專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫球蛋白G Fc區(qū)結(jié)合多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合免疫球蛋白G Fe (IgG Fe)的多肽及其生產(chǎn)方法。所述多肽在例如抗體和/或Fe融合蛋白生產(chǎn)中的分離和/或純化中，例如在色譜法中具有工業(yè)應(yīng)用。背景
在單克隆抗體和Fe融合蛋白的工業(yè)生產(chǎn)中，經(jīng)常使用色譜法進(jìn)行純化。由于蛋白A對(duì)IgG的Fe部分的天然親和力，來(lái)自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A早已在所述應(yīng)用中被用作親和配體。其后，蛋白A以其整體，及其五個(gè)單獨(dú)的Fe-結(jié)合結(jié)構(gòu)域被用作用于合理設(shè)計(jì)具有改進(jìn)性能的經(jīng)工程改造親和配體的起始點(diǎn)。例如，蛋白A的B結(jié)構(gòu)域被用作用于產(chǎn)生經(jīng)工程改造的、IgG Fe-結(jié)合的、單個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白 Z 的起始點(diǎn)(Nilsson B 等，Protein Eng I (2) : 107-13,1987)。為了改進(jìn)該蛋白在堿性條件下，例如在工業(yè)色譜過(guò)程期間用于原位清洗程序的條件下的穩(wěn)定性，Linhult等(Proteins 55 (2) :407-16，2004)提出包含突變的天冬酰胺殘基的蛋白Z變體。GE Healthcare、Uppsala、Sweden 將該突變體進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為市售產(chǎn)品 MAbSelect SuRe。W02009/146755公開(kāi)了另外的具有IgG Fe親和力的Z變體。W02009/080811描述了基于蛋白Z的突變的結(jié)合蛋白，其中天然的IgG Fe結(jié)合被修飾。已表明具有五個(gè)單獨(dú)的IgG Fe-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然蛋白A只結(jié)合2分子的IgG或3分子的重組Fe片段，但事實(shí)上五個(gè)結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)都具有結(jié)合一個(gè)IgG的能力(BirgerJansson, PhD 論文，Stockholm, Sweden, 1996, ISBN 91-7170-656-9)。盡管目前使用的IgG Fe親和配體比較成功，但仍需要改進(jìn)，特別是關(guān)于改進(jìn)化學(xué)計(jì)量(stoichiometry)并同時(shí)保持且理想地改進(jìn)對(duì)于酸性和堿性條件的穩(wěn)定性的聯(lián)合需求。不斷提供具有對(duì)于IgG Fe的親和力的試劑仍是一個(gè)極為關(guān)注的問(wèn)題。發(fā)明概述
根據(jù)其第一方面，本發(fā)明提供免疫球蛋白G Fe (IgG Fe)結(jié)合多肽，所述多肽包含選自以下的氨基酸序列
權(quán)利要求
1.一種免疫球蛋白G Fe區(qū)結(jié)合多肽，所述多肽包含選自以下的氨基酸序列 I)X -( Ifim-H iJ-KFDKEQQN AFYEiLXirLPX^ LTEEQRNAFi Qklkdx36PSQS Aellaeakql Xs,EAQA-[觸叔 2\ π-Ccterm-iXcterm 其中，彼此獨(dú)立地， X1為P或無(wú)； I間隔基a為由1-3個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列； X17為任何氨基酸殘基； X20為任何氨基酸殘基； X36為除D外的任何氨基酸殘基； X51為任何氨基酸殘基； I間隔基21為由0-20個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列； Xcteem 為D或無(wú)； 以及η 為 1-4 ; 和 ii)與i)中限定的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I的IgGFe-結(jié)合多肽，其中[間隔基1Λ選自A、AE和AEA。
3.權(quán)利要求2的IgGFe-結(jié)合多肽，其中U司隔基八為Α。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中X17為H。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中X2tl為除N外的任何氨基酸殘基，例如Τ。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中X2tl為N。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中X36選自E和Α，例如Ε。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中X51為除N外的任何氨基酸殘基，例如D。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中X51為N。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中I間隔基2~]的所有氨基酸殘基獨(dú)立地選自A、E、F、G、I、K、L、P、Q、R、S、T和V，特別地選自A、E、G、K、P、Q、R、S和T，例如選自G、Q和S。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中V間隔基2~\為G。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中η為I。
13.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中η為2。
14.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中η為4。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，所述多肽與IgG Fe結(jié)合，使得該相互作用的Kd值為至多I X 10_6 M0
16.權(quán)利要求15的IgGFe-結(jié)合多肽，所述多肽與IgG Fe結(jié)合，使得該相互作用的Kd值為至多1Χ10—7 M0
17.權(quán)利要求16的IgGFe-結(jié)合多肽，所述多肽與IgG Fe結(jié)合，使得該相互作用的Kd值為至多5X10_8 M0
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，所述多肽能夠與人IgG分子的Fe部分結(jié)合。
19.權(quán)利要求18的IgGFe-結(jié)合多肽，所述多肽能夠與1、2和4類(lèi)人IgG結(jié)合。
20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，所述多肽能夠結(jié)合到IgG Fe的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域之間的界面。
21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列i)選自SEQ IDNO:5-6。
22.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽，其中X1為P且Xcteem為D。
23.權(quán)利要求22的IgGFe-結(jié)合多肽，其中所述氨基酸序列i)選自SEQ ID N0:l_4。
24.—種多核苷酸,所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。
25.—種多聚體多肽,所述多聚體多肽包含 至少兩個(gè)亞單位，各亞單位為權(quán)利要求22-23中任一項(xiàng)的多肽；和 N-末端前導(dǎo)肽，所述前導(dǎo)肽包含作為其末端殘基的D殘基。
26.—種多核苷酸,所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求25的多聚體多肽的核苷酸序列。
27.生產(chǎn)權(quán)利要求25的多聚體多肽的方法，所述方法包括 提供含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求26的多核苷酸， 在使得能夠?qū)⑺龆嗪塑账岜磉_(dá)為多聚體多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和 分離所得的多聚體多肽。
28.生產(chǎn)權(quán)利要求22-23中任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括 使用權(quán)利要求27的方法生產(chǎn)權(quán)利要求25的多聚體多肽， 使用酸催化的水解在包含序列DP的位點(diǎn)切割所述多聚體多肽，得到權(quán)利要求22-23中任一項(xiàng)的多肽和N-末端前導(dǎo)肽，和 分離權(quán)利要求22-23中任一項(xiàng)的所述多肽。
29.—種IgG Fe-結(jié)合組合物，所述組合物包含至少一種權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的多肽，其通過(guò)半胱氨酸殘基Cctemh與非肽、非核酸的接頭聚合物共價(jià)偶聯(lián)。
30.權(quán)利要求29的IgGFe-結(jié)合組合物，所述組合物包含I至4種權(quán)利要求1_23中任一項(xiàng)的多肽，各多肽通過(guò)其半胱氨酸殘基Cctemh與所述接頭聚合物共價(jià)偶聯(lián)。
31.權(quán)利要求29-30中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合組合物，其中所述接頭聚合物為聚(乙二醇)。
32.生產(chǎn)權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的組合物的方法，所述方法包括 提供至少一種權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的多肽，和 通過(guò)所述多肽中存在的半胱氨酸殘基Cctemh將所述多肽與非肽、非核酸的接頭聚合物偶聯(lián)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述多肽為權(quán)利要求22-23中任一項(xiàng)的多肽，且所述提供通過(guò)實(shí)施權(quán)利要求28的方法進(jìn)行。
34.權(quán)利要求32-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述接頭聚合物為聚乙二醇。
35.從樣品中分離包含IgGFe的分子的方法，所述方法包括以下步驟(i)提供液體，其含有包含IgGFC的分子； (ii)使所述液體與權(quán)利要求1-23和29-31中任一項(xiàng)的IgGFe結(jié)合多肽或組合物接觸，其中所述包含IgG Fe的分子與所述多肽或組合物結(jié)合； (iii)從液體中分離結(jié)合的包含IgGFe的分子。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述液體源自表達(dá)包含IgGFe的分子的細(xì)胞。
37.權(quán)利要求35-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含IgGFe的分子為IgG分子或其片段。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述IgG為人IgG。
39.權(quán)利要求37-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述IgG為單克隆IgG抗體。
40.權(quán)利要求35-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含IgGFe的分子為Fe融合蛋白。
41.權(quán)利要求35-40中任一項(xiàng)的方法，其中將所述IgGFe-結(jié)合多肽或組合物固定化在色譜介質(zhì)上。
42.權(quán)利要求1-23和29-31中任一項(xiàng)的IgGFe-結(jié)合多肽或組合物，所述多肽或組合物與不溶性基質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)。
43.權(quán)利要求42的多肽或組合物，其中所述基質(zhì)為色譜基質(zhì)或膜。
44.一種色譜介質(zhì),所述色譜介質(zhì)包含權(quán)利要求42或43的IgG Fe-結(jié)合多肽或組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種免疫球蛋白GFc區(qū)結(jié)合多肽，所述多肽由選自i)的氨基酸序列和與其具有至少95%同一性的氨基酸序列組成。還提供了用于生產(chǎn)所述多肽、包含所述多肽的組合物、編碼所述多肽的多核苷酸以及所述多肽的多聚體的方法，以及使用所述多肽的方法。
文檔編號(hào)B01D15/38GK102811782SQ201180012844
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月8日
發(fā)明者L.阿布拉姆森 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司