用于預(yù)測(cè)、檢測(cè)和減少涉及免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的測(cè)定法中的非特異性蛋白干擾的技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供，并且在某些具體但非限制性的方面中涉及：測(cè)定法，所述測(cè)定法可以用于預(yù)測(cè)給定的ISV是否遭受如本文所述的蛋白干擾和/或在所述測(cè)定法(如例如在ADA免疫測(cè)定法)中產(chǎn)生（非特異性）信號(hào)。所述預(yù)測(cè)性測(cè)定法可以例如用于測(cè)試給定的ISV是否可能具有產(chǎn)生所述蛋白干擾和/或所述信號(hào)的傾向；用于選擇不易遭受或較不容易遭受所述蛋白干擾或產(chǎn)生所述信號(hào)的ISV’s；作為這樣的測(cè)定法或測(cè)試，其可以用于測(cè)試對(duì)ISV的某些修飾是否(完全或部分)減少其產(chǎn)生這樣的干擾或這樣的信號(hào)的傾向；和/或作為這樣的測(cè)定法或測(cè)試，其可以用于指導(dǎo)ISV的修飾或改進(jìn)從而減少其產(chǎn)生所述蛋白干擾或信號(hào)的傾向；-方法，所述方法用于修飾和/或改進(jìn)ISV’s從而消除或減少其產(chǎn)生所述蛋白干擾或所述信號(hào)的傾向；-可以引入ISV的修飾，其消除或減少所述ISV產(chǎn)生所述蛋白干擾或所述信號(hào)的傾向；-被特異性選擇(例如，使用本文所述的測(cè)定法)從而不具有或具有較低/減小的產(chǎn)生所述蛋白干擾或所述信號(hào)的傾向的ISV’s；-被修飾和/或改進(jìn)的ISV’s，其不具有或具有較低/減小的產(chǎn)生所述蛋白干擾或所述信號(hào)的傾向。
【專利說(shuō)明】用于預(yù)測(cè)、檢測(cè)和減少涉及免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的測(cè) 定法中的非特異性蛋白干擾的技術(shù)
[0001] 本發(fā)明涉及免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域領(lǐng)域。
[0002] 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或"ISV"在本文中通常定義為這樣的氨基酸序列，其
[0003] -包含免疫球蛋白折疊或在適合的條件下（如生理?xiàng)l件下）能夠形成免疫球蛋白 折疊（即通過(guò)折疊），即從而形成免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域（如，例如，VH，VL或VHH結(jié)構(gòu)域）；
[0004] 和
[0005] -形成（或在這樣適合的條件下能夠形成）免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，其包含功能 性抗原結(jié)合位點(diǎn)（在其不需要與另一個(gè)免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域相互作用（如VH-VL相互作 用）以形成功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的意義上）。
[0006] 本領(lǐng)域目前已知的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的一些實(shí)例是VHH's和/或（其它） 納米抗體，dAb' s和（單）結(jié)構(gòu)域抗體。在這些之中，到提交本申請(qǐng)之日時(shí)，各種納米抗體 處于I期和II期臨床試驗(yàn)中。這使得獲得可靠的測(cè)定法變得重要，所述測(cè)定法用于分析來(lái) 自用ISV' s治療的人（如臨床試驗(yàn)受試者，和在所述ISV' s上市后，用所述ISV' s治療的 患者）的生物樣品。
[0007] 這不僅對(duì)于管理目的是重要的，而且對(duì)于用生物藥物治療患者也是重要的，因?yàn)?開(kāi)出所述治療處方的臨床醫(yī)生也希望獲得監(jiān)測(cè)治療的各個(gè)方面的可靠測(cè)定法。
[0008] 例如，在生物藥物分子的臨床開(kāi)發(fā)中，重要的是評(píng)估它們的免疫原潛力，以及具體 地它們可以激發(fā)所謂"抗-藥物抗體"或"ADA's"的程度。這可以使用所謂的"抗-藥物抗體" 或"ADA's"(免疫測(cè)定法)進(jìn)行測(cè)定（見(jiàn)例如Shankar等的綜述，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(藥物和生物醫(yī)學(xué)分析雜志），48(2008), 1267-1281;以及 Mire-Sluis 等，J. Immunol. Meth. 289 (2004)，1-16; Peng 等，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(藥物和生物醫(yī)學(xué)分析雜志），54, (2011)，629-635;和 Loyet 等，J. Immunol. Meth. 345 (2009)，17-28。所述ADA測(cè)定法和進(jìn)行該測(cè)定法的方法是藥學(xué)領(lǐng) 域的標(biāo)準(zhǔn)常識(shí)并且在生物藥物產(chǎn)品的臨床開(kāi)發(fā)中常規(guī)使用它們（并且也為世界上的各個(gè) 管理機(jī)構(gòu)所要求）。
[0009] 例如，如在Mire-Sluis的文章第3和第4頁(yè)上所述，并且如例如也在Peng的文章 的圖中示意性地舉例，已知許多不同的ADA測(cè)定法形式，如"ELISA-橋接形式"，"ELISA-直 接形式"，"間接形式"，放射免疫沉淀測(cè)定法（RIP)，"表面等離振子共振"和"電化學(xué)發(fā)光-橋 接形式"。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚進(jìn)行ADA免疫測(cè)定法的其它形式。
[0010] 技術(shù)人員也熟悉許多不同的商購(gòu)技術(shù)平臺(tái)，其已經(jīng)顯示適合于建立和進(jìn)行ADA 測(cè)定法。這些包括但不限于MSD平臺(tái)（Mesoscale)，Gyrolab (Gyros)和octet平臺(tái) (Fortebio)〇
[0011] ADA測(cè)定形式的一些非限制性實(shí)例也在圖1A-1C中示意性地顯示。
[0012] 通常，應(yīng)該注意在這些用于檢測(cè)或測(cè)量針對(duì)ISV的ADA' S的ADA測(cè)定法中，ISV 用作"分析試劑"（即，作為用于檢測(cè)任何ADA' s在測(cè)試樣品中是否存在的化合物）"，并且 ADA's是"抗原"（即，在測(cè)試的樣品中待檢測(cè)的化合物）。因此，在這些測(cè)定法中，ISV通常 /經(jīng)常結(jié)合于載體(如ELISA板)，而ADA' s (如果存在）在進(jìn)行測(cè)定法的樣品中存在。
[0013] 為了更好地理解本文所述的本發(fā)明，也應(yīng)該注意-作為對(duì)比-在本文中用于預(yù)測(cè) ISV是否產(chǎn)生蛋白干擾的方法中，ISV通常用作"抗原"（即，作為待檢測(cè)的化合物），并且抗 體(其如本文進(jìn)一步所述）用作"分析試劑"（即作為分別檢測(cè)給定的ISV是否結(jié)合；并且由 此分別檢測(cè)其是否具有產(chǎn)生蛋白干擾的較高或增加的風(fēng)險(xiǎn)的工具）。因此，在根據(jù)本發(fā)明的 這種方法中，用作分析試劑的抗體（其在本文中也稱為"分析抗體"）通常結(jié)合于載體（即 結(jié)合于ELISA板），并且ISV(存在）于待測(cè)試的樣品中。然而，通常應(yīng)該注意到本發(fā)明不 限于其中"分析抗體"結(jié)合于載體的測(cè)定法。例如，在進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定法的備選方法 中（如例如在圖1中顯示并且在實(shí)施例中描述），分析抗體替代性地用作橋接劑（bridging agent)，并且因此在溶液中而不是結(jié)合于板（盡管其通過(guò)包被在板上的ISV間接結(jié)合于 板）。然而，也在實(shí)施例中所述的特異性橋接測(cè)定法中（其是競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法），分析抗體仍 舊用作分析試劑（即，分別確定目的ISV是否結(jié)合；并且因此分別確定其是否具有產(chǎn)生蛋 白干擾的較高風(fēng)險(xiǎn)或增加的風(fēng)險(xiǎn)）。還設(shè)想，基于本文進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容，技術(shù)人員能夠設(shè) 計(jì)其他的測(cè)定形式，其中分析抗體可以用作分析試劑從而分別確定給定的ISV是否能夠結(jié) 合；并由此確定其是否具有產(chǎn)生蛋白干擾的較高或增加的風(fēng)險(xiǎn)）。
[0014] 作為研究單鏈Fv's或"ScFv's"(其是包含免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體，并 且類似于ISV' S，不與恒定結(jié)構(gòu)域締合）的結(jié)果，已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述，免疫球蛋白可變結(jié) 構(gòu)域的C端形成疏水補(bǔ)片（hydrophobic patch),其在抗體中被埋在可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié) 構(gòu)域之間的界面中，但是當(dāng)可變結(jié)構(gòu)域不與恒定結(jié)構(gòu)域締合時(shí)，成為溶劑-暴露的（Nieba 等，Protein Engineering, 10, 435-444(1997))。還描述了暴露的 C-端可以形成 B-細(xì)胞 表位，其可以產(chǎn)生抗-藥物抗體和/或與(新出現(xiàn)和/或預(yù)先存在的）抗-藥物抗體相互作 用（W0 11/07586)，可以接著使用上述提及的ADA測(cè)定法來(lái)確定它的存在。為此原因，已經(jīng) 提議對(duì)形成可變結(jié)構(gòu)域的C-端的部分的一些氨基酸殘基進(jìn)行突變以減少所述疏水性和/ 或去除所述表位。例如，Nieba等提議突變VH區(qū)的位置11，14, 41，84, 87和/或89 (按照 Kabat編號(hào)），而在W0 11/07586中，提議突變VL結(jié)構(gòu)域的位置99, 101和/或148 (AHo編 號(hào)）或VH結(jié)構(gòu)域的位置12, 97, 98, 99, 103和/或144 (也是AHo編號(hào)-這些位置對(duì)應(yīng)于 根據(jù) Kabat 的位置 11，83, 84, 85, 89 和 103)。
[0015] 然而，這些參考文獻(xiàn)中都沒(méi)有意識(shí)到在受試者的血液或血清中存在的某些蛋白會(huì) 干擾涉及ISV's的ADA測(cè)定法，并且因?yàn)榇耍@些文獻(xiàn)中并不涉及(也沒(méi)有提供方案給)這樣 的問(wèn)題，即在所述ADA測(cè)定法中怎樣避免非特異性蛋白干擾，從而允許ADA測(cè)定法用于確定 待測(cè)試樣品中（新出現(xiàn)或已經(jīng)存在的）抗-藥物抗體的真實(shí)存在/程度。
[0016] 作為對(duì)比，本發(fā)明提供這樣的方法和測(cè)定法，其容易使技術(shù)人員預(yù)測(cè)免疫球蛋白 單可變結(jié)構(gòu)域是否具有在ADA測(cè)定法中遭受非特異性蛋白干擾的傾向。本文所述的方法和 測(cè)定法還允許技術(shù)人員，在發(fā)現(xiàn)可變結(jié)構(gòu)域可能具有在ADA測(cè)定法中遭受所述蛋白干擾的 傾向或風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，容易測(cè)試可變結(jié)構(gòu)域（提議）的修飾從而預(yù)測(cè)任何這樣(提議）的修飾是否 減少或基本上完全避免這樣的蛋白干擾。
[0017] 本發(fā)明還描述了可以對(duì)可變結(jié)構(gòu)域進(jìn)行許多修飾從而減少或基本避免這樣的蛋 白干擾。根據(jù)一個(gè)非限制性的方面，這種修飾包括將有限量（如本文進(jìn)一步所述）的氨基 酸殘基（如本文進(jìn)一步所述）添加到可變結(jié)構(gòu)域的C-端末端。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì) 于許多基于其的不同的可變結(jié)構(gòu)域或構(gòu)建體，甚至將單氨基酸殘基加入c-端末端（如單丙 氨酸殘基）也可以充分地或甚至基本上完全消除ADA測(cè)定法中的蛋白干擾問(wèn)題，即使加入 一個(gè)這樣的氨基酸本身不足以"覆蓋"或"包埋"根據(jù)Nieba等存在于ISV的C-端的疏水 片也是如此。類似地，但是不希望以任何方式限制本發(fā)明或限于任何機(jī)制或解釋，還認(rèn)為加 入一個(gè)這樣的氨基酸不足以"覆蓋"或"包埋"根據(jù)W011/07586所述可能存在于可變結(jié)構(gòu) 域的C-端的任何B-細(xì)胞表位。還應(yīng)該注意，盡管根據(jù)本發(fā)明這一具體方面，在可變結(jié)構(gòu) 域的C-端加入有限量的氨基酸或甚至單氨基酸（S卩，在C-端區(qū)本身內(nèi)不進(jìn)行任何取代，如 由Nieba等和W0 11/07586所提議的）可以-并且在許多情形中-明顯減少或甚至基本上 去除非特異性蛋白干擾的問(wèn)題，但是在C-端末端的這樣的添加與C-端區(qū)突變的組合也在 本發(fā)明這一方面的范圍內(nèi)。然而，在該方面中，還應(yīng)該注意，本發(fā)明不具體受限于進(jìn)行這些 突變背后的基本原理。例如，本領(lǐng)域公知在C-端內(nèi)對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行突變（包括由Nieba 等和在W011/07586中清楚提及的那些位置）從而對(duì)可變結(jié)構(gòu)域（包括，但不限于VHH結(jié)構(gòu) 域）進(jìn)行人源化或從而對(duì)V H結(jié)構(gòu)域進(jìn)行"駱駝源化"（例如參考W008/020079和本文提及 的Ablynx N. V.的一些其它申請(qǐng)）。
[0018] 認(rèn)為本文教導(dǎo)的方法，測(cè)定法和修飾可以應(yīng)用于任何這樣的可變結(jié)構(gòu)域，其不與 恒定結(jié)構(gòu)域（或用功能為"遮蔽"、覆蓋或"包埋"可變結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)的其他基團(tuán)或肽結(jié) 構(gòu)部分）連接或不以其他方式與恒定結(jié)構(gòu)域（或用功能為"遮蔽"、覆蓋或"包埋"可變結(jié)構(gòu) 域的C-端區(qū)的其他基團(tuán)或肽結(jié)構(gòu)部分）締合并且更通常，應(yīng)用于具有溶劑-暴露的C-端 區(qū)的任何可變結(jié)構(gòu)域。然而，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的，但非限制性方面，所述方法，測(cè)定法和 修飾可以具體地應(yīng)用于重鏈可變結(jié)構(gòu)域（V H結(jié)構(gòu)域），并且根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面，應(yīng) 用于VHH結(jié)構(gòu)域。
[0019] 還認(rèn)為本文所述的方法，測(cè)定法和修飾可以適當(dāng)?shù)貞?yīng)用于包含一個(gè)或多個(gè)可變 結(jié)構(gòu)域的蛋白構(gòu)建體，并且具體地應(yīng)用于其中可變結(jié)構(gòu)域形成所述構(gòu)建體的C-端部分的 構(gòu)建體，或在本文所述的方法和測(cè)定法情形中，具體應(yīng)用于其中可變結(jié)構(gòu)域的c-端區(qū)是溶 劑-暴露的構(gòu)建體。此外，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選但非限制性方面，所述方法，測(cè)定法和修 飾應(yīng)用于這樣的構(gòu)建體，其中V H結(jié)構(gòu)域（并且具體地，VHH結(jié)構(gòu)域）形成構(gòu)建體的C-端部 分，或在本發(fā)明的方法和測(cè)定法情形中，是溶劑-暴露的。
[0020] 所述構(gòu)建體的一些非限制性實(shí)例是多價(jià)、多特異性的（如雙特異性）或多互補(bǔ)位 (如雙互補(bǔ)位）構(gòu)建體，其包含兩個(gè)以上直接連接的ISV'S或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合接頭連 接（根據(jù)一個(gè)具體方面，也用V H或Vhh結(jié)構(gòu)域連接）的ISV's，所述ISV's形成所述構(gòu)建體 的C-端部分。例如，但不限于，所述構(gòu)建體可以完全包含也是直接連接的或通過(guò)一個(gè)或多 個(gè)適合的接頭連接的V H結(jié)構(gòu)域，具體地納米抗體（即，Vhh結(jié)構(gòu)域，人源化的VHH結(jié)構(gòu)域或 駱駝源化的VH結(jié)構(gòu)域）。對(duì)于這些構(gòu)建體和怎樣構(gòu)建這些構(gòu)建體（具體地基于納米抗體） 的通常教導(dǎo)的一些非限制性實(shí)例，例如參考Conrath等，JBC 276, 10(9)，7346(2001)以及 Muyldermans. Reviews in Mol. Biotechnol.(分子生物技術(shù)綜述），74:27(2001)的綜述文 .-?ν. 早。
[0021] 然而，例如還認(rèn)為本發(fā)明可應(yīng)用于具有溶劑-暴露的可變結(jié)構(gòu)域的其它構(gòu)建體并 且具體地在其C-端具有可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體，如例如單鏈Fv's，具體地在C-端具有它們的 重鏈可變結(jié)構(gòu)域的ScFv's。
[0022] 在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)如"ISV"，"分析試劑"和"蛋白干擾"具有 如本文進(jìn)一步定義的含義。
[0023] 具體地，如本文所述的ISV可以具體地是納米抗體，或(其它）ISV( S卩，不同于納米 抗體），其是VH結(jié)構(gòu)域或包含VH結(jié)構(gòu)域；并且優(yōu)選地是納米抗體。
[0024] 此外，包含ISV的任何蛋白或多肽（如基于ISV的藥物）優(yōu)選地在其C-端末端 具有所述（或至少一個(gè)）這樣的ISV。此外，所述的ISV可以具體地是納米抗體，或(其它） ISV(即，不同于納米抗體），其是VH結(jié)構(gòu)域或包含VH結(jié)構(gòu)域；并且優(yōu)選地是納米抗體。
[0025] 本文所述的發(fā)明具體地意欲并且適合應(yīng)用于ISVs，其包含，基于和/或衍生自重 鏈可變結(jié)構(gòu)域，如VH結(jié)構(gòu)域（包括人VH結(jié)構(gòu)域）和納米抗體如VHH結(jié)構(gòu)域（包括人源化 的和序列優(yōu)化的VHH結(jié)構(gòu)域）或駱駝源化的VH結(jié)構(gòu)域。這些可以是合成的（例如，從合成 庫(kù)起始獲得和/或基于固定的構(gòu)架區(qū)），半合成的（例如人源化的，駱駝源化或序列優(yōu)化的， 或從天然VH或VHH結(jié)構(gòu)域開(kāi)始，通過(guò)親和力成熟或⑶R移植獲得）或完全天然存在的VH 或VHH結(jié)構(gòu)域。因此本發(fā)明關(guān)于作為VH或VHH結(jié)構(gòu)域，基于VH或VHH結(jié)構(gòu)域和/或衍生 自VH或VHH結(jié)構(gòu)域的ISV' s如本文進(jìn)一步所述。
[0026] 在產(chǎn)生本發(fā)明時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些用于分析生物樣品（如血液樣品，包括全血、血 清和血漿、眼淚、支氣管肺泡液/BALF、腦脊髓液或生物流體的其他樣品）的測(cè)定法（如，例 如在ADA免疫測(cè)定法中）中，可能存在蛋白干擾，并且這樣的蛋白干擾可能在一些這樣的測(cè) 定法和/或在一些這樣的樣品中產(chǎn)生非特異性信號(hào)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這樣的蛋白干擾不僅在獲 自用ISV's (和具體地，用納米抗體；或用包含至少一種所述ISV或納米抗體的蛋白，多肽或 其他生物藥物）治療的受試者和/或已經(jīng)施用了其的受試者（如患者或臨床試驗(yàn)受試者） 的樣品中存在，而且在從未接受ISV的受試者中也存在（說(shuō)明所述干擾可能是由于與預(yù)先 存在的蛋白而不是與任何新出現(xiàn)的ADA' S的非特異性蛋白-蛋白相互作用產(chǎn)生的）。
[0027] 盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在這些測(cè)定法中這樣的蛋白干擾和/或所述信號(hào)不與ISV's的藥物 性質(zhì)（如藥物代謝動(dòng)力學(xué)/PK或藥效學(xué)/ro性質(zhì)）的任何變化或減少相關(guān)，但是還是需要 獲得這樣的技術(shù)，其用于預(yù)測(cè)、檢測(cè)、減少和/或（如果可能）避免這樣的非特異性蛋白干 擾。這是本發(fā)明的一般目的。
[0028] 具體地，本發(fā)明提供，并且在某些具體的但非限制性方面涉及：
[0029] -測(cè)定法，其可以用于預(yù)測(cè)給定的ISV是否在這樣的測(cè)定法（如例如在ADA免疫測(cè) 定法中）中遭受這樣的蛋白干擾和/或產(chǎn)生這樣的（非特異）信號(hào)。這樣的預(yù)測(cè)性測(cè)定法 可以例如用于測(cè)試給定的ISV是否具有產(chǎn)生這樣的蛋白干擾和/或這樣的信號(hào)的傾向；用 于選擇不易產(chǎn)生或較不容易產(chǎn)生這樣的蛋白干擾或產(chǎn)生這樣的信號(hào)的ISV' S ;作為這樣的 測(cè)定法或測(cè)試，其可以用于測(cè)試對(duì)ISV的某些修飾是否（完全或部分）減少其產(chǎn)生這樣的 干擾或這樣的信號(hào)的傾向；和/或作為這樣的測(cè)定法或測(cè)試，其可以用于指導(dǎo)ISV的修飾或 改進(jìn)從而減少其產(chǎn)生這樣的蛋白干擾或信號(hào)的傾向；
[0030] -用于修飾和/或改進(jìn)ISV's從而消除或減少其產(chǎn)生這樣的蛋白干擾或這樣的信 號(hào)的傾向；
[0031] -可以被引入ISV從而消除或減少其產(chǎn)生這樣的蛋白干擾或這樣的信號(hào)的傾向的 修飾；
[0032] -可以被特異性選擇（例如，使用本文所述的測(cè)定法）從而不具有或具有較低/減 少的產(chǎn)生這樣的蛋白干擾或這樣的信號(hào)的傾向的ISV' s;
[0033]-不具有或具有較低/減少的產(chǎn)生這樣的蛋白干擾或這樣的信號(hào)的傾向的修飾和 /或改進(jìn)的ISV' s。
[0034] 例如，在第一個(gè)非限制性方面中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其可以用于預(yù)測(cè)給定的 ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）是否在免疫測(cè)定法中產(chǎn)生（或具有 較高或增加的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生）蛋白干擾（即，在其施用于受試者后，生物流體的樣品獲自所述受 試者，并且所述樣品進(jìn)行如本文進(jìn)一步所述的免疫測(cè)定法），所述方法包括進(jìn)行這樣的免疫 測(cè)定法，其至少包括下述步驟：
[0035] (i)使所述ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）與這樣的抗體 接觸，所述抗體獲自人受試者并且已經(jīng)基于它們識(shí)別和/或結(jié)合ISV或納米抗體的C-端末 端的能力進(jìn)行選擇，產(chǎn)生和/或分離（"分析抗體；和
[0036] (ii)確定所述ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）是否在所述 免疫測(cè)定法中與所述抗體結(jié)合。
[0037] 在這種方法中，當(dāng)所述ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物與 所述分析抗體結(jié)合時(shí)，可以預(yù)期所述ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥 物將產(chǎn)生（或具有較高或增加的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生）這樣的蛋白干擾（如本文進(jìn)一步所述）?；?此，例如，可以修飾或改進(jìn)所述ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物從而 減少或消除其產(chǎn)生這樣的蛋白干擾的傾向（其也可以使用上述測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定），并且可 以用于修飾所述ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物的一些策略如本文 所述（例如，包括將少量的氨基酸殘基連接于C-端末端和/或引入一個(gè)或多個(gè)具體氨基酸 取代）。
[0038] 因此，一般地，本發(fā)明使技術(shù)人員獲得這樣的測(cè)定法和方法/技術(shù)，其可以用于預(yù) 測(cè)ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物產(chǎn)生蛋白干擾的傾向和/或作為 改進(jìn)ISVs，從而減少或避免它們產(chǎn)生蛋白干擾的傾向的工具。這樣做的時(shí)候，本發(fā)明還給技 術(shù)人員提供選擇ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物的手段，該選擇是 基于它們產(chǎn)生蛋白干擾的較低或減少的能力（或缺乏任何能力）進(jìn)行的。因此，本發(fā)明給 技術(shù)人員提供重要的測(cè)定法和工具，其可以用在優(yōu)化和開(kāi)發(fā)ISV、納米抗體、基于ISV的藥 物或基于納米抗體的藥物中。
[0039] 此外，如本文進(jìn)一步所述，本發(fā)明教導(dǎo)技術(shù)人員許多這樣的方法，其中可以修飾或 改進(jìn)ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物從而減少或避免它們產(chǎn)生蛋白 干擾的傾向。因此本發(fā)明通常還獲得了具有減少的、較低的或不具有任何產(chǎn)生蛋白干擾傾 向的修飾和/或改進(jìn)的ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物。
[0040] 如本文進(jìn)一步所述，本發(fā)明可以具體地用于預(yù)測(cè)給定的ISV或納米抗體（或基于 ISV或基于納米抗體的藥物）是否在免疫測(cè)定法中，和更具體地在ADA測(cè)定法中產(chǎn)生蛋白 干擾（如本文進(jìn)一步所述）。所述ADA測(cè)定法可以通常例如是用于檢測(cè)或測(cè)量針對(duì)ISV' s 的ADA's的ADA測(cè)定法，并且可以具體地是用于檢測(cè)或測(cè)量針對(duì)在上述步驟（i)和（ii)中 所用的ISV的ADA' s的ADA測(cè)定法。
[0041] 此外，如本文提及，如本文所述的ISV可以具體的是這樣的納米抗體或（其它） ISV(即，不同于納米抗體），其是VH結(jié)構(gòu)域或包含VH結(jié)構(gòu)域；并且優(yōu)選地是納米抗體。
[0042] 此外，包含ISV的任何蛋白或多肽（如基于ISV的藥物）優(yōu)選地在其C-端末端具 有所述(或至少一種)這樣的ISV。此外，所述ISV可以具體地是這樣的納米抗體或（其它） ISV(即，不同于納米抗體），其是VH結(jié)構(gòu)域或包含VH結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地是納米抗體。
[0043] 在所述免疫測(cè)定法或ADA測(cè)定法中測(cè)試的樣品在本文中也稱為"測(cè)試樣品"或"測(cè) 定樣品"。為避免混淆，諸如"測(cè)試樣品"或"測(cè)定樣品"不應(yīng)該與在本文中用作獲得在本發(fā) 明中使用的（多克隆或單克?。?分析抗體"的原料的生物樣品混淆。
[0044] 在一個(gè)特別優(yōu)選但是非限制性的方面中，本發(fā)明可以用于預(yù)測(cè)給定的ISV或納米 抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）是否將在包括使用所述ISV的免疫測(cè)定法中 (和具體地，在ADA測(cè)定法中）產(chǎn)生蛋白干擾（如本文進(jìn)一步所述）。此外，所述ADA測(cè)定 法可以通常例如是用于檢測(cè)或測(cè)量針對(duì)ISV's的ADA's的ADA測(cè)定法，并且可以具體地是 用于檢測(cè)或測(cè)量針對(duì)在上述步驟（i)和（ii)中所用的ISV的ADA' s的ADA測(cè)定法。
[0045] 在甚至更具體的但非限制性的方面中，本發(fā)明可以用于預(yù)測(cè)給定的ISV或納米抗 體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）是否將在免疫測(cè)定法中（和具體地，在ADA測(cè)定 法中）產(chǎn)生蛋白干擾（如本文進(jìn)一步所述），所述免疫測(cè)定法意欲確定或測(cè)量所述樣品是否 包含任何針對(duì)ISV的ADA's。此外，例如，所述免疫測(cè)定法可以是一種已知類型的ADA測(cè)定 法（關(guān)于其例如參考本文引用的關(guān)于ADA測(cè)定法的現(xiàn)有技術(shù)）（進(jìn)行所述ADA測(cè)定法以確 定或測(cè)量是否在"測(cè)試樣品"中存在任何針對(duì)所述ISV的ADA' s)，其中所述測(cè)試樣品是獲 自已經(jīng)施用了所述ISV的受試者（如本文進(jìn)一步所述）的生物流體的樣品（如本文所述）。
[0046] 如本文進(jìn)一步所述，在所有這些方面（和本文所述的本發(fā)明的其他方面）中，本發(fā) 明還可以用于選擇在所述免疫測(cè)定法或ADA測(cè)定法中不易產(chǎn)生或較不容易產(chǎn)生這樣的蛋 白干擾的ISV' s ;作為這樣的測(cè)定法或測(cè)試，其可以用于測(cè)試ISV的某些修飾是否（完全或 部分）減少其在所述免疫測(cè)定法或ADA測(cè)定法中產(chǎn)生所述干擾的傾向；和/或作為這樣的 測(cè)定法或測(cè)試，其可以用于指導(dǎo)ISV的修飾或改進(jìn)從而減少其在所述免疫測(cè)定法或ADA測(cè) 定法中產(chǎn)生這樣的蛋白干擾的傾向。
[0047] 本發(fā)明的其他方面，實(shí)施方案，優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用將通過(guò)本文進(jìn)一步描述變得清楚。
[0048] 在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，無(wú)論何時(shí)使用術(shù)語(yǔ)"ISV"，其應(yīng)該理解為：
[0049] -所述ISV優(yōu)選地是納米抗體，其中術(shù)語(yǔ)"納米抗體"通常如在W008/020079或 TO 09/138519中定義，并且因此在具體的方面中通常指VHH，人源化的VHH或駱駝源化的 VH(如駱駝源化的人VH)或通常指序列優(yōu)化的VHH(如例如關(guān)于化學(xué)穩(wěn)定性和/或溶解性、 與已知人構(gòu)架區(qū)的最大重疊和最大表達(dá)優(yōu)化的）。注意術(shù)語(yǔ)納米抗體（Nanobody)或納米 抗體（Nanobodies)是Ablynx N. V.的注冊(cè)商標(biāo)并且因此也可以稱為Nanobody?和/或 NniiobodicS'iv');.
[0050] -術(shù)語(yǔ)"ISV"在其最廣泛的意義上還包括"基于ISV的生物制品"，并且當(dāng)ISV是納 米抗體時(shí)，包括"基于納米抗體的生物制品"。"基于ISV的生物制品"在本文中定義為包含至 少一種(如一種，兩種或三種)ISV' s或基本由其組成的蛋白，多肽或其他生物藥物。類似地， "基于納米抗體的生物制品"定義為包含至少一種(如一種，兩種或三種）納米抗體或基本由 其組成的蛋白，多肽或其他生物藥物。關(guān)于術(shù)語(yǔ)"ISV"，無(wú)論何時(shí)使用術(shù)語(yǔ)"基于ISV的生 物制品"，應(yīng)該理解所述基于ISV的生物制品優(yōu)選地是基于納米抗體的生物制品。在本發(fā)明 的背景中，"基于ISV的生物制品"和基于納米抗體的生物制品"可以例如分別是單價(jià)，二價(jià) (或多價(jià))，雙特異性(或多特異性)和雙互補(bǔ)位（或多互補(bǔ)位）ISV構(gòu)建體或納米抗體構(gòu)建體。 此外，除了一種或多種（如一種，兩種或三種）ISV'S或納米抗體之外，任何基于ISV的生物 制品或基于納米抗體的生物制品，任選地還包含一種或多種（如一種或兩種）其他治療結(jié) 構(gòu)部分和/或一種或多種（如一種或兩種）影響基于ISV的生物制品或基于納米抗體的生 物制品的藥物代謝動(dòng)力學(xué)或藥效學(xué)性質(zhì)(如其半衰期)的其它結(jié)構(gòu)部分。這些其他治療劑或 其他結(jié)構(gòu)部分的適合的實(shí)例對(duì)于技術(shù)人員是清楚的，并且例如一般可以包括任何治療活性 蛋白，多肽或其他結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合單元，以及例如修飾如在W0 09/138159的第149-152 頁(yè)上描述的那些?；贗SV的生物制品或基于納米抗體的生物制品優(yōu)選地是治療劑或意 欲用作治療劑(其包括預(yù)防和診斷)，并且為此目的優(yōu)選地包含至少一種針對(duì)治療相關(guān)靶標(biāo) (如例如RANK-L，vWF，IgE，RSV，CXCR4, IL-23或其他白介素等））的ISV。對(duì)于所述基于ISV 的生物制品或基于納米抗體的生物制品的一些具體的但非限制性的實(shí)例，例如參考Ablynx N.V.的各個(gè)申請(qǐng)（如例如但不限于 WO 2004/062551、W02006/122825、WO 2008/020079 和 TO 2009/068627)，以及例如（但不限于）申請(qǐng)如 WO 06/038027, WO 06/059108, TO 07/063308, WO 07/063311，W007/066016 和 WO 07/085814。此外，在本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中，除非 另外清楚提及，所有本文提及的術(shù)語(yǔ)具有在WO 09/138519(或在W0 09/138519引用的現(xiàn)有 技術(shù)中）或WO 08/020079(或在W0 08/020079引用的現(xiàn)有技術(shù)）中給定的含義。此外，如 果方法或技術(shù)沒(méi)有具體在本文中描述，其可以如在WO 09/138519(或在W0 09/138519中引 用的現(xiàn)有技術(shù)）或WO 08/020079(或在W0 08/020079引用的現(xiàn)有技術(shù)）中所述進(jìn)行。
[0051] 具體地，下述術(shù)語(yǔ)具有與在W0 09/138519的第62-75頁(yè)上給出的含義相同的含 義，和/或如果適用時(shí)可以以在該頁(yè)上所述的方式進(jìn)行確定："激動(dòng)劑"，"拮抗劑"，"逆激 動(dòng)劑"，"非極性，不帶電荷氨基酸殘基"，"極性，不帶電荷氨基酸殘基"，"極性，帶電荷氨 基酸殘基"，"序列同一性"，"精確相同"和"氨基酸差異"（當(dāng)提及兩個(gè)氨基酸序列的比較 時(shí)），"（以)基本分離的（形式"結(jié)構(gòu)域"，"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"，"抗原決定簇"，"表位"，"針 對(duì)"或"針對(duì)"（抗原），"特異性"和"半衰期"。此外，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"和"待調(diào)節(jié)"，"相互作用 位點(diǎn)"，"特異于"，"交叉-阻斷（cross-block)"，"交叉阻斷的（cross-blocked)"和"交 叉阻斷（cross-blocking) "和"基本獨(dú)立于pH"如在 申請(qǐng)人:的W0 10/130832第74-79頁(yè)上 定義（和/或可以如在該頁(yè)上所述）。此外，當(dāng)提及本發(fā)明的構(gòu)建體、化合物、蛋白質(zhì)或多肽 時(shí)，術(shù)語(yǔ)如"單價(jià)"，"二價(jià)"（或"多價(jià)")，"雙特異性"（或"多特異性")，和"二互補(bǔ)位"（或 "多互補(bǔ)位"）可以具有在W0 09/138. 519, W0 10/130832或W0 08/020079中所述的含義。
[0052] 在本文使用時(shí)，關(guān)于ISV、納米抗體、基于ISV的生物制品、基于納米抗體的生物制 品或任何其它氨基酸序列、化合物或多肽的術(shù)語(yǔ)"半衰期"可以通常如在W0 08/020079的 第57頁(yè)上的段落〇)中所述定義，并且如本文提及時(shí)，指在體內(nèi)例如由于通過(guò)天然機(jī)制降 解序列或化合物和/或清除或螯合序列或化合物而使氨基酸序列、化合物或多肽的血清濃 度減少50%所需的時(shí)間。本發(fā)明的氨基酸序列、化合物或多肽的體內(nèi)半衰期可以以任何本 身已知的方式，如通過(guò)藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析進(jìn)行確定。適合的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是 顯而易見(jiàn)的，并且可以通常例如如在W0 08/020079的第57頁(yè)上的段落〇)中所述。也如 在TO 08/020079的第57頁(yè)上的段落〇)中所提及，可以使用參數(shù)如tl/2-a、tl/2-@和 曲線下面積（AUC)表示半衰期。在該方面，應(yīng)該注意術(shù)語(yǔ)"半衰期"在本文中使用時(shí)具體指 tl/2-β或終末半衰期(其中tl/2-a和/或AUC都可以不用考慮)。參考例如下面的實(shí)驗(yàn)部 分以及標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，如Kenneth, A 等：Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists (藥物的化學(xué)穩(wěn)定性：藥劑師手冊(cè)）和Peters等，Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析：實(shí)踐方法）（1996)。還參考 "Pharmacokinetics (藥物代謝動(dòng)力學(xué)）〃，M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker 出版，第 2版，（1982)。類似地，術(shù)語(yǔ)"半衰期增加"或"增加的半衰期"也如在WO 08/020079的第57 頁(yè)上的段落〇)中定義并且具體地指tl/2-β增加，伴隨或不伴隨tl/2-α和/或AUC或兩 者的增加。
[0053] 當(dāng)術(shù)語(yǔ)未在本文具體定義時(shí)，其具有本領(lǐng)域中為技術(shù)人員所知曉的通常含義。 例如，參考標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)如 Sambrook 等，〃Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分 子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)）〃（第2版），第1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版（1989) ;F.AUSUbel等 編輯·，"Current protocols in molecular biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊(cè)）〃，Green Publishing&Wiley Interscience，New York(1987);Lewin, "Genes II(基因 II)，'，John Wiley&Sons，New York, N.Y·，（1985);01d 等，"Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering(基因操作原理：遺傳工程介紹）"，第2版，加利福 尼亞大學(xué)出版，Berkeley, CA(1981) ;Roitt 等，"Immunology (免疫學(xué)）"（第 6 版），Mosby/ Elsevier, Edinburgh(2001);Roitt 等，Roitt' s Essential Immunology (Roitt' s 基 本免疫學(xué)），第 10 版。Blackwell Publishing, UK (2001);和 Janeway 等，"免疫生物學(xué) (Immunobiology)，'（第 6 版），Garland Science Publishing/Churchi 11 Livingstone, New York(2005)，以及參考本文引用的一般【背景技術(shù)】。
[0054] 此外，在本文中，納米抗體的氨基酸殘基根據(jù)Kabat等給出的關(guān)于VH結(jié)構(gòu)域的一 般編號(hào)方式進(jìn)行編號(hào)（"Sequence of proteins of immunological interest(免疫學(xué)目的 蛋白序列）"，US Public Health Services，NIH Bethesda，MD,出版號(hào) 91)，如在 Riechmann 和 Muyldermans, J. Immunol. Methods (免疫方法雜志）2000 年 6 月 23 日；240 (1-2) : 185-195 中應(yīng)用于來(lái)自駱駝科動(dòng)物（Camelids)的VHH結(jié)構(gòu)域；或在本文提及。根據(jù)該編號(hào)方式，納 米抗體的FR1包含在位置1-30的氨基酸殘基，納米抗體的⑶R1包含在位置31-35的氨基酸 殘基，納米抗體的FR2包含在位置36-49的氨基酸，納米抗體的⑶R2包含在位置50-65的 氨基酸殘基，納米抗體的FR3包含在位置66-94的氨基酸殘基，納米抗體的CDR3包含在位 置95-102的氨基酸殘基，納米抗體的FR4包含在位置103-113的氨基酸殘基。[在這一方 面中，應(yīng)該注意-如本領(lǐng)域關(guān)于VH結(jié)構(gòu)域和VHH結(jié)構(gòu)域所熟知的-在每個(gè)CDR's中的氨基 酸殘基的總數(shù)可以變化并且可以不對(duì)應(yīng)于由Kabat編號(hào)所指定的氨基酸殘基的總數(shù)（即， 根據(jù)Kabat編號(hào)方式的一個(gè)或多個(gè)位置可以不由實(shí)際序列占滿，或?qū)嶋H序列可以包含多于 Kabat編號(hào)方式所允許數(shù)目的氨基酸殘基）。這一般意為，根據(jù)Kabat的編號(hào)方式可以對(duì)應(yīng) 于或可以不對(duì)應(yīng)于實(shí)際序列中的氨基酸殘基的實(shí)際編號(hào)。然而，一般認(rèn)為，根據(jù)Kabat的編 號(hào)方式并且不考慮CDR' s中的氨基酸殘基數(shù)目，根據(jù)Kabat編號(hào)方式的位置1對(duì)應(yīng)于FR1 的開(kāi)始并且反之亦然，根據(jù)Kabat編號(hào)方式的位置36對(duì)應(yīng)于FR2的開(kāi)始并且反之亦然，根 據(jù)Kabat編號(hào)方式的位置66對(duì)應(yīng)于FR3的開(kāi)始并且反之亦然，并且根據(jù)Kabat編號(hào)方式的 位置103對(duì)應(yīng)于FR4的開(kāi)始并且反之亦然]。
[0055] 用于對(duì)VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)的備選方法（所述方法也可以以類似于 來(lái)自駱駝科動(dòng)物的VHH結(jié)構(gòu)域和納米抗體的方式應(yīng)用），是Chothia等所述的方法（自然 (Nature) 342, 877-883 (1989))，所謂"AbM定義"和所謂"接觸定義"。然而，在本發(fā)明的說(shuō) 明書(shū)，方面和附圖中，將遵循Riechmann和Muyldermans的應(yīng)用于VHH結(jié)構(gòu)域的根據(jù)Kabat 的編號(hào)方式，除非另外指出。
[0056] 還應(yīng)該注意提供附圖，任何序列表和實(shí)驗(yàn)部分/實(shí)施例僅是為了進(jìn)一步舉例說(shuō)明 本發(fā)明并且不應(yīng)該以任何方式被解釋或闡釋為限制本發(fā)明的范圍和/或后附的權(quán)利要求， 除非本文另外清楚指出。
[0057] 還應(yīng)該注意，本發(fā)明不具體限于任何關(guān)于在本發(fā)明中觀察到或根據(jù)本發(fā)明可以被 減少的蛋白干擾(和/或在免疫測(cè)定法中產(chǎn)生的信號(hào)）的任何起因，解釋，假說(shuō)或機(jī)制。然 而，認(rèn)為某些個(gè)體或個(gè)體群體的血液或血清（或其他生物流體，如本文提及的那些）可以包 含某些（預(yù)先存在）的蛋白，其在某些情形下可以（非特異性地）結(jié)合于ISV's，導(dǎo)致在某 些測(cè)定法（其用于分析獲自所述個(gè)體的血液或血清樣品）中的干擾信號(hào)。這特別基于在產(chǎn) 生本發(fā)明中所做的觀察，即由本發(fā)明所解決的非特異性蛋白干擾不僅在測(cè)定獲自預(yù)先施用 了 ISV的受試者的樣品時(shí)存在，而且在測(cè)定獲自預(yù)先未接受ISV的受試者中獲得的樣品時(shí) 也會(huì)存在。
[0058] 具體地，基于在產(chǎn)生本發(fā)明時(shí)的觀察，并且盡管本發(fā)明并不限于此，但是認(rèn)為所述 (預(yù)先存在）的蛋白可以具體地（能夠）結(jié)合于該ISV's的C-端末端(在全長(zhǎng)的常規(guī)4-鏈 單克隆抗體中以及在駱駝科動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的"僅重鏈"抗體中，其與抗體的剩余部分連接-即 分別與常規(guī)單克隆抗體中的CH1區(qū)連接-和與駱駝科動(dòng)物重鏈抗體中的鉸鏈區(qū)連接-并因 此在所述全長(zhǎng)抗體中可以免受這樣的蛋白干擾)。
[0059] 這通過(guò)本發(fā)明發(fā)明人在形成本發(fā)明時(shí)的發(fā)現(xiàn)（所述發(fā)現(xiàn)如本文進(jìn)一步所述）所證 實(shí)，即ISV' s在其C-端末端的某些(簡(jiǎn)單）修飾可以基本上減少或基本上防止這樣的蛋白 干擾。因此,用于以這種方式修飾ISV' S的方法以及已經(jīng)以這種方式修飾的ISV' S形成本 發(fā)明的其他方面，如本文進(jìn)一步所述。
[0060] 本發(fā)明具體地可以用于減少或避免由于在免疫測(cè)定法中的非特異性結(jié)合所導(dǎo)致 的蛋白干擾和/或信號(hào)，所述免疫測(cè)定法在獲自受試者的生物學(xué)樣品（如血液或血清樣 品）上進(jìn)行，所述受試者已經(jīng)被施用了（生物制品）藥物（再一次，所述樣品在本文中也稱 為"測(cè)試樣品"或"測(cè)定樣品"）。其一些實(shí)例是用于在向受試者施用生物學(xué)藥物后表征藥 物處置和抗體形成的免疫測(cè)定法，如在由歐洲藥物管理機(jī)構(gòu)（EMEA)的人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員 會(huì)（CHMP) (Committee for Medicinal Products for Human Use(CHMP)of the European Medicines Agency (EMEA) ·)所頒發(fā)的 "Guideline on the Clinical Investigation of the Pharmacokinetics of Therapeutic proteins(治療蛋白的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的臨床研 究指導(dǎo)）"（日期為2007年1月27日的文件CHMP/EWP/89249/2004)中提及的那些。如在 該文獻(xiàn)的第4和第5頁(yè)上所指出的：
[0061] "已經(jīng)鑒定了一些可能的缺陷并且其可能導(dǎo)致藥物處置和抗體形成的錯(cuò)誤表征。 應(yīng)該考慮下述問(wèn)題[…]:
[0062] 免疫測(cè)丨定法
[0063] 藥物測(cè)定法：
[0064] […]
[0065] (iii)內(nèi)源物質(zhì)的干擾·
[0066] (iv)血漿成分或抗-藥物抗體與分析物結(jié)合并且抑制與捕獲抗體的互補(bǔ)性結(jié)合 的干擾"
[0067] 本發(fā)明可以具體地用于預(yù)測(cè)，減少或避免在用于分析取自受試者的生物流體的測(cè) 試樣品/測(cè)定樣品中的免疫測(cè)定法中的這種類型的干擾，所述受試者已經(jīng)施用了 ISV's (和 具體地納米抗體；或基于ISV的生物制品或基于納米抗體的生物制品，如本文進(jìn)一步所 述）。
[0068] 本發(fā)明可以具體地用于預(yù)測(cè)，減少或避免免疫測(cè)定法中這種類型的（非特異性） 蛋白干擾，所述免疫測(cè)定法用于表征藥物處置和/或用于確定任何ADA' s (抗-藥物）抗 體的形成。在這一方面，應(yīng)該注意通常在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和后附的權(quán)利要求中，當(dāng)使用短語(yǔ) 如"預(yù)測(cè)，減少或避免蛋白干擾時(shí)"，這不僅包括預(yù)測(cè)，減少或避免這樣的蛋白干擾本身，一 般還包括預(yù)測(cè)，減少或避免在免疫測(cè)定法（如其中可以存在與蛋白干擾相關(guān)（非特異性） 信號(hào)的那些，如在ADA測(cè)定法中）中出現(xiàn)非特異性信號(hào)，和具體地在所述免疫測(cè)定法中，預(yù) 測(cè)，減少或避免非特異性信號(hào)的出現(xiàn)，當(dāng)所述非特異性信號(hào)在該測(cè)定法中觀察到時(shí)，它們通 常歸因于(非特異性）蛋白干擾，與其相關(guān)和/或被視為(非特異性）蛋白干擾的跡象。在這 一方面，通常應(yīng)該注意，如在本文提及，本發(fā)明不特別限于任何起因，解釋，假說(shuō)或機(jī)制。
[0069] 在一個(gè)具體的，但非限制性的方面中，本發(fā)明可以用于預(yù)測(cè)，避免或減少在 "抗-藥物抗體"或"ADA"測(cè)定法中這樣的蛋白干擾，所述測(cè)定法在取自受試者的生物流體 樣品（即"測(cè)試樣品"）上進(jìn)行，所述受試者已經(jīng)被施用了 ISV' s(和具體地納米抗體；或基 于ISV的生物制品或基于納米抗體的生物制品，如本文進(jìn)一步定義）。
[0070] 在另一個(gè)具體但非限制性的方面中，本發(fā)明可以用于預(yù)測(cè)，避免或減少在"抗-藥 物抗體"或"ADA"測(cè)定法中這樣的蛋白干擾（和/或通常與其相關(guān)的非特異性信號(hào)），所述 測(cè)定法用于檢測(cè)、測(cè)量和/或表征針對(duì)一種或多種ISV's (和具體地針對(duì)納米抗體；或基于 ISV的生物制品或基于納米抗體的生物制品，如本文進(jìn)一步定義）的(任何)抗-藥物抗體 的存在。具體地，本發(fā)明可以用于預(yù)測(cè)，避免或減少在所述"抗-藥物抗體"或"ADA"測(cè)定法 中這樣的蛋白干擾，所述測(cè)定法在生物流體的樣品（即，"測(cè)試樣品"）上進(jìn)行，更具體地在 已經(jīng)獲自受試者的生物流體的樣品上進(jìn)行，所述受試者已經(jīng)被施用了一種或多種ISV' s或 納米抗體（或基于ISV的生物制品或基于納米抗體的生物制品，如本文進(jìn)一步定義）。例 如，本發(fā)明可以用于在所述"抗-藥物抗體"或"ADA"測(cè)定法中預(yù)測(cè)，避免或減少這樣的蛋 白干擾，所述測(cè)定法用于檢測(cè)、測(cè)量和/或表征針對(duì)ISV或納米抗體（或基于ISV的生物制 品或基于納米抗體的生物制品，如本文進(jìn)一步定義）的(任何）抗-藥物抗體的存在，所述 ISV或納米抗體已經(jīng)被施用于受試者（從所述受試者中獲得樣品）（在臨床試驗(yàn)的背景和/ 或在治療的背景中）。
[0071] 因此，在一個(gè)具體的，但非限制性的方面中，本發(fā)明可以用于預(yù)測(cè)，避免或減少生 物樣品（即，"測(cè)試樣品"）中這樣的蛋白干擾（和/或通常與其相關(guān)的非特異性信號(hào)）， 所述生物樣品獲自已經(jīng)被施用了一種或多種所述ISV' s或納米抗體（或基于ISV的生物 制品或基于納米抗體的生物制品，如本文進(jìn)一步定義）的受試者，其中所述樣品適合于和 /或意欲用于免疫學(xué)測(cè)定法中，如ADA測(cè)定法。如所提及的，所述生物樣品可以是血液（包 括全血、血清或血漿），眼淚，支氣管肺泡液/BALF，腦脊髓液或任何其它適合用于免疫測(cè)定 法，和具體地ADA測(cè)定法的適合的生物流體或樣品。
[0072] 在一個(gè)具體的，但非限制性的方面中，所述測(cè)試樣品可以獲自這樣的受試者，所述 受試者已經(jīng)進(jìn)行了多次施用（例如，在至少10天，如至少一個(gè)月或更長(zhǎng)的時(shí)期中至少1-3 次的單獨(dú)施用）ISV、納米抗體、基于ISV的生物制品（如本文進(jìn)一步定義）或基于納米抗體 的生物制品（如本文進(jìn)一步定義）和/或用其進(jìn)行的長(zhǎng)期治療（即在至少10天如至少一 個(gè)月期間的治療）。所述ISV、納米抗體、基于ISV的生物制品或基于納米抗體的生物制品 可以例如在治療的背景或在臨床試驗(yàn)的背景下施用于所述受試者。
[0073] 在一個(gè)具體的，但非限制性的方面中，所述測(cè)試樣品可以獲自這樣的受試者，所述 受試者已經(jīng)被施用（和/或已經(jīng)被提供了）了這樣的ISV、納米抗體、基于ISV的生物制品 或基于納米抗體的生物制品，所述ISV、納米抗體、基于ISV的生物制品或基于納米抗體的 生物制品在施用了其的受試者中具有增加的半衰期(如本文定義，并且與單價(jià)ISV比較)，例 如至少1天，優(yōu)選地至少3天，更優(yōu)選地至少7天，如至少10天的半衰期。
[0074] 例如但不限于，通過(guò)官能化和/或通過(guò)在構(gòu)建體中包含增加構(gòu)建體的半衰期的結(jié) 構(gòu)部分或結(jié)合單元來(lái)給所述ISV、納米抗體、基于ISV的生物制品或基于納米抗體的生物制 品提供增加的半衰期。技術(shù)人員知曉所述官能化，結(jié)構(gòu)部分或結(jié)合單元的實(shí)例，其可以例如 如本文所述，并且例如可包括聚乙二醇化，與血清白蛋白融合，或與可以結(jié)合于血清蛋白如 血清白蛋白的肽或結(jié)合單元（binding unit)融合。所述血清-白蛋白結(jié)合肽或結(jié)合結(jié)構(gòu) 域可以是能夠增加構(gòu)建體的半衰期的（與不具有血清白蛋白結(jié)合肽或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相同構(gòu) 建體比較）任何適合的血清-白蛋白結(jié)合肽或結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且可以具體地是如在 申請(qǐng)人: 的TO 2008/068280(和具體地都屬于 申請(qǐng)人:的W0 2009/127691和未預(yù)先公開(kāi)的美國(guó)申請(qǐng) 61/301,819)中所述的血清白蛋白結(jié)合肽，或血清-白蛋白結(jié)合ISV(如血清白蛋白結(jié)合納 米抗體；例如Alb-Ι或Alb-Ι的人源化形式如Alb-8,對(duì)于其例如參考W006/122787)。
[0075] 因此，在一個(gè)具體但非限制性的方面中，所述生物樣品可以獲自已經(jīng)施用了這樣 的ISV、納米抗體、基于ISV的生物制品或基于納米抗體的生物制品的受試者，所述ISV、納 米抗體、基于ISV的生物制品或基于納米抗體的生物制品包含（人）血清白蛋白-結(jié)合結(jié) 合肽或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0076] 如已在上文提及，在一個(gè)非限制性的方面中，本發(fā)明通常涉及這樣的方法，所述方 法可以用于預(yù)測(cè)給定的ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）在免疫測(cè)定 法中（即在將所述ISV施用于受試者后，生物流體樣品獲自所述受試者，并且所述生物流體 進(jìn)行如本文進(jìn)一步所述的免疫測(cè)定法）中是否會(huì)產(chǎn)生（或具有較高或增加的傾向產(chǎn)生）蛋 白干擾（如本文進(jìn)一步所述），所述方法包括進(jìn)行至少包括下述步驟的免疫測(cè)定法：
[0077] (i)使所述ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）與獲自人受試 者并且已經(jīng)基于其識(shí)別和/或結(jié)合ISV或納米抗體的C-端末端的能力選擇、產(chǎn)生和/或分 離的抗體（"分析抗體"）接觸；和
[0078] (ii)確定所述ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）在所述免疫 測(cè)定法中是否與所述抗體結(jié)合。
[0079] 此外，如本文提及，如本文所述的ISV可以具體的是這樣的納米抗體或（其它） ISV(即，不同于納米抗體），其是VH結(jié)構(gòu)域或包含VH結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地是納米抗體。
[0080] 此外，包含ISV的任何蛋白或多肽（如基于ISV的藥物）優(yōu)選地在其c-端末端具 有所述（或至少一個(gè)）這樣的ISV。此外，所述ISV可以具體地是這樣的納米抗體或（其 它）ISV (即，不同于納米抗體），其是VH結(jié)構(gòu)域或包含VH結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地是納米抗體。
[0081] 在備選實(shí)施方案中，其也如本文進(jìn)一步所述，取代前述獲自人受試者的抗體，可以 使用在本文稱為〃21-4-3〃（或簡(jiǎn)稱為〃21-4〃，見(jiàn)關(guān)于VH和VL序列的SEQ ID NO' S35和 36)的單克隆抗體。使用雜交瘤技術(shù)從用在W02006/122825中的SEQ ID N0:98的納米抗 體構(gòu)建體免疫的小鼠開(kāi)始，如在實(shí)施例7中進(jìn)一步所述產(chǎn)生21-4,并且將表達(dá)21-4的雜 交瘤細(xì)胞系（稱為"ABH0015"）在2012年6月4日保藏于BCCM，Ghent，比利時(shí)，保藏號(hào)為 LMBP-9680-CB。已經(jīng)顯示單克隆21-4識(shí)別W0 2006/122825中SEQ ID N0:98的納米抗體 構(gòu)建體的C-端，所述C-端末端由針對(duì)馮維勒布蘭德因子（vWF)產(chǎn)生的納米抗體（人源化的 V。組成。開(kāi)始產(chǎn)生21-4作為分析試劑是為了用于檢測(cè)（血清）樣品中的蛋白納米抗體（具 體地，在W0 2006/122825中的SEQ ID N0:98的納米抗體構(gòu)建體）；令人驚奇的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn) 也可以使用21-4來(lái)預(yù)測(cè)ISV是否具有遭受非特異性蛋白干擾的傾向（針對(duì)W02006/122825 中的SEQ ID N0:98的納米抗體構(gòu)建體或針對(duì)其它納米抗體產(chǎn)生的一些其它相當(dāng)?shù)模ㄐ∈螅?單克隆抗體更是如此)。
[0082] 具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)根據(jù)實(shí)施例9給出的方案測(cè)定時(shí)，如果測(cè)量21-4與ISV(或 與在其C-端末端包含ISV的蛋白或多肽，或如本文提及的類似蛋白或多肽）的結(jié)合產(chǎn)生少 于500的RU值（在根據(jù)公式[測(cè)量的RU] / [蛋白的MW] X106,關(guān)于蛋白的分子量調(diào)整測(cè)量 的RU值后），那么所述ISV或蛋白可能不具有遭受蛋白干擾的傾向（在由下述實(shí)施例中提 出的數(shù)據(jù)所提供的置信度內(nèi)）。為了上述公式的目的，可以將MW計(jì)算為在ISV中存在的所 有氨基酸殘基的所有MT s的總和。
[0083] 因此，本文所述的任何ISV、蛋白或多肽與21-4的結(jié)合優(yōu)選地具有這樣的少于500 的RU值（根據(jù)在實(shí)施例9中提出的方案測(cè)定，并且在根據(jù)上述公式關(guān)于所用的ISV或蛋白 的分子量調(diào)整測(cè)量的RU值后）。
[0084] 因此，本發(fā)明的該方面通常涉及這樣的方法，所述方法可以用于預(yù)測(cè)給定的ISV 或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）在免疫測(cè)定法中（即在將所述ISV施用 于受試者后，生物流體樣品獲自所述受試者，并且所述生物流體進(jìn)行如本文進(jìn)一步所述的 免疫測(cè)定法）中是否會(huì)產(chǎn)生（或具有較高或增加的傾向產(chǎn)生）蛋白干擾（如本文進(jìn)一步所 述），所述方法包括進(jìn)行至少包括下述步驟的免疫測(cè)定法：
[0085] (i)使所述ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）與單克隆抗體 21-4( S卩，用作"分析抗體"）接觸；和
[0086] (ii)確定所述ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）在所述免疫 測(cè)定法中是否與單克隆抗體21-4結(jié)合。
[0087] 所述方法可以具體地使用BiaCore或類似技術(shù)進(jìn)行，和更具體地使用在實(shí)施例9 中提出的方案進(jìn)行。如本文提及，當(dāng)ISV或基于ISV的藥物在該方案中的結(jié)合顯示少于500 的RU值時(shí)（在根據(jù)公式[測(cè)量的RU]/[蛋白的MW]xl0 6,關(guān)于蛋白的分子量調(diào)整測(cè)量的RU 值后），所述ISV或基于ISV的蛋白不可能與在人的血液或血清中存在的任何干擾因子結(jié)合 和/或不可能具有在ADA測(cè)定法中遭受非特異性蛋白干擾的傾向（即在下面的實(shí)驗(yàn)部分中 提出的置信度內(nèi)）。
[0088] 此外，如本文提及，如本文所述的ISV可以具體地是這樣的納米抗體或（其它） ISV(即，不同于納米抗體），其是VH結(jié)構(gòu)域或包含VH結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地是納米抗體。
[0089] 此外，包含ISV的任何蛋白或多肽（如基于ISV的藥物）優(yōu)選地在其C-端末端具 有所述（或至少一個(gè)）這樣的ISV。此外，所述ISV可以具體地是這樣的納米抗體或（其 它）ISV (即，不同于納米抗體），其是VH結(jié)構(gòu)域或包含VH結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地是納米抗體。
[0090] 也如本文提及，上述使用21-4的方法也可以用于確定ISV或包含ISV的蛋白或多 肽是否與人血液或血清中存在的干擾因子結(jié)合（或具有與其結(jié)合的傾向）。
[0091] 此外，如本文提及，認(rèn)為所述使用21-4的方法也可以用于預(yù)測(cè)在其C-端末端具有 VH結(jié)構(gòu)域的任何蛋白或多肽（如抗體片段或ScFv)是否與存在于人血液或血清中的干擾因 子結(jié)合（或具有與其結(jié)合的傾向）和/或是否具有在ADA測(cè)定法中遭受蛋白干擾的傾向。
[0092] 除了 21-4之外，認(rèn)為包含21-4的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（分別見(jiàn)SEQ ID N0's:35 和36)或甚至僅包含21-4的⑶R序列（適當(dāng)?shù)匾浦驳狡渌m合的VH和VK構(gòu)架中）的抗 體或抗體片段（如適合的Fab片段）也可以用在本文所述的方法中。
[0093] 如本文進(jìn)一步所述，本發(fā)明可以具體地用于預(yù)測(cè)給定的ISV或納米抗體（或基于 ISV或基于納米抗體的藥物）是否在免疫測(cè)定法中（其是ADA測(cè)定法）將產(chǎn)生蛋白干擾（如 本文進(jìn)一步所述）。所述ADA測(cè)定法可以通常例如是用于檢測(cè)或測(cè)量針對(duì)ISV's的ADA's 的ADA測(cè)定法，并且可以具體地是用于檢測(cè)或測(cè)量在上述步驟（i)和（ii)中所用的針對(duì) ISV的ADA' s的ADA測(cè)定法。
[0094] 在一個(gè)特別優(yōu)選但非限制性的方面中，本發(fā)明可以用于預(yù)測(cè)給定的ISV或納米抗 體（或基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物）是否將在包括使用所述ISV的免疫測(cè)定法 中（和具體地，在ADA測(cè)定法中）產(chǎn)生蛋白干擾（如本文進(jìn)一步所述）。此外，所述ADA測(cè) 定法可以通常例如是用于檢測(cè)或測(cè)量針對(duì)ISV's的ADA's的ADA測(cè)定法，并且可以具體地 是用于檢測(cè)或測(cè)量在上述步驟（i)和（ii)中所用的針對(duì)ISV的ADA' s的ADA測(cè)定法。 [0095] 在甚至更具體但非限制性方面中，本發(fā)明可以用于預(yù)測(cè)給定的ISV或納米抗體 (或基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物）是否在包括使用所述ISV的免疫測(cè)定法中（和 具體地，在ADA測(cè)定法中）將產(chǎn)生蛋白干擾（如本文進(jìn)一步所述）。例如，所述免疫測(cè)定法 可以是進(jìn)行測(cè)定或測(cè)量任何針對(duì)所述ISV的ADA' s是否在測(cè)試樣品中存在的ADA測(cè)定法 (即包括ISV)，其中所述樣品是獲自施用了所述ISV的受試者（如本文進(jìn)一步所述）的生 物流體樣品（如本文所述）。例如，如本文進(jìn)一步提及，所述樣品（即，"測(cè)試樣品"）可以 是血液樣品（包括全血，血清或血漿），眼淚，支氣管肺泡液/BALF，腦脊髓液或任何其他適 合的生物流體，并且可以具體地是適合和/或意欲用于免疫學(xué)測(cè)定法，如ADA測(cè)定法的生物 樣品。
[0096] 如本文進(jìn)一步所述，在所有這些方面（和如本文所述的本發(fā)明的其它方面）中，本 發(fā)明也可以用于選擇在所述免疫測(cè)定法或ADA測(cè)定法中不易產(chǎn)生或較不容易產(chǎn)生這樣的 蛋白干擾的ISV's ;作為這樣的測(cè)定法或測(cè)試，其可以用于測(cè)試對(duì)ISV的某些修飾是否（完 全或部分）在所述免疫測(cè)定法或ADA測(cè)定法中減少其產(chǎn)生這樣的干擾的傾向；和/或作為 這樣的測(cè)定法或測(cè)試，其可以用于指導(dǎo)ISV的修飾或改進(jìn)從而減少其在所述免疫測(cè)定法或 ADA測(cè)定法中產(chǎn)生這樣的蛋白干擾的傾向。
[0097] 如所提及，本發(fā)明的方法的步驟（i)包括使所述ISV或納米抗體（或基于ISV或 基于納米抗體的藥物）與這樣的抗體接觸，所述抗體獲自人受試者并且已經(jīng)基于其識(shí)別和 /或結(jié)合ISV或納米抗體（如本文進(jìn)一步所述）的C-端末端的能力進(jìn)行選擇/分離。本 文所述的方法的所述步驟（i)中，"所述ISV或納米抗體（或基于ISV的藥物或基于納米抗 體的藥物）"在免疫測(cè)定法中用作抗原（即作為待檢測(cè)的物質(zhì))。此外，在所述步驟（i)中， "獲自人受試者并且已經(jīng)基于其識(shí)別和/或結(jié)合ISV或納米抗體的C-端末端的能力進(jìn)行選 擇/分離的抗體"用作分析試劑（即以與其他抗體相同的方式用在免疫測(cè)定法中來(lái)檢測(cè)它 們所針對(duì)的抗原的存在）。
[0098] 如已經(jīng)提及，并且為了更好地理解本文所述的本發(fā)明，應(yīng)該注意，在步驟（i)中， 所述ISV通常用作"抗原"，（S卩，作為待檢測(cè)的化合物），并且"分析抗體"用作分析試劑 (即，作為分別檢測(cè)給定的ISV是否結(jié)合的手段；并且因此作為分別檢測(cè)給定的ISV是否具 有較高或增加的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生蛋白干擾的手段）。例如，當(dāng)步驟（i)以ELISA形式進(jìn)行時(shí)，所述 "抗體/分析試劑"通常結(jié)合于載體（即，結(jié)合于ELISA板），并且ISV(存在于）待測(cè)試的 樣品中。
[0099] 作為對(duì)比，應(yīng)該注意在這些用于檢測(cè)或測(cè)量針對(duì)ISV的ADA' s的ADA測(cè)定法中， ISV用作"分析試劑"（即，作為用于檢測(cè)任何ADA'S是否存在的化合物），并且ADA'S是"抗 原"（即，待檢測(cè)的化合物）。因此，在這些測(cè)定法中，ISV通常/經(jīng)常結(jié)合于載體(如ELISA 板)，而ADA' s (如果存在）在進(jìn)行測(cè)定法的樣品中存在。
[0100] 然而，如已經(jīng)提及的，通常應(yīng)該注意到本發(fā)明不限于其中"分析抗體"結(jié)合于載體 的測(cè)定法。例如，在進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定法的備選方法中（如在實(shí)施例5中顯示），分析 抗體替代性地用作橋接劑（bridging agent)，并且因此在溶液中而不是結(jié)合于板（盡管其 通過(guò)包被在板上的ISV間接結(jié)合于板）。然而，也在實(shí)施例5中所述的特異性橋接測(cè)定法中 (其是競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法），分析抗體仍舊用作分析試劑（即，分別確定目的ISV是否結(jié)合；并且 因此分別確定其是否具有產(chǎn)生蛋白干擾的較高風(fēng)險(xiǎn)或增加的風(fēng)險(xiǎn)）。還設(shè)想，基于本文進(jìn)一 步的公開(kāi)內(nèi)容，技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)其他的測(cè)定形式，其中分析抗體可以被用作分析試劑從 而分別確定給定的ISV是否能夠結(jié)合；并由此確定其是否具有產(chǎn)生蛋白干擾的較高或增加 的風(fēng)險(xiǎn)）。
[0101] 在步驟⑴中所用的"分析抗體"可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0102] 當(dāng)所述分析抗體是多克隆抗體時(shí)，其可以例如是這樣的多克隆抗體（制劑），其由 獲自人受試者的生物樣品（如血液、血漿、B-細(xì)胞或其他可以從其中適當(dāng)?shù)胤蛛x多克隆抗 體的適合的生物樣品或流體）中獲得/純化/分離。這可以例如是獲自施用了至少一個(gè) ISV的（如在步驟（i)中使用的ISV，但是這不是需要的或必需的）人受試者的適合的生物 樣品，并且也可以是（并且優(yōu)選地是）來(lái)自從未接受ISV或用ISV治療的人受試者的適合 的生物樣品。更重要的是，所述多克隆抗體通過(guò)這樣的方法獲自所述生物樣品，所述方法包 括使用攜帶ISV作為親和結(jié)構(gòu)部分的親和基質(zhì)或親和柱的至少一個(gè)親和步驟（和一個(gè)或多 個(gè)本身已知的用于獲得/純化/分離多克隆抗體的其它步驟）。例如，可以通過(guò)使用攜帶 ISV的親和柱通過(guò)親和層析的方式從所述生物樣品獲得多克隆抗體，如例如在實(shí)施例2中 所述。這可以例如使用攜帶ISV作為抗原的親和基質(zhì)，使用關(guān)于從生物樣品分離抗體的免 疫親和層析的公知技術(shù)進(jìn)行。所述技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且技術(shù)人員基于本文公開(kāi)的內(nèi) 容清楚其適合的實(shí)例。
[0103] 所述多克隆抗體（制劑）可以具體地是IgG(或IgG級(jí)分（fraction))。
[0104] 例如，其可以是這樣的多克隆抗體，所述多克隆抗體使用不含C-端標(biāo)記（即其中 C-端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)終止）的ISV(和具體地納米抗體，如VHH，人源 化的和/序列優(yōu)化VHH或駱駝源化的VH，如駱駝源化人VH)作為結(jié)合于親和基質(zhì)的抗原， 通過(guò)在獲自人受試者的生物流體的樣品上進(jìn)行的包括（免疫）親和層析的方法獲得。具體 地，用作結(jié)合于親和基質(zhì)的抗原的ISV可以是人源化的或序列-優(yōu)化的VHH(或備選地相應(yīng) 駱駝源化的人VH)，其中C-端以氨基酸序列VTVSS(SEQIDN0 :33)終止。在一個(gè)具體，但 非限制性方面中，用作結(jié)合于親和基質(zhì)的抗原的ISV可以是人源化的或序列-優(yōu)化的VHH， 其作為這樣人源化或序列-優(yōu)化的結(jié)果，在位置14包括脯氨酸（P)殘基，其中相應(yīng)的"幼 稚" VHH在位置14包括丙氨酸（A)(換言之，用作抗原的ISV是VHH的人源化形式，其天然 在位置14包括丙氨酸，所述丙氨酸殘基，作為人源化和/或序列優(yōu)化的結(jié)果，已經(jīng)被脯氨酸 (P)殘基取代）。作為這樣的人源化或序列優(yōu)化的結(jié)果，用作抗原的ISV也可以包括一個(gè)或 多個(gè)其它氨基酸取代，例如通常在W0 08/020079或W0 09/138519中所述。
[0105] 可以用作抗原從而產(chǎn)生/分離在本發(fā)明中所用的"分析抗體"的ISVs的一些具體 實(shí)例在SEQ ID NO' s: 1和2中給出。
[0106] 此外，用于獲得多克隆抗體的方法，除了（免疫）親和步驟之外，還可以包括一個(gè)或 多個(gè)用于從生物樣品分離/純化多克隆抗體的其他步驟（在親和步驟之前或之后進(jìn)行）。 此外，技術(shù)人員清楚用于進(jìn)行它們的這些步驟和技術(shù)。
[0107] 因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明包括如本文進(jìn)一步所述的方法，其包括本文所述的步 驟（i)和（ii)，其中使用包括至少一個(gè)親和步驟（如親和層析，如免疫親和層析的步驟） 的方法，"分析抗體"（即獲自人受試者并且已經(jīng)基于其識(shí)別和/或結(jié)合ISV或納米抗體的 C-端末端的能力進(jìn)行選擇/分離的抗體）獲自從人受試者中獲得的生物樣品（其中所述 生物樣品是適合用于從所述樣品產(chǎn)生/分離抗體的方法的樣品），其中ISV(并且優(yōu)選地 納米抗體）用作抗原，并且優(yōu)選地，ISV用作包含氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)作為 C_端序列的抗原，并且更優(yōu)選地，人源化的和/或序列優(yōu)化的納米抗體用作包含氨基酸序 列VTVSS(SEQ ID N0:33)作為C-端序列的抗原，并且甚至更優(yōu)選地，人源化的和/或序列 優(yōu)化的納米抗體用作這樣的抗原，其包含氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)作為C-端序 列，并且在位置14包含脯氨酸殘基，如這樣的納米抗體，其包含氨基酸序列VTVSS (SEQ ID NO: 33)作為C-端序列并且在位置14包含脯氨酸殘基，所述脯氨酸殘基作為所述人源化和 /或序列優(yōu)化的結(jié)果被引入納米抗體(例如，為了在被人源化和/或序列優(yōu)化的VHH中取代 在所述位置天然存在的丙氨酸殘基)。
[0108] 上述ISV's也可以用在分離單克隆抗體的方法中（其也是從獲自人的適合生物樣 品開(kāi)始），所述單克隆抗體適合在本發(fā)明中用作"分析抗體"。
[0109] 例如，所述單克隆抗體可以從血液、B-細(xì)胞或其它用于分離抗體的適合樣品和材 料起始獲得，可以基于其識(shí)別和/或結(jié)合ISV或納米抗體（C-端末端）的能力進(jìn)行選擇(其 中，再一次，在篩選和/或選擇過(guò)程中用作抗原的ISV (S)優(yōu)選地如在前述段落中描述，包括 關(guān)于所述ISV/抗原所指出的優(yōu)先選擇)。這樣的篩選和選擇可以以任何適合的方式進(jìn)行， 例如通過(guò)使用B-細(xì)胞選擇和/或擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行（所述B-細(xì)胞選擇和/或擴(kuò)增技術(shù)基本上 與在 EP 0488470, W0 92/02551，EP 1633787, W0 01/55216, W0 02/26829, W004/051268，W0 04/102198或W0 04/106377中所述的B-細(xì)胞選擇技術(shù)相同或適當(dāng)?shù)仡愃疲?，或通過(guò)使用類 似于在W0 06/079372中所述的納米克隆技術(shù)的技術(shù)進(jìn)行(但是使用人B-細(xì)胞而不是駱駝 科動(dòng)物B-細(xì)胞)。
[0110] 一旦已經(jīng)鑒定/分離表達(dá)適合抗體的一種或多種B-細(xì)胞，所述抗體可以以任何適 合的方式分離，表達(dá)和/或生產(chǎn)。例如，所述B-細(xì)胞可以作為雜交瘤無(wú)限增殖化，產(chǎn)生需要 的一種抗體/多種抗體（使用從選定的B-細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生雜交瘤的本身熟知的技術(shù)），并且 所述一種抗體/多種抗體可以接著再次使用本領(lǐng)域中充分建立和在各種書(shū)籍和手冊(cè)中描 述的和此外，在前述段落中提及的專利出版物中描述和/或提及的適合技術(shù)從所述雜交瘤 (培養(yǎng)物上清液）中分離。
[0111] 備選地，所述B-細(xì)胞可以使用本身已知的B-細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，并且所述一 種抗體/多種抗體可以從所述擴(kuò)增的B-細(xì)胞的（培養(yǎng)物上清液）分離。此外，這可以使用 本領(lǐng)域中充分建立和在各種書(shū)籍和手冊(cè)中描述的和此外，在前述段落中提及的專利出版物 中描述和/或提及的適合技術(shù)進(jìn)行。
[0112] 在另一個(gè)備選的實(shí)施方案中，可以從所述B-細(xì)胞或其他適合的細(xì)胞中，直接(例 如使用適合的單細(xì)胞PCR克隆技術(shù)）或在適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)增需要的B-細(xì)胞后，獲得(例如，通過(guò)擴(kuò) 增)編碼目的一種抗體/多種抗體的DNA。接著，所述DNA可以在適合的宿主細(xì)胞或宿主生 物中適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)以提供需要的一種抗體/多種抗體。此外，這可以使用本領(lǐng)域中充分建立 和在各種書(shū)籍和手冊(cè)中描述的和此外，在前述段落中提及的專利出版物中描述和/或提及 的適合技術(shù)進(jìn)行。
[0113] 還可以通過(guò)這樣的方法產(chǎn)生適合用作"分析抗體"的單克隆抗體，所述方法包括 所有組成成分（repertoire)克隆(從獲自人受試者的適合樣品開(kāi)始）和關(guān)于結(jié)合用作抗原 的ISV的抗體篩選克隆的所有組成成分（repertoire)(其中，再次，在篩選和/或選擇過(guò)程 中用作抗原的ISV(s)優(yōu)選地如在前述段落中所述，包括關(guān)于所述ISV/抗原所指定的優(yōu)先 選擇）。用于所有組成成分克隆的方法和用于展示關(guān)于選擇和篩選的克隆的所有組成成分 的各種技術(shù)（如噬菌體展示，核糖體展示和酵母展示）是技術(shù)人員清楚的，并且例如在EP 0589877, EP 0774511，W0 90/14430和EP 0368684中以及在關(guān)于受試者的各種書(shū)籍中描 述。
[0114] 通常，用作獲得(多克隆或單克隆）分析抗體的起點(diǎn)的生物樣品可以是獲自任何適 合的人受試者的任何適合的樣品（即適合分別作為獲得多克隆抗體或單克隆抗體的原料)。 在一個(gè)具體但非限制性的方面中，所述樣品可以例如獲自女人，并且具體地獲自絕經(jīng)期后 的女人。因此，在一個(gè)具體但非限制性的方面中，在上述步驟（i)和（ii)中所用的分析抗 體從這樣的生物樣品起始獲得，所述生物樣品獲得/來(lái)自絕經(jīng)期后的女人（或由已經(jīng)獲自 /來(lái)自絕經(jīng)期后女人的抗體衍生）。
[0115] 此外，用作獲得(多克隆或單克?。┓治隹贵w的起點(diǎn)的生物樣品可以獲自已經(jīng)預(yù)先 施用了 ISV(例如作為臨床試驗(yàn)或治療的一部分）的受試者，但是優(yōu)選地獲自預(yù)先未施用 ISV的受試者。
[0116] 然而，應(yīng)該注意本發(fā)明不特別受限于所用的一種分析抗體/多種分析抗體的來(lái) 源，并且證實(shí)在一些情形中，使用本文所述的技術(shù)，從其它來(lái)源獲得（產(chǎn)生，分離）其他適合 的分析抗體也是可以的，所述其他來(lái)源包括商購(gòu)人血液或血漿（和甚至來(lái)自其他哺乳動(dòng)物 或靈長(zhǎng)類動(dòng)物種類（如來(lái)自狒狒或食蟹猴）的血液，血漿或B-細(xì)胞）。
[0117] 如上述提及，在步驟（i)和（ii)中所用的（多克隆或單克?。┓治隹贵w應(yīng)該是這 樣的從而其能夠識(shí)別或結(jié)合ISV或納米抗體的c-端末端，并且最優(yōu)選地基于其結(jié)合ISV或 納米抗體的c-端末端的能力進(jìn)行選擇和/或分離。
[0118] 如可以從圖2中觀察到的，當(dāng)ISV基于VH或VHH結(jié)構(gòu)域或由其衍生時(shí)，ISV的C-端 末端包含氨基酸序列VTVSS (SEQ ID N0:33)，并且因此分析抗體應(yīng)該能夠識(shí)別在其C-端末 端具有氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)的任何ISV。如可以進(jìn)一步從圖2中觀察到的，在 序列VTVSS(SEQ ID N0:33)中的（至少一些氨基酸殘基）是在ISV上的推定表位的一部分， 并且除了別的殘基之外，其還包含在位置14 (和在氨基酸序列中與其相鄰的氨基酸殘基/ 接近其的氨基酸殘基，如位置11，13和15)的氨基酸殘基，并且也可以包含在位置83 (和在 氨基酸序列中與其相鄰的氨基酸殘基/接近其的氨基酸殘基，如位置82,82a，82b和84)的 氨基酸殘基和/或包含在位置108 (和在氨基酸序列中與其相鄰的氨基酸殘基/接近其的 氨基酸殘基，如位置107)的氨基酸殘基。位置109是C-端VTVSS(SEQ ID N0:33)序列的第 一個(gè)V，并且已經(jīng)顯示例如位置110也可以對(duì)蛋白干擾有影響）。在本文這也統(tǒng)稱為"C-端 區(qū)"，理解該C-端區(qū)至少包含C-端序列VTVSS (SEQ ID N0:33)，和在位置14的氨基酸殘基， 并且也可以包含在位置83和108的氨基酸殘基，并且可能還包含在位置13, 15, 82b，83, 84 和107的氣基酸殘基。
[0119] 也如提及，并且也不受限于任何假說(shuō)或解釋，在全長(zhǎng)4-鏈單克隆抗體中，或在僅 全長(zhǎng)重鏈抗體如在駱駝科動(dòng)物中存在的那些中，VH或VHH結(jié)構(gòu)域的C-端末端連接于抗體的 剩余部分-即分別連接于常規(guī)單克隆抗體中的CH1區(qū)或連接于駱駝科動(dòng)物重鏈抗體中的鉸 鏈區(qū)-并因此在所述全長(zhǎng)抗體中可以免受這樣的蛋白干擾影響和/或被VH/VL相互作用所 覆蓋（在常規(guī)4-鏈抗體中）從而使該"C-端區(qū)"因此通常不是溶劑-暴露的和/或作為對(duì) 于蛋白的相互作用位點(diǎn)是可及的，所述蛋白存在于已經(jīng)施用了所述ISV的人的血液，血清 或身體中。然而，如果使用ISV或納米抗體本身（即不與抗體的任何其他部分連接），或如 果使用基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物，所述藥物在其C-端末端攜帶ISV或納米抗 體，該C-端表位對(duì)于與其它蛋白的（非特異性）相互作用是可獲得的，并且也不受限于任 何假說(shuō)或解釋，認(rèn)為這種C-端區(qū)可能目前容易遭受與一種或多種預(yù)先存在于待測(cè)試的"測(cè) 試樣品"中蛋白（例如，一種或多種IgG' s)的（非特異性）蛋白相互作用，并且這可在免 疫測(cè)定法（和具體地在ADA測(cè)定法中）導(dǎo)致蛋白干擾和/或非特異性信號(hào)。
[0120] 如所提及，本文所述的方法可以用于預(yù)測(cè)，減少或避免這樣的蛋白相互作用，并且 還可以用作指導(dǎo)對(duì)ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物的修飾的工具從 而給其提供（部分或優(yōu)選地基本上全部地）減少的產(chǎn)生這樣的蛋白干擾的傾向。
[0121] 如由前述段落可清楚的，并且也不受限于任何假說(shuō)和解釋，特別預(yù)期（并且是本 發(fā)明教導(dǎo)的部分）"C-端區(qū)"的（某些）修飾將改變（并且優(yōu)選地減少）ISV遭受這樣的 非特異性蛋白相互作用的傾向，并且這也是通過(guò)實(shí)驗(yàn)所觀察到的(見(jiàn)，例如在下述實(shí)施例1C 和3中所述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。
[0122] 基于此，并且也不受限于任何假說(shuō)或解釋，本發(fā)明還教導(dǎo)某些可以為此目的被引 入ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物的C-端區(qū)的修飾（可以使用本文 所述的方法測(cè)試其（潛在）的有效性）。此外，基于本文的教導(dǎo)，認(rèn)為技術(shù)人員能夠選擇，設(shè) 計(jì)或提出可以為此目的被引入的C-端區(qū)的其他(候選）修飾（并且也可以使用本文所述的 方法測(cè)試其（潛在）的有效性）。
[0123] 回到本發(fā)明所用的分析抗體，其優(yōu)選地是這樣的（多克隆或單克?。┛贵w，其識(shí)別 ISV的C-端區(qū)(如上定義)，并且具體地，但不限于識(shí)別納米抗體的C-端區(qū)。
[0124] 例如，在一個(gè)具體但非限制性的方面中，所述"分析抗體"可以是這樣的多克隆或 單克隆抗體，其識(shí)別（和/或能夠結(jié)合于，和具體地特異性結(jié)合于）ISV或納米抗體的C-端 區(qū)（其中所述序列的C-端末端以VTVSS(SEQ ID N0:33)終止），但是不識(shí)別（和/或不能 特異性結(jié)合于）這樣的ISV或納米抗體的C-端區(qū)（其可以是不同的ISV，但是優(yōu)選地是相 同的ISV)，其中存在一個(gè)或多個(gè)與C-端VTVSS(SEQ ID N0:33)連接的其他氨基酸殘基(如 1-5個(gè)氨基酸殘基，或備選地小肽序列或甚至其他的多肽或蛋白。
[0125] 在另一個(gè)更具體，但仍非限制性的方面中，所述"分析抗體"可以是這樣的多克隆 或單克隆抗體，其識(shí)別（和/或能夠結(jié)合于，和具體地特異性結(jié)合于）ISV或納米抗體的 C-端區(qū)（其中所述序列的C-端末端以VTVSS(SEQ ID N0:33)終止，并且其中位置14是非 天然存在于位置14的氨基酸和/或與天然存在于位置14的氨基酸相比是被修飾的氨基酸 (例如作為人源化、駱駝源化和/或序列優(yōu)化的結(jié)果）），但是不識(shí)別（和/或不能特異性結(jié) 合）這樣的ISV或納米抗體的C-端區(qū)（其可以是不同的ISV但是優(yōu)選地是相同的ISV)，其 中存在一個(gè)或多個(gè)與C-端VTVSS(SEQ ID N0:33)連接的其他氨基酸殘基(如1-5個(gè)氨基酸 殘基，或備選地小肽序列或甚至其他的多肽或蛋白；和/或其中位置14是天然存在于位置 14的氨基酸（例如，丙氨酸，或當(dāng)ISV在位置14天然包含脯氨酸時(shí)，是脯氨酸）。
[0126] 例如，"分析抗體"也可以是這樣的多克隆抗體或單克隆抗體，其識(shí)別（和/或能 夠結(jié)合于，和具體地特異性結(jié)合于）ISV或納米抗體的C-端區(qū)（其中所述序列的C-端末端 以VTVSS (SEQ ID N0:33)終止，并且其中位置14是脯氨酸（并且具體地，當(dāng)位置14是例如 作為人源化、駱駝源化和/或序列優(yōu)化的結(jié)果被修飾為脯氨酸時(shí)）），但是不識(shí)別這樣的ISV 或納米抗體的C-端區(qū)（其可以是不同的ISV但是優(yōu)選地是相同的ISV)，其中存在一個(gè)或多 個(gè)與C-端VTVSS(SEQ ID N0:33)連接的其他氨基酸殘基(如1-5個(gè)氨基酸殘基，或備選地 小肽序列或甚至其他的多肽或蛋白；和/或其中位置14是丙氨酸。
[0127] "分析抗體"也可以是這樣的多克隆抗體或單克隆抗體，其識(shí)別（和/或能夠結(jié) 合于，和具體地特異性結(jié)合于）ISV或納米抗體的C-端區(qū)（其中所述序列的C-端末端以 VTVSS(SEQ ID N0:33)終止，并且其中位置14是脯氨酸（并且具體地，其中脯氨酸殘基在 所述ISV中在所述位置是天然存在的），但是不識(shí)別這樣的ISV或納米抗體的C-端區(qū)（其 可以是不同的ISV但是優(yōu)選地是相同的ISV)，其中存在一個(gè)或多個(gè)與C-端VTVSS(SEQ ID N0:33)連接的其他氨基酸殘基(如1-5個(gè)氨基酸殘基，或備選地小肽序列或甚至其他的多 肽或蛋白，其中位置14仍是（天然存在或未修飾的）脯氨酸。
[0128] "分析抗體"也可以例如是這樣的多克隆抗體或單克隆抗體，其識(shí)別在本文被稱為 "Nb3. 4"的ISV的序列（的C-端區(qū)）（SEQ ID N0:5)，但是不識(shí)別在本文被稱為"Nb3. 1"的 ISV的序列（的C-端區(qū)）(SEQ ID N0:3)和/或（并且優(yōu)選地）不識(shí)別在本文被稱為"Nb3.2" 的 ISV 的序列（SEQ ID NO:4)。
[0129] 對(duì)于上述目的，可以使用任何適合的結(jié)合測(cè)定法（如Biacore)確定"分析抗體"是 (否）識(shí)別ISV或納米抗體（和/或能或不能（特異性）結(jié)合ISV或納米抗體），但是也可 以使用在實(shí)施例3中所述的BIAC0RE測(cè)定法或在實(shí)施例5中所述的ADA測(cè)定法如ADA橋接 /競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法確定（還見(jiàn)如圖1A到1C和具體地圖1B)。
[0130] 基于本文公開(kāi)的內(nèi)容，技術(shù)人員清楚進(jìn)行所述測(cè)定法的適合的形式/技術(shù)，其例 如包括（但不限于） ：
[0131] -比色測(cè)定法，如用直接或間接包被所述板的分析抗體進(jìn)行ELISA并且用單克隆 或多克隆抗-ISV抗體檢測(cè)結(jié)合的ISV。用于這種設(shè)置的其它有用的備選技術(shù)包括但不限于 電致化學(xué)發(fā)光（MSD平臺(tái)），熒光（DELFIA，GYROS)，和依賴于結(jié)合的ISV的二次檢測(cè)的其它 方法。
[0132] -表面等離振子共振（如BIAC0RE)或其他實(shí)時(shí)生物傳感器方法（即除了使用SPR 之外的方法），所述方法使用直接或間接固定的分析抗體并監(jiān)測(cè)隨后注射/施加的ISV的結(jié) 合。這些方法不需要進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)合的ISV。在實(shí)施例3中描述了進(jìn)行這種類型測(cè)定法的 代表方法。
[0133] -使用分析抗體取代包含生物流體的ADA在橋接測(cè)定法（ADA測(cè)定法）中分析ISV 的競(jìng)爭(zhēng)性行為。對(duì)于橋接測(cè)定法，可以使用不同的技術(shù)如ELISA，MSD平臺(tái)。用于進(jìn)行這種 類型的代表性方法示意性地在圖1A到1C中顯示，并且還在實(shí)施例5中描述這種測(cè)定法的 一個(gè)具體實(shí)例。
[0134] -任何層析法，其中分析抗體在層析基質(zhì)上固定并且ISV從溶液中特異性捕獲/分 離。
[0135] -旦使用本文或在一個(gè)具體的實(shí)例中所述的一種方法（或基本等價(jià)于其的方法） 獲得適合的分析抗體，所述分析抗體可以用于，即通過(guò)進(jìn)行上述步驟（i)和（ii)確定給定 的ISV或納米抗體（或基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物）是否將產(chǎn)生（或具有較高 或增加的傾向產(chǎn)生）蛋白干擾（如本文定義）。也如本文已經(jīng)所述，這通常包括使所述ISV、 納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物與分析抗體接觸并且確定所述ISV、納米 抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物是否被所述分析抗體識(shí)別（和/或與所述分 析抗體結(jié)合，和具體地與所述分析抗體特異性結(jié)合）（并且具體地確定形成所述基于ISV的 藥物或基于納米抗體的藥物的C-端末端的所述ISV或納米抗體的C-端區(qū)或任何ISV或納 米抗體的C-端區(qū)是否被所述分析抗體識(shí)別）。
[0136] 所述方法可以通常使用任何用于確定抗原（在本發(fā)明情形中，ISV、納米抗體、基 于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物）是否與抗體結(jié)合的適合技術(shù)來(lái)進(jìn)行，并且所述適合 的（免疫）測(cè)定技術(shù)是技術(shù)人員清楚的。一些非限制性的實(shí)例是適合的ELISA技術(shù)（包括 例如夾心式ELISA' s)，其中，取決于所用的ELISA形式（如技術(shù)人員所清楚的），分析抗體 或ISV可以包被在平板上并且分析抗體或ISV可以被可檢測(cè)地標(biāo)記。其它技術(shù)可以例如包 括使用BIAcore儀器（其中分析抗體或ISV也可以包被在芯片上，見(jiàn)例如實(shí)施例3)。另一 種備選的方法可以是競(jìng)爭(zhēng)性橋接測(cè)定法（如例如在實(shí)施例5中例示），其中測(cè)試ISV與其 他已知與分析抗體結(jié)合的ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物競(jìng)爭(zhēng)的能 力（或反之亦然）。技術(shù)人員基于本文公開(kāi)的內(nèi)容清楚這些和用于確定給定的ISV、納米抗 體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物是否被分析抗體（特異性）結(jié)合或識(shí)別的其他 適合的技術(shù)。
[0137] 基于本文公開(kāi)的內(nèi)容，還清楚的是，本發(fā)明（和具體地在本發(fā)明中所用的分析抗 體）可以用于確定給定的ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物是否包含 這樣的相互作用位點(diǎn)（如在C-端區(qū)處或C-端區(qū)內(nèi)存在的相互作用位點(diǎn)，和/或C-端區(qū)形 成其一部分的相互作用位點(diǎn)），所述相互作用位點(diǎn)能夠進(jìn)行與可存在于生物樣品（即，"測(cè) 試樣品"）中的一種或多種蛋白或其他成分的（非特異性）蛋白相互作用，所述生物樣品獲 自進(jìn)行免疫測(cè)定法如ADA測(cè)定法（具體地，用于確定針對(duì)ISV、納米抗體、基于ISV的藥物 或基于納米抗體的藥物的任何ADA's的存在的ADA測(cè)定法）的受試者。因此，當(dāng)ISV、納米 抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物被在本發(fā)明中所用的分析抗體識(shí)別時(shí)，所述 ISV，納米抗體，基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物非?？赡馨@樣的（可及的或暴 露的）相互作用位點(diǎn)，并且因此當(dāng)其用在這樣的用于測(cè)試測(cè)試樣品的免疫測(cè)定法或ADA測(cè) 定法中時(shí)，具有產(chǎn)生這樣的蛋白干擾（如本文定義）的傾向。如技術(shù)人員所清楚的，這是應(yīng) 該優(yōu)選要避免的問(wèn)題，如果可能這通過(guò)選擇/使用另一種ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或 基于納米抗體的藥物，或通過(guò)修飾ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物， 從而基本減少或基本消除其產(chǎn)生這樣的蛋白干擾的傾向（再次，這可以使用本文公開(kāi)的方 法和分析抗體測(cè)試）避免。
[0138] 如技術(shù)人員基于本文公開(kāi)的內(nèi)容清楚的，這樣的修飾可以例如包括對(duì)在ISV、納米 抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體上的相互作用位點(diǎn)進(jìn)行一種或多種修飾（如氨基酸 插入、添加、缺失或取代），從而減少或消除其遭受與可存在于測(cè)試樣品中的一種或多種蛋 白或其他成分的（非特異性）蛋白相互作用的能力。此外，這可以通過(guò)引入一種或多種修 飾并且接著也是使用本文公開(kāi)的方法和分析抗體測(cè)試這種能力是否被減少，通過(guò)有限的試 錯(cuò)法來(lái)進(jìn)行。例如，可以引入一種多種這樣的修飾，接著可以將修飾的ISV與所述分析抗體 結(jié)合的能力與原始/未修飾的ISV與所述分析抗體結(jié)合的能力進(jìn)行比較。備選地，使用競(jìng) 爭(zhēng)性橋接形式（如例如在實(shí)施例5中例示），或使用BIAcore (見(jiàn)例如實(shí)施例3)，可以確定 修飾的ISV與原始ISV(仍舊）競(jìng)爭(zhēng)與分析抗體結(jié)合的能力。
[0139] 再一次，并且盡管本發(fā)明不限于任何假說(shuō)或解釋，基于在下面的實(shí)施例中提出的 實(shí)驗(yàn)證據(jù)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這種相互作用位點(diǎn)可能位于C端區(qū)上/鄰近C端區(qū)（如本文定義） 或所述相互作用位點(diǎn)形成C-端區(qū)的部分（或C-端區(qū)形成這種相互作用位點(diǎn)的部分）。 這例如至少部分基于這樣的觀察，即，如果ISV具有產(chǎn)生這樣的蛋白干擾的傾向并且具有 VTVSS(SEQ ID N0:33)作為在其C端末端的氨基酸殘基，則將有限數(shù)量的氨基酸殘基（如 1-10,例如1-5,如1，2, 3, 4或5個(gè)），或備選地，標(biāo)記肽或其他的肽，蛋白或其他結(jié)構(gòu)部分 連接于這種C端末端將通?；緶p少或基本消除所述傾向。在一些情形中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甚至 將1，2或3個(gè)氨基酸殘基添加到C-端VTVSS (SEQ ID N0:33)(其可以是任何適合的氨基酸 或氨基酸的組合，其可以分別獨(dú)立地選自任何天然存在的氨基酸，如在W0 09/138519的第 64頁(yè)上的表A-2中列舉的那些，例如但不限于選自丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮 氨酸）也可以基本減少或基本消除所述傾向。這也部分基于這樣的觀察，即在一些情形中， 如果VHH在位置14天然包含丙氨酸殘基（其如提及形成C-端區(qū)的部分；見(jiàn)圖2)，天然存 在的VHH通常不具有（或具有較低）產(chǎn)生這樣的蛋白干擾的傾向，然而相應(yīng)的VHH(其中在 位置14的所述丙氨酸已經(jīng)被脯氨酸殘基取代）（例如出于人源化或序列-優(yōu)化的目的）結(jié) 果可以具有增加的產(chǎn)生這樣的蛋白干擾（即，與在位置14處具有丙氨酸的VHH比較）的傾 向。
[0140] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及這樣的VHH，納米抗體（如本文定義，和具體地人源化 的VHH或駱駝源化的VH，如駱駝源化的人VH)或其他ISV (或在其C-端末端具有VHH、納米 抗體或其他ISV的基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物），其進(jìn)行了修飾(例如，通過(guò)引入 一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，添加或缺失)，和具體地在C-端區(qū)進(jìn)行了修飾（如通過(guò)在C-端區(qū) 的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代或添加），從而使（i)其具有基本減少的產(chǎn)生蛋白干擾（如本文定 義）的傾向（如至少統(tǒng)計(jì)學(xué)上相關(guān)的減少傾向）；和/或使（ii)其在本文所述的本發(fā)明的 方法（如在實(shí)施例3或5所述的具體測(cè)試法）中，具有基本減少的與如本文所述的分析抗 體（如在實(shí)施例2中所述和在實(shí)施例3和5中所用的多克隆抗體）結(jié)合的能力，在兩種情 形中都優(yōu)選地與相同的但不具有修飾的VHH，納米抗體或ISV比較。
[0141] 因此,在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及這樣的VHH，納米抗體（如本文定義，和具體地人 源化的VHH或駱駝源化的VH，如駱駝源化的人VH)或其他ISV (或在其C-端末端具有VHH、 納米抗體或其他ISV的基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物），其是VHH或VH結(jié)構(gòu)域（即 這樣的ISV，其是VH結(jié)構(gòu)域或衍生自VH結(jié)構(gòu)域）和/或基于VHH或VH結(jié)構(gòu)域（的氨基酸序 列）或衍生自所述VHH或VH結(jié)構(gòu)域（的氨基酸序列），所述VHH，納米抗體或ISV在其C-端 末端包含氨基酸序列VTVSS(X) n(SEQIDN0:34)，其中n是l-10，優(yōu)選地l-5，如l，2,3,4或 5 (和優(yōu)選地1或2,如1)，并且其中每個(gè)X是（優(yōu)選地天然存在的）氨基酸殘基，其獨(dú)立地 選擇（并且優(yōu)選獨(dú)立地選自由丙氨酸（A)，甘氨酸（G)，纈氨酸（V)，亮氨酸（L)或異亮氨酸 (I)組成的組；然而，如可以從下述數(shù)據(jù)中觀察到的，也可以使用其它（優(yōu)選地天然存在的） 氨基酸殘基或前述優(yōu)選的氨基酸殘基與其他氨基酸殘基（如絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和/或 賴氨酸）的組合）。優(yōu)選地，所述在其C-端末端具有氨基酸序列VTVSS(X) n(SEQ ID N0:34) 的VHH，納米抗體或ISV是這樣的從而使（i)其具有基本減小的（如至少統(tǒng)計(jì)學(xué)上相關(guān)減小 的傾向）產(chǎn)生蛋白干擾（如本文定義）的傾向；和/或是這樣的從而使（ii)其在本文所述 的本發(fā)明的方法（如在實(shí)施例3或5所述的具體測(cè)試法）中，具有基本減少的與如本文所 述的分析抗體（如在實(shí)施例2中所述的多克隆抗體）結(jié)合的能力，在兩種情形中都優(yōu)選地 與相同的但在其C-端末端具有氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)的VHH，納米抗體或ISV 比較。例如參考在實(shí)施例3中列出的測(cè)定法和數(shù)據(jù)。
[0142] 前述VHH' s，納米抗體或（其他）ISVs優(yōu)選地是這樣的從而使它們具有少于500 的與21-4結(jié)合的RU值（根據(jù)在實(shí)施例9中提出的方案，并且在關(guān)于分子量調(diào)整測(cè)量的 RU值后確定）。還應(yīng)該注意，無(wú)論何時(shí)在本文的說(shuō)明書(shū)或權(quán)利要求中提及任何C-端序列 VTVSS(X)n(包括根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面的上述方面（a)-(p)中任一個(gè)），氨基酸X中 沒(méi)有一個(gè)是半胱氨酸殘基。
[0143] 例如，在一些優(yōu)選的方面中，ISV或包含ISV的構(gòu)建體的C-端末端（當(dāng)該C-端末 端是VH-衍生的ISV，VHH或納米抗體時(shí)）可以是 ：
[0144] (a)VTVSS(X)n，其中 n=l 并且 X=Ala ;
[0145] (b)VTVSS(X)n，其中 n=2 并且每個(gè) X=Ala ;
[0146] (c)VTVSS(X)n，其中 n=3 并且每個(gè) X=Ala ;
[0147] (d)VTVSS(X)n，其中n=2并且至少一個(gè)X=Ala (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0148] (e)VTVSS(X)n，其中n=3并且至少一個(gè)X=Ala (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0149] (f)VTVSS(X)n，其中n=3并且至少兩個(gè)X=Ala (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0150] (g)VTVSS(X)n，其中 n=l 并且 X=Gly;
[0151] (h)VTVSS(X)n，其中 n=2 并且每個(gè) X=Gly;
[0152] (i)VTVSS(X)n，其中 n=3 并且每個(gè) X=Gly;
[0153] (j)VTVSS(X)n，其中n=2并且至少一個(gè)X=Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0154] (k)VTVSS(X)n，其中n=3并且至少一個(gè)X=Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0155] (1) VTVSS (X) n，其中n=3并且至少兩個(gè)X=Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0156] (m)VTVSS(X)n，其中 n=2 并且每個(gè) X=Ala 或 Gly;
[0157] (1〇￥1755(父)11，其中11=3并且每個(gè)父=六1&或61 7;
[0158] (〇) VTVSS (X) n，其中n=3并且至少一個(gè)X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地 選自任何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);或
[0159] (p) VTVSS (X) n，其中n=3并且至少兩個(gè)X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地 選自任何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0160] 其中方面（a)，（b)，（c)，（g)，（h)，⑴，（m)和（η)是特別優(yōu)選的，其中n=l或2的 方面是優(yōu)選的和其中n=l的方面是特別優(yōu)選的。
[0161] 應(yīng)該注意，無(wú)論何時(shí)在本文的說(shuō)明書(shū)或權(quán)利要求中提及任何C-端序列VTVSS(X) n(包括根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面的上述方面（a)-(p)中任一個(gè)），氨基酸X中沒(méi)有一個(gè) 是半胱氨酸殘基。
[0162] 因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)， 其是納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序 列為VTVSS(X)n的C-端末端，其中n=l并且X=Ala(或在其C-端末端包含所述ISV(并且 優(yōu)選地所述納米抗體的）蛋白或多肽）。
[0163] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=2并且每個(gè)X=Ala (或在其C-端末端包含所述ISV (并且優(yōu) 選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0164] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=2并且至少一個(gè)X=Ala (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)(或在其C-端末端包含所 述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0165] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且至少一個(gè)X=Ala (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)(或在其C-端末端包含所 述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0166] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且至少兩個(gè)X=Ala (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)(或在其C-端末端包含所 述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0167] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且X=Ala (或在其C-端末端包含所述ISV (優(yōu)選地所述 納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0168] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=l并且X=Gly (或在其C-端末端包含所述ISV (優(yōu)選地所述 納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0169] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=2并且每個(gè)X=Gly (或在其C-端末端包含所述ISV (優(yōu)選地 所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0170] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且每個(gè)X=Gly (或在其C-端末端包含所述ISV (優(yōu)選地 所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0171] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=2并且至少一個(gè)X=Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)(或在其C-端末端包含所 述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0172] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且至少一個(gè)X=Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)(或在其C-端末端包含所 述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0173] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且至少兩個(gè)X=Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任 何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)(或在其C-端末端包含所 述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0174] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV(其中優(yōu)選納米抗體），具有序列 為VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=2并且每個(gè)X=Ala或Gly (或在其C-端末端包含所述 ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0175] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV(其中優(yōu)選納米抗體），具有序列 為VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且每個(gè)X=Ala或Gly (或在其C-端末端包含所述 ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0176] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且至少一個(gè)X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地 選自任何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)(或在其C-端末端 包含所述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）?；?br> [0177] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS (X)n的C-端末端，其中n=3并且至少兩個(gè)X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地 選自任何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)(或在其C-端末端 包含所述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0178] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選所述納米抗體），具有序 列為VTVSS (X) n的C-端末端，其中n=1，2或3，其中每個(gè)X=A1 a或G1 y。
[0179] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選所述納米抗體），所述 VH序列具有序列為VTVSS (X)n的C-端末端，其中
[0180] -n=l, 2 或 3,其中每個(gè) X=Ala 或 Gly ;或
[0181] _n=2或3，其中除了一個(gè)之外全部的X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選 自任何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie)
[0182] 或在其C-端末端包含所述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽）。
[0183] 在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是 納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的（其它）ISV (其中優(yōu)選納米抗體），具有序列為 VTVSS(x)d9c-端末端，其中：
[0184] -n=l, 2 或 3,其中每個(gè) X=Ala 或 Gly ;或
[0185] -n=2或3,其中至少一個(gè)X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任何天然 存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0186] _n=2或3，其中除了一個(gè)之外全部的X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選 自任何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);
[0187] 或在其C-端末端包含所述ISV (優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽。
[0188] 在上述方面中，關(guān)于"包含VH序列或衍生自VH序列的ISV"的所述（其他）ISV， 意為任何這樣的包含VH序列或衍生自VH序列的ISV，其不是納米抗體（S卩，不是VHH，人源 化的VHH或駱駝源化的VH)。例如，這樣的（其他）ISV可以例如是基于VH的（單）結(jié)構(gòu)域 抗體，基于VH的dAb?，或基于VH的微體（microbody)(見(jiàn)W0 00/29004)。
[0189] 此外，應(yīng)該注意，無(wú)論何時(shí)在本文提及的一個(gè)ISV' s具有根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體 方面的C-端序列VTVSS (X) n (包括但不限于在前述方面中提及的ISV's)，在序列VTVSS (X) n中沒(méi)有一個(gè)氨基酸X是半胱氨酸殘基。
[0190] 如本文進(jìn)一步所述，任何所述蛋白或多肽可以例如是這樣的構(gòu)建體，其包含任選 地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭連接的兩個(gè)以上的ISV'S (如兩個(gè)以上的納米抗體）。因此， 例如所述構(gòu)建體可以是二價(jià)、三價(jià)、四價(jià)或五價(jià)構(gòu)建體（如二價(jià)、三價(jià)、四價(jià)或五價(jià)納米抗 體構(gòu)建體），并且可以例如是二價(jià)、三價(jià)、四價(jià)或五價(jià)構(gòu)建體（如二價(jià)，三價(jià)，四價(jià)或五價(jià)納 米抗體構(gòu)建體），其是雙特異性，三特異性或雙互補(bǔ)位構(gòu)建體（包括例如也可以結(jié)合血清白 蛋白（優(yōu)選的）或其他血清蛋白以延長(zhǎng)半衰期的單特異性，雙特異性或雙互補(bǔ)位構(gòu)建體）。
[0191] 此外，根據(jù)上述每個(gè)方面的納米抗體，ISVs和蛋白/多肽優(yōu)選地是這樣的從而使 它們具有少于500的與21-4結(jié)合的RU值(根據(jù)在實(shí)施例9中提出的方案，并且在根據(jù)上述 提出的公式關(guān)于所用的ISV或蛋白的分子量調(diào)整測(cè)量的RU值后確定)。
[0192] 如本文提及，還認(rèn)為本發(fā)明還可以用于在其C-端末端具有VH-結(jié)構(gòu)域的其他蛋 白或多肽(和具體地抗體片段如Fab片段或基于抗體片段的其他蛋白或多肽，如ScFv' s)。 因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及這樣的蛋白或多肽（如ScFv)，所述蛋白或多肽在 其C-端末端具有VH結(jié)構(gòu)域，所述VH結(jié)構(gòu)域在其C-端末端具有氨基酸序列VTVSS(X) n(SEQ ID N0:34)，其中η是1-10,優(yōu)選地1-5,如1，2,3,4或5,并且其中每個(gè)X是（優(yōu) 選地天然存在）的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基獨(dú)立地選擇（并且優(yōu)選地獨(dú)立選自由丙 氨酸（Α)、甘氨酸（G)、纈氨酸（V)、亮氨酸（L)或異亮氨酸⑴組成的組）。此外，根據(jù) 一些具體的方面，所述C-端末端可以根據(jù)上述（a)-(p)中任一項(xiàng)所述，并且優(yōu)選地根據(jù) (a)，（b)，（c)，（g)，（h)，⑴，（m)或（η)之一所述，其中η是1，2或3并且優(yōu)選地1或2。
[0193] 此外，所述蛋白或多肽優(yōu)選地是這樣的從而使它們具有少于500的與21-4結(jié)合的 RU值(根據(jù)在實(shí)施例9中提出的方案，并且在根據(jù)上述提出的公式關(guān)于所用的ISV或蛋白的 分子量調(diào)整測(cè)量的RU值后確定)。此外，再一次，根據(jù)本發(fā)明的該方面的一個(gè)具體方面，在 C-端序列VTVSS (Χ)η中的氨基酸X沒(méi)有一個(gè)是半胱氨酸殘基。
[0194] 本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含ISV(并且優(yōu)選地治療性ISV)或含有至少一個(gè) ISV(并且優(yōu)選地至少一種治療性ISV)的蛋白或多肽和至少一種適合的載體、稀釋劑或賦 形劑（即適合用于藥用），和任選地一種或多種其他活性物質(zhì)，其中所述ISV、蛋白或多肽如 本文進(jìn)一步所述（即根據(jù)本文所述的一個(gè)或多個(gè)方面的ISV、蛋白或多肽，和具體地根據(jù)前 述頁(yè)上所述一個(gè)或多個(gè)方面的ISV、蛋白或多肽；和更具體地具有根據(jù)本文所述的一個(gè)或 多個(gè)方面的C-端末端/序列的ISV、蛋白或多肽）。所述組合物、載體、稀釋劑或賦形劑可 以例如如在W0 08/020079中關(guān)于包含納米抗體或含有至少一種納米抗體的蛋白或多肽的 藥物組合物所述（并且也如已經(jīng)提及的，根據(jù)本發(fā)明，ISV也優(yōu)選地是納米抗體）。
[0195] 本發(fā)明還涉及用于治療人（例如需要所述治療的患者）的疾病的ISV或包含至 少一個(gè)ISV的蛋白或多肽，其中所述ISV、蛋白或多肽如本文進(jìn)一步所述（即根據(jù)本文所述 的一個(gè)或多個(gè)方面的ISV、蛋白或多肽，和具體地根據(jù)在前述頁(yè)上所述一個(gè)或多個(gè)方面的 ISV、蛋白或多肽；和更具體地具有根據(jù)本文所述的一個(gè)或多個(gè)方面的C-端末端/序列的 ISV、蛋白或多肽）。
[0196] 本發(fā)明還涉及ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋白或多肽用于制備藥物組合物的用 途，其中所述ISV、蛋白或多肽如本文進(jìn)一步所述（即根據(jù)本文所述的一個(gè)或多個(gè)方面的 ISV、蛋白或多肽，和具體地根據(jù)在前述頁(yè)上所述一個(gè)或多個(gè)方面的ISV、蛋白或多肽；和更 具體地具有根據(jù)本文所述的一個(gè)或多個(gè)方面的C-端末端/序列的ISV、蛋白或多肽）。
[0197] 本發(fā)明還涉及治療方法，所述方法包括向人受試者(例如需要所述治療的患者）施 用在藥物組合物的制劑中的ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋白或多肽，其中所述ISV、蛋白或 多肽如本文進(jìn)一步所述（即根據(jù)本文所述的一個(gè)或多個(gè)方面的ISV、蛋白或多肽，和具體地 根據(jù)在前述頁(yè)上所述一個(gè)或多個(gè)方面的ISV、蛋白或多肽；和更具體地具有根據(jù)本文所述 的一個(gè)或多個(gè)方面的C-端末端/序列的ISV、蛋白或多肽；或包含至少一種所述ISV、蛋白 或多肽的藥物組合物（如上所述）。
[0198] 關(guān)于上述方面，清楚的是本文所述的ISV's，蛋白和多肽的治療應(yīng)用是本發(fā)明非常 重要的方面，因?yàn)樗鲋委煈?yīng)用（或用于所述治療應(yīng)用的所述ISV's，蛋白和多肽的臨床開(kāi) 發(fā)）可以包括使用ADA測(cè)定法來(lái)確定所述ISV、蛋白或多肽是否是免疫原性的（即當(dāng)施用于 人受試者時(shí)可以產(chǎn)生ADA' s)。在該方面，清楚的是當(dāng)治療劑用于更長(zhǎng)時(shí)期（在數(shù)周、數(shù)月 或數(shù)年時(shí)期內(nèi)），和/或在人受試者中具有至少3天，如至少一周，并且至多可達(dá)10天以上 的半衰期（優(yōu)選地以tl/2-β表示）時(shí)，關(guān)于可能的免疫原性的問(wèn)題特別需要得到解決。
[0199] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面，如本文所述的ISV、蛋白、多肽或藥物組合物意 欲用于治療人的慢性疾病，和/或如本文所述的這樣的ISV、蛋白、多肽意欲在（即以治療 活性劑量）施用其的受試者的循環(huán)中（即以藥理學(xué)活性水平）存在至少一周，優(yōu)選地至少 兩周，如至少一個(gè)月的時(shí)期；和/或如本文所述的這樣的ISV、蛋白、多肽是這樣的從而使 其在人受試者中具有至少3天，如至少一周，并且最多可達(dá)10天以上的半衰期（優(yōu)選地以 tl/2-β表示）；和/或如本文所述的這樣的ISV、蛋白、多肽或藥物組合物意欲作為兩個(gè)以 上的劑量（dose)施用于人,所述兩個(gè)以上的劑量在至少3天,如至少1周，例如至少2周或 至少一個(gè)月，或甚至更長(zhǎng)（即至少3個(gè)月，至少6個(gè)月或至少一年）的時(shí)期內(nèi)施用，或甚至 長(zhǎng)期施用。
[0200] 本發(fā)明還涉及（基本）減少或基本消除ISV，納米抗體或基于ISV的藥物或基于納 米抗體的藥物產(chǎn)生蛋白干擾的傾向的方法，所述方法包括至少下述步驟：
[0201] -使用至少包括如本文提及的步驟（i)和（ii)的方法，任選地確定ISV、納米抗 體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物產(chǎn)生蛋白干擾的傾向；
[0202] -通過(guò)下述方式修飾所述ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物： 通過(guò)在所述ISV或納米抗體中引入一種或多種、一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，添加或缺失，或在 基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物的C-端ISV或納米抗體（如果存在）中引入一種 或多種、一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，添加或缺失；和具體地通過(guò)在所述ISV或納米抗體的C-端 區(qū)引入一種或多種氨基酸取代或添加，或在基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物的C-端 ISV或納米抗體（如果存在）的C-端區(qū)引入一種或多種氨基酸取代或添加，例如通過(guò)向序 列的C-端末端添加1-10,如1-5,如1，2, 3, 4或5個(gè)氨基酸殘基，所述氨基酸殘基每個(gè)獨(dú)立 地選自任何天然存在的氨基酸（如在W0 09/138519的第64頁(yè)的表A-2中列舉的那些，例 如但不限于丙氨酸，甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸）；
[0203] -使用至少包括如本文提及的步驟（i)和（ii)的方法確定這樣修飾的ISV、納米 抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物產(chǎn)生蛋白干擾的傾向；任選地以這樣的方式 進(jìn)行，即允許這樣修飾的ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物產(chǎn)生蛋白 干擾的傾向與起始ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物產(chǎn)生蛋白干擾的 傾向進(jìn)行比較（包括，但不限于，在如本文所述的關(guān)于與分析抗體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中比 較它們）。備選地，可以使用涉及使用21-4的本文所述的方法。
[0204] 現(xiàn)在本發(fā)明通過(guò)下述非限制性優(yōu)選的方面，實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述，其中：
[0205] -圖1A-1C示意性顯示ADA測(cè)定法形式的一些非限制性實(shí)例。關(guān)于進(jìn)行這些測(cè)定 法的一些代表性但非限制性的方法在實(shí)施例4中提及。
[0206] -圖2示意性顯示ISV、諸如納米抗體的代表性3D結(jié)構(gòu)。
[0207] -圖3是顯示NB's3. 4-3. 9 (SEQ ID NO's. 5-10)與在實(shí)施例2中獲得的固定化的 多克隆抗體結(jié)合的結(jié)合曲線(使用在實(shí)施例3中所述的BIAC0RE測(cè)定法獲得)。
[0208] -圖 4 是顯示 NB' s3. 4, 3. 11，3. 12 和 3. 13 (SEQ ID NO' s: 5, 12, 13 和 14)與在實(shí) 施例2中獲得的固定化的多克隆抗體結(jié)合的結(jié)合曲線（使用在實(shí)施例3中所述的BIAC0RE 測(cè)定法獲得)。
[0209] -圖 5 是顯示 NB' s3. 4, 3. 14 和 3. 15 (SEQ ID NO' s: 5, 15 和 16)與在實(shí)施例 2 中 獲得的固定化的多克隆抗體結(jié)合的結(jié)合曲線（使用在實(shí)施例3中所述的BIAC0RE測(cè)定法獲 得)。
[0210] -圖6是顯示NB' s3. 1，3. 2和3. 4 (SEQ ID NO' s: 3, 4和5)與在實(shí)施例2中獲得 的固定化的多克隆抗體結(jié)合的結(jié)合曲線(使用在實(shí)施例3中所述的BIAC0RE測(cè)定法獲得)。
[0211] -圖7是顯示NB' s4.1和4.2 (SEQ ID NO' s: 17和18)與在實(shí)施例2中獲得的固 定化的多克隆抗體結(jié)合的結(jié)合曲線(使用在實(shí)施例3中所述的BIAC0RE測(cè)定法獲得)。
[0212] -圖 8 是顯示 NB's6. 1，6. 2, 6. 4 和 6. 5(SEQ ID N0'sl9-22)與在實(shí)施例 2 中獲得 的固定化的多克隆抗體結(jié)合的結(jié)合曲線(使用在實(shí)施例3中所述的BIAC0RE測(cè)定法獲得)。
[0213] -圖9提供這樣的表，所述表顯示在實(shí)施例8中所用的序列（SEQ ID NO's :37-89) 并且展示相應(yīng)的參考序列。
[0214] 在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中提及的序列在下面的表A中列出（SEQ ID NO' s:l-37)和在圖 9 中列出（SEQ ID NO' s:38-89)。
[0215] 表 A
[0216]
【權(quán)利要求】
1. 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是納米抗體或包含VH序列（即，不同于納米抗 體的）或衍生自VH序列的ISV，所述ISV具有序列為VTVSS (X) n的C-端末端，其中： -n=l, 2或3(并且優(yōu)選地1或2),其中每個(gè)X=Ala或Gly ;或 -n=l, 2或3(并且優(yōu)選地1或2),其中每個(gè)X=Ala ;或 -n=l, 2或3(并且優(yōu)選地1或2),其中每個(gè)X=Gly ;或 -n=2或3,其中至少一個(gè)X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自任何天然存在 的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie);或 -n=2或3,其中除了一個(gè)X之外所有的X=Ala或Gly (其余的氨基酸殘基X獨(dú)立地選自 任何天然存在的氨基酸但是優(yōu)選獨(dú)立地選自Val，Leu和/或lie); 或在其C-端末端包含所述ISV(優(yōu)選地所述納米抗體）的蛋白或多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)、蛋白或多肽，其中： -n=l, 2或3(并且優(yōu)選地1或2),其中每個(gè)X=Ala或Gly ;或 -n=l, 2或3(并且優(yōu)選地1或2),其中每個(gè)X=Ala ;或 -n=l, 2或3(并且優(yōu)選地1或2),其中每個(gè)X=Gly。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)、蛋白或多肽，其中X不是半 胱氨酸。
4. 免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)，其是納米抗體或包含VH序列或衍生自VH序列的 ISV，所述ISV具有序列為VTVSS (X)n的C-端末端，其中η是1-10,優(yōu)選地1-5,如1，2, 3, 4 或5 (和優(yōu)選地1或2,如1)，并且其中每個(gè)X是（優(yōu)選地天然存在的）氨基酸殘基，所述 氨基酸殘基獨(dú)立地選擇（并且優(yōu)選獨(dú)立地選自由丙氨酸（Α)、甘氨酸（G)、纈氨酸（V)、亮 氨酸（L)或異亮氨酸（I)組成的組，條件是X不是半胱氨酸；或在其C-端末端包含這樣的 ISV(并且優(yōu)選地這樣的納米抗體）的蛋白或多肽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)、蛋白或多肽，其 中所述（C-端）ISV是納米抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（ISV)、蛋白或多肽， 其具有少于500的與21-4結(jié)合的RU值，所述RU值是根據(jù)在實(shí)施例9中提出的方案使用 Biacore并且在根據(jù)公式（[測(cè)量的RU]/[蛋白的MW]xl06)，關(guān)于ISV、蛋白或多肽的分子量 調(diào)整測(cè)量的RU值后確定。
7. 用于預(yù)測(cè)ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋白或多肽是否將在免疫測(cè)定法如ADA測(cè)定法 中產(chǎn)生蛋白干擾的方法，所述方法包括進(jìn)行至少包括下述步驟的免疫測(cè)定法： (i) 使所述ISV或蛋白/多肽與已經(jīng)獲自人受試者并且已經(jīng)基于其識(shí)別和/或結(jié)合所 述ISV的C-端末端的能力選擇/分離的抗體接觸；和 (ii) 確定所述ISV、蛋白或多肽在所述免疫測(cè)定法中是否與所述抗體結(jié)合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述ISV是納米抗體或作為VH結(jié)構(gòu)域或包含VH 結(jié)構(gòu)域的（其它）ISV( S卩，不同于納米抗體）。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述ISV是納米抗體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7或9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白或多肽在其C-端末端具 有所述ISV。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ISV、蛋白或多肽在步驟（ii) 中與所述抗體結(jié)合的事實(shí)意味著所述ISV、蛋白或多肽能夠產(chǎn)生（或具有較高或增加的風(fēng) 險(xiǎn)產(chǎn)生）這樣的蛋白干擾。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7或11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是多克隆抗體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是這樣的多克隆抗體，其 已經(jīng)如下獲得：從已經(jīng)獲自人受試者并且適合用作獲得多克隆抗體的原材料的生物樣品開(kāi) 始，通過(guò)包括至少一個(gè)（免疫）親和層析步驟和任選地一個(gè)或多個(gè)其他的用于從所述樣品 中分離和/或純化多克隆抗體的步驟(在所述親和步驟之前和/或之后進(jìn)行）的方法獲得， 在所述親和層析中使用這樣的親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)攜帶ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋 白或多肽和/或其中將所述ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋白或多肽用作親和結(jié)構(gòu)部分或抗 原。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中在親和基質(zhì)上攜帶和/或用作親和結(jié)構(gòu)部分或 抗原的所述ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋白或多肽是這樣的ISV或包含至少一種這樣的 ISV的蛋白或多肽，所述ISV在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)結(jié)尾，或其 中在親和基質(zhì)上攜帶和/或用作親和結(jié)構(gòu)部分或抗原的所述ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋 白或多肽在其C-端末端具有這樣的ISV或納米抗體，所述ISV或納米抗體在其C-端末端 以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)結(jié)尾。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中在親和基質(zhì)上攜帶和/或用作親和結(jié)構(gòu)部 分或抗原的所述ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋白或多肽是這樣的ISV或包含至少一種這樣 的ISV的蛋白或多肽，所述ISV在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)結(jié)尾并 且在位置14處具有脯氨酸殘基；或其中在親和基質(zhì)上攜帶和/或用作親和結(jié)構(gòu)部分或抗原 的所述ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋白或多肽在其C-端末端具有這樣的ISV或包含至少 一個(gè)ISV的蛋白或多肽，所述ISV在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID N0:33)結(jié)尾 并且在位置14處具有脯氨酸殘基。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述親和基質(zhì)上攜帶和/或用作 所述親和結(jié)構(gòu)部分或抗原的ISV或納米抗體是序列-優(yōu)化的和/或人源化的納米抗體（如 序列-優(yōu)化的和/或人源化VHH或駱駝源化的VH，如駱駝源化的人VH);或其中在所述親和 基質(zhì)上攜帶和/或用作親和結(jié)構(gòu)部分或抗原的基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物在其 C-端末端具有這樣的ISV或納米抗體，所述ISV或納米抗體是序列-優(yōu)化的和/或人源化 的納米抗體(如序列-優(yōu)化的和/或人源化的VHH或駱駝源化的VH，如駱駝源化的人VH)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述親和基質(zhì)上攜帶和/或 用作所述親和結(jié)構(gòu)部分或抗原的ISV或納米抗體是序列-優(yōu)化的和/或人源化的納米抗 體，所述序列-優(yōu)化的和/或人源化的納米抗體在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS (SEQ ID N0:33)結(jié)尾并且在位置14處具有脯氨酸殘基，其已經(jīng)被引入作為相應(yīng)的天然存在的VHH的 人源化和/或序列優(yōu)化的部分；或其中在所述親和基質(zhì)上攜帶和/或用作親和結(jié)構(gòu)部分或 抗原的基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物在其C-端末端具有序列-優(yōu)化的和/或人 源化的納米抗體，所述序列-優(yōu)化的和/或人源化的納米抗體在其C-端末端以氨基酸序列 VTVSS(SEQ ID N0:33)結(jié)尾并且在位置14處具有脯氨酸殘基，其已經(jīng)被引入作為相應(yīng)的天 然存在的VHH的人源化和/或序列優(yōu)化的部分。
18. 權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求7-11或權(quán)利要求18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是這樣的多 克隆抗體，其已經(jīng)如下獲得：從已經(jīng)獲自人受試者并且適合用作獲得單克隆抗體的原材料 的生物樣品開(kāi)始，通過(guò)包括至少一個(gè)篩選或選擇步驟和任選地一個(gè)或多個(gè)其他的用于從所 述樣品中分離和/或純化單克隆抗體的步驟(在所述篩選和/或選擇步驟之前和/或之后 進(jìn)行)的方法獲得，在所述篩選或選擇步驟中ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗 體的藥物用于篩選和選擇結(jié)合所述ISV、納米抗體、基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物 (和具體地結(jié)合其C-端末端）的單克隆抗體。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在所述篩選或選擇步驟中所用的ISV或納米抗 體在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID NO:33)結(jié)尾，或其中在所述篩選或選擇步驟 中所用的基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物在其C-端末端具有這樣的ISV或納米抗 體，所述ISV或納米抗體在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID NO:33)結(jié)尾。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的方法，其中在所述篩選或選擇步驟中所用的ISV或納 米抗體在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID NO: 33)結(jié)尾并且在位置14處具有脯氨 酸殘基，或其中在所述篩選或選擇步驟中所用的基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物在 其C-端末端具有這樣的ISV或納米抗體，所述ISV或納米抗體在其C-端末端以氨基酸序 列VTVSS(SEQ ID N0:33)結(jié)尾并且在位置14處具有脯氨酸殘基。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19、20或21所述的方法，其中在所述篩選或選擇步驟中所用的ISV 或納米抗體是序列-優(yōu)化的和/或人源化的納米抗體（如序列-優(yōu)化的和/或人源化的VHH 或駱駝源化的VH，如駱駝源化的人VH);或其中在所述篩選或選擇步驟中所用的基于ISV的 藥物或基于納米抗體的藥物在其C-端末端具有這樣的ISV或納米抗體，其是序列-優(yōu)化的 和/或人源化的納米抗體（如序列-優(yōu)化的和/或人源化的VHH或駱駝源化的VH，如駱駝 源化的人VH)。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述篩選或選擇步驟中所用的 ISV或納米抗體是序列-優(yōu)化的和/或人源化的納米抗體，所述序列-優(yōu)化的和/或人源化 的納米抗體在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID NO: 33)結(jié)尾并且在位置14處具有 脯氨酸殘基，其已經(jīng)被引入作為相應(yīng)的天然存在的VHH的人源化和/或序列優(yōu)化的部分；或 其中在所述篩選或選擇步驟中所用的基于ISV的藥物或基于納米抗體的藥物在其C-端末 端具有這樣的序列-優(yōu)化的和/或人源化的納米抗體，所述序列-優(yōu)化的和/或人源化的 納米抗體在其C-端末端以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID NO: 33)結(jié)尾并且在位置14處具有脯 氨酸殘基，其已經(jīng)被引入作為相應(yīng)的天然存在的VHH的人源化和/或序列優(yōu)化的部分。
24. 能夠用于預(yù)測(cè)ISV或包含至少一個(gè)ISV的蛋白或多肽在免疫測(cè)定法中是否會(huì)產(chǎn)生 (或具有較高或增加的傾向產(chǎn)生）蛋白干擾（和/或預(yù)測(cè)所述ISV或包含至少一個(gè)ISV的 蛋白或多肽是否將與人血液或血清中存在的干擾因子結(jié)合）的方法，所述方法包括進(jìn)行至 少包括下述步驟的免疫測(cè)定法： (i) 使所述ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）與單克隆抗體 21-4( S卩，用作"分析抗體"）接觸；和 (ii) 確定所述ISV或納米抗體（或基于ISV或基于納米抗體的藥物）在所述免疫測(cè)定 法中是否與所述單克隆抗體21-4結(jié)合。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述ISV是納米抗體或作為VH結(jié)構(gòu)域或包含 VH結(jié)構(gòu)域的（其它）ISV(g卩，不同于納米抗體）。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中所述ISV是納米抗體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白或多肽在其C-端末端具 有所述ISV。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法根據(jù)在實(shí)施例9中所述的方案 進(jìn)行。
29. 藥物組合物，其包含：根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的ISV、蛋白或多肽；和至少 一種適合的載體、稀釋劑或賦形劑。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中： -所述組合物、ISV、蛋白或多肽意欲用于治療人的慢性疾病，和/或 -所述ISV、蛋白或多肽意欲在（即以治療活性劑量）施用其的受試者的循環(huán)中（即以 藥理學(xué)活性水平）存在至少一周，優(yōu)選地至少兩周，如至少一個(gè)月的時(shí)期；和/或 -所述ISV、蛋白、多肽是這樣的從而使其在人受試者中具有至少3天，如至少一周，并 且最多可達(dá)10天以上的半衰期（優(yōu)選地以tl/2-β表示）；和/或這樣 -所述ISV、蛋白、多肽或藥物組合物意欲作為兩個(gè)以上的劑量施用于人，所述兩個(gè)以 上的劑量在至少3天，如至少1周，例如至少2周或至少一個(gè)月，或甚至更長(zhǎng)（即至少3個(gè) 月，至少6個(gè)月或至少一年）的時(shí)期內(nèi)施用，或甚至長(zhǎng)期施用。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的ISV、蛋白或多肽，其用于治療人的疾病。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1-6和/或權(quán)利要求31中任一項(xiàng)所述的ISV、蛋白或多肽，其中： -所述ISV、蛋白或多肽意欲用于治療人的慢性疾病，和/或 -所述ISV、蛋白、多肽意欲在（即以治療活性劑量）施用其的受試者的循環(huán)中（即以 藥理學(xué)活性水平）存在至少一周，優(yōu)選地至少兩周，如至少一個(gè)月的時(shí)期；和/或 -所述ISV、蛋白、多肽是這樣的從而使其在人受試者中具有至少3天，如至少一周，并 且最多可達(dá)10天以上的半衰期（優(yōu)選地以tl/2-β表示）；和/或這樣 -所述ISV、蛋白、或多肽意欲作為兩個(gè)以上的劑量施用于人，所述兩個(gè)以上的劑量在 至少3天，如至少1周，例如至少2周或至少一個(gè)月，或甚至更長(zhǎng)（即至少3個(gè)月，至少6個(gè) 月或至少一年）的時(shí)期內(nèi)施用，或甚至長(zhǎng)期施用。
33. 根據(jù)權(quán)利要求1-6、權(quán)利要求31或32中任一項(xiàng)所述的ISV或蛋白或多肽在制備藥 物組合物中的應(yīng)用，和具體地，在制備根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的藥物組合物中的應(yīng)用。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用，其中 -所述ISV、蛋白或多肽意欲用于治療人的慢性疾病，和/或 -所述ISV、蛋白、多肽意欲在（即以治療活性劑量）施用其的受試者的循環(huán)中（即以 藥理學(xué)活性水平）存在至少一周，優(yōu)選地至少兩周，如至少一個(gè)月的時(shí)期；和/或 -所述ISV、蛋白、多肽是這樣的從而使其在人受試者中具有至少3天，如至少一周，并 且最多可達(dá)10天以上的半衰期（優(yōu)選地以tl/2-β表示）；和/或這樣 -所述ISV、蛋白、或多肽意欲作為兩個(gè)以上的劑量施用于人，所述兩個(gè)以上的劑量在 至少3天，如至少1周，例如至少2周或至少一個(gè)月，或甚至更長(zhǎng)（即至少3個(gè)月，至少6個(gè) 月或至少一年）的時(shí)期內(nèi)施用，或甚至長(zhǎng)期施用。
35. 治療方法，所述方法包括向人受試者（例如向需要所述治療的患者）施用根據(jù)權(quán)利 要求1-6, 31或32之一所述的ISV或蛋白或多肽或根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的藥物組合 物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的治療方法，其中： -所述藥物組合物、ISV、蛋白或多肽意欲用于治療人的慢性疾病，和/或 -所述ISV、蛋白、多肽意欲在（即以治療活性劑量）施用其的受試者的循環(huán)中（即以 藥理學(xué)活性水平）存在至少一周，優(yōu)選地至少兩周，如至少一個(gè)月的時(shí)期；和/或 -所述ISV、蛋白、多肽是這樣的從而使其在人受試者中具有至少3天，如至少一周，并 且最多可達(dá)10天以上的半衰期（優(yōu)選地以tl/2-β表示）；和/或這樣的 -所述藥物組合物、ISV、蛋白、或多肽意欲作為兩個(gè)以上的劑量施用于人，所述兩個(gè)以 上的劑量在至少3天，如至少1周，例如至少2周或至少一個(gè)月，或甚至更長(zhǎng)（即至少3個(gè) 月，至少6個(gè)月或至少一年）的時(shí)期內(nèi)施用，或甚至長(zhǎng)期施用。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK104203975SQ201280030902
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月23日
【發(fā)明者】尤迪特·鮑邁斯特, 瑪麗-葆拉·呂西安娜·阿曼達(dá)·布什, 卡羅·布東, 瑪麗-安格·比斯, 維爾勒·斯諾爾克, 斯特凡妮·斯塔埃朗 申請(qǐng)人:埃博靈克斯股份有限公司