專利名稱：一種乳清蛋白降膽固醇肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳清蛋白降膽固醇肽及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及的是一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法以及分離純化技術(shù)。
背景技術(shù)：
隨著人們生活的日益改善，各種富貴病呈現(xiàn)遞增趨勢，就膽固醇而言，高膽固醇是對(duì)人類健康危害極大的一種慢性疾病，醫(yī)藥業(yè)人工合成的藥物可能會(huì)產(chǎn)生某些副作用，而從蛋白酶解液中提取的降膽固醇肽安全性極高，無毒副作用。其優(yōu)勢在于對(duì)于膽固醇值正常的人，沒有降低膽固醇的作用，而對(duì)于膽固醇值高的人具有降低膽固醇的作用；對(duì)膽固醇值正常的人，在食用高膽固醇含量的蛋、肉、動(dòng)物內(nèi)臟等食品時(shí)，也有防止血清膽固醇值升高的作用；在總膽固醇中，乳清蛋白源降膽固醇肽所降低的膽固醇是對(duì)人體有害的低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)，它不降低對(duì)人體有益的高密度脂蛋白(HDL)的數(shù) 值，除降膽固醇功能外，往往同時(shí)具有免疫促進(jìn)、抗凝血、易消化吸收、抗腫瘤的功能，而且這種肽是經(jīng)食用級(jí)酶在溫和條件下獲得的，易作為功能因子添加到各類食品中，有著良好的市場前景。Nagaoka. S通過小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，牛乳清蛋白源生物活性肽比大豆蛋白或酪蛋白具有更強(qiáng)的降低血液膽固醇的活性，并從乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液中成功地分離出一種五肽IIAGL F(71-75),據(jù)目前已有的相關(guān)文獻(xiàn)可知，乳清蛋白降膽固醇肽的分子量主要集中在2000u左右。本發(fā)明采用胰蛋白酶水解，利用其專一性切割特點(diǎn)，尤其對(duì)精氨酸、賴氨酸的羧基端肽鍵有強(qiáng)切割專一性來定點(diǎn)酶解乳清蛋白，制備乳清蛋白水解液，據(jù)模擬人體胃腸道試驗(yàn)研究表明胰蛋白酶較其他酶類的水解產(chǎn)物在人體中的穩(wěn)定性更強(qiáng)。并采用了多級(jí)色譜對(duì)水解液進(jìn)行分離純化，比以往的單一分離得到的多肽純度和抑制率更高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法。本發(fā)明所使用的乳清蛋白粉是脫鹽乳清粉，其蛋白質(zhì)含量不少于12. 7%，灰分低于
5.6%，乳糖含量為總干物質(zhì)的80%左右。本發(fā)明制備乳清蛋白降膽固醇肽的方法，其步驟如下
(1)用胰蛋白酶水解乳清蛋白粉；
(2)水解液(多肽)離心，取上清液，冷凍干燥，得到粗多肽；
(3)將水解液(多肽)經(jīng)離子交換樹脂脫鹽處理，進(jìn)而純化精制；
(4)用凝膠過濾色譜(S^)HadexG-15)對(duì)水解的肽進(jìn)行分離純化；
(5)使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對(duì)步驟(4)中得到的HMG-CoA還原酶抑制率高的洗脫組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。所述步驟(I)中，乳清蛋白粉以脫鹽乳清蛋白粉為原料，按照底物質(zhì)量濃度5%將其水化，65°C水浴加熱20 min，使乳清蛋白變性，冷卻至40°C，調(diào)至pH為8. 0，E/S (酶與底物比)為0. 06，水解時(shí)間為6h。所述步驟(2)中，酶解結(jié)束后加入適量HCl調(diào)制pH=4. 6左右，使未水解的蛋白質(zhì)沉淀，90°C保持10分鐘滅酶活，然后冷卻至室溫在4500r/min離心，取上清液，冷凍干燥得多肽粗制品。所述步驟(3)中，取(2)的冷凍干燥的粗肽配成50mg/mL的多肽溶液，用離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽，在流速為45ml/h條件下，乳清蛋白水解液總的氮回收率為80%以上，脫鹽率為80%以上，并且脫鹽前后HMG-CoA還原酶的抑制率無影響。所述步驟(4)中，將水解的多肽溶液利用SepHadex G-15進(jìn)行降膽固醇肽的分離，洗脫液0. Olmol/LHCl溶液，流速65ml/h，檢測波長220nm，上樣量450mg，得到吸收組分峰，通過測HMG-CoA還原酶的抑制率，收集抑制率高的組分。 所述步驟(5)中，取(4)中抑制率較高的組分用反相高效液相色譜(RP -HPLC)進(jìn)一步進(jìn)行分離純化，色譜柱C18色譜柱，緩沖液0. 15%三氟乙酸溶液，檢測波長220-280nm，洗脫方式梯度洗脫，流速lml/h，收集HMG-CoA還原酶抑制率高組分的洗脫峰，進(jìn)行冷凍干燥，得粉末狀乳清蛋白降膽固醇肽。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)
(1)所選原料本身已為脫鹽乳清粉，使后續(xù)的離子交換樹脂脫鹽得到的乳清蛋白肽更加精制；
(2)本發(fā)明制備的乳清蛋白降膽固醇肽經(jīng)過離子交換樹脂、凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜等多級(jí)色譜進(jìn)行分離純化使降膽固醇肽的純度大大提高，其HMG-CoA還原酶抑制率可高達(dá)百分之二十以上；
(3)本發(fā)明采用凝膠色譜進(jìn)行降膽固醇肽的分離純化時(shí)選擇0.01mol/L的HCl溶液作為洗脫液，與傳統(tǒng)的鹽緩沖溶液相比，其優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)在洗脫樣品中帶入其它鹽離子，消除了某些帶電離子與SepHadex凝膠引起的相互作用，也不會(huì)破壞肽段的生理活性，而且HCl易揮發(fā)，因此在洗脫液蒸發(fā)濃縮的同時(shí)，即可被除去；
(4)水解所用蛋白酶為胰蛋白酶，其具有專一性切割特點(diǎn)，能獲得我所需要的理想肽段，并且在人體模擬胃腸道時(shí)其使降膽固醇肽穩(wěn)定性較其它酶類更具優(yōu)勢。具體實(shí)驗(yàn)方式 實(shí)例I
原料為脫鹽乳清粉，在0-4°C下貯存。將乳清蛋白粉按5%進(jìn)行水化，在65 °C保持20分鐘使乳清蛋白變性，然后降至40°C，調(diào)pH為8. 0，按酶與底物質(zhì)量濃度比為0. 06加入胰蛋白酶后在磁力攪拌器下進(jìn)行水解，時(shí)間為6h，在90°C下保持IOmin滅酶活，冷卻后在4500r/min離心，將上清液進(jìn)行冷凍干燥得到乳清蛋白多肽粗制品，取乳清蛋白粗制肽配成10mg/ml的多肽溶液，然后以45ml/h的流速進(jìn)離子交換樹脂柱，收集流出液，將流出液通過SepHadex G_15進(jìn)行分離純化,所用洗脫液為0. 0lmol/L的HCl，收集到的流出液應(yīng)用分光光度法進(jìn)行HMG-CoA還原酶抑制率的測定，從中選出抑制率最高的洗脫峰進(jìn)入下一步反相高效液相色譜進(jìn)行分離純化，所用的緩沖溶液為0. 15%三氟乙酸溶液，得到不同的洗脫峰，同上進(jìn)行抑制率測定，收集抑制率最高的洗脫峰組分冷凍干燥得降膽固醇肽產(chǎn)品。上述SepHadex G-15分離得到的乳清蛋白降膽固醇肽HMG-CoA還原酶抑制率的測定，如表I所示
權(quán)利要求
1.一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，按照如下步驟完成 (1)用胰蛋白酶水解乳清蛋白粉； (2)將(I)中得到的水解液進(jìn)行離心，取上清液，冷凍干燥，得到粗多肽冷凍干燥； (3)將水解液(多肽)經(jīng)離子交換樹脂脫鹽處理，進(jìn)而純化精制； (4)用凝膠過濾色譜(S^)HadexG-15)對(duì)水解的肽進(jìn)行分離純化； (5)使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對(duì)步驟(4)中得到的HMG-CoA還原酶抑制率高的洗脫組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，其特征是步驟(I)中乳清蛋白采用的是脫鹽乳清粉，其蛋白質(zhì)含量不少于12. 7%，灰分低于5. 6%，乳糖含量為總干物質(zhì)的80%左右，水解條件E/S為O. 05 O. 06，ΡΗ=8. 0 9· 0，時(shí)間為6 8h，溫度37 40°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，其特征是步驟(I)中得到的多肽水解液在90°C滅酶IOmin,4500r/min下離心IOmin,保留上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，其特征是將步驟(2)的冷凍干燥的粗肽配成50mg/mL的多肽溶液，用離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽，此過程只是減少水解液中鹽的含量，在流速為45ml/h條件下，乳清蛋白水解液總的氮回收率為80%以上，脫鹽率為80%以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，其特征是將水解的多肽溶液利用SepHadex G_15進(jìn)行降膽固醇肽的初步分離，收集流出液，采用分光光度法對(duì)其HMG-CoA還原酶抑制率進(jìn)行測定，收集第二組分洗脫峰進(jìn)行下一個(gè)反相高效液相色譜進(jìn)一步進(jìn)行分離純化，收集第四組分洗脫峰，進(jìn)行冷凍干燥，得粉末狀乳清蛋白降膽固醇肽。
全文摘要
本發(fā)明旨在水解乳清蛋白，研究其水解機(jī)制以及分離純化技術(shù)，以制備一種乳清蛋白降膽固醇肽。該制備水解用具有專一切割性的胰蛋白酶，獲得所需肽段優(yōu)勢更強(qiáng)。采用多級(jí)色譜進(jìn)行分離純化，所得組分純度以及HMG-CoA還原酶抑制率更高，在凝膠過濾時(shí)所用洗脫液為HCl，與以往的鹽類洗脫液相比，消除了某些帶電離子與SepHadex凝膠引起的相互作用，也不會(huì)破壞肽段的生理活性，而且HCl易揮發(fā)，因此在洗脫液蒸發(fā)濃縮的同時(shí)，即可被除去。本發(fā)明所得產(chǎn)品具有安全性極高，無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，易作為功能因子添加到各類食品中，有著良好的市場前景，且其純度、抑制率均達(dá)到相當(dāng)高要求，可用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。
文檔編號(hào)C07K1/20GK102816822SQ201210336978
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者李曉東, 張金鳳, 馬麗媛, 王妍 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)