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少76%、更優(yōu)選地至少77%、更優(yōu)選地至少78%、更優(yōu)選地至少79%、更優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少81%、更優(yōu)選地至少82%、更優(yōu)選地至少83%、更優(yōu)選地至少84%、更優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少86%、更優(yōu)選地至少87%、更優(yōu)選地至少88%、更優(yōu)選地至少89%、更優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少91%、更優(yōu)選地至少92%、更優(yōu)選地至少93%、更優(yōu)選地至少94%、更優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少96%、更優(yōu)選地至少97%、更優(yōu)選地至少98%和最優(yōu)選地至少99%的同本發(fā)明的序列的同一性。同一性通過具有至少20個(gè)核苷酸位置、優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸位置、更優(yōu)選地至少100個(gè)核苷酸位置和最優(yōu)選地通過本發(fā)明的全長(zhǎng)多聚核苷酸的對(duì)比窗而發(fā)現(xiàn)。多聚核苷酸序列同一性能以下述方法進(jìn)行測(cè)定。使用bl2seq中的BLASTN (來自BLAST套件程序，版本2. 2. 5 [2002年11月])將所述目標(biāo)多聚核苷酸序列同候選多聚核苷酸序列進(jìn)行比較(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999)，"Blast 2sequences_anew tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMSMicrobiolLett. 174:247-250),公眾可從 NCBI (ftp://fp. ncbi. nih. gov/blast/)獲得所述程序。除了低復(fù)雜度部分過濾(filtering of low complexity parts)應(yīng)當(dāng)被關(guān)閉外，bl2seq的默認(rèn)參數(shù)被使用。多聚核苷酸序列的同一性通過使用下述unix命令行參數(shù)進(jìn)行檢查bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p blastn 參數(shù)-F F 關(guān)閉了低復(fù)雜度部分過濾。參數(shù)-P選擇合適的序列配對(duì)算法。所述bl2seq程序在命令行“Identities=”中以相同核苷酸的數(shù)目和百分比報(bào)告序列同一性。多聚核苷酸同一性也能通過使用通用序列比對(duì)程序測(cè)定候選和目標(biāo)多聚核苷酸序列間的重疊的全部長(zhǎng)度而進(jìn)行計(jì)算(例如，Needleman, S. B. and ffunsch, C. D. (1970)J. MoL Biol. 48，443-453)。Needleman-Wunsch通用比對(duì)算法的完整工具可在EMBOSS程序包中的針(needle)程序中發(fā)現(xiàn)(Rice, P. Longden, I. and Bleasby,A. EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000,vol 16, No6. pp. 276-277)，所述程序包可從 http: //www. hRmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/)獲得。歐洲生物信息學(xué)研究所服務(wù)器也提供執(zhí)行兩個(gè)序列間的EMBOSS-針(needle)通用比對(duì)的在線工具，網(wǎng)址為http:/www. ebi. ac. uk/emboss/align/0
可選地，計(jì)算兩個(gè)序列間的最佳通用比對(duì)而沒有末端空位罰分的GAP序列能被使用。GAP 在下述文章中進(jìn)行了描述Huang, X. (1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。本發(fā)明的多聚核苷酸變種也包括那些顯示了同一種或更多種明確鑒定的序列的相似性的序列，該序列可能保留那些序列的功能等價(jià)物并且，該序列不能被適當(dāng)?shù)卣J(rèn)為已經(jīng)隨機(jī)發(fā)生。關(guān)于多肽的這樣的序列相似性可能通過使用公開可得的bl2seq程序進(jìn)行測(cè)定，所述程序可從NCBI的BLAST程序套件(版本2. 2. 5 [2002年11月])(fp//ftp ncbinihgov/blast/)中獲得。多聚核苷酸序列的相似性可能通過使用下述unix命令行參數(shù)進(jìn)行檢查bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p tblastx 參數(shù)-F F 關(guān)閉了低復(fù)雜度部分過濾。參數(shù)-P選擇合適的序列配對(duì)算法。該程序發(fā)現(xiàn)序列間具有相似性的區(qū)域并為每一個(gè)這樣的區(qū)域報(bào)告“E值”，所述“E值”是預(yù)期的一個(gè)人可以期望在含有隨機(jī)序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫(kù)中看到的這樣的偶然匹配的次數(shù)的數(shù)目。該數(shù)據(jù)庫(kù)的大小在 bl2seq程序中通過默認(rèn)進(jìn)行設(shè)定。對(duì)于比一小的多的小的E值，所述E值近似于這樣的隨機(jī)匹配的幾率。當(dāng)同任何一種具體鑒定的序列比較時(shí)，變種多聚核苷酸序列優(yōu)選地顯示小于I X 10_6、更優(yōu)選地小于I X 10_9、更優(yōu)選地小于I X 10_12、更優(yōu)選地小于I X 10_15、更優(yōu)選地小于I X 10_18、更優(yōu)選地小于I X 10_21、更優(yōu)選地小于I X 10_3°、更優(yōu)選地小于I X 10_4°、更優(yōu)選地小于I X 10_5°、更優(yōu)選地小于I X 10_6°、更優(yōu)選地小于I X 10_7°、更優(yōu)選地小于I X 10_8°、更優(yōu)選地小于I X 10_9°和最優(yōu)選地小于I X 10_1CI°的E值。可選地，本發(fā)明的變種多聚核苷酸在嚴(yán)格條件下同特定多聚核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交。術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”和其語法上的同義詞指多聚核苷酸在確定的溫度和鹽濃度條件下同目標(biāo)多聚核苷酸分子(諸如固定在諸如Souther blot或Northern blot等DNA或RNA印記上的目標(biāo)多聚核苷酸分子)雜交的能力。在嚴(yán)格條件下雜交的能力能通過在較低嚴(yán)格條件下初始雜交然后增加嚴(yán)格條件到期望的嚴(yán)格條件下的雜交進(jìn)行測(cè)定。關(guān)于長(zhǎng)度大于大約100個(gè)堿基的多聚核苷酸分子，典型的嚴(yán)格的雜交條件是低于天然雙鏈的解鏈溫度(Tm)不超過25-30°C (例如，10°C )(通常參見，Sambrook etal.,Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring HarborPress ；Ausubel et al. , 1987, Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing,)。超過100個(gè)堿基的多聚核苷酸分子的Tm能通過公式Tm=81. 5+0. 41%(G+C-log(Na+)進(jìn)行計(jì)算(Sambrook et al. , Eds, 1987, Molecular Cloning, A LaboratoryManual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Bolton and McCarthy,1962, PNAS 84:1390)。對(duì)于長(zhǎng)度超過大約100個(gè)堿基的多聚核苷酸的典型的嚴(yán)格條件將是諸如在6X SSC、0. 2%SDS的溶液中預(yù)洗；在65°C、6X SSC、0. 2% SDS過夜雜交；然后在IX SSC、0. 1% SDS的溶液中在65°C下洗滌30分鐘，洗滌兩次，和在0. 2X SSC、0. 1% SDS的溶液中在65°C下洗滌30分鐘，洗滌兩次。關(guān)于具有少于100個(gè)堿基的多聚核苷酸分子，范例性的嚴(yán)格的雜交條件是低于Tm5-10°C。平均而言，長(zhǎng)度低于100個(gè)堿基對(duì)的多聚核苷酸分子的Tm被降低大約(500/寡核苷酸長(zhǎng)度)°c。關(guān)于稱為妝核酸(PNAs)的DNA 模擬物(Nielsen et al. , Science. 1991Dec6; 254 (5037) : 1497-500)，其Tm值高于那些DNA-DNA或DNA-RNA雜交物的Tm值，并能通過使用在 Giesen et al. , Nucleic Acids Res. 1998 Nov I; 26 (21) : 5004-6 中描述的公式進(jìn)行計(jì)算。具有少于100個(gè)堿基的DNA-PNA雜交物的范例性的嚴(yán)格的雜交條件是低于Tm值 5-10。。。本發(fā)明的變種多聚核苷酸也包括不同于本發(fā)明的序列但，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，編碼具有同被本發(fā)明的多聚核苷酸編碼的多肽相似活性的多肽的多聚核苷酸。不改變所述多肽的氨基酸序列的序列改變是“沉默突變”。除了 ATG (甲硫氨酸)和TGG (色氨酸)夕卜，相同氨基酸的其它的密碼子可能通過人工識(shí)別技術(shù)進(jìn)行改變，例如，優(yōu)化密碼子在特定 宿主生物中的表達(dá)。導(dǎo)致在被編碼的多肽序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸保守替換而沒有顯著改變其生物活性的多聚核苷酸序列改變也包括在本發(fā)明中。技術(shù)人員將知道制備表型沉默的氨基酸替換的方法(參見例如，Bowie et al.，1990，Science 247，1306)。歸因于被編碼的多肽序列中的沉默突變和保守替換的變種多聚核苷酸可能通過使用公眾可得的bl2seq程序經(jīng)由如前面所述的tblastx算法進(jìn)行測(cè)定，所述程序來自NCBI的 BLAST 程序套件(ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast)(版本 2. 2. 5 [2002 年 11 月])。多肽變種關(guān)于多肽的術(shù)語“變種”包括天然發(fā)生地、重組地和合成地生產(chǎn)的多肽。變種多肽序列優(yōu)選地顯示至少50%、更優(yōu)選地至少51%、更優(yōu)選地至少52%、更優(yōu)選地至少53%、更優(yōu)選地至少54%、更優(yōu)選地至少55%、更優(yōu)選地至少56%、更優(yōu)選地至少57%、更優(yōu)選地至少58%、更優(yōu)選地至少59%、更優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少61%、更優(yōu)選地至少62%、更優(yōu)選地至少63%、更優(yōu)選地至少64%、更優(yōu)選地至少65%、更優(yōu)選地至少66%、更優(yōu)選地至少67%、更優(yōu)選地至少68%、更優(yōu)選地至少69%、更優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少71%、更優(yōu)選地至少72%、更優(yōu)選地至少73%、更優(yōu)選地至少74%、更優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少76%、更優(yōu)選地至少77%、更優(yōu)選地至少78%、更優(yōu)選地至少79%、更優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少81%、更優(yōu)選地至少82%、更優(yōu)選地至少83%、更優(yōu)選地至少84%、更優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少86%、更優(yōu)選地至少87%、更優(yōu)選地至少88%、更優(yōu)選地至少89%、更優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少91%、更優(yōu)選地至少92%、更優(yōu)選地至少93%、更優(yōu)選地至少94%、更優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少96%、更優(yōu)選地至少97%、更優(yōu)選地至少98%和最優(yōu)選地至少99%的同本發(fā)明的序列的同一性。同一性通過具有至少20個(gè)氨基酸位置、優(yōu)選地至少50個(gè)氨基酸位置、更優(yōu)選地至少100個(gè)氨基酸位置和最優(yōu)選地通過本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽的對(duì)比窗而發(fā)現(xiàn)。多肽序列同一性能以下述方法進(jìn)行測(cè)定。使用bl2seq中的BLASTP (來自BLAST套件程序，版本2. 2. 5 [2002年11月])將所述目標(biāo)多肽序列同候選多肽序列進(jìn)行比較，公眾可從NCBI (ftp://ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)獲得所述程序。除了低復(fù)雜度部分過濾(filtering of low complexity parts)應(yīng)當(dāng)被關(guān)閉外，bl2seq的默認(rèn)參數(shù)被利用。多肽序列同一性也可能通過使用通用序列比對(duì)程序比對(duì)候選和目標(biāo)多肽序列間的重疊的全部長(zhǎng)度而計(jì)算。如上面所討論的，EMBOSS-needle (來自http:/www. ebi.ac. uk/emboss/align/)和 GAP(Huang, X. (1994)On Global Sequence Alignment. ComputerApplications in the Biosciences 10，227-235.)也是計(jì)算多肽序列同一性的合適的通用序列比對(duì)程序。優(yōu)選的計(jì)算多肽序列同一性的方法基于通過使用Clustal W比對(duì)待比較序列(Thompson et al 1994, Nucleic Acid Res 11(22)4673-4680)。本發(fā)明的多肽變種也包括那些顯示了同一種或更多種明確鑒定的序列的相似性的序列，該序列可能保留那些序列的功能等價(jià)物并且，該序列不能被適當(dāng)?shù)卣J(rèn)為已經(jīng)隨機(jī)發(fā)生。關(guān)于多肽的這樣的序列相似性可能通過使用公開可得的bl2seq程序進(jìn)行測(cè)定，所述程序可從 NCBI 的 BLAST 程序套件(ftp: //ftp, ncbi. nih. gov/blast/)(版本 2. 2. 5 [2002年11月])中獲得。多肽序列的相似性能通過使用下述unix命令行參數(shù)進(jìn)行測(cè)定bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2_F F -p blastp當(dāng)同任何一種具體鑒定的序列比較時(shí)，變種多肽序列優(yōu)選地顯示小于IX 10_6、更優(yōu)選地小于IX 10_9、更優(yōu)選地小于I X 10_12、更優(yōu)選地小于I X 10_15、更優(yōu)選地小于I X 10_18、更優(yōu)選地小于1X10_21、更優(yōu)選地小于1X10_3°、更優(yōu)選地小于1X10_4°、更優(yōu)選地小于I X 10_5°、更優(yōu)選地小于I X 10_6°、更優(yōu)選地小于I X 10_7°、更優(yōu)選地小于I X 10_8°、更優(yōu)選地小于I X 10_9°和最優(yōu)選地小于I X 10_1CI°的E值。參數(shù)-F F關(guān)閉了低復(fù)雜度部分過濾。參數(shù)-P選擇合適的序列配對(duì)算法。該程序發(fā)現(xiàn)序列間具有相似性的區(qū)域并為每一個(gè)這樣的區(qū)域報(bào)告“E值”，所述“E值”是預(yù)期的一個(gè)人可以期望在含有隨機(jī)序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫(kù)中看到的這樣的偶然匹配的次數(shù)的數(shù)目。對(duì)于比一小的多的小的E值，所述E值近似于這樣的隨機(jī)匹配的幾率。沒有明顯改變其生物活性的所述多肽序列的一個(gè)或多個(gè)保守替換也被包括在本發(fā)明中。技術(shù)人員將知曉制備表型沉默氨基酸替換的方法(參見例如，Bowie etal,1990,Science 247, 1306)。構(gòu)建物、載體及其元件術(shù)語“遺傳構(gòu)建物”指通常是雙鏈DNA的多聚核苷酸分子，其可能已經(jīng)被插入另外的諸如但不限于cDNA分子的多聚核苷酸分子(插入物多聚核苷酸分子)。遺傳構(gòu)建物可能包含支持轉(zhuǎn)錄所述插入物多聚核苷酸分子并且可選地翻譯所述轉(zhuǎn)錄物到多肽的必需元件。所述插入物多聚核苷酸分子可能衍生自宿主細(xì)胞，或可能衍生自不同的細(xì)胞或生物體和/或可能是重組的多聚核苷酸。一旦處于宿主細(xì)胞內(nèi)，所述遺傳構(gòu)建物可能會(huì)整合入宿主染色體DNA。所述遺傳構(gòu)建物可能被連接到載體。術(shù)語“載體”指通常是雙鏈DNA的多聚核苷酸分子，其被用來運(yùn)輸所述遺傳構(gòu)建物到宿主細(xì)胞。所述載體可能能在諸如E. coli的至少一種另外的宿主系統(tǒng)中復(fù)制。術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建物”指包括支持轉(zhuǎn)錄所述插入物多聚核苷酸分子并且可選地翻譯所述轉(zhuǎn)錄物到多肽的必需元件的遺傳構(gòu)建物。表達(dá)構(gòu)建物典型地包含(5’到3’方向)a)在所述構(gòu)建物將被轉(zhuǎn)化入的宿主細(xì)胞內(nèi)起作用的啟動(dòng)子，b)待表達(dá)的多聚核苷酸,和c)在所述構(gòu)建物將被轉(zhuǎn)化入的宿主細(xì)胞內(nèi)起作用的終止子。術(shù)語“編碼區(qū)”或“開放閱讀框”(ORF)指能在適當(dāng)調(diào)控序列的控制下生產(chǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或多肽的基因組DNA序列或cDNA序列的正義鏈。所述編碼序列被5’翻譯起始密碼子和3’翻譯終止密碼子的存在而鑒定。當(dāng)“編碼序列”被插入到遺傳構(gòu)建物中時(shí)并且當(dāng)“編碼序列”被可操作地連接到啟動(dòng)子和終止子序列時(shí)，“編碼序列”能被表達(dá)?！翱刹僮鞯剡B接”指，所述待表達(dá)的序列(sequenced)被置于包括啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)控元件、時(shí)間調(diào)控元件、增強(qiáng)子、抑制子和終止子的調(diào)控元件的控制下。術(shù)語“非編碼區(qū)”指處于翻譯起始位點(diǎn)上游和翻譯終止位點(diǎn)下游的非翻譯序列。這些序列也分別以5’ UTR和3’ UTR指代。這些區(qū)域包括轉(zhuǎn)錄起始和終止以及調(diào)控翻譯效率所必需的元件。終止子是終止轉(zhuǎn)錄并在被翻譯序列下游的基因的3’非翻譯末端發(fā)現(xiàn)的序列。終止子是mRNA穩(wěn)定性的重要決定因素并在某些情況下被發(fā)現(xiàn)具有空間調(diào)控功能。術(shù)語“啟動(dòng)子”指位于所述編碼區(qū)上游的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的非轉(zhuǎn)錄順式調(diào)控元件。啟動(dòng)子包含指定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和諸如TATA框的保守框以及被轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基序的順式起始元件?！稗D(zhuǎn)基因”是從一種生物體獲取并通過轉(zhuǎn)化被引入到不同生物體的多聚核苷酸。所述轉(zhuǎn)基因可能衍生自相同物種或同所述轉(zhuǎn)基因被引入的生物體所屬的物種不同的物種?！稗D(zhuǎn)基因植物”指含有作為遺傳操作或轉(zhuǎn)化結(jié)果的新遺傳物質(zhì)的植物。所述新遺傳物質(zhì)可能衍生自與產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的物種相同或與之不同的植物。“反向重復(fù)”是被重復(fù)的、其中所述重復(fù)的第二個(gè)一半是互補(bǔ)鏈的序列，例如(5，)GATCTA......TAGATC (3 ’ )(5，)CTAGAT......ATCTAG (3，)只要在所述重復(fù)區(qū)域間具有3-5堿基對(duì)的間隔區(qū)，通讀轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生經(jīng)歷互補(bǔ)堿基配對(duì)來形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物。術(shù)語“調(diào)控花青素生產(chǎn)”要包括增加和減少花青素生產(chǎn)。優(yōu)選地，該術(shù)語指增加花青素生產(chǎn)?？赡鼙徽{(diào)控的花青素包括但不限于cyanindin-3-葡糖苷、cyaniding-3-鄰-蕓香糖苷、cyanadin-3-半乳糖苷和cyanadin_3-戍糖苷。術(shù)語“改變本發(fā)明的多聚核苷酸或多肽的表達(dá)”或“改變的本發(fā)明的多聚核苷酸或多肽的表達(dá)”要包括相應(yīng)于本發(fā)明的多聚核苷酸的基因組DNA被修飾從而導(dǎo)致本發(fā)明的多聚核苷酸或多肽的改變的表達(dá)的情況。所述基因組DNA的修飾可能是通過遺傳轉(zhuǎn)化或其他的本領(lǐng)域已知的誘導(dǎo)突變的方法而進(jìn)行。所述“改變的表達(dá)”能與信使RNA和/或產(chǎn)生的多肽的量的增加或減少有關(guān)，并可能由于多聚核苷酸或產(chǎn)生的多肽的序列的改變而產(chǎn)生多肽的改變的活性。申請(qǐng)人:已經(jīng)鑒定了來源于蘋果分別編碼多肽(SEQ ID NO :1到4)的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO :5到8)，這些序列是能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子。申請(qǐng)人還鑒定了編碼SEQ ID NO 1的多肽變種(SEQ ID NO 9到21)的SEQ ID NO 5的多聚核苷酸變種(SEQ ID N0:22到47)。所述多聚核苷酸和多肽間關(guān)系的概要可在表3(序列概要)中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供了包含所述多聚核苷酸序列的遺傳構(gòu)建物、載體和植物。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明所述遺傳構(gòu)建物和載體的植物。本發(fā)明提供了相對(duì)于合適的對(duì)照植物其花青素色素生產(chǎn)發(fā)生改變的植物。本發(fā)明提供了具有增加的和減少的花青素色素生產(chǎn)的植物。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)所述植物的方法和選擇所述植物的方法。合適的對(duì)照植物可能包括相同物種和變種的未轉(zhuǎn)化植物或用對(duì)照構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的、相同物種和變種的植物。本發(fā)明組合物的用途包括具有增加的花青素著色水平的水果或其它植物部分的生產(chǎn)，例如，具有紅色果皮和或紅色果肉的蘋果的生產(chǎn)。本發(fā)明也提供通過選擇具有增加的花青素色素的植物細(xì)胞和植物選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和植物的方法，所述增加的花青素色素指明所述植物被轉(zhuǎn)化來表達(dá)本發(fā)明的多聚核苷酸或多肽。分離或生產(chǎn)多聚核苷酸的方法本發(fā)明的多聚核苷酸分子能通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的各種技術(shù)進(jìn)行分離。用例子進(jìn)行說明，這樣的多肽能通過使用在Mullis et al. , Eds. 1994 ThePolymerase Chain Reaction, Birkhauser中描述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(將其引入本文作為參考)進(jìn)行分離。如本文定義的，本發(fā)明的多肽能使用衍生自本發(fā)明的多聚核苷酸序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增。 分離本發(fā)明的多聚核苷酸的進(jìn)一步的方法包括具有本文創(chuàng)立的作為雜交探針的序列的多肽的全部或部分的使用。將標(biāo)記的多聚核苷酸探針同固定在諸如硝酸纖維素濾紙或尼龍膜的固體支持介質(zhì)上的多聚核苷酸進(jìn)行雜交的技術(shù)能用來篩選基因組或cDNA文庫(kù)。范例性的雜交和洗滌條件是在5. OX SSC、0. 5%十二烷基磺酸鈉、IX Denhardt’s溶液中于65V雜交20小時(shí)；在I. OX SSC、1% (w/v)十二烷基磺酸鈉溶液中洗滌(于55°C洗滌三次，每次20分鐘)，和在0.5 X SSC、1% (w/v)十二烷基磺酸鈉溶液中于60°C可選地洗滌一次(20分鐘)?？蛇x的進(jìn)一步的洗滌(20分鐘)能在0. IX SSC、1% (w/v)十二烷基磺酸鈉溶液中于60°C的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的多聚核苷酸片段可能通過諸如限制性內(nèi)切酶消化、寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增等本領(lǐng)域著名的技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。部分的多聚核苷酸序列可能以本領(lǐng)域著名的方法使用來鑒定相應(yīng)的全長(zhǎng)多聚核苷酸序列。這樣的方法包括基于PCR的方法、5’ RACE (Frohman MA, 1993，MethodsEnzymoI. 218:340-56)和基于雜交的方法、基于計(jì)算機(jī)/數(shù)據(jù)庫(kù)的方法。進(jìn)一步地，用例子進(jìn)行說明，使用基于已知區(qū)域的引物的反向PCR支持獲得位于本文公開的多聚核苷酸序列的兩端的未知序列(Triglia et al. , 1998, Nucleic Acids Res 16，8186,引入本文作為參考)。所述方法使用多個(gè)限制性酶來在基因的已知區(qū)域中產(chǎn)生合適的片段。所述片段然后通過分子內(nèi)連接進(jìn)行環(huán)化并用作PCR模板。分歧引物(divergent primers)從已知區(qū)域設(shè)計(jì)而來。為了完全地組裝成全長(zhǎng)的克隆，標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法能被使用(Sambrook et al. , Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring HarborPress, 1987)。當(dāng)從特定物種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，用衍生自該物種的序列轉(zhuǎn)化這樣的植物可能是有益地。所述的益處可能是改善公眾對(duì)在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物中的物種間轉(zhuǎn)化的關(guān)注。此外，當(dāng)基因的下調(diào)是所期望的結(jié)果時(shí)，利用同所述植物中的序列相同(或至少是高度相似的)的序列可能是必需的，對(duì)該基因而言，降低的表達(dá)是所期望的。因?yàn)檫@些以及其它的原因，能鑒定和分離在多個(gè)不同植物物種中的特定基因的直系同源物是可期望的。變種(包括直系同源物)可能通過所描述的方法進(jìn)行鑒定。鑒定變種的方法
物理方法變種多肽可能通過使用基于PCR的方法進(jìn)行鑒定(Mullis et al.，Eds. 1994 ThePolymerase Chain Reaction, Birkhauser)。典型地，用來通過PCR擴(kuò)增本發(fā)明的多聚核苷酸分子變種的引物的多聚核苷酸序列可能基于編碼相應(yīng)的氨基酸序列的保守區(qū)域的序列?？蛇x地，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的庫(kù)篩選方法可能被使用(Sambrook etal. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.Cold Spring HarborPress, 1987)。當(dāng)鑒定所述探針序列的變種時(shí)，相對(duì)于當(dāng)精確無誤的序列匹配被尋找時(shí)所需的條件，其雜交和/或洗滌的嚴(yán)格條件將典型地被降低。多肽變種也可能通過物理方法進(jìn)行鑒定，例如，通過使用抗本發(fā)明的多肽的抗體篩選表達(dá)文庫(kù)(Sambrook et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. ColdSpring Harbor Press, 1987)或在這樣的抗體的幫助下將多肽從天然來源中鑒定出?；谟?jì)算機(jī)的方法包括多聚核苷酸和多肽變種的本發(fā)明的變種序列也可能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的基于計(jì)算機(jī)的方法通過使用公眾域序列比對(duì)算法和序列相似性搜索工具來搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)(公眾域數(shù)據(jù)庫(kù)包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它)而進(jìn)行鑒定。參見例如，Nucleic Acids Res. 29: l-lOand 11-16，2001中在線資源的例子。相似性搜索檢索和比對(duì)針對(duì)同待分析序列相比較的序列(即查詢序列)。序列比較算法使用打分矩陣來為每一條比對(duì)序列賦予總體的分?jǐn)?shù)。用于鑒定序列數(shù)據(jù)庫(kù)中變種的范例性的程序族是包括BLASTN、BLASTP, BLASTX,tBLASTN 和 tBLASTX 的 BLAST 程序套件(版本 2. 2. 5 [2002 年 11 月])，公眾可從(ftp: //ftp.ncbi. nih. gov/blast/)或從美國(guó)馬里蘭州貝塞斯達(dá)市38A棟8N805房間的國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)獲取。NCBI服務(wù)器也提供使用所述程序來篩選大量公眾可得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)的工具。BLASTN比較核苷酸查詢序列和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。BLASTP比較氨基酸查詢序列和蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)。BLASTX比較在所有閱讀框中被翻譯的核苷酸查詢序列和蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)。tBLASTN比較蛋白查詢序列和在所有閱讀框中動(dòng)態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。tBLASTX比較核苷酸查詢序列的六讀碼框翻譯和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的六讀碼框翻譯。所述BLAST程序可能以默認(rèn)參數(shù)使用或所述參數(shù)可能按改進(jìn)篩選所需而改變。包括BLASTN、BLASTP和BLASTX的BLAST算法族的使用在出版物Altschul etal. ,NucleicAcids Res. 25:3389-3402，1997 中進(jìn)行了描述。被BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法產(chǎn)生的被被查詢序列產(chǎn)生的對(duì)一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)序列的“擊中序列數(shù)”(hits)比對(duì)和鑒定了序列的相似部分。擊中序列數(shù)以相似性的程度和序列重疊的長(zhǎng)度的順序排列。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)序列的擊中序列數(shù)通常代表了僅是被查詢序列的序列長(zhǎng)度的部分的重疊。BLASTN,BLASTP,BLASTX,tBLASTN 和 tBLASTX 算法也為比對(duì)產(chǎn)生“期望”(Expect)值。期望值(E)表明當(dāng)搜索含有隨機(jī)連續(xù)序列的相同大小的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)人們能“期望”隨機(jī)看到的擊中的數(shù)目。期望值用作決定所述對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的擊中是否表明真的相似性的顯著性閾值。例如，指定到多聚核苷酸擊中數(shù)的0. I的E值被解釋為意味著，在被篩選的數(shù)據(jù)庫(kù)大 小的數(shù)據(jù)庫(kù)中，人們可能期望看到具有簡(jiǎn)單隨機(jī)地相似分值的序列的被比對(duì)部分的0. I匹配。對(duì)于被比對(duì)和匹配部分具有0. 01或更低的E值的序列，通過使用所述BLASTN、BLASTP、BLASTX, tBLASTN或tBLASTX算法在那個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)隨機(jī)匹配的可能性是1%或更低。一組相關(guān)序列的多序列比對(duì)能用 CLUSTALW(Thompson, J. D. , Higgins, D. G. andGibson,T.J. (1994)CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penaltiesand weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc.u-strasbg. fr/BioInfo/Clustalff/Top. html)或 T-COFFEE (Cedric Notredame, DesmondG. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee:A novel method for fast and accurate multiplesequence alignment, J. Mol. Biol. (2000)302:205-217))或 PILEUP 進(jìn)行，這些算法使用漸進(jìn)(progressive)配對(duì)比對(duì)。(Feng and Doolittle, 1987，J. Mol. Evol. 25，351 )。模式識(shí)別軟件應(yīng)用可用于發(fā)現(xiàn)基序或標(biāo)記序列。例如，MEME(用于基序引出的多重Em, Multiple Em for Motif Elicitation)在一組序列中發(fā)現(xiàn)基序標(biāo)記序列，和MAST (基序比對(duì)和搜索工具，Motif Alignment and Search Tool)使用這些基序來鑒定查詢序列中 的相似或相同基序。MAST結(jié)果以具有適當(dāng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和發(fā)現(xiàn)的基序的可視概觀的系列比對(duì)的形式提供。MEME和MAST在圣地亞哥的加利福尼亞大學(xué)開發(fā)。PR0SITE (Bairoch and Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583;Hofmannetal.，1999，Nucleic Acids Res. 27，215)是鑒定從基因組或cDNA翻譯而來的未鑒定蛋白的功能的方法。PR0SITE數(shù)據(jù)庫(kù)(www. expasy. orR/prosite)含有生物學(xué)上重要的模式和輪廓并被設(shè)計(jì)以便它能同適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)工具共同使用來指定新的序列到已知的蛋白家族或來測(cè)定已知的結(jié)構(gòu)域在所述序列中存在(Falquet et al. , 2002, Nucleic AcidsRes. 30，235)。Prosearch是能用給定序列模式或標(biāo)記搜索SWISS-PR0T和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的工具。因?yàn)榫幋a能調(diào)控植物中色素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子的本發(fā)明的變種多聚核苷酸的功能，轉(zhuǎn)錄因子能被檢測(cè)調(diào)控已知花青素生物合成基因的表達(dá)(例如實(shí)施例4)的這個(gè)能力或能被檢測(cè)它們的調(diào)控色素生產(chǎn)的能力(例如實(shí)施例5和6)。分離多肽的方法包括變種多肽的本發(fā)明的多肽可能通過使用本領(lǐng)域著名的肽合成方法進(jìn)行制備，例如使用固相合成技術(shù)的定向肽合成(例如Stewart et al. , 1969, in Solid-PhasePeptide Synthesis, WH Freeman Co,加利福尼亞圣弗朗西斯科)或自動(dòng)化合成,例如使用應(yīng)用生物系統(tǒng)431A肽合成儀(加利福尼亞，福斯特市)。所述多肽的突變形式也可能在這樣的合成過程中生產(chǎn)。本發(fā)明的多肽和變種多肽也可能通過使用本領(lǐng)域著名的各種技術(shù)從天然來源中純化而來(例如，Deutscher, 1990，Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to ProteinPurification, X可選地，本發(fā)明的多肽和變種多肽可能在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)并按下面討論的方法從所述細(xì)胞中分離而來。生產(chǎn)構(gòu)建物和載體的方法本發(fā)明的遺傳構(gòu)建物包含一條或多條本發(fā)明的多聚核苷酸序列和/或編碼本發(fā)明的多肽的多聚核苷酸，并可能是對(duì)轉(zhuǎn)化有用的，例如，細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物或植物生物體。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建物要包括如本文定義的表達(dá)構(gòu)建物。
生產(chǎn)和使用遺傳構(gòu)建物和載體的方法在本領(lǐng)域中是公知的并通常在Sambrooket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed.Cold Spring HarborPress,1987;Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing, 1987)中進(jìn)行了描述。生產(chǎn)包含多聚核苷酸、構(gòu)建物或載體的宿主細(xì)胞的方法本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建物或載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可能衍生自，例如，細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物或植物生物體。包含本發(fā)明的諸如表達(dá)構(gòu)建物的遺傳構(gòu)建物的宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域著名的方法中對(duì)重組生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的是有用的(例如，Sambrook et al.，MolecularCloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987;Ausubel etal. , CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)。這樣的方法 可能涉及在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中在適于或有助于本發(fā)明的多肽的表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？赡軙?huì)可選地分泌到培養(yǎng)物中的表達(dá)的重組多肽可能然后被從培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物培養(yǎng)基中用本領(lǐng)域著名的方法分離(例如，Deutscher, Ed, 1990, Methods in Enzymology,Vol 182,Guide to Protein Purification)。生產(chǎn)包含構(gòu)建物和載體的植物細(xì)胞和植物的方法本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建物的植物細(xì)胞和被修飾來改變本發(fā)明的多聚核苷酸或多肽的表達(dá)的植物細(xì)胞。包含這樣的細(xì)胞的植物也形成了本發(fā)明的一個(gè)方面。在色素生產(chǎn)上發(fā)生改變的植物的生產(chǎn)可能通過本發(fā)明的方法而獲得。這樣的方法可能涉及用被設(shè)計(jì)來改變能調(diào)控在這樣的植物細(xì)胞和植物中的色素生產(chǎn)的的多聚核苷酸或多肽的表達(dá)的本發(fā)明的構(gòu)建物來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物。這樣的方法也包括用本發(fā)明的構(gòu)建物和一個(gè)或多個(gè)其它的設(shè)計(jì)來改變一個(gè)或更多個(gè)多肽或能調(diào)控在這樣的植物細(xì)胞和植物中的色素生產(chǎn)的多肽的表達(dá)的構(gòu)建物的組合來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物。用多肽轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物和其部分的方法在下述文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述Draper etal.,1988, Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory ManualBlackwell Sci.Pub. Oxford, p. 365;Potrykus and Spangenburg, 1995, Gene Transfer toPlants. Springer-Verlag,Berlin.;和 Gelvin et al. , 1993, Plant Molecular Biol.Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht。包括轉(zhuǎn)化技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物的綜述在Galun andBreiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, London 中提供。植物遺傳操作的方法大量植物轉(zhuǎn)化策略是可獲得的(例如，Birch, 1997，Ann Rev Plant Phys PlantMol Biol, 48,297).例如，在多聚核苷酸/多肽被正常表達(dá)時(shí)，策略可能被設(shè)計(jì)來增加多聚核苷酸/多肽在植物細(xì)胞、器官中和/或在特定發(fā)育階段的表達(dá)，或在多聚核苷酸/多肽不能正常被表達(dá)時(shí)，策略被設(shè)計(jì)來在細(xì)胞、組織、器官中和/或特定發(fā)育階段異常表達(dá)多聚核苷酸/多肽。表達(dá)的多聚核苷酸/多肽可能衍生自將被轉(zhuǎn)化的植物物種或可能衍生自不同的植物物種。轉(zhuǎn)化策略可能被設(shè)計(jì)來降低多聚核苷酸/多肽在被正常表達(dá)時(shí)在植物細(xì)胞、組織、器官或在特定發(fā)育階段的表達(dá)。這樣的策略稱為基因沉默策略。
在轉(zhuǎn)基因植物中用于基因表達(dá)的遺傳構(gòu)建物典型地包括驅(qū)動(dòng)一條或更多條克隆的多聚核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)子、終止子和檢測(cè)(detest)遺傳構(gòu)建物在被轉(zhuǎn)化植物中存在的選擇性標(biāo)記序列。適用于本發(fā)明構(gòu)建物的啟動(dòng)子在單子葉植物或雙子葉植物的細(xì)胞、組織或器官中是有作用的并包括細(xì)胞_、組織-和器官-特異的啟動(dòng)子、細(xì)胞周期特異的啟動(dòng)子、時(shí)間啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、在大多數(shù)植物組織中有活性的組成型啟動(dòng)子和重組啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的選擇將依賴于所期望的克隆的多聚核苷酸在時(shí)間和空間上的表達(dá)。所述啟動(dòng)子可能是那些同目標(biāo)轉(zhuǎn)基因正常相關(guān)的啟動(dòng)子，或衍生自 其它植物、病毒和植物病原性細(xì)菌和真菌的基因的啟動(dòng)子。在沒有不恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能通過使用包含本發(fā)明的多聚核苷酸序列的遺傳構(gòu)建物選擇適用于修飾和調(diào)控植物特性的啟動(dòng)子。組成型植物啟動(dòng)子的例子包括CaMV 35S啟動(dòng)子、膽脂堿合成酶啟動(dòng)子和章魚堿合成酶啟動(dòng)子和來自于玉米的UbiI啟動(dòng)子。在特定組織中有效并應(yīng)對(duì)內(nèi)部發(fā)育信號(hào)或外部無生命或有生命的應(yīng)激的植物啟動(dòng)子在科學(xué)文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述。范例性的啟動(dòng)子被進(jìn)行了描述，例如在WO 02/00894中，將其引入本文作為參考。在植物轉(zhuǎn)化遺傳構(gòu)建物中普遍使用的范例性的終止子包括，例如，花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S終止子、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶或章魚肉堿合成酶終止子、玉米(Zea mays)醇溶蛋白基因終止子、水稻(Oryza sativa) ADP葡糖焦磷酸化酶終止子和馬鈴薯(Solanum tuberosum) PI-II終止子。在植物轉(zhuǎn)化中普遍使用的選擇性標(biāo)記包括賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(phophotransferase) II基因(NPT II)、賦予壯觀霉素和鏈霉素抗性的aadA基因、賦予Ignite (AgrEvo)和 Basta (Hoechst)抗性的 phosphinothricin 乙酸基轉(zhuǎn)移酶(bar 基因)和賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)。包含可能用于植物和植物組織中啟動(dòng)子表達(dá)分析的報(bào)告基因(表達(dá)對(duì)于宿主而言是外來的、通常是酶活性和/或可視信號(hào)(例如熒光素酶、GUS、GFP)的活性的編碼序列)的遺傳構(gòu)建物的使用也是被考慮的。報(bào)告基因的文獻(xiàn)在Herrera-Estrellaet al. , 1993,Nature 303,209，和 Schrott, 1995，In: Gene Transfer toPlants (Potrykus, T. , Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berline, pp. 325-336 中進(jìn)行了綜述。基因沉默策略可能會(huì)聚焦于所述基因本身或影響被編碼的多肽的表達(dá)的調(diào)控元件。“調(diào)控元件”在本文中以其最廣泛可能的意思使用并包括同目標(biāo)基因相互作用的其它基因。設(shè)計(jì)來降低或沉默本發(fā)明的多聚核苷酸/多肽的表達(dá)的遺傳構(gòu)建物可能包括本發(fā)明多聚核苷酸的反義拷貝。在這樣的構(gòu)建物中，所述多聚核苷酸被以與啟動(dòng)子和終止子相關(guān)的反義方向進(jìn)行放置?！胺戳x”多聚核苷酸通過逆變所述多聚核苷酸的多聚核苷酸或片段以使產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物將對(duì)所述基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)而獲得，例如，5' GATCTA 3'(編碼鏈)3' CTAGAT 5'(反義鏈)3' CUAGAU 5' mRNA 5' GAUCUCG 3'反義 RNA為基因沉默設(shè)計(jì)的遺傳構(gòu)建物可能也包括反向重復(fù)序列?！聪蛑貜?fù)序列’是所述重復(fù)序列的第二個(gè)一半是在互補(bǔ)鏈內(nèi)重復(fù)的序列，例如，5' -GATCTA......TAGATC-3'3' -CTAGAT......ATCTAG-5'形成的轉(zhuǎn)錄物可能經(jīng)歷互補(bǔ)堿基配對(duì)來形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。通常在所述重復(fù)區(qū)域間的至少3-5堿基對(duì)的間隔區(qū)是允許發(fā)卡形成所必需的。另一種沉默方法涉及靶向miRNA的轉(zhuǎn)錄等價(jià)物的小反義RNA的使用(Llave etal.，2002，Science 297，2053)。這樣的相應(yīng)于本發(fā)明的多聚核苷酸的小反義RNA的使用是特別考慮的。如本文中所用，術(shù)語遺傳構(gòu)建物也包括小反義RNA和其它影響基因沉默的這樣的多肽。如本文定義的，用表達(dá)構(gòu)建物進(jìn)行的轉(zhuǎn)化可能也通過名為正義抑制的過程產(chǎn)生基因沉默(例如，Napoli et al. , 1990, Plant Cell 2, 279; de Carvalho Niebel etal.，1995，Plant Cell，7，347)。在某些情況下，正義抑制可能涉及全部或部分編碼序列的過表達(dá)但也可能涉及所述基因的諸如內(nèi)含子或5’或3’非翻譯區(qū)(UTR)的非編碼區(qū)的表達(dá)。嵌合的部分正義構(gòu)建物能用來協(xié)調(diào)沉默多個(gè)基因(Abbott et al.，2002，PlantPhysiol. 128(3) :844-53; Jones et al.，1998，Planta 204:499-505)。這樣的用來沉默本發(fā)明的多聚核苷酸的表達(dá)的正義抑制的使用也是被考慮的。遺傳構(gòu)建物中為基因沉默設(shè)計(jì)的多聚核苷酸插入物可能對(duì)應(yīng)于諸如啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子和/或5’或3’ UTR序列或相應(yīng)基因的編碼序列和/或非編碼序列。其它的基因沉默策略包括顯性負(fù)向途徑和核酶構(gòu)建物的使用(McIntyre, 1996, Transgenic Res, 5, 257)。轉(zhuǎn)錄前沉默可能通過所述基因本身或它的調(diào)控元件的突變而帶來。這樣的突變可能包括點(diǎn)突變、移碼、插入、刪除和替換。下述文獻(xiàn)是披露能用來遺傳轉(zhuǎn)化下述植物物種的遺傳轉(zhuǎn)化方案的代表性出版物水稻(Alam et al. , 1999, Plant Cell Rep. 18，572)、蘋果(Yao et al. , 1995, PlantCell Reports 14，407-412)、玉米(美國(guó)專利序列號(hào) Nos. 5，177，010 和 5，981，840)、小麥(Ortiz et al.，1996，Plant Cell R印 15，1996，877)、番茄(美國(guó)專利序列號(hào)No. 5，159，135)、馬鈴薯(Kumar et al. , 1996 Plant J. 9，821)、木薯(Li et al. , 1996Nat. Biotechnology 14，736)、萵苣(Michelmore et al. , 1987, Plant Cell Rep. 6，439)、煙草(Horsch et al.，1985，Science 227，1229)、棉花(美國(guó)專利序列號(hào) Nos. 5，846，797 和5，004，863)、草(美國(guó)專利 Nos. 5，187，073 和 6，020，539)、薄荷(Niu et al.，1998，PlantCell Rep. 17，165)、柑橘植物(Pena et al.，1995，Plant Sci. 104，183);葛縷子(Krens et al.，1997，Plant Cell Rep, 17，39)、香蕉(美國(guó)專利序列號(hào) No. 5，792，935)、大豆(美國(guó)專利 Nos. 5，416，011,5, 569，834,5, 824，877,5, 563，04455 和 5，968，830)、菠蘿(美國(guó)專利序列號(hào)No. 5，952，543)、白楊(美國(guó)專利No. 4，795，855)、普通單子葉植物(美國(guó)專利Nos. 5，591，616 和 6，037，522)、蕓苔(美國(guó)專利 Nos. 5，188，958,5, 463，174 和 5，750，871)、谷物(美國(guó)專利 No. 6，074，877)、梨(Matsuda et al.，2005)、李子(Ramesh et al.，2006、Song and Sink 2005、Gonzalez Padilla et al.，2003)、草莓(Oosumiet al.，2006、Foltaet al.，2006)、玫瑰(Li et al.，2003)和懸鉤子(Graham et al.，1995)。其它物種的轉(zhuǎn)化也被本發(fā)明所考慮。合適的方法和方案在科學(xué)文獻(xiàn)中可以獲得。本領(lǐng)域已知的多個(gè)進(jìn)一步的方法可能被用來改變本發(fā)明的核苷酸和/或多聚核苷酸的表達(dá)。這樣的方法包括但不限于Tilling (Till et al. , 2003, Methods MolBiol, 2%，205)、所謂的 “Deletagene” 技術(shù)(Li et al.，2001，Plant Journal 27(3), 235)和諸如合成的鋅指轉(zhuǎn)錄因子的人工轉(zhuǎn)錄因子的使用(例如，Jouvenot et al.，2003, GeneTherapy 10,513)。此外，祀向特定多肽的抗體或其片段也可能在植物中表達(dá)來調(diào)控該多肽的活性(Jobling et al.，2003，Nat. Biotechnol, 21 (1)，35)。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽途徑也可能被應(yīng)用。此外，同本發(fā)明的多肽相互作用的多肽可能通過諸如相位展示的技術(shù)(DyaxCorporation)進(jìn)行鑒定。這樣的相互作用的多肽可能在植物中表達(dá)或應(yīng)用到植物來影響本發(fā)明的多肽的活性。上述改變本發(fā)明的核苷酸和/或多肽的表達(dá)的每一種方法的使用都是 被特別考慮的。選擇植物的方法也提供了選擇具有改變的色素生產(chǎn)的植物的方法。這樣的方法涉及檢測(cè)植物中的本發(fā)明的多聚核苷酸或多肽的改變的表達(dá)。為了提高花青素含量，這樣的方法可能在改變的色素生產(chǎn)可能不必是可視的幼齡或早期發(fā)育階段來應(yīng)用來加快培育程序。諸如信使RNA的多聚核苷酸的表達(dá)被經(jīng)常用作相應(yīng)多肽表達(dá)的指示物。測(cè)定多聚核苷酸的表達(dá)的范例性的方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和斑點(diǎn)印記分析(Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold SpringHarbor Press, 1987)。因此，如本文定義的，本發(fā)明的多聚核苷酸或其部分在鑒定具有改變水平的花青素的植物的方法中是有用的探針或引物。本發(fā)明的多肽可能在設(shè)計(jì)來鑒定這樣的植物的雜交實(shí)驗(yàn)中用作探針或在基于PCR的實(shí)驗(yàn)中用作引物?？蛇x地，抗體可能被產(chǎn)生來抵抗本發(fā)明的多肽。產(chǎn)生和使用抗體的方法在本領(lǐng)域是標(biāo)準(zhǔn)的方法(參見例如Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow A Lane, Eds, ColdSpring Harbour Laboratory, 1998)。這樣的抗體可能被用在檢測(cè)調(diào)控植物花朵大小的多肽的改變的表達(dá)的方法中。這樣的方法可能包括ELISA (Kemeny, 1991, A PracticalGuide to ELISA, NY Pergamon Press)和Western分析(Towbin & Gordon, 1994, J ImmunolMethods, 72, 313)。這些分析多聚核苷酸或多肽表達(dá)和選擇具有改變的表達(dá)的植物的方法在設(shè)計(jì)來生產(chǎn)具有改變的色素生產(chǎn)的變種的傳統(tǒng)的培育程序中是有用的。植物本發(fā)明的植物可能被栽培并且被自交或同不同的植物植株進(jìn)行雜交并且產(chǎn)生的具有期望的表型特征的雜交體可能被鑒定。二或更多代植物可能被栽培來確保目標(biāo)表型特征是穩(wěn)定保持和遺傳的。從這樣的標(biāo)準(zhǔn)培育方法產(chǎn)生的植物也形成本發(fā)明的一個(gè)方面?，F(xiàn)在，本發(fā)明將參考下述非限制性實(shí)施例進(jìn)行解釋。實(shí)施例I :用于編碼調(diào)控色素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子的多聚核苷酸的分離的恰當(dāng)蘋果組織和發(fā)育階段的鑒定材料和方法實(shí)時(shí)(qPCR)表達(dá)分析蘋果在2003-2004年從春季(十月)經(jīng)過夏季到(三月)的蘋果季的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)從HortResearch果園的蘋果樹上(新西蘭納爾遜)進(jìn)行收集十月(盛花期后7天,DAFB)、^
月(40DAFB)、十二月(67DAFB)、一月(102DAFB)、二月(130DAFB)和三月(146DAFB)。RNA 被從所述果實(shí)(分別從相同的果樹而來的6個(gè)果實(shí)、皮和皮層)和2個(gè)基因型的葉片分離而來(改自Chang et al.，1993的方法)；白色果肉的商品化的家蘋果品種變種Sciros (太平洋玫瑰(Pacific Rose) ,衍生自噶拉和華麗蘋果間的雜交)和紅色果肉的家蘋果品種變種紅地，品種‘紅地’的自花授粉幼苗(‘狼河’(WolfRiver)和家蘋果變種Niedzwetzkyana的雜交)(Brooks and Olmo, 1972)。對(duì)于第一個(gè)發(fā)育水果時(shí)間點(diǎn)，十月(7DAFB),從皮層成功地切除果皮是不可能的并且來源于這個(gè)樣品的數(shù)據(jù)已經(jīng)被排除。在第一鏈cDNA合成(每一個(gè)樣品重復(fù)三次然后三次的結(jié)果被混合)前用DNase處理，然后按照廠商說明書使用寡dT進(jìn)行合成(Transcriptor, Roche Applied Science)。編碼蘋果花青素路徑酶和調(diào)控因子的基因通過在HortResearch EST數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性鑒定,并且，在可能的異型體的情況下，選擇按照表達(dá)輪廓和文庫(kù)組織進(jìn)行制備。相應(yīng)于這些基因的基因特定引物使用Vector NTI版本9. 0. 0 (www. invitroRen. com)按照一套嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計(jì),從而使通用反應(yīng)條件的應(yīng)用成為可能。為了檢查反應(yīng)的特異性，RT-PCR被按照廠商說明書進(jìn)行使用(Platinum Taq, Invitrogen)。每一對(duì)引物的序列和相關(guān)的登入號(hào)在下面的表I中補(bǔ)充顯示。表IDNA擴(kuò)增和分析使用LightCycler系統(tǒng)(Roche LightCycler I. 5)進(jìn)行。所有的
U I j；l'
坫閃名丨卜:|4引物IScqIDNO:)反丨士jl物(Scq IDNCh )
GGAGACAACTGGAaAAGGACT COACATTQATACTGGTGTCTr CN944824 MdCHS GGAA(Sl)CA (82)
GGGATAACCTCGCOGCCAAA GCATCCATGCCGCMAOCTACA 麵繩 MdC (S3)A_
TO0AAGCTTeTGAG0ACTG^eCTCCTCCGATGGCAAATCAAA
CN491664 MdFSH
GT (ES)GA (86)
GATAGGGTTTGAGTTCAAGTATCTCCTCAGCA0CCTCAGT1T
AY227729 MdDFR (明賣_
CCAAGTGAAGCGGGTTGTGCT CAAAGCAGGCGGACAGGAGT AFl 17269 MdLDOX /om一，…
(89)AGC (90)
CCACCGCCCTTCCAAACACTCT CACCCTTATGTTACGCOQCAT
AFl 17267 MdUFGT
(91)QT (92)
TGCCTGQACTCGAGAGGAAGA CCTGITTCCCAAAAGCCTGTG MdMYBlO …—
CA <93)AA (94)
ATGTTnTGCGACGGAGAGAGCTAGQCGAGTGAACACCATAC
MdbHLH33 .,…
A (95)ATTAAAGG (96)
AGQGTTCCAQAAGACCACGCCTTGGATGTGGAGTGCTCGGAQ
CN934367 MdbHLH3A
T (97)A (98)
TGACCQAATGAGCAAGGAAATTACTCAGCTTTGGCAATCCAC CN938023 MdA ctin …一 MA " m、
TACT (99)ATC (100)反應(yīng)均按照廠商方法用LightCycler FastStart SYBR Green Master MixCRocheApplied Science)進(jìn)行。反應(yīng)通過使用2 u I 5x Master Mix、0. 5 u M的每種引物、I u I稀釋的cDNA和無核酶的水(RocheApplied Science)并使終體積為IOu I進(jìn)行，同時(shí)進(jìn)行三份反應(yīng)。在每一個(gè)反應(yīng)中均包括陰性水對(duì)照。下述熱循環(huán)被用于所有的qPCR反應(yīng)95°C預(yù)孵育5分鐘，然后95°C (5秒)、60°C (5秒)和72°C (10秒)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在每一個(gè)退火步驟的末期測(cè)量熒光。擴(kuò)增后，用在65°C到95°C熔解時(shí)獲取的連續(xù)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行熔解曲線分析。用LightCycler軟件版本4分析原始數(shù)據(jù)并且表達(dá)用具有標(biāo)稱值I的作為校準(zhǔn)的太平洋玫瑰蘋果葉片樣品來標(biāo)準(zhǔn)化到家蘋果肌動(dòng)蛋白(MdActin，登入號(hào)CN938023)。對(duì)于每一個(gè)基因，標(biāo)準(zhǔn)曲線用cDNA系列稀釋產(chǎn)生并且產(chǎn)生的PCR效率計(jì)算結(jié)果(位于I. 839到
I.945間)被輸入到相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)分析中。 結(jié)果 生物合成酶的qPCR表達(dá)分析為了鑒定水果發(fā)育中花青素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是最大的階段，主要的生物合成基因的表達(dá)分析被進(jìn)行。在太平洋玫瑰蘋果和紅地蘋果間的編碼花青素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄物水平的比較顯示了驚人的不同。在實(shí)驗(yàn)的代表所述路徑中大多數(shù)酶步驟的所有基因中，與在太平洋玫瑰蘋果中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄水平相比，紅地蘋果的轉(zhuǎn)錄水平在水果發(fā)育的所有階段均顯示了顯著的提高(圖3)。具有指明最高的轉(zhuǎn)錄物水平是在一月的時(shí)間點(diǎn)的一般模式的紅地蘋果生物合成基因的轉(zhuǎn)錄物豐度在果皮和皮層的整個(gè)水果發(fā)育階段均被增強(qiáng)。這個(gè)格局模擬了在組織取樣時(shí)被觀測(cè)到的在發(fā)育早期(40DAFB)及然后再一次在仲夏(102DAFB)被觀測(cè)到的具有最強(qiáng)烈著色的的著色程度，該水平然后被保持到夏末水果成熟時(shí)(圖3b)。在水果發(fā)育過程中通常具有下降的表達(dá)的太平洋玫瑰蘋果皮層組織中，所有花青素生物合成基因的均具有相對(duì)低的轉(zhuǎn)錄物水平。中等的活性在果皮中觀察到，具有同水果成熟過程中的增強(qiáng)的著色水平并發(fā)的在發(fā)育中途的在102DAFB處的表達(dá)峰。在兩種變種的葉片中的表達(dá)水平是明顯的但相對(duì)的低且紅地蘋果和太平洋玫瑰蘋果間的區(qū)別不明顯?；ㄇ嗨厣锖铣擅皋D(zhuǎn)錄物水平的qPCR分析結(jié)果被分析來測(cè)定相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子分離的最適組織/時(shí)間點(diǎn)。我們選擇顯示了最高的花青素生物合成基因表達(dá)水平的來源于紅地蘋果皮層的組織。實(shí)施例2 :編碼潛在調(diào)控蘋果中色素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子的多聚核苷酸的分離PCR通過使用來源于紅地(一月時(shí)間點(diǎn))皮層樣品的cDNA和在基于各種物種的花青素調(diào)控因子的序列的R2R3結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物(具有32倍的簡(jiǎn)并性)進(jìn)行。各種編碼R2R3MYB區(qū)域的cDNAs被獲得。來源于測(cè)序數(shù)據(jù)的結(jié)果揭示，通過使用5’ RACE(GeneRacer, Invitrogen)具有同花青素調(diào)控因子和全長(zhǎng)序列的高度同一11"生的一種cDNA被獲得。MdMYBlO cDNA的完整序列由重疊片段編譯而來。為了比較來源于紅地蘋果的轉(zhuǎn)錄物，全長(zhǎng)的cDNAs隨后被從家蘋果變種太平洋玫瑰蘋果和史密斯祖母(Granny Smith)蘋果分離而來。MdMYBll (亞組 IlMYB) (DQ074463)(根據(jù) Stracke et al. 2001)也用相同的過程進(jìn)行分離和測(cè)序。其它的候選轉(zhuǎn)錄因子從HortResearch EST標(biāo)本分離而來擬南芥TT2的蘋果同族體MdMYB9 (Nesi et al.，2001，AJ299452)和具有同已知花青素調(diào)控因子很少序列同源性的蘋果MYB MdMYB80先前在其它物種中的研究已經(jīng)表明，亞組10MYB可能是著色的關(guān)鍵決定因素。在公眾可得的蘋果EST數(shù)據(jù)庫(kù)中(在2005年8月時(shí)具有185，000種核苷酸序列)，經(jīng)過序列同源性比較，沒有顯示出同擬南芥PAPl和來源于其它物種的亞組10MYB高度同源性的MYB TF、被發(fā)現(xiàn)。在PCR后克隆的cDNAs的重疊序列比對(duì)顯示，最好的候選者M(jìn)dMYBlO同其它MYBTFs在R2R3區(qū)域并且具體地，同來源于其它物種的花青素調(diào)控因子分享了高度的同源性(圖I)。MdMYBlO同擬南芥亞組10MYB、PAPl緊密相關(guān)，它們?cè)赗2R3結(jié)合區(qū)域具有77%的氨基酸同一性并整體具有58%的氨基酸同一性。對(duì)于擬南芥PAP2，這些氨基酸同一性百分比分別為75%和57%，同時(shí)對(duì)于其它物種，整體的同一性數(shù)字如下牽?；ˋN260%，番茄ANT157%，玉米 C158% 和玉米 P 26%。所有這些MYB TFs均具有同bHLHs特定相互作用的氨基酸殘基(Grotewold etal.，2000)。因此，這些共同因子的候選者均選自HortResearch EST數(shù)據(jù)庫(kù)。在具有組成型bHLH型TF的巨大系統(tǒng)發(fā)育家族中，似乎被涉及到類黃酮生物合成調(diào)控中的命名為IIIf的更小的進(jìn)化枝(Heim et al, 2003)是存在的。在這個(gè)進(jìn)化枝內(nèi)，兩個(gè)來源于HortResearch
EST數(shù)據(jù)庫(kù)的蘋果TFs集成簇(數(shù)據(jù)未顯示)。這些均被全長(zhǎng)測(cè)序并給予識(shí)別符MdbHLH3(CN934367)(擬南芥TT8基因的假定同源物)和MdbHLH33 (Delila的假定同源物)(來源于金魚草，Goodrich et al. , 1992)。種系發(fā)生蘋果EST序列用載體、接口和低質(zhì)量序列區(qū)域修飾并被上傳到Vector NTI版本9. O. 0(www. invitrogen. com)0 EST 聚族相(EST clustering phase)通過使用 Vector NTIAlignX程序進(jìn)行。比對(duì)然后以MSF格式文檔被輸出到GeneDoc版本2. 6. 002(http://www.psc. edu/biomed/genedoc/)中。通過在CLUSTALX (vl. 81)中使用默認(rèn)設(shè)置重新排列輸出的文檔，進(jìn)化樹被產(chǎn)生(Thompson et al，1997)。使用PHYLIP軟件包進(jìn)行種系發(fā)生分析(Felsenstein, 1993)。Tree View (v. I. 6. 5)被用來展示產(chǎn)生的進(jìn)化樹(Page, 1996)或通過使用 MEGA 版本 2. I 產(chǎn)生環(huán)狀進(jìn)化樹(circular trees) (Kumar et al, 2001 )0實(shí)施例3 =MdMyblO變種的鑒定從全部為薔薇科物種的家蘋果、野蘋果(Ms，歐洲山楂果)、西洋梨(Pc，梨)、沙梨(Ppy梨，Nashi),白梨(Pb，梨，鴨梨)、榲梓(Co，榲梓)、中國(guó)李(Ps，日本李，洋李)、紅葉李(Pcf，櫻桃李)、碧桃(Ppr，桃)、枇杷(Ei，枇杷)、扁桃(Pd，杏)、歐洲甜櫻桃(Pav，甜櫻桃)、西洋木瓜(Mg，歐楂)、歐洲李(Pdm，普通李)、復(fù)盆子(Ri，紅樹莓)、山杏(par，杏)和烏荊子李(Pi，西洋李子)中收集組織。使用DNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN,目錄號(hào)69104)按照廠商指導(dǎo)從每一種物種的葉片抽提基因組DNA (gDNA)，砂梨(Ppy梨，Nashi )和白梨(Pb，梨，鴨梨)除外，它們的基因組DNA從水果果皮中分離。使用在下面的表2中顯示的引物的組合進(jìn)行對(duì)來源于上述物種的gDNA的PCR(通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù))。表權(quán)利要求
1.一種分離的多聚核苷酸,其選自 a)編碼具有同SEQID NO :I的氨基酸序列至少69%同一性的多肽的序列，其中％同一性通過全長(zhǎng)的所述氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算，其中所述多肽是能上調(diào)植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子；和 b)a)的序列的互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的多聚核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列選自SEQIDNO :1,9-17 和 19-21。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的多聚核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列選自SEQIDNO :1、15、16、18 或 19。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的多聚核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列選自SEQIDNO :1 和 15。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的多聚核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO 1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的多聚核苷酸，其中在a)中的序列如SEQID NO 5所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的多聚核苷酸，其中在a)中的序列是如SEQID N0:5所示的序列的編碼序列。
8.一種分離的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸的序列如SEQ ID N0:5所示。
9.一種分離的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸具有SEQ ID NO :5所示序列的編碼序列。
10.一種分離的多聚核苷酸，其選自 a)編碼具有同SEQID NO :I的氨基酸序列至少69%同一性的多肽的序列，其中％同一性通過全長(zhǎng)的所述氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算，并且其中所述多肽是能上調(diào)在花青素生物合成途徑中的基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子；和 b)a)的序列的互補(bǔ)序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的分離的多聚核苷酸，其中多肽的氨基酸序列選自SEQID NO U9-17 和 19-21。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的多聚核苷酸，其中將被調(diào)控的基因編碼二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11的多聚核苷酸，其中將被調(diào)控的基因編碼查耳酮合成酶(CHS)0
14.一種分離的多聚核苷酸,其選自 a)編碼具有SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽變體的序列，其中所述多肽變體是能上調(diào)植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，并且其中所述多肽變體包含SEQ ID NO=IOl的序列；和 b)a)的序列的互補(bǔ)序列。
15.—種分離的多肽,其選自 a)具有同SEQID NO :I的氨基酸序列至少69%同一性的序列，其中％同一性通過全長(zhǎng)的所述氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算，其中所述多肽是能上調(diào)植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，和 b)a)的序列的互補(bǔ)序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的分離的多肽，其中所述多肽具有選自SEQID N0:l、9-17、和19-21的序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的分離的多肽，其中在a)中的序列如SEQID NO 1所示。
18.—種編碼權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的多肽的分離的多聚核苷酸。
19.一種抗權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的多肽的抗體。
20.—種分離的多聚核苷酸,其選自 a)能夠在65°C下在0.2 X SSC、0. 1%SDS中與編碼具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸雜交的核酸序列，其中所述核酸序列編碼能上調(diào)植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子；和 b)a)的核酸序列的互補(bǔ)序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的分離的多聚核苷酸，其中在a)中的核酸序列具有選自SEQIDNO :5,22-47 和 102 的序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的分離的多聚核苷酸，其中在a)中的核酸序列具有選自SEQIDNO :5、34-37、40-23 和 102 的序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的分離的多聚核苷酸，其中在a)中的核酸序列具有選自SEQIDNO :5、34、35 和 102 的序列。
24.包含權(quán)利要求1-14、18、和20-23的任一項(xiàng)的多聚核苷酸的遺傳構(gòu)建物。
25.包含權(quán)利要求24的遺傳構(gòu)建物的載體。
26.包含權(quán)利要求24的遺傳構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。
27.被遺傳修飾來表達(dá)權(quán)利要求1-14、18和20-23的任一項(xiàng)的多聚核苷酸的宿主細(xì)胞。
28.包含權(quán)利要求24的遺傳構(gòu)建物的植物細(xì)胞。
29.被遺傳修飾來表達(dá)權(quán)利要求1-14、18和20-23的任一項(xiàng)的多聚核苷酸的植物細(xì)胞。
30.包含權(quán)利要求28或29的植物細(xì)胞的植物。
31.一種生產(chǎn)權(quán)利要求15-17的任一項(xiàng)的多肽的方法,所述方法包含培養(yǎng)包含權(quán)利要求24的遺傳構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。
32.—種生產(chǎn)具有改變的花青素生產(chǎn)的植物細(xì)胞或植物的方法，所述方法包含用遺傳構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物的步驟，所述遺傳構(gòu)建物包括 a)至少一種編碼權(quán)利要求15-17的任一項(xiàng)的多肽的多聚核苷酸； b)至少一種包含a)的多聚核苷酸的至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段的多聚核苷酸；或 c)至少一種包含a)的多聚核苷酸的至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的互補(bǔ)序列的多聚核苷酸。
33.一種生產(chǎn)具有改變的花青素生產(chǎn)的植物細(xì)胞或植物的方法，所述方法包含用遺傳構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物的步驟，所述遺傳構(gòu)建物包括 a)至少一種權(quán)利要求1-14、18和20-23的任一項(xiàng)的多聚核苷酸； b)至少一種包含a)的多聚核苷酸的至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段的多聚核苷酸，或 c)至少一種包含a)的多聚核苷酸的至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的互補(bǔ)序列的多聚核苷酸， d)至少一種能在嚴(yán)格條件下同a)或b)的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。
34.一種通過權(quán)利要求32或33的方法生產(chǎn)的植物。
35.一種選擇花青素生產(chǎn)發(fā)生改變的植物的方法，所述方法包含檢測(cè)植物的如權(quán)利要求1-14、18和20-23的任一項(xiàng)的多聚核苷酸的改變的表達(dá)。
36.一種選擇花青素生產(chǎn)發(fā)生改變的植物的方法，所述方法包含檢測(cè)植物的如權(quán)利要求15-17的任一項(xiàng)的多肽的改變的表達(dá)。
37.一種選擇已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物的方法，所述方法包含步驟 a)用權(quán)利要求1-14、18和20-23的任一項(xiàng)的編碼能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的多肽的多聚核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物； b)在植物細(xì)胞或植物中表達(dá)所述多肽；和 c)選擇相對(duì)于其他植物細(xì)胞或植物而言具有增加的花青素著色的植物細(xì)胞或植物，其中所述增加的花青素著色表明所述植物細(xì)胞或植物已經(jīng)被轉(zhuǎn)化。
38.一種被權(quán)利要求35-37的任一項(xiàng)的方法選擇的植物。
39.一種根據(jù)權(quán)利要求30、34和38的任一項(xiàng)的植物的植物部分、繁殖體、后代或種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的新轉(zhuǎn)錄因子的多聚核苷酸和被編碼的能調(diào)控植物中花青素生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明也涉及包含所述多聚核苷酸的構(gòu)建物和載體，和宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞和用所述多聚核苷酸、構(gòu)建物和載體轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)具有改變的花青素生產(chǎn)的植物的方法和通過該方法獲得的植物。
文檔編號(hào)C07K16/16GK102703470SQ20121014733
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2006年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者A·阿蘭, R·埃斯普利, R·海倫斯 申請(qǐng)人:新西蘭植物和食品研究院有限公司