具有降低的免疫原性的纖連蛋白結(jié)合域的制作方法
【專利摘要】提供了一種III型纖連蛋白(10Fn3)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其具有與降低免疫原性相關(guān)的新設(shè)計(jì)。本申請(qǐng)描述了可選擇的10Fn3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中某些免疫原區(qū)在產(chǎn)生結(jié)合子(binder)時(shí)不被修飾，以便保持被宿主生物體識(shí)別為自身抗原。本申請(qǐng)還描述了10Fn3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中HLA錨定區(qū)被破壞，從而降低了相鄰區(qū)域的免疫原性貢獻(xiàn)。還提供了具有被修飾區(qū)域的新型組合的10Fn3結(jié)構(gòu)域，其能夠以高親和力結(jié)合期望的靶標(biāo)。
【專利說(shuō)明】具有降低的免疫原性的纖連蛋白結(jié)合域
[0001]序列表
[0002]本申請(qǐng)包含一個(gè)序列表，其已經(jīng)通過(guò)EFS-Web以ASCII格式提交，本文援引并入其全部?jī)?nèi)容。所述ASCII拷貝于2012年10月31日生成，命名為MXI523PC.txt，大小為48，779字節(jié)。
[0003]引言
[0004]纖連蛋白是一個(gè)大蛋白，在細(xì)胞外基質(zhì)的形成和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用中發(fā)揮至關(guān)重要的作用；它由多個(gè)重復(fù)的三種類型(1、II和III型)的小結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(Fn3)是一個(gè)大的亞家族，其成員經(jīng)常作為細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞表面激素和細(xì)胞因子受體、分子伴侶和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一部分被發(fā)現(xiàn)。綜述可見(jiàn) Bork&Doolittle、Proc Natl Acad Sci USA89(19):8990-4(1992) ；Bork et al.、J MolB1l.242(4):309-20(1994) ;Campbell&Spitzfaden、Structure〗(5):333-7(1994)；Harpez&Chothia、J Mol B1l.238 (4):528-39(1994))。
[0005]基于纖連蛋白的支架(Fibronectin based scaffold)是一個(gè)具有免疫球蛋白樣折疊的蛋白的家族。這些蛋白一般使用衍生自III型纖連蛋白(Fn3)或Fn3樣結(jié)構(gòu)域的支架，以天然或工程化抗體(即多克隆、單克隆或單鏈抗體)的特征方式發(fā)揮作用，并且具有結(jié)構(gòu)上的優(yōu)勢(shì)。具體地講，這些抗體模擬物的結(jié)構(gòu)經(jīng)常被優(yōu)化以獲得最佳的折疊、穩(wěn)定性和溶解性，即使是在通常會(huì)導(dǎo)致抗體結(jié)構(gòu)和功能喪失的條件下。基于纖連蛋白的支架蛋白的一個(gè)實(shí)例是Adnectins?(Adnexus、Bristol-Myers Squibb的一個(gè)全資子公司)。已經(jīng)顯不，基于纖連蛋白的支架的CDR樣環(huán)區(qū)能夠被修飾，從而進(jìn)化成能夠結(jié)合任何興趣化合物的蛋白。例如美國(guó)專利N0.7，115，396描述了 Fn3結(jié)構(gòu)域蛋白，其中對(duì)BC、DE和FG環(huán)的改變產(chǎn)生了高親和力的TNFa結(jié)合子。美國(guó)專利N0.7，858，739描述了 Fn3結(jié)構(gòu)域蛋白，其中對(duì)BC、DE和FG環(huán)的改變產(chǎn)生了高親和力的VEGFR2結(jié)合子。
[0006]蛋白藥物在患者體內(nèi)經(jīng)常伴隨一定水平的免疫原性。這些免疫原性問(wèn)題可能導(dǎo)致蛋白藥物效力降低，以及在患者體內(nèi)產(chǎn)生潛在的有害免疫應(yīng)答。因此，獲得免疫原性降低的、并可同時(shí)用于治療和診斷目的的改良纖連蛋白結(jié)構(gòu)域支架蛋白，將是有利的。
[0007]概要
[0008]本申請(qǐng)的一個(gè)方面提供基于纖連蛋白的支架多肽，其包含經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和支架區(qū)，例如與改進(jìn)的靶結(jié)合關(guān)聯(lián)的β_鏈，的新組合。本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了具有降低的免疫原性的新型基于纖連蛋白的支架多肽。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中該1QFn3結(jié)構(gòu)域包含⑴相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)，在從BC、DE和FG環(huán)中選出的至少一個(gè)北極環(huán)(north pole loop)的氨基酸序列中含有修飾，和(?)相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)，在從AB、CD和EF環(huán)中選出的至少一個(gè)南極環(huán)(south pole loop)的氨基酸序列中含有修飾,其中該至少一個(gè)修飾的北極環(huán)和至少一個(gè)修飾的南極環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，多肽的至少一個(gè)北極環(huán)或至少一個(gè)南極環(huán)具有野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
[0010]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中uiFr^結(jié)構(gòu)域包含(i)AB、BC、⑶、DE、EF、或FG環(huán)中的至少一個(gè)的氨基酸序列中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的修飾，和(ii)至少一個(gè)鏈的氨基酸序列中相對(duì)于野生型人’113結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈的修飾，其中該至少一個(gè)修飾的環(huán)和至少一個(gè)修飾的鏈貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，多肽可在至少一個(gè)鏈和至少兩個(gè)環(huán)中包含修飾的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，多肽的至少一個(gè)修飾的環(huán)是從BC、DE和FG環(huán)中選出的北極環(huán)，且至少一個(gè)修飾的環(huán)是從AB、CD和EF環(huán)中選出的南極環(huán)，并且兩個(gè)環(huán)均貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)環(huán)不是修飾的，即至少一個(gè)環(huán)具有對(duì)應(yīng)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
[0011]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中所述wFnS結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在CD和FG環(huán)的氨基酸序列中含有修飾，并且其中CD和FG環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環(huán)的序列，⑶環(huán)的至少3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)氨基酸被修飾。在一些實(shí)施方案中，⑶環(huán)中對(duì)應(yīng)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)氨基酸殘基46或47的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與那些位置處的野生型氨基酸相同。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的序列，F(xiàn)G環(huán)的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個(gè)氨基酸被修飾。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)中對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基75或87的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與那些位置處的野生型氨基酸相同。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，CD環(huán)和/或FG環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。還構(gòu)想了它們的組合。例如，相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，CD和FG環(huán)中的至少一個(gè)的氨基酸序列的長(zhǎng)度可以延長(zhǎng)，且相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，CD和FG環(huán)中的至少一個(gè)的氨基酸序列的長(zhǎng)度縮短。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈的序列，包含修飾的CD和FG環(huán)的wFM結(jié)構(gòu)域的多肽可以進(jìn)一步在β -鏈C、β -鏈D、β -鏈F和/或β -鏈G的一個(gè)或多個(gè)中含有氨基酸序列修飾。在一些實(shí)施方案中，具有修飾的CD和FG環(huán)的多肽可以進(jìn)一步在BC環(huán)的至少一部分中含有氨基酸序列修飾，例如BC環(huán)中對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基30和31的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的修飾。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)修飾的鏈與經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)一起貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，ΑΒ、DE和EF環(huán)的一個(gè)或多個(gè)沒(méi)有被修飾，即所述環(huán)具有野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
[0012]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中該wFM結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在CD和DE環(huán)的氨基酸序列中含有修飾，并且其中CD和DE環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。多肽還可以進(jìn)一步在EF環(huán)、β-鏈C、β-鏈D和/或β-鏈F中的一者或多者的氨基酸序列中包含修飾，并且這些額外的修飾可以和CD和DE環(huán)一起貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，對(duì)應(yīng)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的殘基 36-66 的氨基酸之間的至少 10、15、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)或全部31個(gè)殘基已經(jīng)被修飾。在一些實(shí)施方案中，CD環(huán)的長(zhǎng)度與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的CD環(huán)相比延長(zhǎng)或縮短。
[0013]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中該1QFn3結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在EF和FG環(huán)的氨基酸序列中含有修飾，并且其中EF和FG環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該多肽可以進(jìn)一步在AB環(huán)、@-鏈六和/或β-鏈G的一個(gè)或多個(gè)中包含氨基酸序列修飾，并且這些額外的修飾可以和EF和FG環(huán)一起貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，多肽可以進(jìn)一步在N端和/或C端含有序列修飾。特別地，相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，最先7個(gè)氨基酸的氨基酸序列或?qū)?yīng)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:1或6)的殘基93-97的氨基酸的氨基酸序列可以被修飾。這些額外的末端修飾也可以和其它序列修飾一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)中的相應(yīng)殘基，uiFr^結(jié)構(gòu)域的前15個(gè)氨基酸殘基中有至少2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個(gè)或全部15個(gè)被修飾。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)中的相應(yīng)殘基，EF環(huán)的至少3、4或5個(gè)氨基酸殘基可以被修飾。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，對(duì)應(yīng)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1 或 6)的殘基 80-97 的氨基酸之間的至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17個(gè)或全部18個(gè)殘基可以被修飾。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)，F(xiàn)G環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度可以被延長(zhǎng)或縮短。
[0014]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中wFM結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈和環(huán)的序列在β -鏈Α、ΑΒ環(huán)、β -鏈B、⑶環(huán)、β -鏈E、EF環(huán)和β -鏈F的氨基酸序列中含有修飾，并且其中被修飾的環(huán)和鏈貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環(huán)，⑶環(huán)氨基酸序列的長(zhǎng)度被延長(zhǎng)或縮短。在一些實(shí)施方案中，多肽可以進(jìn)一步在β-鏈G和/或C端尾巴的氨基酸序列中含有修飾。
[0015]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中該1QFn3結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的氨基酸殘基77-83的序列在FG環(huán)中含有序列修飾，并且其中該uiFr^以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型FG環(huán)的氨基酸殘基77-83的序列，F(xiàn)G環(huán)中對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基77-83的部分的長(zhǎng)度被延長(zhǎng)或縮短。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)單獨(dú)介導(dǎo)與靶的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，AB、BC、⑶、DE或EF環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)具有野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列。
[0016]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中所述wFM結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)和β -鏈的序列在BC環(huán)以及β-鏈B或β-鏈C中至少一個(gè)中包含序列修飾，并且其中相對(duì)于在β-鏈B或β -鏈C中的至少一個(gè)中不含有相對(duì)于野生型的序列修飾的等價(jià)wFnS結(jié)構(gòu)域，該kiFM結(jié)構(gòu)域具有降低的免疫原性。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的BC環(huán)的氨基酸序列，BC環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度被延長(zhǎng)或縮短。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，kiFM結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步在最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列中含有修飾。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列，uiFr^結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步在DE環(huán)和/或FG環(huán)中含有修飾。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的DE環(huán)的氨基酸序列，DE環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度被延長(zhǎng)或縮短。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的氨基酸序列，F(xiàn)G環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度被延長(zhǎng)或縮短。在一些實(shí)施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域在DE環(huán)中含有序列修飾，并且相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈的序列，進(jìn)一步在β-鏈F和/或β-鏈G中含有序列修飾。在一些實(shí)施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域在FG環(huán)中含有序列修飾，并且相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈的序列，進(jìn)一步在β-鏈D和/或β-鏈E含有序列修飾。
[0017]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的BC環(huán)的至少一部分具有野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。例如，BC環(huán)的前1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)殘基可以與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的BC環(huán)中相應(yīng)的殘基相同。在另外的實(shí)施方案中，整個(gè)BC環(huán)具有野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于在BC環(huán)中具有額外修飾的等價(jià)多肽，BC環(huán)的至少一部分具有野生型序列的多肽的免疫原性降低。
[0018]在特定的實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中所述wFnS結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在BC環(huán)的一部分和FG環(huán)的一部分中含有序列修飾，并且其中相對(duì)于和野生型BC環(huán)相比BC環(huán)的更大一部分被修飾的kiFM結(jié)構(gòu)域，該kiFM結(jié)構(gòu)域具有降低的免疫原性。在一些實(shí)施方案中，BC環(huán)的被修飾的部分可對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的BC環(huán)的殘基28-29、27-29、26-29、25-29、或24-29。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)的被修飾的部分可對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的殘基77-79、77-80、77-81、77-82、77-83、77-84、77-85、或77-86。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)的被修飾的部分與野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的相應(yīng)部分相比具有插入或缺失。在一些實(shí)施方案中，BC和FG環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:1或6)的DE環(huán)序列，uiFr^結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步在DE環(huán)的一部分中含有序列修飾。在一些實(shí)施方案中，DE環(huán)的被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的BC環(huán)的殘基52和53。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于進(jìn)一步在氨基酸殘基23-27中的一個(gè)或多個(gè)中與野生型BC環(huán)中的相應(yīng)位置相比包含修飾的等價(jià)kiFM結(jié)構(gòu)域，該kiFM結(jié)構(gòu)域的免疫原性降低。在一些實(shí)施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域以小于500nM的Kd與靶結(jié)合。
[0019]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
[0020]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的疏水核心殘基相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，本文中提供的多肽的至少一個(gè)被修飾的環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度被延長(zhǎng)。在其它實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，本文中提供的多肽的至少一個(gè)被修飾的環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度被縮短。
[0022]在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列，本文中提供的多肽的C端尾巴的氨基酸序列被修飾。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列被修飾。在其它實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)，多肽的N端截短了 1-7個(gè)氨基酸，和/或相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQIDN0:1), C端截短了 1-9個(gè)氨基酸。
[0023]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:l、2、60或6)的氨基酸序列具有至少50%同一性。在其它實(shí)施方案中，所述多肽與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ IDN0:1、2、60或6)的氨基酸序列具有至少65%同一性。在某些實(shí)施方案中，10Fn3結(jié)構(gòu)域包含與由SEQ ID NO: 1,2,60或6的代表的天然存在的人uiFr^結(jié)構(gòu)域至少60、
70、80或90%相同的氨基酸序列。
[0024]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含III型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中該uiFr^結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO: 2或60具有至少60%同一性的氨基酸序列，并以小于10nM的Kd與靶分子結(jié)合，其中所述kiFM結(jié)構(gòu)域還包含不含有DK序列的C端尾巴。在一些實(shí)施方案中，C端尾巴包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，C端尾巴還包含半胱氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，C端尾巴包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，C端尾巴可以包含SEQ ID NOs:23-31中任一的序列。
[0025]在某些實(shí)施方案中，所述基于纖連蛋白的支架蛋白結(jié)合野生型kiFM結(jié)構(gòu)域不結(jié)合的靶標(biāo)。
[0026]在一些實(shí)施方案中，所述基于纖連蛋白的支架蛋白的kiFM結(jié)構(gòu)域還包含具有1-10個(gè)氨基酸的N端延伸。在某些實(shí)施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域包含位于SEQ ID NO:1或6的第一個(gè)氨基酸的N端一側(cè)的M、MG或G N。在其它實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6第1-8個(gè)氨基酸的氨基酸殘基被SEQ ID NOs:9-11或16-21中的任一個(gè)代替。
[0027]在一些實(shí)施方案中，所述基于纖連蛋白的支架蛋白進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)模塊:聚氧化烯模塊、人血清白蛋白結(jié)合蛋白、唾液酸、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG、IgG結(jié)合蛋白和FC片段。在一些實(shí)施方案中，PK模塊是聚氧化烯模塊，并且所述聚氧化烯模塊是聚乙二醇(PEG)。在一些實(shí)施方案中，PEG模塊通過(guò)半胱氨酸或賴氨酸與所述基于纖連蛋白的支架蛋白共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，PEG為大約0.5kDa-大約 10kDa。
[0028]在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┛伤幱玫慕M合物，其包含本文中所述的新型uiFr^結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該組合物基本上沒(méi)有致熱源。在一些實(shí)施方案中，組合物基本上沒(méi)有微生物污染，使得其適合于體內(nèi)施用。組合物可以被配制成用于，例如，靜脈內(nèi)(IV)、腹膜內(nèi)(IP)或皮下(SubQ)施用。在一些實(shí)施方案中，組合物包含生理學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，組合物的pH為4.0-6.5,4.0-5.5，或者等于4.0,4.5、5.0或5.5。在一些實(shí)施方案中，組合物中基于纖連蛋白的支架蛋白的濃度為5mg/ml。
[0029]在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司幋a如本文中所述的新型uiFr^結(jié)構(gòu)域的核酸。還包括含有這些蛋白的多核苷酸的載體。合適的載體包括，例如，表達(dá)載體。本申請(qǐng)的進(jìn)一步的方面提供一種細(xì)胞，其包含編碼kiFM結(jié)構(gòu)域的多核苷酸、載體或表達(dá)載體。序列優(yōu)選地被優(yōu)化，以便在所用細(xì)胞類型中獲得最大表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行，例如大腸桿菌。在其它實(shí)施方案中，表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)包含如本文中所述的uiFr^結(jié)構(gòu)域的蛋白。在某些實(shí)施方案中，編碼uiFr^結(jié)構(gòu)域的多肽被密碼子優(yōu)化，以便在所選的細(xì)胞類型中表達(dá)。還提供了用于產(chǎn)生如本文中所述的10Fn3結(jié)構(gòu)域的方法，包括培養(yǎng)包含編碼kiFM結(jié)構(gòu)域的核酸、載體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，和從培養(yǎng)物回收所表達(dá)的蛋白。
[0030]在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳绫疚闹兴龅幕诶w連蛋白的支架蛋白的文庫(kù)。本文中提供的文庫(kù)可以包含例如至少105、106、107、108、109、1010、1012、1013、或114或更多個(gè)成員。還提供了用于從本文中所述的文庫(kù)中的一個(gè)分離特異性結(jié)合感興趣的靶標(biāo)的基于纖連蛋白的支架蛋白的方法。例如，文庫(kù)分離方法可以包括，例如，使基于纖連蛋白的支架蛋白的文庫(kù)與感興趣的靶標(biāo)接觸，和分離與靶標(biāo)結(jié)合(例如以特定的親和力或在合適的清洗條件下結(jié)合)的成員。分離步驟可以用任何合適的方法實(shí)施，例如噬菌體展示或HiRNA展示。類似地，靶標(biāo)結(jié)合可以用任何合適的方法實(shí)施，例如將靶標(biāo)固定在固體支持物(例如柱子、芯片、珠子等)上，并在適合于蛋白結(jié)合的條件下將固定的靶標(biāo)與文庫(kù)混合。然后將可以已結(jié)合的文庫(kù)成員與未結(jié)合的文庫(kù)成員分離，獲得與靶標(biāo)結(jié)合的、分離的基于纖連蛋白的支架蛋白。在某些實(shí)施方案中，分離方法可以涉及重復(fù)多輪靶標(biāo)結(jié)合和分離步驟。
[0031]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0032]圖1:野生型kiFM氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，其中疏水核心氨基酸殘基已被標(biāo)明。β -鏈用粗體標(biāo)明，環(huán)區(qū)用成對(duì)字母標(biāo)示，疏水核心殘基加有粗體下劃線(underlinedin bold)。氨基酸95-101對(duì)應(yīng)于尾巴，當(dāng)具有SEQ ID NO:1的uiFr^結(jié)構(gòu)域沒(méi)有該尾巴時(shí)，便成為具有SEQ ID NO:6的uiFr^結(jié)構(gòu)域。
[0033]圖2 (A-F):野生型uiFr^結(jié)構(gòu)域氨基酸序列(SEQ ID NO:1或6)，其中全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO:1)中標(biāo)明的氨基酸位置可以被突變，以提供一個(gè)代表性的修飾kiFM多肽補(bǔ)丁(patch)文庫(kù)。可以加以修飾而產(chǎn)生各個(gè)代表性補(bǔ)丁文庫(kù)kiFM多肽的可能位置用粗體表示并加有下劃線。這些標(biāo)出的位置中的任何一個(gè)或它們的組合可以被突變而產(chǎn)生西北結(jié)合子(Northwest Binder)(圖 2A)、東北結(jié)合子(Northeast Binder)(圖 2B)、西側(cè)結(jié)合子(WestSide Binder)(圖 2C)、南-前結(jié)合子(South-Front Binder)(圖 2D)、AG 鏈結(jié)合子(圖 2E)和西南結(jié)合子(South West Binder)(圖 2F)。
[0034]圖3(A_F):野生型kiFM結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，其中顯示了不同的可能結(jié)合界面的視圖。可以從野生型改變的殘基用黑體顯示。不屬于6個(gè)環(huán)中其中之一的成員的被改變殘基添加有棒線(Stick)。顯示了野生型kiFM結(jié)構(gòu)域的西北(Northwest)結(jié)合界面(圖3A)、東北(Northeast)結(jié)合界面(圖3B)、西側(cè)(West Side)結(jié)合界面(圖3C)、南-前(South-Front)結(jié)合界面(圖3D)、AG鏈結(jié)合界面(圖3E)和西南(South West)結(jié)合界面(圖 3F)。
[0035]圖4 =HLA結(jié)合數(shù)據(jù)顯示了 5種不同HLA等位蛋白與kiFM多肽的5種不同肽片段的IC5tl結(jié)合親和力(μΜ)。SEQ IDN0s:58、51和52分別是BC、DE和FG環(huán)的環(huán)區(qū)集群 (loopreg1n cluster),環(huán)區(qū)殘基用下劃線標(biāo)示。SEQ ID NOs: 53和54分別是wFnS多肽野生型和經(jīng)過(guò)修飾的支架區(qū)片段。如圖所示，BC環(huán)區(qū)集群(SEQIDN0:58)和兩個(gè)所測(cè)試的支架區(qū)肽片段(SEQ IDN0s:53和54)是大多數(shù)被測(cè)試的HLA等位蛋白的強(qiáng)結(jié)合子(〈25 μ M)。支架區(qū)肽片段(SEQ ID NOs:53和54)的預(yù)測(cè)的免疫顯性(immunodominant)區(qū)用下劃線標(biāo)示。
[0036]圖5 =Notchl:鼠DLL4競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定結(jié)果，顯示通過(guò)Biacore分析確定，SEQ ID NOs: 3和4的WS-LIl結(jié)合子能夠100%抑制Notchl與鼠DLL4之間的相互作用，SEQ ID NO:5的WS-LIl結(jié)合子能夠抑制75%。
[0037]圖6:大小排阻色譜結(jié)果，顯示SEQ ID NO:3的WS-LIl結(jié)合子主要是單體，而SEQID N0s:4和5的WS-LIl結(jié)合子則含有單體和聚集蛋白的混合物。粗線軌跡對(duì)應(yīng)于被測(cè)試的WS-LIl結(jié)合子，而非粗線軌跡對(duì)應(yīng)于分子量標(biāo)記，WS-LIl結(jié)合子單體的預(yù)期在第3和第5標(biāo)記峰之間洗脫。
[0038]圖7:大小排阻色譜結(jié)果，顯示SEQ ID NOs:45-47的WS-LII結(jié)合子主要是單體。粗線軌跡對(duì)應(yīng)于被測(cè)試的WS-LIl結(jié)合子，而非粗線軌跡對(duì)應(yīng)于分子量標(biāo)記，WS-LII結(jié)合子單體預(yù)期在第3和第5標(biāo)記峰之間洗脫。
[0039]圖8:大小排阻色譜結(jié)果，顯示SEQ ID NOs:48-49的WS-LII結(jié)合子主要是單體。粗線軌跡對(duì)應(yīng)于被測(cè)試的WS-LIl結(jié)合子，而非粗線軌跡對(duì)應(yīng)于分子量標(biāo)記，WS-LII結(jié)合子單體預(yù)期在第3和第5標(biāo)記峰之間洗脫。
[0040]圖9(A_C):非傳統(tǒng)kiFM結(jié)合子的文庫(kù)設(shè)計(jì)。圖9A顯示的是BC環(huán)基本上或完全沒(méi)有被修飾(即BC環(huán)的全部或大部分保持野生型序列)的文庫(kù)設(shè)計(jì)。圖9A所示文庫(kù)的所有CD和FG環(huán)可以在大小上不同，特別是，SP1、WS2’、WS2’ -CD、Front3和CDl-環(huán)的CD環(huán)的長(zhǎng)度可以改變。Back3的FG環(huán)的大小也可以改變，⑶1_環(huán)的前3個(gè)氨基酸(即VSD)可以被刪除。圖9B顯示的是BC環(huán)N端的不同部分被保持為野生型的文庫(kù)設(shè)計(jì)。圖9C顯示的是BC環(huán)和BC環(huán)兩側(cè)的β-鏈區(qū)的一個(gè)或兩個(gè)均被修飾的文庫(kù)設(shè)計(jì)。也可以通過(guò)將71位的蘇氨酸保持恒定和/或?qū)被?-7的長(zhǎng)度保持恒定而構(gòu)建文庫(kù)ΝΡ-6。也可以通過(guò)將71位的蘇氨酸保持恒定和/或?qū)被?-7的長(zhǎng)度保持恒定，和/或?qū)C環(huán)保持恒定，來(lái)構(gòu)建文庫(kù)ΝΡ4-5。在圖9A-C的每一個(gè)中，全長(zhǎng)野生型kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)顯示在最上，氨基酸編號(hào)為1-101，并標(biāo)示了環(huán)區(qū)和鏈區(qū)。野生型kiFM結(jié)構(gòu)域的下面是經(jīng)典的北極文庫(kù)(north pole library)設(shè)計(jì)(即BC、DE和FG環(huán)被修飾)。在經(jīng)典北極文庫(kù)設(shè)計(jì)之下顯示的是非傳統(tǒng)的文庫(kù)設(shè)計(jì)?？梢员蝗〈揎椀奈恢糜么煮w加下劃線指示，可以被取代、插入和/或刪除修飾的區(qū)域用粗體加方框指示，非野生型氨基酸殘基加有陰影。在圖9B中，所有序列均是基于 SEQ ID NO:1。在圖 9C 中，WT10Fn3、經(jīng)典 NP、NPU NEU NP4-5、NP6-1、和 NW2 序列如SEQ ID NO:1所示；所有其余序列如SEQ ID NO: 59所示。在圖9A中，WT1QFn3、經(jīng)典N(xiāo)P、WS1、WS2、WS3、L1-3(a)、WS-LI1、WS2，和 WS2’ -CD 是基于 SEQ ID NO:1 ;所有其余序列基于SEQ ID NO: 59。所有文庫(kù)還可以基于SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 12，即分別缺少SEQ ID NO:1和59的氨基酸95-101。
[0041 ] 圖10:8個(gè)特異性結(jié)合人PXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的1QFn3多肽(Adnectin-1至Adnectin-8)與親本1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的序列比對(duì)。β鏈的位置用序列比對(duì)下方的箭頭指示，相應(yīng)氨基酸用粗體指示。Adnectin-3(SEQ ID NO:62)和-4(SEQ IDNO:63)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs:48和49，并具有一個(gè)額外的6xHis尾巴(SEQ ID NO:44)。Adnectin-U _2、-5、-6、-7 和 _8(分別為 SEQ ID NOs:70-72 和 13-15)分別對(duì)應(yīng)于 SEQ IDNO: 64-69，并具有一個(gè)額外的 6xHi s 尾巴(SEQ ID NO: 44)。
[0042] 圖11:柱狀圖顯示了(從左至右)玻連蛋白、纖連蛋白、非結(jié)合性對(duì)照adnectin(RGD被變?yōu)镽GE)、以及三種不同與特異靶標(biāo)結(jié)合但不含有RGD序列的wFM分子(分別為kiFMAJ和C)與固定的整聯(lián)蛋白αν_β3的結(jié)合程度。
[0043]圖12:野生型人 10Fn3 (SEQ ID NO: 6)(頂行)和 WS4、WS5、WS6 和 WS7 文庫(kù)的 10Fn3的氨基酸序列。用下劃線粗體和方框標(biāo)記的氨基酸可以通過(guò)取代、刪除和添加而改變。用下劃線標(biāo)記的氨基酸可以通過(guò)取代改變。
[0044]詳細(xì)說(shuō)明
[0045]定義
[0046]“多肽”的意思是兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的任何序列，不考慮其長(zhǎng)度、翻譯后修飾或功能。“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文中可以互換使用。多肽可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，例如在美國(guó)專利N0.6，559，126中描述的那些，本文援引并入其內(nèi)容。多肽還可以通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法中的任何一種進(jìn)行修飾(例如氨基酸可以被保護(hù)基團(tuán)修飾；羧基端氨基酸可以被變成末端酰胺基團(tuán)；氨基端殘基可以被基團(tuán)修飾從而例如提高親脂性；或者多肽可以被化學(xué)糖基化或被其它修飾，從而提高穩(wěn)定性或體內(nèi)半衰期)。多肽修飾可以包括向多肽附接另一種結(jié)構(gòu)，例如環(huán)狀化合物或其它分子，也可以包括含有一個(gè)或多個(gè)構(gòu)型改變的氨基酸(即R或S ;或L或D)的多肽。
[0047]如本文中所使用的，kiFM的“區(qū)域”是指人kiFM結(jié)構(gòu)域的環(huán)(AB、BC、⑶、DE、EF和FG)、β-鏈(八、8、(:、03、卩和6)川端(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基1-7)、或C端(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基93-101)。
[0048]“北極環(huán)”是指人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的BC、DE和FG環(huán)中的任一個(gè)。
[0049]“南極環(huán)”是指人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的AB、⑶和EF環(huán)中的任一個(gè)。
[0050]“支架區(qū)”是指人kiFM結(jié)構(gòu)域的任何非環(huán)區(qū)。支架區(qū)包括β-鏈A、B、C、D、E、F和G以及N端區(qū)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的殘基1_7的氨基酸)、和C端(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的殘基93-101的氨基酸)。
[0051]本文中“百分比(％)氨基酸同一性”的定義為，在比對(duì)序列并在需要時(shí)引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性之后，同時(shí)不將任何保守取代看作序列同一性的一部分，在此條件下候選序列中與所選序列氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。出于確定百分比氨基酸序列同一性的目的進(jìn)行的比對(duì)，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)中的各種方法實(shí)現(xiàn)，例如使用公眾可得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定用于比對(duì)的合適參數(shù)，包括在所比較的全長(zhǎng)序列上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。然而為了本文中的目的，％氨基酸同一性數(shù)值通過(guò)使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2如下文所述地獲得。ALIGN-2序列比較計(jì)算程序由GenentechInc.編寫(xiě)，并在美國(guó)版權(quán)局，Washington D.C.、20559，以用戶文檔存檔(filed with userdocumentat1n),其注冊(cè)的美國(guó)版權(quán)登記號(hào)為N0.TXU510087,并可以通過(guò)Genentech Inc.(South San Francisco、Calif)公共獲得。ALIGN-2程序應(yīng)當(dāng)被編譯用于在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選地在digital UNIX V4.0D上使用。所有的序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定，并不做改變。
[0052]為了本文的目的，給定氨基酸序列A與、和、相對(duì)于給定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(該語(yǔ)句可以另行表述為，給定的氨基酸序列A與、和、或相對(duì)于給定氨基酸序列B具有或包含特定的％氨基酸序列同一性)，其計(jì)算如下:100乘以X/Y的分?jǐn)?shù)，其中X是序列比對(duì)程序ALIGN-2在程序比對(duì)A和B之后打分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，而Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，當(dāng)氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的長(zhǎng)度不相等時(shí)，A與B的％氨基酸序列同一性并不等同于B與A的％氨基酸序列同一性。
[0053]如本文中所使用的，如果滿足如下條件，則認(rèn)為多肽中的氨基酸殘基“貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合”:(I)基于實(shí)驗(yàn)確定的復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，殘基的側(cè)鏈或主鏈的任何非氫原子被發(fā)現(xiàn)與結(jié)合靶標(biāo)的任何原子的距離在5A之內(nèi)，和/或(2)將殘基突變成其在野生型kiFM (例如SEQ ID NO:1或6)中的等價(jià)物，突支成丙氨酸，或突變成與所述殘基具有相似大小或更小的側(cè)鏈的殘基，導(dǎo)致與靶標(biāo)的平衡解離常數(shù)發(fā)生可測(cè)量的增加(例如km增加)。
[0054]多肽的“半衰期”可以一般地定義為，由于例如多肽的降解和/或多肽通過(guò)自然機(jī)制被清除或隔離，導(dǎo)致多肽的血清濃度在體內(nèi)降低50%所需的時(shí)間。半衰期可以通過(guò)任何本身已知的方法加以確定，例如藥代動(dòng)力學(xué)分析。合適的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，并且一般地涉及例如如下步驟:向靈長(zhǎng)動(dòng)物施加合適劑量的多肽；以規(guī)則的時(shí)間間隔從所述靈長(zhǎng)動(dòng)物收集血液樣品或其它樣品；確定所述血液樣品中多肽的水平或濃度；和從所得數(shù)據(jù)(的圖)計(jì)算與施用時(shí)的初始水平相比多肽的水平或濃度降低50%所需的時(shí)間。用于確定半衰期的方法可以在例如如下文獻(xiàn)中找到=Kenneth等、Chemical Stabilityof Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists (1986) ；Peters 等、Pharmacokineteanalysis: A Practical Approach (1996);和"Pharmacokinetics"、M Gibaldi 和 D Perron、Marcel Dekker出版、第二次修改版本(1982)。
[0055]半衰期可以用參數(shù)表示，例如tl/2-α、tl/2-β和曲線下面積(AUC)。在本說(shuō)明書(shū)中，“半衰期增加”是指這些參數(shù)中任何一個(gè)增加，這些參數(shù)中的任何兩個(gè)增加，或這三個(gè)參數(shù)增加。在某些實(shí)施方案中，半衰期增加是指tl/2-β增加，同時(shí)伴隨或不伴隨tl/2-α和/或AUC或兩者的增加。
[0056]概覽
[0057]10Fn3結(jié)構(gòu)域是抗體特別是抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能類似物。在歷史上，10Fn3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)依賴于wFM結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)與抗體VH結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的相似性。特別是，10Fn3結(jié)合結(jié)構(gòu)域傳統(tǒng)上依賴于wFnS結(jié)構(gòu)域⑶R樣環(huán)的氨基酸序列的修飾。wFnS結(jié)構(gòu)域AB、BC、⑶、DE、EF和FG環(huán)中的每一個(gè)都與免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)相似，因?yàn)樗鼈冇腥嵝圆⑶乙子趯?duì)其氨基酸序列進(jìn)行修飾，而不會(huì)改變kiFM結(jié)構(gòu)域的整體結(jié)構(gòu)。而且已經(jīng)顯示，對(duì)沿著kiFM結(jié)構(gòu)域一個(gè)表面的CDR樣環(huán)組(即“北極環(huán)”)的修飾容許開(kāi)發(fā)出可以結(jié)合期望靶標(biāo)的 1QFn3 結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)例如 PCT 公開(kāi) W002/032925、W02008/097497、和 W02008/066752)。在這些傳統(tǒng)的wFM支架設(shè)計(jì)中，環(huán)之間的蛋白序列，即β -鏈，通常不被修飾或者僅有很少的修飾，因?yàn)樗鼈冊(cè)诒３謐iFM的整體結(jié)構(gòu)構(gòu)象中發(fā)揮作用。我們現(xiàn)在驚訝地發(fā)現(xiàn)，有可能以非傳統(tǒng)的方式對(duì)kiFM結(jié)構(gòu)域進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生可以結(jié)合期望靶標(biāo)同時(shí)保持合適穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。
[0058]特別地，本申請(qǐng)?zhí)峁┝嘶诶w連蛋白的支架多肽，其包含經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和支架區(qū)的新組合，并與改善的性質(zhì)相關(guān)。本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白包括一個(gè)或多個(gè)人第十III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域，其已被修飾從而與一種或多種期望的靶標(biāo)結(jié)合。本申請(qǐng)部分地涉及如下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即纖連蛋白結(jié)構(gòu)域環(huán)和/或支架區(qū)的修飾的新組合與特異的靶結(jié)合相關(guān)。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于纖連蛋白的支架蛋白中的新支架區(qū)(例如非環(huán)區(qū))修飾可以與特定的環(huán)修飾組合，以獲得特異的靶結(jié)合。這樣的新支架設(shè)計(jì)拓展了設(shè)計(jì)基于10Fn3的結(jié)合蛋白的潛力。例如，本文中所述的非傳統(tǒng)支架設(shè)計(jì)通過(guò)開(kāi)放kiFM結(jié)構(gòu)域中的新區(qū)域以供序列修飾，為創(chuàng)建具有更大多樣性的文庫(kù)提供了可能。此外，利用非傳統(tǒng)支架設(shè)計(jì)可以產(chǎn)生與傳統(tǒng)CDR樣環(huán)界面提供的界面幾何形狀相比替代性的表面界面幾何形狀。這些非傳統(tǒng)結(jié)合子提供的額外的多樣性和備選的表面幾何結(jié)構(gòu)可能有助于開(kāi)發(fā)具有期望性質(zhì)的wFnS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如通過(guò)提供對(duì)給定靶標(biāo)具有更高的親和力的kiFM結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者通過(guò)提供結(jié)合給定靶標(biāo)上的不同表位的kiFM結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0059]本申請(qǐng)還描述了具有降低的免疫原性的新型基于纖連蛋白的支架多肽。如本文中的實(shí)施例所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于強(qiáng)HLA結(jié)合活性，β -鏈B/BC環(huán)/ β -鏈C區(qū)可能是免疫原性“熱點(diǎn)”。特別地，該區(qū)域似乎充當(dāng)HLA結(jié)合的強(qiáng)錨定序列。實(shí)施例還顯示，β-鏈B/BC環(huán)/β -鏈C區(qū)的野生型序列被靈長(zhǎng)動(dòng)物宿主識(shí)別為自身抗原。因此，盡管具有強(qiáng)HLA結(jié)合，但是沒(méi)有產(chǎn)生對(duì)野生型序列的免疫應(yīng)答。因此，我們開(kāi)發(fā)了備選的kiFM支架，其中β-鏈B/BC環(huán)/β-鏈C區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵區(qū)域被保留為野生型，同時(shí)對(duì)該序列其它區(qū)域的修飾允許高親和性靶結(jié)合。這些備選的結(jié)合子將會(huì)有更大的機(jī)會(huì)產(chǎn)生具有高親和力，并避免在宿主生物體中發(fā)生不良免疫應(yīng)答的kiFM結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因?yàn)棣?-鏈B/BC環(huán)/ β -鏈C區(qū)的免疫原性熱點(diǎn)沒(méi)有改變，故其應(yīng)會(huì)被宿主生物體識(shí)別為自身抗原。本申請(qǐng)還提供了備選的kiFM結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中β -鏈B/BC環(huán)/ β -鏈C區(qū)中的HLA錨定序列已被破壞，其應(yīng)當(dāng)會(huì)降低該區(qū)域的免疫原潛能。這些除去了錨定序列的kiFM結(jié)合結(jié)構(gòu)域應(yīng)當(dāng)允許對(duì)全部或部分BC環(huán)多樣化，同時(shí)仍然避免發(fā)生與此區(qū)域相關(guān)的不良免疫應(yīng)答。HLA錨定序列的除去或破壞可以通過(guò)修飾β -鏈B/BC環(huán)/ β -鏈C區(qū)中的關(guān)鍵殘基，結(jié)合對(duì)BC環(huán)區(qū)進(jìn)行修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。具有被降低的免疫原潛力的非傳統(tǒng)kiFM結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例在下面進(jìn)一步描述。
[0060]本文中所述的新型基于纖連蛋白的支架多肽可以加以設(shè)計(jì)而結(jié)合任何感興趣的靶標(biāo)。在示例實(shí)施方案中，靶標(biāo)是抗原，多肽或感興趣的治療性蛋白靶標(biāo)。期望的治療性靶標(biāo)實(shí)例包括，例如，腫瘤壞死因子α (TNF-α)、δ樣蛋白4 (DLL4)、白細(xì)胞介素17 (IL-17)和孕烷X受體(PXP)。
[0061]基于纖連蛋白的支架
[0062]A.一般結(jié)構(gòu)
[0063]Fn3是指纖連蛋白的3型結(jié)構(gòu)域。Fn3結(jié)構(gòu)域小、單體、可溶并且穩(wěn)定。它缺少二硫鍵，因此在還原條件下穩(wěn)定。Fn3的整體結(jié)構(gòu)類似于免疫球蛋白折疊。Fn3結(jié)構(gòu)域包括，按照從N端到C端順序，β或β樣鏈A ;AB環(huán)；β或β樣鏈B ;BC環(huán)；β或β樣鏈C ；CD環(huán)；β或β樣鏈D ;DE環(huán)；β或β樣鏈E ;EF環(huán)；β或β樣鏈F ；FG環(huán)；和β或β樣鏈G。7個(gè)反平行β_鏈排列成2個(gè)β折疊片，它們形成一個(gè)穩(wěn)定核心，同時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)由連接β或β樣鏈的環(huán)構(gòu)成的“面”。ΑΒ、⑶和EF環(huán)位于一個(gè)面上(“南極”)，BC、DE和FG環(huán)位于相對(duì)面上(“北極”)。AB、BC、⑶、DE、EF和FG環(huán)的任一個(gè)或全部可參與配體結(jié)合。在人纖連蛋白中有至少15種不同的Fn3模組(module)，雖然模組之間的序列相似度較低，但是它們?cè)谒募?jí)結(jié)構(gòu)上均具有高度相似性。
[0064]在示例實(shí)施方案中，本文中所述的配體結(jié)合支架蛋白是基于第十3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域，即Fn3的第十模組(1QFn3)。天然存在的人1QFn3的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中給出:
[0065]VSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:1) (AB、CD和EF環(huán)用下劃線標(biāo)出；BC、FG和DE環(huán)用粗體強(qiáng)調(diào)；β -鏈位于每?jī)蓚€(gè)環(huán)區(qū)之間；Ν端和C端區(qū)域用斜體顯示)。SEQ ID NO:1是包含尾巴，即氨基酸95-101，的1QFn3分子的序列。SEQ ID NO:6是不包含尾巴、并且由SEQID NO:1的氨基酸1-94構(gòu)成的野生型人kiFM分子的氨基酸序列。
[0066]SEQ ID NO:1中參與形成疏水核心的殘基(“核心氨基酸殘基”)包括對(duì)應(yīng)于SEQID N0:1 或 6 的如下氨基酸的氨基酸:L8、V10, A13、L18、120、W22、Y32、134、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、188、190和Y92，其中核心氨基酸殘基用單字母氨基酸符號(hào)和其后的其在SEQ ID NO:1中的位置來(lái)表示。見(jiàn)例如Dickinson et al.、J.Mol.B1l.236:1079-1092(1994)。在一些實(shí)施方案中，使用參與形成疏水核心的殘基來(lái)界定多肽環(huán)區(qū)的邊界。例如，AB環(huán)可以定義為β -鏈A疏水核心殘基Α13與β -鏈B疏水核心殘基L18之間的一段氨基酸。見(jiàn)圖1。在一些實(shí)施方案中，疏水核心氨基酸與野生型序列相比沒(méi)有被修飾。在其它實(shí)施方案中，如下的疏水氨基酸可以突變:Α13，其是β-凸起(bulge)的一部分，并可以轉(zhuǎn)變成表面殘基；Y32和Α74，它們中的一個(gè)或兩個(gè)能夠改變，從而與相鄰環(huán)發(fā)生不同的相互作用；188，其是部分暴露于溶劑的，并且相應(yīng)位置并不總是天然III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的疏水殘基；和Υ92，其與C端尾巴相連，并且在C端區(qū)發(fā)生多樣化時(shí)可以被多樣化。
[0067]在一些實(shí)施方案中，AB環(huán)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的殘基14_17，BC環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基23-31，CD環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基37-47，DE環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基51-56，EF環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基63-67，F(xiàn)G環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基75-87。BC、DE和FG環(huán)沿著分子的一個(gè)面排列，即“北極”，ΑΒ、CD和EF環(huán)沿著分子的相對(duì)面排列，即“南極”。在SEQ ID NO:1中，β-鏈A對(duì)應(yīng)于殘基8-13，β -鏈B對(duì)應(yīng)于殘基17-22，β-鏈C對(duì)應(yīng)于殘基32-36，β -鏈D對(duì)應(yīng)于殘基48-50，β -鏈E對(duì)應(yīng)于殘基57-62，β -鏈F對(duì)應(yīng)于殘基68-74，β -鏈G對(duì)應(yīng)于殘基88-92。各β -鏈通過(guò)相應(yīng)的環(huán)彼此相連，例如鏈A和B通過(guò)AB環(huán)相連，構(gòu)成β -鏈Α、ΑΒ環(huán)和β -鏈B的隊(duì)形，諸如此類。N端和/或C端區(qū)(上面斜體標(biāo)示)可以被除去或者改變，從而產(chǎn)生保留生物活性并包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分子。在某些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的最先8個(gè)氨基酸殘基和/或SEQ ID NO:1的最后7個(gè)氨基酸殘基(即SEQ ID NO:1的氨基酸殘基95-101)可以被除去或改變，從而產(chǎn)生包含SEQ ID NO: 60或SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的多肽(相當(dāng)于SEQ ID NO:1沒(méi)有7個(gè)N端氨基酸，由SEQ ID NO:1的氨基酸1_94構(gòu)成)。本文中所述的文庫(kù)可以包含SEQ IDNOil中提出的N或C端區(qū)。在某些實(shí)施方案中，文庫(kù)包含N端區(qū)域，但不包含C端區(qū)域(即它們是基于SEQ ID NO:6)。
[0068]如上所述，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1 的殘基 14-17、23-31、37-47、51-56、63_67 和 75-87的氨基酸殘基分別界定了 AB、BC、⑶、DE、EF和FG環(huán)。然而應(yīng)當(dāng)理解，為了獲得對(duì)期望靶標(biāo)具有強(qiáng)親和力的kiFM結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并非環(huán)區(qū)內(nèi)的每一個(gè)殘基均需要被修飾。例如，在一些實(shí)施方案中，只有對(duì)應(yīng)于CD環(huán)的氨基酸39-45和FG環(huán)的氨基酸77-87的殘基被修飾，從而產(chǎn)生高親和力wFM結(jié)合子(見(jiàn)例如具有SEQ ID N0:3、4或5的氨基酸序列的鼠DLL4結(jié)合核心，和具有SEQ ID N0:45、46或47的氨基酸序列的鼠IL-17結(jié)合核心)。
[0069] 此外，還可以在環(huán)區(qū)中進(jìn)行插入和缺失，同時(shí)仍然產(chǎn)生高親和力kiFM結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，具有SEQ ID N0:3的鼠DLL4結(jié)合子的⑶環(huán)具有與野生型uiFr^結(jié)構(gòu)域⑶環(huán)相同的長(zhǎng)度，即SEQ ID NO:1的7個(gè)氨基酸39-45被SEQ ID NO: 3的7個(gè)殘基41-47代替。與之相對(duì)，具有SEQ ID NO: 3的鼠DLL4結(jié)合子的FG環(huán)的長(zhǎng)度比野生型1QFn3結(jié)構(gòu)域的FG環(huán)更長(zhǎng)，即SEQ ID NO:1的9個(gè)氨基酸77-85被SEQ ID NO: 3的19個(gè)殘基79-98代替。
[0070]因此，在一些實(shí)施方案中，與野生型人1QFn3的相應(yīng)環(huán)相比，選自AB、BC、⑶、DE、EF和FG中的一個(gè)或多個(gè)環(huán)的長(zhǎng)度可以被延長(zhǎng)或縮短。在任何給定的多肽中，一個(gè)或多個(gè)環(huán)的長(zhǎng)度可以被延長(zhǎng)，一個(gè)或多個(gè)環(huán)的長(zhǎng)度可以被縮短，或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，給定環(huán)的長(zhǎng)度可以被延長(zhǎng) 2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-20、或10-15個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，給定環(huán)的長(zhǎng)度可以被縮短1-15、1-11、1-10、1-5、1-3、1-2、2-10、或2-5個(gè)氨基酸。特別地，kiFM的FG環(huán)長(zhǎng)度為13個(gè)殘基，而抗體重鏈的相應(yīng)環(huán)長(zhǎng)度為4-28個(gè)殘基不等。因此，為了優(yōu)化依賴FG進(jìn)行靶結(jié)合的多肽的抗原結(jié)合，可以改變wFM的FG環(huán)的長(zhǎng)度和序列，以便獲得靶結(jié)合中最大的可能靈活性和親和性。
[0071]在一些實(shí)施方案中，整聯(lián)蛋白結(jié)合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD) (SEQID NO:1或6的氨基酸78-80)中的一個(gè)或多個(gè)殘基可以被取代，以破壞整聯(lián)蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RGD序列被極性氨基酸-中心氨基酸-酸性氨基酸序列(從N端到C端方向)取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RGD序列被SGE取代。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，RGD序列被RGE取代。
[0072]在一些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白包含與具有SEQ ID N0:l、2、60或6的氨基酸序列的人1QFn3結(jié)構(gòu)域具有至少40%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%、或90%同一性的uiFr^結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽與野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:l、2、60或6)的氨基酸序列具有至少50%同一性。在其它實(shí)施方案中，多肽與野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:l、2、60或6)的氨基酸序列具有至少65%同一性。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)環(huán)相對(duì)于野生型序列相應(yīng)環(huán)的序列不會(huì)被修飾，和/或一個(gè)或多個(gè)β-鏈相對(duì)于野生型序列相應(yīng)鏈的序列不會(huì)被修飾。在某些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白中的kiFM結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)β或β樣鏈可以包含、基本上組成為、或組成為與SEQ IDN0:1或6的相應(yīng)β或β樣鏈序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，β鏈區(qū)中的變化不會(huì)干擾多肽在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性。在示例實(shí)施方案中，1QFn3域結(jié)合期望靶標(biāo)的Kd值小于500nM、100nM、50nM、lnM、500pM、100pM或更小。在一些實(shí)施方案中，纖連蛋白基蛋白支架的kiFM結(jié)構(gòu)域結(jié)合期望靶標(biāo)的Kd值為1ρΜ-1μΜ、100ρΜ-500ηΜ、1ηΜ-500ηΜ、或ΙηΜ-ΙΟΟηΜ。在示例實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白特異性結(jié)合不與野生型kiFM結(jié)構(gòu)域，特別是野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域結(jié)合的靶標(biāo)。
[0073]在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了包含wFnS結(jié)構(gòu)域的多肽，其中該kiFM結(jié)構(gòu)域包含AB環(huán)、BC環(huán)、CD環(huán)、DE環(huán)、EF環(huán)和FG環(huán)，并且相對(duì)于SEQ ID NO:1的人1QFn3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)的序列，從AB、BC、⑶、DE、EF和FG環(huán)中選出的至少一個(gè)環(huán)具有改變的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，BC、DE和FG環(huán)被改變。在其它實(shí)施方案中，CD和FG環(huán)被改變。在其它實(shí)施方案中，CD、DE和EF環(huán)被改變。在其它實(shí)施方案中，EF和FG環(huán)被改變。在其它實(shí)施方案中，AB、CD和EF環(huán)被改變。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)是唯一一個(gè)被改變的環(huán)。在其它實(shí)施方案中，CD和FG環(huán)均被改變。在其它實(shí)施方案中，CD和EF環(huán)被改變。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)特定的支架變化與一個(gè)或多個(gè)環(huán)變化相組合?！?被)改變”的意思是，與模板序列(即相應(yīng)的野生型人纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)相比，一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列發(fā)生變化，并且包括氨基酸添加、缺失和取代。
[0074]在一些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白包含具有與SEQ ID NO:1或6的非環(huán)區(qū)有至少80、85、90、95、98或100%同一性的氨基酸序列的1QFn3結(jié)構(gòu)域，其中選自AB、BC、⑶、DE、EF和FG的至少一個(gè)環(huán)被改變。例如，在某些實(shí)施方案中，AB環(huán)可以具有最多4個(gè)氨基酸取代，最多10個(gè)氨基酸插入，最多3個(gè)氨基酸缺失，或其組合；BC環(huán)可以具有最多10個(gè)氨基酸取代，最多4個(gè)氨基酸缺失，最多10個(gè)氨基酸插入，或其組合；CD環(huán)可以具有最多6個(gè)氨基酸取代，最多10個(gè)氨基酸插入，最多4個(gè)氨基酸缺失，或其組合；DE環(huán)可以具有最多6個(gè)氨基酸取代，最多4個(gè)氨基酸缺失，最多13個(gè)氨基酸插入，或其組合；EF環(huán)可以具有最多5個(gè)氨基酸取代，最多10個(gè)氨基酸插入，最多3個(gè)氨基酸缺失，或其組合；和/或FG環(huán)可以具有最多12個(gè)氨基酸取代，最多11個(gè)氨基酸缺失，最多25個(gè)氨基酸插入，或其組合。
[0075]在某些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白包含由如下序列一般性地限定的10Fn3結(jié)構(gòu)域:
[0076]VSDVPRDLEVVAA (X)..LLISff(X)..YRITY(X)...FTV(X)..ATISGL(X) yYTITVYA(X)JSINYRT(SEQ ID NO:22)
[0077]在SEQ ID NO:22中，AB環(huán)用(X)u代表，BC環(huán)用(X)v代表，CD環(huán)用(X)w代表，DE環(huán)用(X)x代表，EF環(huán)用(X)y代表，F(xiàn)G環(huán)用(X)z代表。X代表任何氨基酸，X后面的腳標(biāo)代表氨基酸數(shù)目的整數(shù)。特別地，u、v、w、x、y和z每一個(gè)可以獨(dú)立地是2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8 、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或 6-7 個(gè)氨基酸。相對(duì)于 SEQ ID NO:22 中的相應(yīng)氨基酸，β鏈(加有下劃線)的序列在全部7個(gè)支架區(qū)中可以具有0-10、0-8、0-6、0-6、0-4、0-3、或0-1個(gè)取代、缺失或添加。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于SEQ ID NO: 22中的相應(yīng)氨基酸，β鏈的序列在全部7個(gè)支架區(qū)中可以具有0-10、0-8、0-6、0-6、0-4、0-3、或0-1個(gè)保守取代。在某些實(shí)施方案中，疏水核心氨基酸殘基(上面SEQ ID NO: 22中的粗體殘基)是固定的，而任何取代、保守取代、缺失或添加發(fā)生在疏水核心氨基酸殘基之外的殘基。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的疏水核心殘基相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:1)沒(méi)有被修飾。
[0078]B.支架區(qū)修飾
[0079]10Fn3的非環(huán)序列，即“支架區(qū)”，可以被改變，只要kiFM結(jié)構(gòu)域仍保持靶標(biāo)結(jié)合功能和/或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性即可。在一些實(shí)施方案中，Asp7、Glu9、和Asp23中的一個(gè)或多個(gè)被其它氨基酸，例如非負(fù)電荷氨基酸殘基(例如AsruLys等)代替。這些突變已經(jīng)被報(bào)道具有相對(duì)于野生型提高突變體kiFM在中性pH下的穩(wěn)定性的作用(見(jiàn)PCT公開(kāi)N0.W002/04523)。許多其他有利的或中性的1QFn3支架改變已經(jīng)被公開(kāi)。見(jiàn)例如Batori et al.、ProteinEng.200215 (12): 1015-20 ；Koide et al.、B1chemistry200140 (34): 10326-33。
[0080]10Fn3的支架區(qū)，例如β -鏈和/或N端和C端，可以被修飾以提高多肽與期望靶標(biāo)的結(jié)合或降低免疫原性。在一些實(shí)施萬(wàn)案中，參與形成疏水核心的殘基，即對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0:1 或 6 的 L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、134、Y36、F48、V50、A57、159、L62、Y68、170、V72、A74、188、190和Y92殘基的殘基，不被突變。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于SEQ ID NO:1或6所示的氨基酸序列中存在的相應(yīng)氨基酸，對(duì)應(yīng)于kiFM多肽支架區(qū)殘基1-7、9-15、19、21、33、35、36、49、58、60、61、69、7173、88、89和91-101的殘基的任何一個(gè)殘基或任何殘基的組合被突變成不同的氨基酸。
[0081]在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)多肽的支架區(qū)進(jìn)行突變，但要排除下列特定突變中的一個(gè)或多個(gè):V1A ；S2P ；S2T ；D3G ；D3S ；P5S ；R6G ；R6S ；D7G ；D7K ；L8P ；L8Q ；E9D ；E9K ；E9R ；E9V ；V10A ；V10I ；A12D ；A12E ；A12V ；L18E ；L18I ；L18P；L18Q；L18R ；L19Q ；S21C ；S21G ；S21N ；R29G ；R29S ；R29Y ；Y31H ；Y32F ；R33G ；I34T ；I34V ；T35A ；T35F ；T35I ；Y36H ；F48L ；F48S ；T49A ；T49I ；V50A ；V50E ；V50M ;A57 缺失；T58A ；T58I ;T58 缺失；I59V 159 缺失；S60G ；S60N ；S60R ；G61C ；G61R ；L62R ；D67G ；D67K ；D67N ；Y68A ；Y68D ；T69I ；I70N ；I70S ；I70V ；T71A ；V72A ；V72G ；Y73C ；Y73H ；A74G ；A74T ；I88S ；I88T ；I88V ；S89P ；I90F ；I90T ；I90V ；N91D ；N91S ；N91T ；Y92C ；Y92H ；Y92L ；Y92R ；Y92 缺失；R93Q ；R93T 和 T94A。在某些實(shí)施方案中，在BC、DE和FG環(huán)被修飾的kiFM結(jié)構(gòu)域的語(yǔ)境下，這些特定的支架突變被排除。
[0082]在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)多肽的支架區(qū)進(jìn)行突變，但是排除以下突變組合:
[0083].L18R、S21C 和 S60G ;
[0084].E9D、L18R、V50E 和 T56I ；
[0085].L18R、T49I 和 N91D ;
[0086].F48S 和 T71A;
[0087].P5S、V10A、S60G 和 S89P ；
[0088].L18R 和 Y92C ；
[0089].L18R 和 F48S ；
[0090].L18R 和 V72A ；
[0091].L18Q、R33G 和 F48S ;
[0092].Y68D 和 Y92H ；
[0093].R6S、L62R 和 N91S ;
[0094].L8P、E9V、I34V、T71A 和 Y92 缺失；
[0095].E9K、L18R 和 F48L ；
[0096].E9R、L18R、S60G 和 I70V ；
[0097].L18R、I88V 和 I90T ；
[0098].L18R、N91D 和 Y92C ;
[0099].L18R 和 I34T;
[0100].L18R 和 G61C;
[0101].Y32F、T71A 和 T94A ;
[0102].L18R、T58A、Y92L 和 R93T ；
[0103].V50M、T58A、S89P、I90F 和 Y92R ；
[0104].S2T、D7G、E9K、V101、T58A、S60N 和 S89P ；
[0105].I59V、S60N 和 T94A ;
[0106].R6G、S21G、T35A、T58I 和 S60G ；
[0107].L18P、S21C、T58A、Y73H 和 Y92C ；
[0108].Y31H、R33G 和 G61R ;
[0109].A74G、R93Q 和 T94A
[0110].S2P 和 T58I;
[0111].T58I 和 I88T ;
[0112].T58I 和 I90T ;
[0113]*G61R 和 A74T
[0114].A57缺失、T58缺失和159缺失
[0115].R33G、T35I 和 V50M
[0116].VIA、R33G 和 V50M
[0117].R33G 和 V50M
[0118].R33G、I34V 和 V50M
[0119].D3G、L181、R33G、V50M、Y73!^PN91T
[0120].R6G、T35F 和 V72A
[0121].A12V、S21N 和 T35A
[0122].S21G 和 T49A
[0123].D3S 和 D7K
[0124].Α12ν 和 L19Q
[0125].A12D、L18I 和 L19Q
[0126].A12E、L18I 和 L19Q
[0127]在某些實(shí)施方案中，在BC、DE和FG環(huán)被修飾的wFnS結(jié)構(gòu)域的語(yǔ)境下，這些特定的支架突變組合被排除。
[0128]在一些實(shí)施方案中，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的位置21的位置處具有突變的多肽被排除，除非該位置的突變與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的位置1_7、19、31、49、58、60、73、75和89中的任何一個(gè)氨基酸位置的突變組合。在一些實(shí)施方案中，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置60的位置處具有突變的多肽被排除，除非該位置的突變與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的位置 1-7、9-17、19、21、23-31、33、35、49、51-56、65-67、75-87 和 89 中的任何一個(gè)氨基酸位置的突變組合。在一些實(shí)施方案中，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的位置61的位置處具有突變的多肽被排除，除非該位置的突變與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的位置11、12、19、46、66-67、69和91的任何一個(gè)氨基酸位置的突變組合。在一些實(shí)施方案中，在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的位置93或94的位置處具有突變的多肽被排除，除非這些位置中任一處的突變與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的位置1-7、9_14、65_67、89和91的任何一個(gè)氨基酸位置的突變組合。在某些實(shí)施方案中，這些排除適用于其中BC、DE和FG環(huán)被修飾的kiFM結(jié)構(gòu)域。
[0129]在某些實(shí)施方案中，呷113結(jié)構(gòu)域的非環(huán)區(qū)可以被一個(gè)或多個(gè)保守取代所修飾。10Fn3結(jié)構(gòu)域中多達(dá)5%、10%、20%或甚至30%或更多的氨基酸可以通過(guò)保守取代被改變，而不會(huì)顯著改變kiFM對(duì)配體的親和力。在某些實(shí)施方案中，支架可以包含0-15、0-10、
0-8、0-6、0-5、0-4、0-3、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、5-15、或5-10個(gè)保守氨基酸取代。在示例實(shí)施方案中，支架修飾優(yōu)選地使kiFM結(jié)合子與配體的結(jié)合親和力降低少于100倍、50倍、25倍、10倍、5倍或2倍。這樣的變化有可能在體內(nèi)改變kiFM的免疫原性，且當(dāng)免疫原性被降低時(shí)，這樣的改變是期望的。如本文中所使用的，“保守取代”是用物理上或功能上相似的殘基代替相應(yīng)的參考?xì)埢?。也就是說(shuō)，保守取代和其參考?xì)埢哂邢嗨频拇笮?、性質(zhì)、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵的能力，等。優(yōu)選的保守取代滿足在Dayhoff et al.、Atlas of Protein Sequence andStructure5:345-352 (1978&Supp.)中定義的可接受的點(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)。保守取代的實(shí)例包括如下組內(nèi)的取代:(a)纈氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)絲氨酸、蘇氨酸；(g)賴氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。
[0130]在一些實(shí)施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域包含具有本文中記載的任何文庫(kù)設(shè)計(jì)，例如在圖
2、9和12(或其氨基酸1-94 ；SEQIDN0:6)中提出的任何文庫(kù)設(shè)計(jì)的氨基酸序列，并且在環(huán)和/或鏈中包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)額外取代、添加或缺失。在某些實(shí)施方案中，uiFr^結(jié)構(gòu)域包含具有本文中記載的、例如在圖2、9和12 (或其氨基酸1_94 ；SEQ IDNO:6)中記載的任何文庫(kù)設(shè)計(jì)的氨基酸序列，并且沒(méi)有其它氨基酸修飾。包含具有本文中記載的、例如在圖2、9和12 (或其氨基酸1-94 ；SEQ ID NO: 6)中記載的任何文庫(kù)設(shè)計(jì)的氨基酸序列的kiFM分子在被改變的位置處可以包含任何氨基酸，在某些情況下甚至包含野生型kiFM分子的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，包含具有本文中記載的、例如在圖2、9和12 (或其氨基酸1-94 ；SEQ ID NO:6)中記載的任何文庫(kù)設(shè)計(jì)的氨基酸序列的kiFM分子在每一個(gè)標(biāo)示為“被改變”的位置(加有下劃線或方框，并用粗體標(biāo)記的那些)上僅包含非野生型氨基酸。
[0131]C.N 和 C 端區(qū)
[0132]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的N端和/或C端區(qū)氨基酸序列相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列可以通過(guò)缺失、取代或插入被修飾。kiFM結(jié)構(gòu)域一般以SEQ ID NO:1的氨基酸編號(hào)I開(kāi)始。然而，具有氨基酸缺失的結(jié)構(gòu)域也包含在本發(fā)明之內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的最先8個(gè)氨基酸(即殘基1-8)和最后7個(gè)氨基酸( 即殘基95-101)缺失，生成具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的10Fn3結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的最后7個(gè)氨基酸(即殘基95-101)缺失，生成具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的1QFn3結(jié)構(gòu)域。在具有SEQ ID NO: 1、2、6、或60氨基酸序列的kiFM結(jié)構(gòu)域的N或C端也可以添加有額外的序列。例如，在一些實(shí)施方案中，N端延伸由選自下組的氨基酸序列構(gòu)成:M、MG和G。
[0133]在某些實(shí)施方案中，在本文中提供的多肽中，SEQ IDN0:1或6的前1、2、3、4、5、6、
7、8或9個(gè)氨基酸的氨基酸序列相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)氨基酸序列可以被修飾或缺失。在示例的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的氨基酸1_8的氨基酸被長(zhǎng)度為1-20個(gè)、1-15個(gè)、1-10個(gè)、1-8個(gè)、1-5個(gè)、1-4個(gè)、1-3個(gè)、1-2個(gè)、或I個(gè)氨基酸的備選N端區(qū)所代替。備選N端區(qū)的實(shí)例包括(用單字母氨基酸編碼表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:9)和 GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 11)、或 SEQ ID NO: 9 和 11 中任一個(gè)的N-端截短物。其它合適的備選N端區(qū)包括，例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO: 16)、XnDVPRDL(SEQID NO: 17)、XnVPRDL(SEQ ID NO: 18)、XnPRDL(SEQ ID NO: 19)、XnRDL(SEQ ID NO: 20)、XnDL(SEQID NO: 21)、或XnL,其中η = 0、1或2個(gè)氨基酸,其中當(dāng)η = I時(shí)，X是Met或Gly,當(dāng)η = 2時(shí)，X是Met-Gly。當(dāng)Met-Gly序列被添加在uiFr^結(jié)構(gòu)域的N端時(shí)，M通常會(huì)被切掉，在N端留下一個(gè)G。在其它實(shí)施方案中，備選的N端區(qū)包括MASTSG (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列。
[0134]在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)氨基酸序列，本文提供的多肽中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸93-101、94-101、95-101、96-101、97-101、98-101、99-101、100-101、或101的氨基酸序列缺失或被修飾。在示例實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1氨基酸95-101的氨基酸被長(zhǎng)度為1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、
1-3、1-2、或I個(gè)氨基酸的備選C端區(qū)代替。備選C端區(qū)序列的具體實(shí)例包括，例如，包含、基本上組成為、或組成為 EIEK(SEQ ID NO:7), EGSGC(SEQ ID NO:23), EIEKPCQ(SEQ IDNO:24)、EIEKPSQ(SEQ ID NO:25)、EIEKP(SEQ ID NO:26)、EIEKPS(SEQ ID NO:27)、EIEKPC(SEQID NO:8)、或SEQ ID NO:44構(gòu)成的多肽。在一些實(shí)施方案中，備選C端區(qū)包含EIDK(SEQ IDNO:29)，在特定的實(shí)施方案中，備選C端區(qū)是EIDKPCQ(SEQ ID NO:31)或EIDKPSQ(SEQ IDNO:30)。
[0135]在某些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白包含具有備選N端區(qū)序列和備選C端區(qū)序列二者的uiFr^結(jié)構(gòu)域。
[0136]當(dāng)本文中提到包含特定文庫(kù)設(shè)計(jì)的分子，且該文庫(kù)設(shè)計(jì)包含氨基酸1-101 (SEQ IDNO:1)時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，包含氨基酸1-94 (SEQ ID NO:6)、但不包含7個(gè)N端氨基酸和/或不包含C端氨基酸的該分子也涵蓋在本文之內(nèi)。
[0137]D.具有新的環(huán)與支架組合的蛋白質(zhì)
[0138]如本文中所述，“補(bǔ)丁文庫(kù)”是指這樣的文庫(kù)，其中支架蛋白表面上的某個(gè)區(qū)域被多樣化。要進(jìn)行多樣化的殘基可以通過(guò)這樣的方式確定:挑取(picking)蛋白表面上的一個(gè)點(diǎn)(spot)，然后鑒定據(jù)其一定距離(例如8A)內(nèi)的所有表面和環(huán)殘基，并調(diào)節(jié)形狀、序列連通性、保守性等。例如，為了產(chǎn)生以支架“西南(西南)”部分為中心的補(bǔ)丁文庫(kù)，選擇EF環(huán)中的最后一個(gè)氨基酸一Asp67,它大約位于SW側(cè)面的中心。然后鑒定距離Asp67在gA范圍內(nèi)的所有殘基，并從要多樣化殘基的列表中除去疏水核心殘基，從而提供了總共14個(gè)供隨機(jī)化的氨基酸，包括G37-G41、K63-D67、T69，和自N91開(kāi)始的C端序列(殘基位置根據(jù)具有SEQ ID NO:1或6的野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域的序列進(jìn)行編號(hào))。然后可以在支架設(shè)計(jì)中引入其它多樣化手段，例如，改變CD環(huán)的長(zhǎng)度(以允許更大的形狀變化)、或修飾或延伸N端區(qū)的序列。圖2A-F和9A-C提供了可以加以突變從而產(chǎn)生代表性補(bǔ)丁文庫(kù)的氨基酸殘基的實(shí)例。圖3A-F顯示了 kiFM結(jié)構(gòu)域肽的三維結(jié)構(gòu)，例示了數(shù)個(gè)不同的界面，這些界面可以被靶定而產(chǎn)生代表性補(bǔ)丁文庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域多肽的氨基酸的多樣化不是就環(huán)的定義而言，而是就它們?cè)趉iFM結(jié)構(gòu)表面上的物理定位而言。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)有10-30個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“補(bǔ)丁”被多樣化，并被選用來(lái)形成一個(gè)大體上連續(xù)的表面，該表面可以是跨環(huán)和鏈的，或者可以是僅位于鏈殘基上的。
[0139]1.北極環(huán)和南極環(huán)被修飾的結(jié)合子
[0140]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含uiFr^結(jié)構(gòu)域，所述kiFM結(jié)構(gòu)域具有:⑴相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)，在從BC、DE和FG環(huán)選出的至少一個(gè)北極環(huán)的氨基酸序列中含有修飾，和(ii)相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:1或6)的相應(yīng)環(huán)，在從AB、CD和EF環(huán)選出的至少一個(gè)南極環(huán)的氨基酸序列中含有修飾。所述經(jīng)修飾的北極環(huán)和南極環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。構(gòu)想了經(jīng)修飾的北極環(huán)與南極環(huán)的各種組合。例如，kiFM可以包含一個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的北極環(huán)和一個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的南極環(huán)，一個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的北極環(huán)和兩個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的南極環(huán)，兩個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的北極環(huán)和一個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的南極環(huán)，兩個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的北極環(huán)和兩個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的南極環(huán)，三個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的北極環(huán)和一個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的南極環(huán)，等，其中每一個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)均貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。可以被修飾的北極環(huán)和南極環(huán)的組合的實(shí)例包括，例如，CD環(huán)(南極環(huán))和FG環(huán)(北極環(huán))，CD環(huán)(南極環(huán))和DE環(huán)(北極環(huán))，EF環(huán)(南極環(huán))和FG環(huán)(北極環(huán))，AB環(huán)(南極環(huán))和FG環(huán)(北極環(huán))，或DE環(huán)(北極環(huán))和EF環(huán)(南極環(huán))。另一個(gè)環(huán)組合實(shí)例是CD環(huán)(南極環(huán))、DE環(huán)(北極環(huán))和EF環(huán)(南極環(huán))。再另外的環(huán)組合實(shí)例是DE環(huán)(北極環(huán))和AB、CD和EF環(huán)(南極環(huán))中的一個(gè)或多個(gè)。經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)可以在整個(gè)環(huán)中都有序列修飾，或者僅在環(huán)的一部分中有序列修飾。此外，一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)可以具有插入或缺失，從而使環(huán)的長(zhǎng)度與野生型序列的相應(yīng)環(huán)的長(zhǎng)度相比發(fā)生改變。在某些實(shí)施方案中，uiFr^結(jié)構(gòu)域的其它區(qū)域(即除了北極環(huán)和南極環(huán)之外)，例如β -鏈、N端和/或C端區(qū)的序列，與野生型10Fn3結(jié)構(gòu)域相比也可以被修飾，并且這些額外修飾也可以貢獻(xiàn)于與靶標(biāo)的結(jié)合。
[0141]有至少一個(gè)北極環(huán)和至少一個(gè)南極環(huán)被修飾的kiFM設(shè)計(jì)實(shí)例包括，例如，圖9A所示的胃51、152、153、152’、前1、前、后1、后2、WS-LI1、南前、和AG鏈設(shè)計(jì)，和圖2C-2E所示的西側(cè)、南前和AG鏈設(shè)計(jì)。
[0142]2.具有環(huán)和支架區(qū)修飾的結(jié)合子
[0143]本文中還提供了具有新型環(huán)和支架修飾組合的kiFM結(jié)構(gòu)域。特別地，本申請(qǐng)?zhí)峁┑亩嚯陌@樣的uiFr^結(jié)構(gòu)域，其包括⑴在環(huán)AB、BCXD、DE、EF、或FG的至少一個(gè)中的氨基酸序列修飾，和(ii)在至少一個(gè)支架區(qū)中的氨基酸序列的修飾(即在至少一個(gè)鏈、N端區(qū)和/或C端區(qū)中的修飾)，其中經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和經(jīng)過(guò)修飾的支架區(qū)均貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在示例實(shí)施方案中，支架區(qū)修飾與環(huán)區(qū)中的修飾相鄰，例如，如果AB環(huán)被修飾，則支架突變多位于在kiFM結(jié)構(gòu)域的線性序列中與AB環(huán)相鄰的β-鏈A和/或β-鏈B中。在其它實(shí)施方案中，在kiFM結(jié)構(gòu)域的線性序列中彼此相鄰的環(huán)和支架區(qū)內(nèi)可發(fā)現(xiàn)成簇的修飾。例如，例如 ，同時(shí)具有環(huán)和支架修飾的kiFM結(jié)合子，可以在kiFM結(jié)構(gòu)域的線性序列中彼此相鄰的環(huán)和支架區(qū)的如下組合中具有氨基酸修飾簇:β -鏈/環(huán)/ β -鏈、環(huán)/ β -鏈/環(huán)、環(huán)/β-鏈/環(huán)/β-鏈、末端區(qū)/β-鏈/環(huán)、或環(huán)/β-鏈/末端區(qū)，等。例如，具有新型環(huán)和支架修飾組合的kiFM結(jié)構(gòu)域可以具有成簇的修飾，從而與野生型相比，在由20個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成的區(qū)段(stretch)中有至少15個(gè)氨基酸被修飾。在其它實(shí)施方案中，與野生型kiFM結(jié)構(gòu)域在相應(yīng)氨基酸區(qū)段上的序列相比，在一段連續(xù)區(qū)段中，20個(gè)殘基中的至少17個(gè)，20個(gè)中的至少18個(gè)，25個(gè)中的至少17個(gè)，25個(gè)中的至少20個(gè)，或30個(gè)殘基中的至少25個(gè)被修飾。在某些實(shí)施方案中，給定的uiFr^結(jié)構(gòu)域可以具有兩個(gè)或三個(gè)成簇的修飾，它們被未經(jīng)修飾的(即野生型)序列隔開(kāi)。對(duì)于任何給定的被修飾區(qū)域(即環(huán)、鏈或末端區(qū))，區(qū)域的全部或僅有一部分與野生型序列相比被修飾。當(dāng)鏈區(qū)被修飾時(shí)，優(yōu)選地疏水核心殘基保持不被修飾(即野生型)，而β_鏈中的一個(gè)或多個(gè)非核心殘基被修飾。環(huán)、β -鏈或末端區(qū)中的合適修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，及其組合。
[0144]在至少一個(gè)環(huán)區(qū)和至少一個(gè)支架區(qū)具有修飾的wFM設(shè)計(jì)實(shí)例包括，例如，圖9Α所示的WS1、前1、前2、后1、后2、SPU SP2、SP3、南前、AG鏈和西南設(shè)計(jì)，圖9Β所示的NW3設(shè)計(jì)，圖9C所示的ΝΡ1、ΝΕ1、ΝΡ4-5、ΝΡ6-1和NW2設(shè)計(jì)，和圖2A-2F所示的設(shè)計(jì)。
[0145]3.“西側(cè)”結(jié)合子
[0146]在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑膋iFM結(jié)構(gòu)域具有沿著分子“西側(cè)”的結(jié)合面(見(jiàn)圖3C)，并被稱作“西側(cè)結(jié)合子”或“WS結(jié)合子”。與SEQ ID NO:1或6中記載的相應(yīng)CD和FG環(huán)序列相比，本文中所述的WS結(jié)合子包含的wFnS結(jié)構(gòu)域具有經(jīng)過(guò)修飾的⑶環(huán)和經(jīng)過(guò)修飾的FG環(huán)。CD環(huán)和FG環(huán)均貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，WS結(jié)合子可在10Fn3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中包含額外的修飾。例如，WS結(jié)合子可以在與CD和/或FG環(huán)相鄰的一個(gè)或多個(gè)鏈區(qū)中含有支架修飾。特別地，WS結(jié)合子可以在@-鏈(:、0-鏈D、β -鏈F和/或β -鏈G的一個(gè)或多個(gè)中含有序列修飾。支架修飾的實(shí)例包括在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置:33、35、49、69、71、73、89和/或91的一個(gè)或多個(gè)支架區(qū)位置處的修飾。WS結(jié)合子還可以在BC環(huán)，特別是在BC環(huán)的C端部分含有修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，BC環(huán)的最后兩個(gè)殘基(即對(duì)應(yīng)于野生型kiFM結(jié)構(gòu)域中的氨基酸30和31)與野生型序列相比被修飾。額外的環(huán)和支架修飾的全部或部分可以和被修飾的CD和FG環(huán)一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。優(yōu)選地，疏水核心殘基與野生型序列相比不被修飾。
[0147]在某些實(shí)施方案中，WS結(jié)合子具有長(zhǎng)為大約3-11個(gè)殘基、4-9或5個(gè)殘基的⑶環(huán)；長(zhǎng)為大約1-10個(gè)殘基，例如6或5個(gè)殘基的FG環(huán)；長(zhǎng)為大約6-14、8-11或9個(gè)殘基的C鏈；和/或長(zhǎng)為大約9-11或10個(gè)殘基的F鏈。β鏈C的位置31、33、35和37-39可以和野生型序列相比被改變。β鏈C的位置32、34和36可以是疏水殘基。β鏈F的位置67、69,71和73可以和野生型序列相比被改變。β鏈F的位置68、70和72可以是疏水殘基。WS結(jié)合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置30、31、32、33、34、35、36、37、38和/或39，例如位置31、33、35、37、38和/或39，如位置31和/或33含有氨基酸取代。WS結(jié)合子可以在SEQID NO:1或6的位置44、45、46、47、48、49、50和/或51，例如位置44、45、47和/或49含有氨基酸取代。WS結(jié)合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置40、41、42、43、44和/或45含有氨基酸取代。WS結(jié)合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置67、68、69、70、71、72、73、74、75和/或76，例如位置67、69、71、73和/或76或位置71、73、75和/或76含有氨基酸取代。WS結(jié)合子可以在SEQ IDN0:1或6的位置76、77、78、79、81、82、83、84、85和/或86，例如位置84和/或85含有氨基酸取代。WS結(jié)合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置85、86、87、88、89、90、91、92、93和/或94含有氨基酸取代。WS結(jié)合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置31、33、47、49,73和/或75含有氨基酸取代。WS結(jié)合子可以包含含有4_9個(gè)被改變的氨基酸，例如非野生型氨基酸的C環(huán)；含有5-6個(gè)被改變的氨基酸，例如非野生型氨基酸的FG環(huán)；并且其中氨基酸31、33、35、37-39、67、69、71、73和76不是野生型?！安皇且吧汀钡陌被崾侵概c野生型人kiFM分子(具有例如SEQ ID NO:1或6)的相同位置處出現(xiàn)的氨基酸不同的氨基酸。
[0148]10Fn3WS結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9A所示的WS1、WS2、WS3、WS2’、和WS-LI1設(shè)計(jì)，和圖2C所示的設(shè)計(jì)(或其氨基酸1-94)。當(dāng)提到具有基于包含氨基酸1-101的kiFM序列的特定設(shè)計(jì)的wFM分子時(shí)，該表述意圖包括那些在末端不含有“DK”和/或不包含N端7個(gè)氨基酸，并且對(duì)應(yīng)于所示序列氨基酸1-94的分子。或者，當(dāng)所示設(shè)計(jì)包含氨基酸1-94時(shí)，該表述意圖包括具有N端7個(gè)氨基酸的相同設(shè)計(jì)，其可以沒(méi)有“DK”序列。本文中描述了其它可以進(jìn)行的修飾。
[0149]圖12提供了 WS結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例。WS3，例如，對(duì)應(yīng)于WS1，其中⑶和FG環(huán)的長(zhǎng)度可以被修飾，D67也可以被修飾。具有WS3設(shè)計(jì)的分子的一個(gè)實(shí)例是具有SEQ ID NO:49的 PXR 結(jié)合子。WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LIUPWS4 的變異體包括在位置 30、31、33、35、37、38、46、47、49、50、67、69、71、73、75、76、84、85、86、87、89 或 91 具有野生型或突變氨基酸的那些。例如，WS結(jié)合子設(shè)計(jì)可以在⑶環(huán)的氨基酸39-45中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，并在FG環(huán)的氨基酸77-83中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(WS-LI1設(shè)計(jì))，并且其中具有該設(shè)計(jì)的kiFM分子特異性結(jié)合一個(gè)靶分子(并且任選地不包含RGD序列)。WS結(jié)合子設(shè)計(jì)可以包含WS-LIl的設(shè)計(jì)并在環(huán)或鏈中具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或25個(gè)額外氨基酸修飾。例如，WS結(jié)合子設(shè)計(jì)可以包含WS-LII的設(shè)計(jì)，并在氨基酸位置37、38、46、47、75、76、和 85-88 等氨基酸位置具有最多 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20 或 25個(gè)額外的氨基酸修飾?？梢园钠渌被嵝揎検窃谖恢?0、31、33、35、49、50、67、69、71、73、89和91的修飾。WS設(shè)計(jì)的一個(gè)實(shí)例可以包含WS7的氨基酸序列(圖12)，其中環(huán)的長(zhǎng)度可以和野生型kiFM分子中環(huán)的長(zhǎng)度不同，并且其中每個(gè)被改變的位置9 (粗體且下劃線)可以被修飾成任何其它氨基酸，或者在某些情況下，可以保持不修飾，只要具有這種設(shè)計(jì)的kiFM分子可以特異性結(jié)合靶分子(并且任選地不包含R⑶位點(diǎn))即可。在某些實(shí)施方案中，kiFM分子包含WS7的氨基酸序列，其中CD和FG環(huán)的長(zhǎng)度可以被改變，其中沒(méi)有其它的氨基酸可以被改變，并且其中被標(biāo)示為“可變”(下劃線且粗體標(biāo)示)的氨基酸殘基中正好有或者最多有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或25個(gè)實(shí)際上沒(méi)有改變，而是野生型人wFM分子相同位置處的氨基酸，即野生型氨基酸(SEQ ID NO:1或6)。例如，WS7中的氨基酸30、31、33、35、36、37、47、49、50、67、69、71、73、75和87中有一個(gè)或多個(gè)可以是野生型氨基酸，只要該WS結(jié)合子特異性結(jié)合其靶標(biāo)即可。在某些實(shí)施方案中，具有WS7設(shè)計(jì)的WS結(jié)合子在除了所標(biāo)明的氨基酸修飾之外不包含任何氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，具有WS7設(shè)計(jì)的WS結(jié)合子除了所標(biāo)明的氨基酸修飾之外，還包含最多1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、12、15、17、20或25個(gè)氨基酸修飾。
[0150]還提供了包含本文中所述任何一種WS結(jié)合子設(shè)計(jì)的文庫(kù)。一個(gè)示例文庫(kù)是如下的文庫(kù)，其包含具有被改變的⑶和FG環(huán)并進(jìn)一步在位置30、31、33、47和49包含非野生型氨基酸的WS結(jié)合子。一個(gè)示例文庫(kù)是如下的文庫(kù)，其具有被改變的FG環(huán)并還在位置30、31、33、47和49包含非野生型氨基酸。
[0151]在某些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)序列的氨基酸至少或至多有10、20、30、40、50、或60個(gè)不被改變，例如不被取代改變。例如，一個(gè)或多個(gè)如下的氨基酸保持為野生型人wFnS分子的氨基酸:位置 1-29、32、34、36、48、51-66、68、70、72、88、90 和 92-101 的氨基酸。
[0152]可特異性結(jié)合治療性靶標(biāo)的WS結(jié)合子的實(shí)例在實(shí)施例中有描述，并且包括例如具有SEQ ID NO:3-5、45-49、62-63、66、和72中任何一個(gè)的氨基酸序列的多肽。
[0153]在一些實(shí)施方案中，WS結(jié)合子包括吧1、吧2、吧3、吧2’、吧-1^1、吧4、吧5、吧6或WS7(或其氨基酸1-94)的氨基酸序列，并且在環(huán)和/或鏈中包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)額外的取代、添加或缺失。在某些實(shí)施方案中，WS結(jié)合子包含WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、WS4、WS5、WS6或WS7(或其氨基酸1_94)的氨基酸序列，并且沒(méi)有其它的氨基酸修飾。包含 WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、WS4、WS5、WS6 或 WS7(或其氨基酸 1-94)的氨基酸序列的WS結(jié)合子在被改變的位置處可以包含任何氨基酸，并且在一些情況下甚至包含野生型uiFr^分子的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，包含151、152、153、152’、15-1^1、154、吧5、WS6或WS7 (或其氨基酸1-94)的氨基酸序列的WS結(jié)合子在每一個(gè)標(biāo)示為“被改變”的位置(下劃線和粗體)均包含非野生型氨基酸。
[0154]4.“前(Front) ” 結(jié)合子
[0155]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含kiFM結(jié)構(gòu)域，所述kiFM結(jié)構(gòu)域在⑶環(huán)、DE環(huán)，以及在某些情況下EF環(huán)中具有修飾，其中環(huán)修飾均貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。這些多肽在本文中被稱作“前結(jié)合子”。前結(jié)合子可以額外地在一個(gè)或多個(gè)支架區(qū)包含修飾，特別是在位于被修飾環(huán)區(qū)的兩側(cè)或臨近的支架區(qū)中。例如，與野生型人呷113結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β_鏈的序列相比，前結(jié)合子可以在0-鏈(:、0-鏈0和/或β-鏈E的一個(gè)或多個(gè)中含有支架修飾。優(yōu)選地，疏水核心殘基與野生型序列相比不被修飾?？纱嬖谟谇敖Y(jié)合子中的支架修飾的實(shí)例包括在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置36、49、58和/或60的一個(gè)或多個(gè)位置處的修飾。這些支架修飾可以和被修飾的環(huán)一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，前結(jié)合子可以包含跨越kiFM結(jié)構(gòu)域的數(shù)個(gè)環(huán)和鏈區(qū)的成簇的修飾。特別地，前結(jié)合子可以在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)殘基36-66的氨基酸之間的31個(gè)殘基中的至少15、20、24、25、或27個(gè)中含有修飾。環(huán)和/或鏈修飾可以包含氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在示例實(shí)施方案中，與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的⑶環(huán)相比，⑶環(huán)的長(zhǎng)度被延長(zhǎng)或縮短。uiFr^前結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9Α所示的前I和前2設(shè)計(jì)。
[0156]5.“后(Back)” 結(jié)合子
[0157]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽包含kiFM結(jié)構(gòu)域，所述kiFM結(jié)構(gòu)域在EF和FG環(huán)中具有修飾，其中環(huán)修飾貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。這些多肽在本文中被稱作“后結(jié)合子”。后結(jié)合子可以在其它環(huán)和/或支架區(qū)含有額外的修飾。例如，后結(jié)合子可以在AB環(huán)的至少一部分，優(yōu)選地AB環(huán)的N端部分中含有修飾。在示例實(shí)施方案中，AB環(huán)的最先2個(gè)氨基酸(即對(duì)應(yīng)于野生型kiFM結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基14和15)相對(duì)于野生型序列被修飾。在某些實(shí)施方案中，后結(jié)合子還可以包含一個(gè)或多個(gè)支架修飾，特別是在與被修飾的環(huán)區(qū)相鄰的一個(gè)或多個(gè)支架區(qū)中含有修飾。例如，后結(jié)合子可以在鏈Α、β-鏈G、N端區(qū)和/或C端區(qū)的一個(gè)或多個(gè)中含有一個(gè)或多個(gè)修飾。優(yōu)選地，疏水核心殘基與野生型序列相比不被修飾。支架修飾的實(shí)例包括在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6氨基酸位置1_7、9_13、89、91、93和/或94的一個(gè)或多個(gè)位置處含有修飾。所述額外的環(huán)和/或支架修飾中的一個(gè)或多個(gè)可以與被修飾的EF和FG環(huán)一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。合適的環(huán)和/或支架區(qū)修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在某些實(shí)施方案中，與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的FG環(huán)相比，F(xiàn)G環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
[0158]在某些實(shí)施方案中，后結(jié)合子可以在跨越kiFM結(jié)構(gòu)域的數(shù)個(gè)區(qū)域的連續(xù)區(qū)段中包含成簇的被修飾的氨基酸殘基。例如，與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)殘基相比，kiFM結(jié)構(gòu)域的最先15個(gè)氨基酸殘基中的至少14個(gè)被修飾，和/或相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)殘基80-97 (或94)的氨基酸之間的18個(gè)殘基中有至少15個(gè)已被修飾。
[0159]10Fn3后結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9A所示的后I和后2設(shè)計(jì)。
[0160]6.“南極”結(jié)合子
[0161] 在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┌╱iFr^結(jié)構(gòu)域的多肽，其中與野生型序列的相應(yīng)殘基的序列相比，kiFM結(jié)構(gòu)域在β -鏈Α、ΑΒ環(huán)、β -鏈B、CD環(huán)、β -鏈E、EF環(huán)和β -鏈F的氨基酸序列中含有修飾。這些多肽在本文中被稱作“南極結(jié)合子”或“SP結(jié)合子”。這些經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和鏈貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶的結(jié)合。與野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的CD環(huán)相比，CD環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度可以延長(zhǎng)或縮短。與野生型序列的相應(yīng)區(qū)域的序列相比，南極結(jié)合子可以在鏈G和/或C端區(qū)含有額外的修飾。在示例實(shí)施方案中，南極環(huán)可以在對(duì)應(yīng)于野生型序列位置11、12、19、60、61、69、91、93和95-97的氨基酸處包含一個(gè)或多個(gè)修飾。kiFM南極結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9A所示的SP1、SP2和SP3設(shè)計(jì)。
[0162]7.“西北(Northwest)，，結(jié)合子
[0163]在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┌琸iFM結(jié)構(gòu)域的多肽，所述kiFM結(jié)構(gòu)域與SEQID NO:1或6中記載的相應(yīng)BC、DE和FG環(huán)序列相比，在BC、DE和FG環(huán)中具有修飾，并且在一個(gè)或多個(gè)β -鏈C、β -鏈D、β -鏈F和β -鏈G鏈殘基中含有額外的修飾。這些β -鏈修飾和環(huán)區(qū)修飾一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。這些蛋白在本文中被稱作“西北結(jié)合子”或“NW結(jié)合子”。在示例實(shí)施方案中，NW結(jié)合子在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6支架區(qū)位置R33、T49、Y73和S89的任何一個(gè)氨基酸位置或其組合處含有一個(gè)或多個(gè)支架修飾。環(huán)和支架區(qū)中的合適修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在某些實(shí)施方案中，與野生型序列相比，BC、DE和FG環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短，或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，與野生型序列(例如SEQ ID NO:1或6)相比，BC、DE和FG環(huán)的每一個(gè)的長(zhǎng)度被延長(zhǎng)或縮短，或其組合。在某些實(shí)施方案中，與野生型序列相比，只有BC環(huán)的一部分，特別是C端部分被修飾。例如，BC環(huán)中可以只有對(duì)應(yīng)于野生型BC環(huán)氨基酸27-31的氨基酸殘基被修飾，而B(niǎo)C環(huán)的其余部分(即對(duì)應(yīng)于野生型環(huán)的殘基23-26)保留不被修飾。
[0164]10Fn3NW結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9B所示的NW3設(shè)計(jì)，圖9C所示的NW2設(shè)計(jì)，和圖2A所示的設(shè)計(jì)。圖3描述了 NW結(jié)合子的一個(gè)模型。
[0165]8.“東北(Northeast)，，結(jié)合子
[0166]在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┌瑆FnS結(jié)構(gòu)域的多肽，所述kiFM結(jié)構(gòu)域具有經(jīng)過(guò)修飾的BC、DE和FG環(huán)，并且在N端區(qū)、β -鏈Α、β -鏈B和/或β -鏈E的任何一個(gè)或其組合中含有一個(gè)或多個(gè)額外的修飾。這些蛋白在本文中被稱作“東北結(jié)合子”或“NE結(jié)合子”。在示例實(shí)施方案中，NE結(jié)合子在對(duì)應(yīng)于野生型序列(SEQ ID NO:1或6)的支架區(qū)位置1-7、E9、L19、S21和/或T58的任何一個(gè)氨基酸或其組合處被修飾。經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和支架區(qū)的組合貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。kiFMNE結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9C所示的NEl設(shè)計(jì)，和圖2B所示的設(shè)計(jì)。圖3B描述了 NE結(jié)合子的一個(gè)模型。
[0167]9.“南前(South Front) ” 結(jié)合子
[0168]在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┌琸iFM結(jié)構(gòu)域的多肽，所述kiFM結(jié)構(gòu)域在AB、⑶、DE和EF環(huán)的一個(gè)或多個(gè)中具有修飾，并且在β -鏈B、β -鏈D和/或β -鏈E的一個(gè)或多個(gè)中具有額外的修飾。這些蛋白在本文中被稱作“南前結(jié)合子”。經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和支架區(qū)的組合貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。在示例實(shí)施方案中，南前結(jié)合子可以在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的支架區(qū)位置1^19、了49、了58、360、和/或661的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處被修飾，和/或在對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:1 或 6 的環(huán)區(qū)位置 T14_S17、P51、T56、G40_E47、和 / 或 K63-G65 的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處被修飾。在示例實(shí)施方案中，南前結(jié)合子的AB環(huán)、對(duì)應(yīng)于野生型序列殘基18和20的氨基酸之間，和/或CD環(huán)的長(zhǎng)度可以被延長(zhǎng)或縮短。kiFM南前結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9A所示的南前設(shè)計(jì)，和圖2D所示的設(shè)計(jì)。圖3D描述了南前結(jié)合子的一個(gè)模型。
[0169]10.“AG” 結(jié)合子
[0170]在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┌琸iFM結(jié)構(gòu)域的多肽，所述kiFM結(jié)構(gòu)域與SEQID NO:1或6的相應(yīng)鏈相比，具有經(jīng)過(guò)修飾的β -鏈A和β -鏈G。這些蛋白在本文中被稱作“AG結(jié)合子”或“AG鏈”結(jié)合子。在某些實(shí)施方案中，AB鏈結(jié)合子在kiFM結(jié)構(gòu)域的N端和C端部分包含成簇的修飾，而kiFM的中間部分保持不被修飾。例如，AG鏈結(jié)合子可以在10Fn3結(jié)構(gòu)域的最先19個(gè)氨基酸(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置1_19)中的16個(gè)處包含修飾，在wFM結(jié)構(gòu)域的最后18個(gè)氨基酸(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置84-101)中的13-17個(gè)處包含修飾，或者在kiFM結(jié)構(gòu)域的最后22個(gè)氨基酸(即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置80-101)中的14-18個(gè)處包含修飾。在示例實(shí)施方案中，AG結(jié)合子可以在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1-7、9、11-17、19、84-89和91-97的一個(gè)或多個(gè)位置處包含修飾。優(yōu)選地，AB結(jié)合子中被修飾的區(qū)域貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶的結(jié)合。kiFmag結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9A所示的AG鏈設(shè)計(jì)，和圖2E所示的設(shè)計(jì)。圖3E描述了 AG結(jié)合子的一個(gè)模型。
[0171]11.“西南(西南)”結(jié)合子
[0172]在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┌瑆FnS結(jié)構(gòu)域的多肽，所述kiFM結(jié)構(gòu)域具有經(jīng)過(guò)修飾的⑶和EF環(huán)，并在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1位置69或91-97中的任何一個(gè)殘基或殘基組合中具有額外的修飾。這些蛋白在本文中被稱作“西南結(jié)合子”或“SW結(jié)合子”。經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和支架區(qū)貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。kiFi^SW結(jié)合子設(shè)計(jì)的實(shí)例包括，例如，圖9A所示的西南設(shè)計(jì)，和圖2F所示的設(shè)計(jì)。圖3F描述了 SW結(jié)合子的一個(gè)模型。
[0173]E.具有降低的免疫原性的蛋白
[0174]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽有降低的免疫原性。如實(shí)施例中所述，uiFr^結(jié)構(gòu)域BC環(huán)周?chē)膮^(qū)域似乎是免疫原性熱點(diǎn)。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藘蓚€(gè)類型的具有降低的免疫原性的kiFM設(shè)計(jì)。在第一個(gè)類型的設(shè)計(jì)中，BC環(huán)保持完全未被修飾或至少部分未被修飾，從而宿主(例如人類)免疫應(yīng)答更可能將kiFM結(jié)構(gòu)域的BC區(qū)識(shí)別為自身，借此避免免疫應(yīng)答。在第二個(gè)類型的設(shè)計(jì)中，kiFM結(jié)構(gòu)域BC環(huán)中的強(qiáng)HLA結(jié)合錨被除去或破壞，從而使BC區(qū)不會(huì)那么緊密地結(jié)合宿主HLA受體，藉此降低kiFM結(jié)構(gòu)域BC環(huán)區(qū)的免疫原潛力。下面對(duì)這些wFM設(shè)計(jì)進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
[0175]在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂薪档偷拿庖咴缘亩嚯?，其包含kiFM結(jié)構(gòu)域，其中整個(gè)BC環(huán)保留為野生型。優(yōu)選地，這些多肽與在BC環(huán)具有修飾的等價(jià)多肽相比，具有更低的免疫原性。具有野生型BC環(huán)的多肽在kiFM結(jié)構(gòu)域的其它參與靶結(jié)合的區(qū)域中具有修飾。優(yōu)選地，BC環(huán)之外的修飾不會(huì)導(dǎo)致在宿主體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)kiFM結(jié)構(gòu)域的強(qiáng)免疫應(yīng)答。整個(gè)BC環(huán)保留為野生型的kiFM結(jié)合子的實(shí)例包括，例如，本文中所述的WS結(jié)合子、前結(jié)合子、后結(jié)合子、南極結(jié)合子、南前結(jié)合子、AG結(jié)合子和西南結(jié)合子。具有與野生型序列相比未被修飾的BC環(huán)的kiFM設(shè)計(jì)的特定實(shí)例包括，例如，圖9A所示的WS2、WS3、前1、前 2、后 1、后 2、SP1、SP2、SP3、L1-3 (a)、WS-LI1、LU-S9、南前、AG 鏈和西南設(shè)計(jì)，和圖 2D-2F所示的設(shè)計(jì)。在具有野生型BC環(huán)的kiFM結(jié)合子設(shè)計(jì)中，可能理想的是使β-鏈B和/或β -鏈C的全部或一部分，特別是與BC環(huán)相鄰的β -鏈B和/或β -鏈C部分(即β -鏈B的C端部分和/或β-鏈C的N端部分)，與野生型序列相比保持不被修飾。在示例實(shí)施方案中，具有野生型BC環(huán)和降低的免疫原性的wFM結(jié)構(gòu)域，在wFM的處于CD環(huán)的N端一側(cè)的部分中可以不含任何修飾，即，N端區(qū)、β-鏈Α、ΑΒ環(huán)、β-鏈B、BC環(huán)和β-鏈C相對(duì)于野生型序列全被保留不被修飾。
[0176]在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂薪档偷拿庖咴缘亩嚯模浒琸iFM結(jié)構(gòu)域，其中BC環(huán)的一部分被保留為野生型。優(yōu)選地，這些多肽與在BC環(huán)的更大部分中具有修飾的等價(jià)多肽相比，具有更低的免疫原性。在示例實(shí)施方案中，BC環(huán)的N端部分被保留為野生型。例如，BC環(huán)的最先1、2、3、4、5、或6個(gè)殘基可以被保留為野生型，而B(niǎo)C環(huán)的其余C端殘基可以被修飾。在BC環(huán)N端區(qū)的至少一部分被保留為野生型的kiFM設(shè)計(jì)中，可能理想的是使β -鏈B和/或β -鏈C的全部或部分，特別是β -鏈B和/或β -鏈C的與BC環(huán)相鄰的部分(即β -鏈B的C端部分和/或β-鏈C的N端部分)，與野生型序列相比保持不被修飾。在示例實(shí)施方案中，在BC環(huán)的N端部分具有野生型序列和降低的免疫原性的uiFr^結(jié)構(gòu)域在N端區(qū)、β -鏈Α、ΑΒ環(huán)和β -鏈B中可以不具有任何修飾。在BC環(huán)的一部分為野生型的kiFM設(shè)計(jì)中，BC環(huán)被修飾的部分可以和kiFM結(jié)構(gòu)域其它區(qū)域內(nèi)的修飾一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。BC環(huán)N端部分保留為野生型的kiFM結(jié)合子的實(shí)例包括，例如，圖9Β所示的kiFM設(shè)計(jì)，圖9Α所示的WSl設(shè)計(jì)，和圖2C所示的kiFM設(shè)計(jì)。
[0177]在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂薪档偷拿庖咴缘亩嚯?，其包含kiFM結(jié)構(gòu)域，其中β -鏈B/BC環(huán)/ β -鏈C ( “BC錨”)區(qū)中的強(qiáng)HLA錨已被除去或破壞(例如以相對(duì)于野生型序列降低對(duì)一種或多種HLA受體的結(jié)合親和力的方式被修飾)。例如，可以通過(guò)在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或6的位置L19、S21、R33和/或T35的一個(gè)或多個(gè)位置處對(duì)1QFn3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行修飾，而除去或破壞BC錨。當(dāng)BC錨已被除去或破壞時(shí)，有可能修飾BC環(huán)的序列而不會(huì)顯著增加BC區(qū)的免疫原潛力。因此，許多這樣的kiFM設(shè)計(jì)除了 0-鏈8和/或β -鏈C中的修飾之外，在BC環(huán)中也有修飾。BC環(huán)可以貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合，任選地與uiFr^結(jié)構(gòu)域其它區(qū)域中的修飾一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。β-鏈B和/或β-鏈C中的修飾可以或者可以不貢獻(xiàn)于對(duì)靶的結(jié)合。BC錨被除去或破壞的kiFM結(jié)合子的實(shí)例包括，例如，圖9C所示的wFM設(shè)計(jì)和圖2Β所示的kiFM設(shè)計(jì)。
[0178]在某些實(shí)施方案中，本文中所述的多肽與具有SEQ ID NO:61的多肽相比具有降低的免疫原性，例如多肽的免疫原性比具有SEQ ID Ν0:61的多肽的免疫原性低。
[0179]本文中所述的多肽的免疫原性可以通過(guò)例如如下的一種或多種方法進(jìn)行評(píng)估:人白細(xì)胞抗原(“HLA”)結(jié)合、HLA結(jié)合的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)(in silico predict1n)(例如使用Epimatrix程序)、人T細(xì)胞的體外活化、體內(nèi)動(dòng)物免疫應(yīng)答，或其它用于評(píng)估免疫原性潛力的方法。
[0180]在某些實(shí)施方案中，免疫原性可以通過(guò)HLA結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。優(yōu)選地，本文中提供的多肽與一種或多種HLA受體結(jié)合的IC5tl小于或等于等價(jià)的HLA受體與野生型wFnS結(jié)構(gòu)域之間結(jié)合的IC5Q。例如，本文中提供的多肽可以以大于10μΜ、15μΜ、20μΜ、25μΜ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ M或200 μ M的IC5tl與HLA受體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，多肽與HLA受體結(jié)合的 IC5tl 為 10μΜ-1πιΜ、100μΜ-1πιΜ*500μΜ-1πιΜ。用于評(píng)估多肽/HLA IC5tl 結(jié)合的HLA 等位體可以是 DRB*0101、DRB*0301、DRB*0401、DRB*0701 和 / 或 DRB*1501 中的一種或多種。
[0181]在一些實(shí)施方案中，免疫原性可以通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，例如EpiMatrix,進(jìn)行評(píng)估。在特定的實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的EpiMatrix “Z”評(píng)分表得分(“Z” scalescore)小于或等于野生型uiFr^結(jié)構(gòu)域的得分。在某些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的EpiMatrix “Z”評(píng)分表得分不大于野生型kiFi^結(jié)構(gòu)域得分的200%。在一些實(shí)施方案中，多妝的 EpiMatrix 得分在 EpiMatrix “Z” 評(píng)分表上小于 1.64 (An Z ；2009 ；TherapeuticMonoclonal Antibodies:From Bench to Clinic ；John Wiley and Sons ；New Jersey ；428~429頁(yè))。
[0182]在一些實(shí)施方案中，免疫原性可以通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。例如，可以用本文中提供的多肽注射動(dòng)物，例如小鼠或猴，并測(cè)量IgG和/或IgM免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，本文中所述的多肽顯示的IgG和/或IgM免疫應(yīng)答不會(huì)超過(guò)在用野生型wFM結(jié)構(gòu)域注射的小鼠或猴中觀察到的免疫應(yīng)答的200%、100%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2% 或 1%。
[0183]本申請(qǐng)還提供了本文中所提供的多肽的文庫(kù)和從文庫(kù)中篩選可結(jié)合期望靶標(biāo)的結(jié)合子的方法。與沒(méi)有進(jìn)行設(shè)計(jì)以避免與BC區(qū)相關(guān)的免疫原潛力的文庫(kù)相比，從本文中提供的文庫(kù)中有更高的可能性分離到具有可接受的免疫原性特征的靶結(jié)合分子。這些文庫(kù)有助于減少對(duì)多肽候選物脫免疫(deimmunize)所需的勞動(dòng)，并提高鑒定出非免疫原性的多肽分子的概率。
[0184]F.多價(jià)蛋白
[0185]在某些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白是包含兩個(gè)或更多個(gè)kiFM結(jié)構(gòu)域的多價(jià)蛋白。例如，多價(jià)的基于纖連蛋白的支架蛋白可以包含2、3、或更多個(gè)共價(jià)締合的10Fn3結(jié)構(gòu)域。在示例實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白是包含兩個(gè)kiFM結(jié)構(gòu)域的雙特異性或二聚體蛋白。在某些實(shí)施方案中，多價(jià)的基于纖連蛋白的支架蛋白包含與第一靶分子結(jié)合的第一 kiFM結(jié)構(gòu)域，和與第二靶分子結(jié)合的第二 kiFM結(jié)構(gòu)域。所述第一和第二靶分子可以是相同或不同的靶分子。當(dāng)?shù)谝缓偷诙蟹肿酉嗤瑫r(shí)，第一和第二 kiFM結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合相同的靶標(biāo)，但結(jié)合于不同的表位。此外，當(dāng)?shù)谝缓偷诙蟹肿酉嗤瑫r(shí)，10Fn3結(jié)構(gòu)域中與靶結(jié)合相關(guān)的修飾區(qū)域可以是相同或不同的。而且，第一和第二 kiFM結(jié)構(gòu)域可以基于相同或不同的支架設(shè)計(jì)。例如，多價(jià)的基于纖連蛋白的蛋白支架可以包含兩個(gè)kiFM結(jié)構(gòu)域，其中兩個(gè)kiFM均是基于本文中所述的相同的非傳統(tǒng)支架設(shè)計(jì)，其中一個(gè)kiFM結(jié)構(gòu)域基于第一類型的非傳統(tǒng)支架設(shè)計(jì)而第二個(gè)kiFM結(jié)構(gòu)域基于第二種類型的非傳統(tǒng)支架設(shè)計(jì)，或者一個(gè)wFM結(jié)構(gòu)域基于一種非傳統(tǒng)支架設(shè)計(jì)，而第二個(gè)基于傳統(tǒng)的支架設(shè)計(jì)(即BC、DE和FG環(huán)被修飾)。
[0186]在示例實(shí)施方案中，多價(jià)的基于纖連蛋白的蛋白支架的每個(gè)kiFM結(jié)構(gòu)域與期望靶標(biāo)的結(jié)合Kd小于500nM、100nM、50nM、lnM、500pM、100pM，或更低。在一些實(shí)施方案中，多價(jià)的基于纖連蛋白的蛋白支架的每個(gè)kiFM結(jié)構(gòu)域與期望靶標(biāo)的結(jié)合Kd為IpM-1 μ M、100pM-500nM、lnM-500nM、或1ηΜ-100ηΜ。在示例實(shí)施方案中，多價(jià)的基于纖連蛋白的蛋白支架的每個(gè)wFM結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合不與野生型wFM結(jié)構(gòu)域，特別是野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域結(jié)合的靶標(biāo)。
[0187]多價(jià)的基于纖連蛋白的支架蛋白的kiFM結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)多肽接頭連接。示例多肽接頭包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1_2個(gè)氨基酸的多肽。用于連接kiFM結(jié)構(gòu)域的合適接頭是那些允許不同的結(jié)構(gòu)域彼此獨(dú)立折疊，從而形成允許與靶分子高親和力結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)的接頭。合適接頭的特定實(shí)例包括基于甘氨酸-絲氨酸的接頭，基于甘氨酸-脯氨酸的接頭，基于脯氨酸-丙氨酸的接頭，以及具有SEQ ID NO: 32的氨基酸序列的接頭。在一些實(shí)施方案中，接頭是基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和絲氨酸殘基，并且長(zhǎng)度可以為8-50、10-30、和10-20個(gè)氨基酸。這些接頭的實(shí)例包括SEQ ID NOs:39-43.在一些實(shí)施方案中，接頭是基于甘氨酸-脯氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和脯氨酸，并且長(zhǎng)度為3-30、10-30、和3-20個(gè)氨基酸。這些接頭的實(shí)例包括SEQ IDNOs:33-35。在一些實(shí)施方案中，接頭是基于脯氨酸-丙氨酸的接頭。這些接頭包含脯氨酸和丙氨酸，并且長(zhǎng)度可以為3-30、10-30、3-20和6_18個(gè)氨基酸。這些接頭的實(shí)例包括SEQID NO: 36-38。在示例實(shí)施方案中，接頭不含有任何Asp-Lys (DK)對(duì)。
[0188]藥代動(dòng)力學(xué)模塊
[0189]在一個(gè)方面中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕诶w連蛋白的支架蛋白進(jìn)一步包括藥代動(dòng)力學(xué)(PK)模塊。藥代動(dòng)力學(xué)包括化合物被對(duì)象例如吸收、分布、代謝和排泄等的性質(zhì)。藥代動(dòng)力學(xué)的改良可以根據(jù)預(yù)期的治療需要進(jìn)行評(píng)估。往往期望增加生物利用度和/或延長(zhǎng)給藥之間的時(shí)間，這可能可以通過(guò)延長(zhǎng)蛋白在施用后在血清中保持可用的時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，期望提高蛋白的血清濃度隨時(shí)間推移的連續(xù)性(例如降低在剛施用后和在下一次施用即將開(kāi)始前的蛋白的血清濃度的差異)。基于纖連蛋白的支架蛋白可以附接于這樣的模塊，其可以將多肽在哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠或人)體內(nèi)的清除速率與未經(jīng)修飾的多肽相比降低超過(guò)3倍。改良的藥代動(dòng)力學(xué)的其它度量包括血清半衰期，其通常被分成α相和β相。這兩個(gè)相的一個(gè)或兩個(gè)可以通過(guò)添加合適的模塊而被顯著改良。PK模塊是指在與生物活性分子融合時(shí)會(huì)影響生物活性分子藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的任何蛋白、肽、或模塊。
[0190]趨向于減慢蛋白從血液中清除的PK模塊包括聚氧化烯模塊，例如聚乙二醇、糖(例如唾液酸)和耐受良好的蛋白模塊(例如Fc、Fc片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白或血清白蛋白)?；诶w連蛋白的支架蛋白可以和如美國(guó)公開(kāi)N0.20070048282中所述的白蛋白或白蛋白的片段(部分)或變異體融合。在一些實(shí)施方案中，PK模塊是血清白蛋白結(jié)合蛋白，例如美國(guó)公開(kāi)Nos.2007/0178082和2007/0269422中描述的那些。在一些實(shí)施方案中，PK模塊是血清免疫球蛋白結(jié)合蛋白，例如美國(guó)公開(kāi)N0.2007/0178082中描述的那些。
[0191]在一些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白可以附接包含非蛋白質(zhì)聚合物的PK模塊。在一些實(shí)施方案中，聚合物是聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯，如美國(guó)專利Nos.4，640，835 ;4，496，689 ;4，301，144 ;4，670，417 ;4，791，192 或 4，179，337 所述。在示例實(shí)施方案中，聚合物是PEG模塊。
[0192] PEG是一種眾所周知的水溶聚合物，其可以商購(gòu)或者根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法(Sandler and Karo、Polymer Synthesis、Academic Press、New York、第 3 卷、138-161 頁(yè))通過(guò)乙二醇的開(kāi)環(huán)聚合加以制備。術(shù)語(yǔ)“PEG”被廣義地使用，包括任何聚乙二醇分子，而不考慮大小或PEG末端的修飾，并且可以用如下公式表示:X-0 (CH2CH2O)^1CH2CH2OH(I)，其中η是20-2300，X是H或末端修飾，例如CV4烷基。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明PEG的一端用羥基或甲氧基封端，即X是H或CH3 (“甲氧基PEG”)。PEG可以進(jìn)一步含有結(jié)合反應(yīng)必需的化學(xué)基團(tuán)，這是該分子的化學(xué)合成的結(jié)果；或者其是用于在分子各部分間獲得最佳距離的間隔子(spacer)。此外，這種PEG可以由一個(gè)或多個(gè)連接在一起的PEG側(cè)鏈構(gòu)成。具有超過(guò)一個(gè)PEG鏈的PEG被稱作多臂或分支PEG。分支PEG可以通過(guò)例如向各種多元醇，包括甘油、季戊四醇和山梨醇，添加聚氧乙烯加以制備。例如，四臂的分支PEG可以用季戊四醇和氧化乙烯制備。分支PEG在例如歐洲公開(kāi)申請(qǐng)N0.473084A和美國(guó)專利N0.5，932，462中有描述。一種形式的PEG包含藉由賴氨酸的伯氨基連接的兩個(gè)PEG側(cè)鏈(PEG2) (Monfardin1、C.、et al.、B1conjugate Chem.6 (1995) 62-69)。
[0193]PEG與肽或蛋白的綴合一般包括PEG的活化和將活化的PEG中間產(chǎn)物直接與靶蛋白/肽偶聯(lián)，或與接頭偶聯(lián)，而接頭隨后被活化并與靶蛋白/肽偶聯(lián)(見(jiàn)Abuchowsk1、A.etal、J.B1l.Chem.,252,3571 (1977)和 J.B1l.Chem.、252、3582(1977)、Zalipsky、et al.、和 Harris et.al.、in:Poly(ethylene glycol)Chemistry:B1technical and B1medicalApplicat1ns ； (J.M.Harris ed.)Plenum Press:New York> 1992 ;第 21 和 22 章)。應(yīng)當(dāng)注意，含有PEG分子的基于纖連蛋白的支架蛋白也被稱作綴合蛋白，而缺少附接的PEG分子的蛋白可以稱作是非綴合的。
[0194]所用PEG的大小將會(huì)取決于多種因素，包括基于纖連蛋白的支架蛋白的預(yù)期用途。優(yōu)選較大的PEG以增加在體內(nèi)、血液、非血液細(xì)胞外液體或組織內(nèi)的半衰期。對(duì)于體內(nèi)細(xì)胞活性，大約10-60kDa范圍內(nèi)PEG是優(yōu)選的，小于大約10kDa的PEG，更優(yōu)選地小于大約60kDa也是優(yōu)選的，盡管也大于約10kDa的大小也可以使用。對(duì)于體內(nèi)成像應(yīng)用，可以使用較小的PEG，一般小于約20kDa，其不會(huì)像較大的PEG那樣增加半衰期，從而允許更快的分布和較小的半衰期?？梢赃x擇多種分子量形式的PEG，例如從大約1，000道爾頓(Da)到100, OOODa(η為20-2300)，用于綴合到基于纖連蛋白的支架蛋白上。PEG中重復(fù)單位“η”的數(shù)目是用道爾頓表述的近似分子量。優(yōu)選地，活化的接頭上PEG的總分子量適合于藥用。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG分子的分子量不超過(guò)100，000Da。例如，如果三個(gè)PEG分子與一個(gè)接頭連接，其中每一個(gè)PEG分子具有12，OOODa的相同分子量(每一個(gè)η為大約270)，那么接頭上PEG的總分子量為大約36，OOODa (總η為大約820)。附接在接頭上的PEG的分子量也可以不同，例如接頭上的三個(gè)分子中，2個(gè)PEG分子可以各為5，OOODa (每一個(gè)的η為大約110)，而一個(gè)PEG分子可以是12，OOODa (η為大約270)。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)PEG模塊與基于纖連蛋白的支架蛋白綴合。在一些實(shí)施方案中，PEG模塊為大約20、30、40、50、60、70、80、或90KDa。在一些實(shí)施方案中，PEG模塊為大約40KDa。
[0195]在一些實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白含有1、2或更多個(gè)PEG模塊。在一個(gè)實(shí)施方案中 ，PEG模塊與位于蛋白表面上和/或背離與靶配體接觸的表面的氨基酸殘基結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白中PEG的總或全分子量為大約3，000Da-60, OOODa、或大約10，000Da-36, OOODa0在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白中的PEG是基本上線性的直鏈PEG。
[0196]本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白如何應(yīng)用于治療、期望的劑量、循環(huán)時(shí)間、對(duì)蛋白水解的耐受、免疫原性和其它考慮，為PEG選擇合適的分子量。關(guān)于PEG及其用于提高蛋白性質(zhì)的應(yīng)用的討論,見(jiàn)N.V.Katre、Advanced Drug DeliveryReviewsl0:91-114(1993)。
[0197]在一些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白與具有如下公式的聚(乙二醇)模塊共價(jià)連接:-C0-CH2)x-(OCH2CH2)m-OR,其中聚(乙二醇)基團(tuán)的-CO(即羰基)與結(jié)合多肽的一個(gè)氨基形成酰胺鍵；R是低級(jí)烷基；x為2或3 ;m為大約450-大約950 ；n和m的選擇令綴合物減去結(jié)合多肽的分子量為大約10-40kDa。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白一個(gè)賴氨酸的ε-氨基是可及的(游離的)氨基。
[0198]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用PEG的碳酸酯形成PEG-基于纖連蛋白的支架蛋白偶聯(lián)物。N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)可在與PEG的反應(yīng)中使用，從而形成活化的混合PEG-琥珀酰亞胺基碳酸酯，其隨后可以和接頭的親核基團(tuán)或基于纖連蛋白的支架蛋白的氨基反應(yīng)(見(jiàn)美國(guó)專利N0.5，281，698和美國(guó)專利N0.5，932，462)。在一個(gè)相似類型的反應(yīng)中，可以用1，I’-(苯并三唑基)碳酸酯(1，I’ -(dibenzotriazolyl) carbonate)和二-(2-吡唳基)碳酸酯(d1-(2-pyridyl) carbonate)和PEG反應(yīng),分別形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美國(guó)專利N0.5，382，657)。
[0199]基于纖連蛋白的支架蛋白的PEG化能夠根據(jù)代表本領(lǐng)域當(dāng)前技術(shù)水平的方法實(shí)施，例如通過(guò)使基于纖連蛋白的支架蛋白與親電子活性的PEG(供應(yīng)商:Shearwater Corp.、USA,萬(wàn)維網(wǎng)shearwatercorp.com)反應(yīng)。本發(fā)明優(yōu)選的PEG試劑是,例如，N-羥基琥拍酰亞胺基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯或有分支的N-羥基玻拍酸亞胺如 mPEG2_NHS (Monfardin1、C.、et al.、B1con jugate Chem.6 (1995) 62-69)。這些方法可以用于在基于纖連蛋白的支架蛋白的賴氨酸ε -氨基處PEG化，或在基于纖連蛋白的脂蛋白的末端氨基處PEG化。
[0200]在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG分子可以和基于纖連蛋白的支架蛋白上的巰基偶聯(lián)(Sartore、L.、et al.> Appl.B1chem.B1technol.、27、45(1991) ；Morpurgo et al.、B1con.Chem.、7、363_368 (1996) ；Goodson et al.、B1/Technology (1990) 8、343 ;美國(guó)專利N0.5，766，897)。美國(guó)專利Nos.6，610，281和5，766，897描述了可以和巰基偶聯(lián)的反應(yīng)活性PEG種類的實(shí)例。
[0201]在一些實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白通過(guò)定點(diǎn)PEG化產(chǎn)生，特別地是通過(guò)將PEG綴合于半胱氨酸模塊而產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，Cys殘基可以位于基于纖連蛋白的支架蛋白的N端,N端與最靠N端的β或β樣鏈之間，C端,或C端與最靠C端的β或β樣鏈之間。Cys殘基也可以位于其他位置，特別是任何不參與靶結(jié)合的環(huán)或者位于多價(jià)的基于纖連蛋白的支架蛋白的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間。PEG化基團(tuán)還可以通過(guò)其它化學(xué)附接，包括通過(guò)與胺綴合。
[0202]在一些實(shí)施方案中，當(dāng)PEG分子與基于纖連蛋白的支架蛋白上的半胱氨酸殘基綴合時(shí)，半胱氨酸是基于纖連蛋白的支架蛋白自帶的，而在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基被工程化到基于纖連蛋白的支架蛋白中。可以在基于纖連蛋白的支架蛋白編碼序列中引入突變，從而產(chǎn)生半胱氨酸殘基。這可以通過(guò)，例如，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基突變成半胱氨酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。用于突變成半胱氨酸氨基的優(yōu)選氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和其它親水氨基酸。優(yōu)選地，要突變成半胱氨酸的殘基是表面暴露的殘基。用于根據(jù)一級(jí)序列或蛋白預(yù)測(cè)殘基的表面可及性的算法是本領(lǐng)域眾所周知的?；蛘撸紤]到設(shè)計(jì)基于纖連蛋白的支架蛋白所依據(jù)的第十fn3結(jié)構(gòu)域的框架已經(jīng)被解析(見(jiàn)Dickinson、et al.> J.Mol.B1l.236 (4): 1079-92 (1994))，則可以通過(guò)比較基于纖連蛋白的支架蛋白的氨基酸序列預(yù)測(cè)表面殘基，從而鑒定出表面暴露的殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，半胱氨酸殘基被引入到基于纖連蛋白的支架蛋白的N和/或C端或其附近，或者被弓丨入到環(huán)區(qū)內(nèi)。半胱氨酸殘基的PEG化可以使用，例如，PEG-馬來(lái)酰亞胺、PEG-乙烯砜、PEG-碘乙酰胺或PEG-鄰二硫吡啶實(shí)施。
[0203]在一些實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白包含與N端氨基酸的α氨基共價(jià)連接的PEG分子。位點(diǎn)特異性N端還原胺化反應(yīng)在P印insky et al.、(2001) JPET,297，1059、和美國(guó)專利N0.5，824，784中有描述。在美國(guó)專利N0.4，002，531，在Wieder etal.、(1979) J.B1l.Chem.254, 12579,和在 Chamow et al.、(1994)B1conjugate Chem.5、133中描述了使用PEG-醛利用其它可得的親核氨基對(duì)蛋白進(jìn)行還原胺化反應(yīng)。
[0204]在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白包含一個(gè)或多個(gè)附接于接頭的PEG分子，而接頭則附接在基于纖連蛋白的支架蛋白的N端氨基酸殘基的α氨基上。這種方法在美國(guó)公開(kāi)N0.2002/0044921和PCT公開(kāi)N0.W094/01451中有公開(kāi)。
[0205]在一個(gè)實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白在C端被PEG化。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過(guò)引入C端疊氮基-甲硫氨酸并隨后通過(guò)Staudinger反應(yīng)進(jìn)行甲基-PEG-三芳基膦化合物綴合，而使蛋白在C端被PEG化。該C端綴合方法在Cazalis et al.、C-TerminalSite-Specific PEGylat1n of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retent1n of FullB1activity、B1conjug Chem.2004 ；15 (5): 1005-1009 中有描述。
[0206]在示例實(shí)施方案中，如在下文進(jìn)一步詳述地那樣對(duì)基于纖連蛋白的支架蛋白進(jìn)行了 C端尾巴區(qū)中的PGE化。在示例實(shí)施方案中，C端含有半胱氨酸殘基，其被用作附接PEG基團(tuán)的位點(diǎn)。示例C端尾巴包括，例如，具有SEQ IDN0:23、24或31中任一個(gè)的多肽。
[0207]PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)分離和純化技術(shù)，例如大小排阻(例如凝膠過(guò)濾)和離子交換色譜，來(lái)進(jìn)行純化。還可以使用SDS-PAGE對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離。可以分離的產(chǎn)物包括單、二、三、多聚和非-PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白，以及游離的PEG。單-PEG偶聯(lián)物的百分比可以通過(guò)匯集(pooling)洗脫峰周?chē)鼜V泛的級(jí)分以增加單-PEG在組合物中的百分比來(lái)進(jìn)行控制。大約90%的單-PEG偶聯(lián)物代表一個(gè)產(chǎn)率和活性的良好平衡。例如其中至少92%或至少96%的偶聯(lián)物是單-PEG物質(zhì)的組合物是理想的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，單-PEG偶聯(lián)物的百分比范圍是90% -96%。
[0208]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白中的PEG在使用羥胺測(cè)定，例如450mM羥胺(pH6.5)在室溫下8_16小時(shí)的條件時(shí)，不會(huì)從PEG化氨基酸殘基上水解下來(lái)，因此是穩(wěn)定的。在一個(gè)實(shí)施方案中，超過(guò)80 %的組合物是穩(wěn)定的單-PEG-基于纖連蛋白的支架蛋白，更優(yōu)選地至少90 %，最優(yōu)選地至少95 %。
[0209]在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白將會(huì)優(yōu)選地保持未經(jīng)修飾蛋白的至少大約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%的生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物活性是指其結(jié)合一種或多種靶分子的能力，用1、1^或1^。?評(píng)價(jià)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白與未PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白相比，與一種或多種靶分子的結(jié)合增強(qiáng)。
[0210]PEG修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的血清清除速率與未經(jīng)修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的清除速率相比，可以降低大約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或者甚至90 %。與未經(jīng)修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的半衰期相比，PEG修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的半衰期(t1/2)提高。與未經(jīng)修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的半衰期相比，PEG修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的半衰期可以提高至少10%、20%、30%、40%,50%,60%,70%,80%,90% ,100% ,125% ,150% ,175%,200%,250%,300%,400%or500%、或者甚至1000%。在一些實(shí)施方案中，蛋白半衰期在體外測(cè)定，例如在緩沖生理鹽水溶液或血清中。在其它實(shí)施方案中，蛋白半衰期是體內(nèi)半衰期，例如基于纖連蛋白的支架蛋白在動(dòng)物的血清或其它體液中的半衰期。
[0211]核酸-蛋白融合技術(shù)
[0212]在一個(gè)方面中，本申請(qǐng)?zhí)峁┗诶w連蛋白的支架蛋白，該蛋白包含III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合人類靶標(biāo)，例如TNF- a、DLL4、IL-17、PXR或其它蛋白。一種快速制作和測(cè)試具有特定結(jié)合性質(zhì)的Fn3結(jié)構(gòu)域的方法是Adnexus,百時(shí)美施貴寶公司(Bristol-MyersSquibb Company),的核酸-蛋白融合技術(shù)。這種體外表達(dá)和標(biāo)簽化技術(shù)稱作PROfus1n?,其利用核酸-蛋白融合(RNA-和DNA-蛋白融合)，可用于鑒定對(duì)與蛋白的結(jié)合重要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白融合技術(shù)是一種使蛋白與其編碼遺傳信息共價(jià)偶聯(lián)的技術(shù)。關(guān)于RNA-蛋白融合技術(shù)和基于纖連蛋白的支架蛋白文庫(kù)篩選方法的詳細(xì)描述見(jiàn) Szostak et al.、美國(guó)專利 Nos.: 6，258，558 ;6，261，804 ;6，214，553 ;6，281，344 ；6，207，446 ;6，518，018 ；PCT 公開(kāi) Nos.W000/34784 ；W001/64942 ；W002/032925 ；和 Robertsand Szostak、Proc Natl.Acad.Sc1.94:12297-12302、1997，本文援引并入這些文獻(xiàn)的內(nèi)容。
[0213]載體和多核苷酸實(shí)施方案
[0214]編碼本文中所公開(kāi)的各種基于纖連蛋白的支架蛋白中任何一種的核酸可以化學(xué)、酶學(xué)或重組合成?？梢赃x擇密碼子用法，以提高在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。這些密碼子用法會(huì)依賴于所選的細(xì)胞類型。已經(jīng)為大腸桿菌(E.coli)和其它細(xì)菌以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞開(kāi)發(fā)出了專用的密碼子使用模式。見(jiàn)例如:Mayfield et al.、Proc NatlAcad Sci USA.2003Jan21 ； 100 (2): 438-42 ；Sinclair et al.Protein Expr Pur if.20020ct ；26(1):96-105 ；Connell ND.Curr Opin B1technol.20010ct ；12(5):446-9 ；Makrides etal.Microb1l Rev.1996Sep ；60 (3): 512-38 ;和 Sharp et al.Yeast.19910ct ；7 (7): 657-78。
[0215]用于核酸操作的一般技術(shù)在例如下列文獻(xiàn)中有描述:Sambrook et al., MolecularCloning:A Laboratory Manual,第 1-3 卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版,1989,或 F.Ausubel et al., Current Protocols in Molecular B1logy (GreenPublishing and ffiley-1nterscience:New York, 1987)及其定期更新，本文援引并入其內(nèi)容。編碼多肽的DNA與來(lái)自哺乳動(dòng)物，病毒或昆蟲(chóng)基因的合適轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件操作連接。這些調(diào)節(jié)元件包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、控制翻譯的任選操作子序列、編碼合適mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。此外還引入在宿主體內(nèi)復(fù)制的能力(通常由復(fù)制原點(diǎn)提供)和便于轉(zhuǎn)化子識(shí)別的篩選基因。
[0216]本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白不僅可以直接重組產(chǎn)生，而且可以與異源多肽一起作為融合多肽產(chǎn)生，異源多肽優(yōu)選地是信號(hào)序列或其它在成熟蛋白或多肽N端具有特異切割位點(diǎn)的多肽。所選擇的異源信號(hào)序列優(yōu)選地可被宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即被信號(hào)肽酶切割)。對(duì)于不識(shí)別和加工天然信號(hào)序列的原核生物宿主細(xì)胞，信號(hào)序列可以用原核生物信號(hào)序列例如從堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定的腸毒素II前導(dǎo)序列(leader)中選出的原核生物信號(hào)序列代替。為了進(jìn)行酵母分泌，可以將天然信號(hào)序列替換為例如酵母轉(zhuǎn)換酶前導(dǎo)序列、因子前導(dǎo)序列(factor leader)(包括酵母和克魯維酵母α -因子前導(dǎo)序列)或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、人白色念珠菌糖化酶前導(dǎo)序列或在PCT公開(kāi)N0.W090/13646中描述的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以獲得哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列，如單純皰疹病毒gD信號(hào)。這類前體區(qū)的DNA可以和編碼蛋白的DNA合閱讀框連接。
[0217]表達(dá)和克隆載體均含有能夠使載體在一種或多種所選宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的核酸序列。一般地，在克隆載體中，該序列是能夠使載體獨(dú)立于宿主染色體DNA復(fù)制、并包含復(fù)制原點(diǎn)或自主復(fù)制序列的序列。許多細(xì)菌、酵母和病毒的這些序列是眾所周知的。來(lái)自質(zhì)粒PBR322的復(fù)制原點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性菌，2μ質(zhì)粒原點(diǎn)適合于酵母，各種病毒原點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適合于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)克隆載體。一般地，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制原點(diǎn)組分(通?？蓛H使用SV40原點(diǎn)，因?yàn)樗性缙趩?dòng)子)。
[0218]表達(dá)和克隆載體可以含有篩選基因，也稱作可篩選標(biāo)簽。典型的篩選基因編碼如下蛋白，其(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素的抗性，(b)補(bǔ)償營(yíng)養(yǎng)缺陷型的缺陷，或(C)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素，例如為芽孢桿菌編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。
[0219]用于酵母的一種合適的篩選基因是酵母質(zhì)粒YRp7中存在的trpl基因(Stinchcomb et al.、Nature、282:39 (1979))。trpl基因?yàn)椴荒茉跓o(wú)色氨酸條件下生長(zhǎng)的酵母突變菌株，例如 ATCC N0.44076 或PEP4-1.Jones, Genetics, 85:12(1977)提供了篩選標(biāo)記。酵母宿主細(xì)胞基因組中存在的trpl缺陷提供了一個(gè)有效的環(huán)境，可通過(guò)在無(wú)色氨酸條件下生長(zhǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。類似地，Leu2-缺陷酵母菌株(ATCC20，622或38，626)可以被已知的攜帶Leu2基因的質(zhì)粒補(bǔ)償。
[0220]表達(dá)和克隆載體通常含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子可以被宿主生物體識(shí)別，并與編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的核酸可操作連接。適合于原核生物宿主使用的啟動(dòng)子包括PhoA啟動(dòng)子、內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)和雜合啟動(dòng)子,例如tac啟動(dòng)子。然而,其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是合適的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還可含有與編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno (S.D.)序列。
[0221]真核生物的啟動(dòng)子序列是已知的。實(shí)際上，所有真核生物基因在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約25-30個(gè)堿基處具有一個(gè)富含AT的區(qū)域。另一個(gè)在許多基因轉(zhuǎn)錄起始上游70-80個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)的序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。大多數(shù)真核生物基因的3’端是AATAAA序列，其可能是用于向編碼序列3’端添加多聚A尾巴的信號(hào)。所有這些基因都被合適地插入在真核生物表達(dá)載體中。
[0222]用于和酵母宿主使用的合適啟動(dòng)子的實(shí)例包括用于3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶的啟動(dòng)子，例如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，和葡萄糖激酶的啟動(dòng)子。
[0223]其它酵母啟動(dòng)子，其是具有可通過(guò)生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點(diǎn)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，是如下酶的啟動(dòng)子區(qū):乙醇脫氫酶2,異細(xì)胞色素C(isocytochrome C),酸性磷酸酶,氮代謝相關(guān)降解酶，金屬硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。用于在酵母中表達(dá)的合適載體和啟動(dòng)子在EP專利公開(kāi)N0.73，657中有進(jìn)一步的描述。酵母增強(qiáng)子也可有利地與酵母啟動(dòng)子一起使用。
[0224]在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中從載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄可以用例如如下啟動(dòng)子進(jìn)行控制，從病毒基因組，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎B病毒，最優(yōu)選猿猴病毒40 (SV40)獲得的啟動(dòng)子；來(lái)自異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，例如，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子；來(lái)自熱休克啟動(dòng)，只要這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)兼容即可。
[0225]S V40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子被方便地用作SV40限制片段，其也含有SV40病毒復(fù)制原點(diǎn)。人巨細(xì)胞病毒的中早期啟動(dòng)子被方便地用作HindIII E限制片段。在美國(guó)專利N0.4, 419, 446中公開(kāi)了一種使用牛乳頭瘤病毒作為載體的，用于在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)表達(dá)DNA的系統(tǒng)。關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在來(lái)自單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動(dòng)子控制下表達(dá)人β 干擾素，另見(jiàn) Reyes et al.，Nature297:598-601 (1982)。
[0226]經(jīng)常通過(guò)在載體中插入增強(qiáng)子序列提高高等真核生物對(duì)編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在已知許多來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶，白蛋白，α-甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。然而，通常會(huì)使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括復(fù)制原點(diǎn)晚期側(cè)(late side) (bp100-270)的SV40增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，復(fù)制原點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核細(xì)胞啟動(dòng)子，另見(jiàn)Yaniv, Nature297:17-18 (1982)。增強(qiáng)子可以剪接(spliced into)到載體多肽編碼序列的5’或3’側(cè)的位置，但是優(yōu)選地位于啟動(dòng)子5’位。
[0227]真核生物宿主細(xì)胞(例如酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)中使用的表達(dá)載體還含有用于終止轉(zhuǎn)錄或用于穩(wěn)定mRNA所需的序列。這些序列通?？梢詮恼婧松锘虿《綝NA或cDNA的5’非翻譯區(qū)獲得，偶爾還可從3’非翻譯區(qū)獲得。這些區(qū)域在編碼多肽的mRNA的非翻譯區(qū)含有被轉(zhuǎn)錄為多聚腺苷酸片段的核苷酸片段。一個(gè)有用的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸區(qū)域。見(jiàn)W094/11026及其中公開(kāi)的表達(dá)載體。
[0228]重組DNA還可以包含任何類型的對(duì)基于纖連蛋白的支架蛋白蛋白的純化有用的標(biāo)簽序列。蛋白標(biāo)簽的實(shí)例包括，但不僅限于，組氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽或GST標(biāo)簽。用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的合適克隆和表達(dá)載體可以在CloningVectors:A Laboratory Manual、(Elsevier、New York、1985)中找到，本文援引并入其相關(guān)公開(kāi)內(nèi)容。
[0229]使用適合于宿主細(xì)胞的方法將表達(dá)構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到的。本領(lǐng)域已知有許多用于將核酸引入到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法，包括但不僅限于，電穿孔；采用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；和感染(其中載體是感染劑)。
[0230]合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。合適的細(xì)菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。酵母，優(yōu)選地來(lái)自釀酒酵母物種如釀酒酵母的酵母，也可用于生產(chǎn)多肽。各種哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也能夠用于表達(dá)重組蛋白。Luckow和Summers, (B1/Technology,6:47,1988)綜述了用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中生產(chǎn)異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞實(shí)例包括內(nèi)皮細(xì)胞、C0S-7猴腎細(xì)胞、CV-1、L細(xì)胞、C127、3T3、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)、人胚胎腎細(xì)胞、HeLa、293、293T和BHK細(xì)胞系。通過(guò)培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，制備純化的基于纖連蛋白的支架蛋白。對(duì)于許多應(yīng)用，在大腸桿菌中表達(dá)小尺寸的基于纖連蛋白的支架蛋白是優(yōu)選的表達(dá)方法?；诶w連蛋白的支架蛋白隨后從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中被純化。
[0231]蛋白生產(chǎn)
[0232]用本文中所述的用于蛋白生產(chǎn)的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基可視需要進(jìn)行改變以適合于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼期望序列的基因。
[0233]用于生產(chǎn)基于纖連蛋白的支架蛋白的宿主細(xì)胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商品化的培養(yǎng)基，例如 Ham’s FlO (Sigma)、Minimal Essential Medium ((MEM)、(Sigma))、RPM1-1640 (Sigma)、和 Dulbecco's Modified Eagle’s Medium ((DMEM) (Sigma))適合于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，在 Ham et al.、Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes et al.、Anal.B1chem.102:255 (1980)、美國(guó)專利 Nos.4，767，704 ;4，657，866 ;4，927，762 ;4，560，655 ；或5，122，469 ；W090/03430 ；W087/00195 ;或美國(guó)專利N0.Re.30，985中描述的任何培養(yǎng)基均可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要添加激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷)、緩沖液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(例如GENTAMYCIN?藥物)、微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)，和葡萄糖或相當(dāng)?shù)哪芰吭?。任何其它必需添加物也可以合適的濃度存在，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。培養(yǎng)條件，例如溫度、PH等，與先前用于篩選表達(dá)宿主細(xì)胞時(shí)所用的相同，并且是普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。
[0234]本文中公開(kāi)的基于纖連蛋白的支架蛋白還可以用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生。為此目的，可以修飾編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的核酸，使其能夠在體外被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，并允許在所用的特定無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(無(wú)真核生物如哺乳動(dòng)物或酵母細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)或無(wú)原核生物如細(xì)菌細(xì)胞的翻譯系統(tǒng))中進(jìn)行mRNA的無(wú)細(xì)胞翻譯。
[0235]基于纖連蛋白的支架蛋白還可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)產(chǎn)生(例如通過(guò)Solid PhasePeptide Synthesis、第二版、1984、The Pierce Chemical 公司、Rockford、IL 中描述的方法)?；诶w連蛋白的支架蛋白的修飾也可以通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。
[0236]本文中公開(kāi)的基于纖連蛋白的支架蛋白可以通過(guò)蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域公知的蛋白分離/純化方法進(jìn)行純化。非限制性實(shí)例包括提取、重結(jié)晶、鹽析(例如用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超過(guò)濾、吸附色譜、離子交換色譜、疏水色譜、正相色譜、反相色譜、凝膠過(guò)濾、凝膠滲透色譜、親和色譜、電泳、逆流分布或這些的任意組合。純化后，基于纖連蛋白的支架蛋白可以與不同的緩沖交換，和/或通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何方法(包括但不僅限于，過(guò)濾和透析)進(jìn)行濃縮。
[0237]純化的基于纖連蛋白的支架蛋白優(yōu)選為至少85%純，更優(yōu)選地至少95%純，最優(yōu)選地至少98%純。無(wú)論純度的精確數(shù)值為何，基于纖連蛋白的支架蛋白的純度足夠用作藥物產(chǎn)品。
[0238]示例用途
[0239]在一個(gè)方面中，本申請(qǐng)?zhí)峁?biāo)記有可檢測(cè)模塊的基于纖連蛋白的支架蛋白?；诶w連蛋白的支架蛋白可以用于各種診斷應(yīng)用?？蓹z測(cè)模塊可以是任何能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的模塊。例如，可檢測(cè)模塊可以是放射性同位素，例如H3、C14、C13、P32、S35、或1131 ;熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，例如異硫氰酸熒光素、羅丹明或熒光素；或者酶，例如堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或辣根過(guò)氧化物酶。
[0240]可以采用任何本領(lǐng)域已知的用于將蛋白與可檢測(cè)模塊綴合的方法，包括在下列文獻(xiàn)中描述的方法:Hunter、et al.、Naturel44:945 (1962) ;David、et al.、B1chemistry13:1014(1974) ;Pain、et al.、J.Tmmunol.Meth.40:219(1981)；和 Nygren>J.Histochem.and Cytochem.30:407 (1982)。體外方法,包括本領(lǐng)域眾所周知的綴合化學(xué),包括與蛋白質(zhì)相容的化學(xué)，例如用于特定氨基酸如Cys和Lys的化學(xué)。為了將可檢測(cè)標(biāo)簽與基于纖連蛋白的支架蛋白連接，使用連接基團(tuán)或反應(yīng)性基團(tuán)。合適的連接基團(tuán)是本領(lǐng)域眾所周知的，包括二硫基、硫酯基、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)和酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)。優(yōu)選的連接基團(tuán)是二硫基和硫酯基，視應(yīng)用而定。對(duì)于沒(méi)有Cys氨基酸的多肽，可以在特定位置處引入Cys，以便使在蛋白具有活性的同時(shí)生成用于綴合的位點(diǎn)。
[0241 ] 與可檢測(cè)模塊連接的基于纖連蛋白的支架蛋白可用于體外或體內(nèi)成像。多肽可以和不透射線劑(rad1-opaque agent)或放射性同位素連接,施用給受試者,優(yōu)選地施用到血流中，并可以測(cè)定受試者體內(nèi)被標(biāo)記蛋白的存在和定位。例如，當(dāng)基于纖連蛋白的支架蛋白與癌相關(guān)靶標(biāo)結(jié)合時(shí)，該成像技術(shù)可以用于惡性腫瘤的分期和治療。基于纖連蛋白的支架蛋白可以用任何可以在受試者內(nèi)檢測(cè)到(無(wú)論是通過(guò)核磁共振、放射學(xué)還是本領(lǐng)域已知的其它檢測(cè)方法)的模塊標(biāo)記。
[0242]基于纖連蛋白的支架蛋白還可用作親和純化劑。在該過(guò)程中，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法將基于纖連蛋白的支架蛋白固定在合適的支持物上，例如Sephadex樹(shù)脂或?yàn)V紙上。
[0243]基于纖連蛋白的支架蛋白可以在任何已知的測(cè)定方法中使用，例如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、直接和間接夾心式測(cè)定、和免疫沉淀測(cè)定(Zola、Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques、pp.147-158 (CRC Press、Inc.、1987))。
[0244]在某些方面中，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)樣品中靶分子的方法。該方法可以包括使樣品與本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白接觸，其中所述接觸在允許基于纖連蛋白的支架蛋白-靶復(fù)合物形成的條件下進(jìn)行；和檢測(cè)所述復(fù)合物，藉此檢測(cè)所述樣品中的所述靶標(biāo)。檢測(cè)可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，例如放射照相、免疫測(cè)定、熒光檢測(cè)、質(zhì)譜或表面等離子體共振來(lái)實(shí)施。樣品經(jīng)常是生物樣品，例如組織活檢，特別是腫瘤或疑似腫瘤的組織活檢，在基于纖連蛋白的支架蛋白與癌癥相關(guān)的靶標(biāo)結(jié)合的情況下。樣品可以來(lái)自人或其它哺乳動(dòng)物?；诶w連蛋白的支架蛋白可以用標(biāo)記模塊，例如放射性模塊、熒光模塊、發(fā)色模塊、化學(xué)發(fā)光模塊或半抗原模塊標(biāo)記?；诶w連蛋白的支架蛋白可以被固定在固體支持物上。
[0245]在一個(gè)方面中，本申請(qǐng)?zhí)峁┛捎糜诩膊〉闹委煹幕诶w連蛋白的支架蛋白?？梢灾委煹募膊』虿“Y將由基于纖連蛋白的支架蛋白的結(jié)合特異性決定。如本文中所述，基于纖連蛋白的支架蛋白可以被設(shè)計(jì)成與任何感興趣的靶標(biāo)結(jié)合。靶標(biāo)實(shí)例包括，例如，TNF-α、DLL4、IL_17和PXR。僅僅作為舉例，與TNF-a結(jié)合的基于纖連蛋白的支架蛋白可用于治療自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病和哮喘；與IL-17結(jié)合的基于纖連蛋白的支架蛋白可用于治療哮喘；和與DLL4結(jié)合的基于纖連蛋白的支架蛋白可用于治療與不期望的血管新生有關(guān)的過(guò)度增殖疾病或病癥，例如癌癥或腫瘤。
[0246]本申請(qǐng)還提供了用于將基于纖連蛋白的支架蛋白施用給受試者的方法。在一些實(shí)施方案中，受試者是人。在一些實(shí)施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物，特別是人而言是可藥用的?！翱伤幱玫摹苯M合物是指這樣的組合物，其施用給動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生明顯的不良醫(yī)學(xué)結(jié)果。可藥用的組合物的實(shí)例包括包含缺少整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RGD)的kiFM結(jié)構(gòu)域的組合物，和基本上沒(méi)有內(nèi)毒素或致熱源或具有極低內(nèi)毒素或致熱源水平的組合物。
[0247]制劑和施用
[0248]本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了可藥用的組合物，其包含本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白，其中該組合物基本上沒(méi)有內(nèi)毒素和/或致熱源。
[0249]包含基于纖連蛋白的支架蛋白的治療性制劑通過(guò)將具有期望純度水平的所述蛋白與任選的生理學(xué)上可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington’s PharmaceuticalSciencesl6版、Osol、A.編輯(1980))混合制備，以水性溶液、凍干或其它干燥制劑的形式儲(chǔ)存?？山邮艿妮d體、賦形劑和穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對(duì)受體是無(wú)毒的，并且包括緩沖劑例如磷酸鹽、醋酸鹽、和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苯基(octadecyidimethylbenzyl)氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨；節(jié)索氯銨；苯酚，丁基或芐醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯類如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲基苯酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)的多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖，雙糖，和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或葡聚糖；螯合劑如EDTA ;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽的反離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如，鋅蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN?、PLURONICS? 或聚乙二醇(PEG)。
[0250]本文中的制劑還可以視需要含有超過(guò)一種活性化合物，用于治療的特定適應(yīng)證，優(yōu)選地具有互補(bǔ)活性并且彼此沒(méi)有不良影響的活性化合物。這些分子以可有效實(shí)現(xiàn)所預(yù)期目的的量適當(dāng)?shù)亟M合存在。
[0251]基于纖連蛋白的支架蛋白還可以包埋在通過(guò)例如凝聚(coacervat1n)技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠囊中，例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基異丁烯酸)微膠囊，包含在膠狀藥物輸送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中，或包含在大乳狀液中(macroemuls1n)。這些技術(shù)在Remington’s PharmaceuticalSciences 第 16 版、Osol、Α.編輯(1980)中有公開(kāi)。
[0252]用于體內(nèi)施用的制劑必須無(wú)菌。這可以通過(guò)過(guò)濾通過(guò)無(wú)菌濾膜容易地實(shí)現(xiàn)。
[0253]可以制備緩釋制備物。緩釋制備物的合適實(shí)例包括含有本文中所述基于纖連蛋白的支架蛋白的固體疏水聚合物半滲透性基質(zhì)，該基質(zhì)呈成形制品(shaped article)的形式，例如薄膜、或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國(guó)專利N0.3，773，919)、L-谷氨酸和Y -乙基-L-谷氨酸酯共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-甘醇酸共聚物如LUPRONDEPOT?(由乳酸-甘醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和乳酸-甘醇酸共聚物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間較短。當(dāng)被包埋的蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間保持在體內(nèi)時(shí)，它們可能由于暴露于37°C的濕氣而變性或聚集，導(dǎo)致生物活性喪失以及可能的免疫原性改變?？梢愿鶕?jù)所涉及的機(jī)理設(shè)計(jì)出用于穩(wěn)定化的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)理是由于巰基-二硫化物交換導(dǎo)致的分子內(nèi)S-S鍵形成，則可以通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制水分含量、使用合適的添加劑和開(kāi)發(fā)特定的聚合物機(jī)制組合物，來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。
[0254]盡管技術(shù)人員會(huì)理解，每種基于纖連蛋白的支架蛋白的劑量取決于蛋白的同一性，但是優(yōu)選的劑量范圍是大約10mg/m2-大約2000mg/m2,更優(yōu)選地，大約50mg/m2-大約1000mg/m2。
[0255]對(duì)于治療性應(yīng)用，基于纖連蛋白的支架蛋白以可藥用的劑量形式施用給受試者。它們可以通過(guò)單次或在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注靜脈施用，通過(guò)肌肉內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)，口服，外用，或吸入途徑。蛋白還可以通過(guò)腫瘤內(nèi)、腫瘤周?chē)⒉≡顑?nèi)或病灶周?chē)緩绞┯?，發(fā)揮局部以及系統(tǒng)治療效果。合適的可藥用的載體、稀釋劑、賦形劑是眾所周知的，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)臨床狀況要求加以確定。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的實(shí)例包括:⑴杜氏磷酸鹽緩沖液，pH大約7.4,含有大約lmg/ml-25mg/ml人血清白蛋白，
(2)0.9%生理鹽水(0.9% w/v NaCl),和(3) 5% (w/v)葡萄糖(dextrose)。本發(fā)明的方法可以在體外、體內(nèi)或離體實(shí)施。
[0256]可以實(shí)施基于纖連蛋白的支架蛋白和一種或多種額外治療劑的施用，無(wú)論是共同施用還是序貫施用，如上文關(guān)于治療性應(yīng)用所述。技術(shù)人員會(huì)理解，用于共同施用的合適的可藥用的載體、稀釋劑和賦形劑取決于所共同施用的特定治療劑的同一性。
[0257]當(dāng)以水性劑型而非凍干狀態(tài)存在時(shí)，基于纖連蛋白的支架蛋白通常以大約0.1mg/ml-10mg/ml的濃度配制，盡管這些范圍之外的寬泛變化也是允許的。對(duì)于疾病的治療，基于纖連蛋白的支架蛋白的合適劑量取決于所治療的疾病類型，疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程，基于纖連蛋白的支架蛋白的施用是出于預(yù)防還是治療目的，先前治療的過(guò)程，患者的病史和對(duì)基于纖連蛋白的支架蛋白的應(yīng)答，和主治醫(yī)生的決定?；诶w連蛋白的支架蛋白可以一次性或通過(guò)一系列治療適當(dāng)?shù)厥┯媒o患者。
[0258]基于纖連蛋白的支架蛋白還可以用作結(jié)晶伴侶(crystallizat1n chaperone),形成蛋白與感興趣化合物的結(jié)構(gòu)。例如，特異性結(jié)合人孕烷X受體(PXR)的基于纖連蛋白的支架蛋白可以用作結(jié)晶伴侶，以方便化合物與PXR，例如PXR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD) —起結(jié)晶。本文中描述了數(shù)種可結(jié)合人PXR的uiFr^分子。
[0259]PXR活化會(huì)上調(diào)多種藥物代謝酶，例如細(xì)胞色素P450酶和MDRl的細(xì)胞水平。CYP酶表達(dá)的提高會(huì)改變藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，并導(dǎo)致危險(xiǎn)的藥物-藥物相互作用，包括治療效力喪失和毒性增加。為了避免晚期臨床失敗和伴隨新藥上市的高昂成本，許多藥物公司采用了篩選測(cè)定，用于早期檢測(cè)可激活PXR的化合物。此外，使用PXR的已知晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行的計(jì)算篩選也越來(lái)越多地被用于預(yù)測(cè)潛在的PXR活性。PXR具有大而柔性的配體結(jié)合口袋，而且這些化合物有可能在PXR配體結(jié)合空穴內(nèi)以多個(gè)取向結(jié)合不同位置，這些都使得對(duì)PXR活性的可靠預(yù)測(cè)變得復(fù)雜。特別是對(duì)于對(duì)預(yù)期的治療靶標(biāo)具有期望的效力、選擇性和生物利用度的更高級(jí)的化合物/化學(xué)型(chemotype)而言，更是如此?？紤]到這些限制，經(jīng)常需要共結(jié)晶結(jié)構(gòu)，以界定精確的結(jié)合相互作用，和提示能夠干擾與PXR結(jié)合有關(guān)的關(guān)鍵相互作用同時(shí)保持針對(duì)主要靶標(biāo)的活性的特定修飾。例如，在某些實(shí)施方案中，用于分析測(cè)試劑與PXR相互作用的方法包括，將(i)PXR或其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)測(cè)試劑和(iii)與PXR，例如PXR LBD，特異性結(jié)合的kiFM蛋白，在適合于結(jié)晶的條件下共同溫育。特異性結(jié)合PXRLBD的1QFn3蛋白的實(shí)例包含與SEQ ID NOs:48,49和62-69和72的其中一個(gè)具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合PXR LBD的1QFn3蛋白包含與SEQ ID NO:48、49和62-69和72中的任一個(gè)相差最多1、2、3、5、
10、15、 20或25個(gè)氨基酸變化，例如取代(例如保守取代)、添加或缺失的氨基酸序列。該方法可進(jìn)一步包括誘導(dǎo)結(jié)晶，并確定測(cè)試劑的哪些部分(或原子)與PXR(—般是PXR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)相互作用，和任選地對(duì)測(cè)試劑進(jìn)行修飾，使其不再與PXR相互作用或以更低的親和力與PXR相互作用。
[0260]序列
[0261]野牛型MFn3序列:
[0262]WT10Fn3 結(jié)構(gòu)域
[0263]VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:1)
[0264]WT10Fn3結(jié)構(gòu)域核心序列版本I
[0265]LEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINY(SEQ ID NO:2)
[0266]具有D80E取代的WT1QFn3結(jié)構(gòu)域
[0267]VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGESPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:59)
[0268]WT10Fn3結(jié)構(gòu)域核心序列版本2
[0269]EWAATPTSLLISTOAPA VTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:60)
[0270]WT10Fn3結(jié)構(gòu)域核心序列版本3
[0271]VSDVPRDLEVVAA (X)..LLISff(X)..YRITY(X)...FTV (X)..ATISGL(X).,YTITVYA(X)JSINYRT (SEQ ID NO:22)
[0272]WT10Fn3結(jié)構(gòu)域核心序列版本4
[0273]VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:6)
[0274]DLL4結(jié)合件WS-LIl結(jié)合子:
[0275]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEQHSKYPHQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTIQPQDPEQDYQYHYYETSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:3)
[0276]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEHVADHFDHNQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTYQFQDPEEHYYYHFYDSSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:4)
[0277]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEYHEHYHSPGFSQKYHYEQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGHKHYHYYYYYHHHSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:5)
[0278]N-端延長(zhǎng)序列實(shí)例:
[0279]MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:9)
[0280]VSDVPRDL(SEQ ID NO:10)
[0281 ] GVSDVPRDL(SEQ ID NO: 11)
[0282]XnSDVPRDL,其中n = 0、I或2個(gè)氨基酸，其中當(dāng)n = I時(shí)，X是Met或Gly，當(dāng)η =2 時(shí)，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 16)
[0283]XnDVPRDL,其中η = 0、1或2個(gè)氨基酸,其中當(dāng)η = I時(shí)，X是Met或Gly,當(dāng)η =2 時(shí)，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 17)
[0284]XnVPRDL,其中η = O、I或2個(gè)氨基酸,其中當(dāng)η = I時(shí)，X是Met或Gly,當(dāng)η = 2時(shí)，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 18)
[0285]XnPRDL,其中η = 0、1或2個(gè)氨基酸,其中當(dāng)η = I時(shí)，X是Met或Gly,當(dāng)η = 2時(shí)，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 19)
[0286]XnRDL,其中η = 0、1或2個(gè)氨基酸,其中當(dāng)η = I時(shí),X是Met或Gly,當(dāng)η = 2時(shí)，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 20)
[0287]XnDL,其中η = 0、1或2個(gè)氨基酸,其中當(dāng)η = I時(shí),X是Met或Gly,當(dāng)η = 2時(shí)，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 21)
[0288]MASTSG (SEQ ID NO: 50)
[0289]C-端尾巴序列實(shí)例:
[0290]EIEK (SEQ ID NO:7)
[0291]EIEKPC (SEQ ID NO:8)
[0292]EGSGC (SEQ ID NO:23)
[0293]EIEKPCQ (SEQ ID NO: 24)
[0294]EIEKPSQ (SEQ ID NO: 25)
[0295]EIEKP (SEQ ID NO:26)
[0296]EIEKPS (SEQ ID NO: 27)
[0297]EGSGS (SEQ ID NO:28)
[0298]EIDK (SEQ ID NO:29)
[0299]EIDKPSQ (SEQ ID NO: 30)
[0300]EIDKPCQ(SEQ ID NO:31)
[0301]接頭序列實(shí)例:
[0302]PSTSTST (SEQ ID NO: 32)
[0303]GPG (SEQ ID NO:33)
[0304]GPGPGPG (SEQ ID NO: 34)
[0305]GPGPGPGPGPG (SEQ ID NO: 35)
[0306]PAPAPA (SEQ ID NO: 36)
[0307]PAPAPAPAPAPA (SEQ ID NO: 37)
[0308]PAPAPAPAPAPAPAPAPA (SEQ ID NO: 38)
[0309]GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 39)
[0310]GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 40)
[0311]GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)
[0312]GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:42)
[0313]GGGGSGGGGSGGGSG(SEQ ID NO:43)
[0314]6Xhis 標(biāo)簽:
[0315]HHHHHH (SEQ ID NO: 44)
[0316]IL-17 結(jié)合 WS-LII 結(jié)合子:
[0317]MGYSDYPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTYRYYRITYGEYHAFFASNGKYYFYIQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDDTVHHGDSNYHSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:45)
[0318]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGEYSSFFQHQGQYYHYIQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTQHEHSQDSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:46)
[0319]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGEFSQFVHSDGEYYQEYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGQYDQDDEPSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:47)
[0320]PXR結(jié)合WSl結(jié)合子:
[0321]MASTSGYSDYPRDLEYVAATPTSLLISffDAPAVPVSKYYIYYffPGALISSMQAFKVPGSKSTATISGLKPGVLYSIVVDALTGDGQGSYVffDPITITYRTEGSGS(SEQ ID NO:48)
[0322]MASTSGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVHSYYITYQELQHHSVPQGFQVPGSKSTATISGLKPGVAYQIAVYAFTGPGLPPSDAPPIVIYYRTEGSGS(SEQ ID NO:49)
[0323]圖4的1^!^環(huán)和支架區(qū)狀:
[0324]PTSLLISffDAPAVTVRYYRITYG(SEQ ID NO:58)
[0325]PVQEFTVPGSKSTATISGLK(SEQ ID NO:51)
[0326]TITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:52)
[0327]MGEVVAATPTSLLIS(SEQ ID NO:53)
[0328]PHFPTRYYRITYGETGGNS(SEQ ID NO:54)
[0329]實(shí)施例2的BC環(huán)序列:
[0330]PTSLLISffDAPAVTVRYYRITYG(SEQ ID NO:55)
[0331]PTSLLISffSARLKVARYYRITYG(SEQ ID NO:56)
[0332]PTSLLISffRHPHFPTRYYRITYG(SEQ ID NO:57)
[0333]IGF-1R結(jié)合具有經(jīng)討修飾的BC、DE和FG環(huán)的MFn3結(jié)構(gòu)域:
[0334]GVSDVPRDLEVVAA TPTSLLISffSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:61)
[0335]PXR結(jié)合性1QFn3分子:
[0336]圖10 的 Adnectinl-8 的氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID N0s:70、71、62、63、72、13、14和15。圖10的無(wú)6xHis尾巴的Adnectinl-8的氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs:64、65、48、49、66、67、68 和 69。
實(shí)施例
[0337]下面通過(guò)參考下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，它們只是舉例，并不意圖對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。盡管已經(jīng)通過(guò)參照本發(fā)明的特定實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下顯然能夠想到各種變化和修改。
[0338]實(shí)施例1.基于纖連蛋白的支架蛋白的表達(dá)和純化
[0339]將選定的結(jié)合子克隆到PET9d載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3plysS細(xì)胞。將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以24孔形式接種在含有50 μ g/mL卡那霉素和34 μ g/ml氯霉素的5ml LB培養(yǎng)基中，并37°C過(guò)夜培養(yǎng)(接種培養(yǎng))。通過(guò)將200 μ I接種培養(yǎng)物吸取到含有50 μ g/mL卡那霉素和34 μ g/ml氯霉素的5ml(以24-孔形式)TB-過(guò)夜表達(dá)培養(yǎng)基(自誘導(dǎo))中，建立生產(chǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)物在37°C培育4小時(shí)，此時(shí)將溫度降低到18°C，并培育20小時(shí)。通過(guò)40C 2750g離心10分鐘收集培養(yǎng)物。
[0340]通過(guò)將細(xì)胞離心沉淀(24-孔形式)混懸在450 μ I裂解緩沖液(50mM NaH2P04、0.5MNaCl、Ix Complete? 蛋白酶抑制劑雞尾酒-無(wú) EDTA(Roche)、ImM PMSF, 1mM CHAPS,40mM 咪唑、lmg/ml溶菌酶、30 μ g/ml DNA酶、2 μ g/ml抑肽酶、ρΗ8.0)中，并在室溫振蕩1-3小時(shí)，裂解細(xì)胞。將裂解物澄清并通過(guò)轉(zhuǎn)移到安裝有96孔、1.2ml收集板(catch plate)的96孔Whatman GF/D過(guò)濾器中并在正壓下過(guò)濾,將其重新分配(re-racked)成96孔格式。將經(jīng)過(guò)澄清的裂解物轉(zhuǎn)移到先前已經(jīng)用平衡緩沖液(50mM NaH2P04、0.5M NaCl、40mM咪唑、pH8.0)平衡的96孔HisPur Cobalt板上,并溫育5min。通過(guò)正壓力除去未結(jié)合的材料。樹(shù)脂用清洗緩沖液 #1 (50mM NaH2PO4^0.5M NaCl、5mM CHAPS,40mM 咪唑、ρΗ8.0)以 2x0.3ml/ 孔進(jìn)行清洗，每次通過(guò)正壓力除去清洗液。在洗脫之前，用50 μ I洗脫緩沖液(PBS+20mM EDTA)清洗每個(gè)孔，溫育5min，通過(guò)正壓力棄去該清洗液。通過(guò)向每孔添加額外的100μ I洗脫緩沖液洗脫蛋白。在室溫下溫育30分鐘之后，將板以200g離心5分鐘，將被洗脫的蛋白收集在96孔收集板中，在洗脫前向洗脫收集板的底部添加5μ 10.5Μ MgCl2。用總蛋白測(cè)定法對(duì)被洗脫的蛋白進(jìn)行定量，以SGE作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)。SGE是一種野生型kiFM結(jié)構(gòu)域，其中FG環(huán)的RGD序列被改變?yōu)镾GE。
[0341]實(shí)施例2.10Fn3結(jié)構(gòu)域多肽免疫原性的表征
[0342]過(guò)繼性免疫應(yīng)答是抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突細(xì)胞，對(duì)內(nèi)化的蛋白進(jìn)行加工和消化而觸發(fā)的。APC將被內(nèi)化的蛋白切割成短肽，然后將多肽展示在其表面MHC II類分子上。MHC II類分子的肽結(jié)合位點(diǎn)長(zhǎng)而窄，類似熱狗面包(hot-dog bun)，并以使其肽保持延伸的形態(tài)，在主結(jié)合位點(diǎn)里有可容納9個(gè)氨基酸的空間(一般可允許肽的任一側(cè)有短尾巴)IHC結(jié)合位點(diǎn)中的某些口袋是確定肽結(jié)合的決定子。這些口袋對(duì)應(yīng)于9聚體肽的被錨定部分中的氨基酸位置1、4、6和9。在這四個(gè)位置中的每一個(gè)處具有有利側(cè)鏈的肽一般可以良好地與HLA(—種MHC II類分子)結(jié)合。
[0343]位置I被認(rèn)為是參與肽與HLA分子間結(jié)合的最重要的“錨殘基”。位置I 一般喜好疏水側(cè)鏈——因此通常結(jié)合HLA的9聚體以V、1、L、M、F、Y、或W起始。其它位置的可變性則高得多，不同的HLA等位片段在每個(gè)位點(diǎn)有利于不同系列的氨基酸。本文中所述多肽的免疫原性同時(shí)用體外和計(jì)算機(jī)方法進(jìn)行評(píng)估。
[0344]A-人白細(xì)胞抗原(“HLA”)結(jié)合的體外測(cè)定
[0345]在本實(shí)驗(yàn)中，在HLA結(jié)合測(cè)定中評(píng)估合成肽，這些合成肽對(duì)應(yīng)于野生型wFM結(jié)構(gòu)域序列或工程化wFnS結(jié)構(gòu)域序列中的不同區(qū)域。類似的HLA結(jié)合測(cè)定在Reijonen H,Kwokffff, Use of HLA class II tetramers in tracking antigen-specific T cells and mappingT-cell epitopes,Methods29 (3):282-8(2003)中有描述。該HLA結(jié)合測(cè)定中所測(cè)試的每一個(gè)實(shí)驗(yàn)肽或是野生型kiFM結(jié)構(gòu)域北極環(huán)(BC、DE或FG環(huán))肽片段，其在每個(gè)環(huán)的N和C端兩側(cè)具有額外的氨基酸(SEQ IDN0s:58、51和52);或是來(lái)自野生型1QFn3結(jié)構(gòu)域的位于BC環(huán)的N端一側(cè)的支架區(qū)肽片段(SEQ ID NO:53);或是來(lái)自工程化uiFr^結(jié)構(gòu)域的位于BC環(huán)的C端一側(cè)的支架區(qū)肽片段(SEQ ID NO: 54)。將各實(shí)驗(yàn)肽以測(cè)定期望濃度的50倍溶解于100% DMSO中。然后將每個(gè)肽在反應(yīng)緩沖液中稀釋，并從128 μ M到2 μ M順序滴定。
[0346]在HLA結(jié)合測(cè)定中，將5種不同HLA等位體分子(DRB*0101 ；DRB*0301 ；DRB*0401 ；DRB*0701或DRB*1501等位片段)分別與未標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)肽及銪標(biāo)記的對(duì)照(競(jìng)爭(zhēng))肽一起分施到96孔板的孔中。將該結(jié)合混合物在孔中溫育24小時(shí)以達(dá)到穩(wěn)定平衡。然后，將HLA分子復(fù)合物捕獲在包被有抗-人HLA-DR抗體的ELISA平板上。通過(guò)時(shí)間解析熒光來(lái)測(cè)量結(jié)合的HLA-標(biāo)記的對(duì)照肽,并通過(guò)Wallac Victor3?單元(Perkin-Elmer)在615nm進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)肽的結(jié)合用被標(biāo)記的對(duì)照肽的百分比抑制(實(shí)驗(yàn)熒光/對(duì)照熒光乘以100)表示。從每個(gè)濃度下的被標(biāo)記對(duì)照肽的百分比抑制，為每個(gè)實(shí)驗(yàn)肽求出針對(duì)測(cè)試的5種等位體的IC5tl曲線。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示。
[0347]如圖4所示，發(fā)現(xiàn)BC環(huán)肽發(fā)現(xiàn)與5種測(cè)試等位體中的4種高親和力結(jié)合，提示它是蛋白內(nèi)的免疫顯性序列。相比之下，對(duì)應(yīng)于DE和FG環(huán)的合成肽一般結(jié)合更少的HLA等位體，并且親和力更低。因此，預(yù)測(cè)DE和FG環(huán)不是野生型wFM結(jié)構(gòu)域中的免疫顯性序列。
[0348]如圖4所示，SEQ ID NO: 53的支架區(qū)肽被發(fā)現(xiàn)以高親和力結(jié)合5種HLA等位體，而SEQ ID NO: 54的支架區(qū)肽被發(fā)現(xiàn)以高親和力結(jié)合其中4種HLA等位體。這些結(jié)果提示，kiFM結(jié)構(gòu)域的BC環(huán)兩側(cè)的支架區(qū)是免疫顯性區(qū)。圖4所示的SEQ ID NO: 53和54序列的下劃線部分被預(yù)測(cè)是這些序列的免疫顯性部分。
[0349]對(duì)于被發(fā)現(xiàn)是免疫顯性環(huán)的BC環(huán)，用相同的HLA結(jié)合測(cè)定進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)估。具體地說(shuō)，使用該測(cè)定對(duì)三種BC環(huán)序列變體肽(SEQ ID NO:55-57)進(jìn)行檢驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)它們顯示幾乎相同的對(duì)所測(cè)試的HLA等位體的強(qiáng)結(jié)合模式。SEQ ID NO:55的肽序列是人野生型序列，SEQ ID NO: 56和57是來(lái)自經(jīng)工程化而結(jié)合兩種不同靶的wFM結(jié)構(gòu)域的BC環(huán)區(qū)。在假定相似的結(jié)合模式反映共同的基序的條件下，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)以幫助鑒定潛在的錨定殘基。所測(cè)試的不同BC環(huán)序列的潛在位置I殘基用下劃線標(biāo)示:
[0350]15 23 30 (基于 SEQ ID NO:1 的位置序列)
[0351]I I
[0352]PTSLLISff DAPAVTV RYYRITYG (SEQ ID NO: 55)
[0353]PTSLLISff SARLKVA RYYRITYG (SEQ ID NO: 56)
[0354]PTSLLISff RHPHFPT RYYRITYG (SEQ ID NO: 57)
[0355]這三種肽的共有序列部分是可變BC環(huán)前面的鏈B、以及BC環(huán)后面的β-鏈C。這些部分的每一個(gè)均具有數(shù)個(gè)疏水殘基(潛在的位置I錨定子)，但是β-鏈C中的那些疏水殘基的后面沒(méi)有跟隨至少8個(gè)額外殘基，因此不可能是MHC結(jié)合的錨定殘基?？勺傿C環(huán)中的疏水殘基在這三種肽中的位置不同，可見(jiàn)具有共同的β -鏈C殘基的單一 9聚體位置不大可能被錨定在BC環(huán)內(nèi)。因此，這些結(jié)果提示，β_鏈B對(duì)于設(shè)計(jì)肽錨定子應(yīng)該是有用的。
[0356]錨定殘基最可能的位置似乎是“LLI” (SEQ ID NO:1的位置18-20)，因?yàn)樗鼈儼欢挝挥贐C環(huán)殘基之前的固定的β-鏈B殘基。如果，例如，是由起始于第一個(gè)L的9聚體來(lái)錨定肽，則第四個(gè)位置總是S，這有利于結(jié)合許多HLA等位體。
[0357]應(yīng)當(dāng)注意，盡管許多完整人序列被MHC展示，但是免疫系統(tǒng)將它們識(shí)別為“自身”，不會(huì)啟動(dòng)免疫應(yīng)答。此外，在具有相同的kiFM序列的食蟹猴中施用各種不同kiFM多肽時(shí)會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但是在施用野生型kiFM時(shí)卻不會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這表明，食蟹猴將人野生型kiFM序列識(shí)別為“自身”蛋白，因此不會(huì)啟動(dòng)對(duì)它們的免疫應(yīng)答。
[0358]B - HLA結(jié)合的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)
[0359]HLA結(jié)合可以在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行預(yù)測(cè)，例如使用EpiMatrix進(jìn)行預(yù)測(cè)。EpiMatrix是由EpiVax開(kāi)發(fā)的一種有權(quán)利保護(hù)的計(jì)算算法，其用于篩選蛋白序列中是否存在假定的HLA結(jié)合基序。輸入序列被解析(parse)成多個(gè)重疊的9聚體框,每一個(gè)框與前一個(gè)框有8個(gè)氨基酸重疊。然后對(duì)每一個(gè)所得的框?qū)σ唤M8種共有II類HLA等位體(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、和 DRB1*1501)的預(yù)測(cè)結(jié)合親和力進(jìn)行打分。將原始分?jǐn)?shù)相對(duì)于隨機(jī)生成肽的大樣本的得分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。報(bào)告所得的“Z”得分。任何EpiMatrix Z-得分超過(guò)1.64的9聚體肽被認(rèn)為是推定的HLA結(jié)合基序。
[0360] 用EpiMatrix算法對(duì)來(lái)自具有SEQ ID N0:61記載的氨基酸序列的1QFn3多肽的肽表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，10Fn3多肽的BC、DE和FG環(huán)的Z-得分分別為21.3,0.9和1.1。
[0361]上面的體外和計(jì)算機(jī)HLA結(jié)合結(jié)果提示，β -鏈B/BC環(huán)片段可能是對(duì)HLA結(jié)合而言的“熱點(diǎn)”。β -鏈B/BC環(huán)片段可能通過(guò)β -鏈B中的氨基酸強(qiáng)烈地錨定于MHC分子，以致于BC環(huán)序列中的至少某些變異體對(duì)與HLA的結(jié)合幾乎沒(méi)有影響。強(qiáng)錨定可能使得該片段難以被脫免疫。然而，如果整個(gè)序列段都是野生型序列，則應(yīng)當(dāng)會(huì)被免疫系統(tǒng)識(shí)別為自身，從而不會(huì)引發(fā)免疫應(yīng)答。因此，通過(guò)將BC環(huán)保留為野生型，或至少將SEQ ID NO:1或6的D23-T28的殘基保留為野生型，以使得被錨定在L18、L19、或120處的任何9聚體肽保持為野生型，可以設(shè)計(jì)出具有降低的免疫原性的kiFM結(jié)構(gòu)域多肽文庫(kù)。圖9A顯示了其中全部或大部分BC環(huán)被保留為野生型的文庫(kù)的實(shí)例。圖9B顯示了 BC環(huán)N端區(qū)的不同部分被保留為野生型的文庫(kù)的實(shí)例。實(shí)施例3中提供了對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的D23-T28的殘基被保留為野生型的kiFM結(jié)合子的具體實(shí)例?；蛘撸绻鸅C環(huán)被修飾，則可以通過(guò)在BC環(huán)中的修飾的基礎(chǔ)上進(jìn)一步破壞該區(qū)域中的強(qiáng)錨定子，即在β -鏈B中進(jìn)行修飾，來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫原性的降低。錨定子被除去的文庫(kù)的實(shí)例包括如下文庫(kù)，其中位置L19和/或S21已經(jīng)被多樣化，藉此增加文庫(kù)成員缺失錨定子殘基的可能性。圖9C顯示了其中錨定殘基被除去的文庫(kù)的實(shí)例。
[0362]實(shí)施例3.西側(cè)(West Side)結(jié)合子的產(chǎn)生
[0363]使用mRNA展示法(Xu et al ChemB1l.2002Aug ；9(8): 933-42)篩選含有經(jīng)過(guò)修飾的kiFM結(jié)構(gòu)域的西側(cè)(West Side) ( “WS”)結(jié)合子多肽的文庫(kù)，檢驗(yàn)是否與作為靶標(biāo)的鼠IL-17、鼠DLL4或人PXR結(jié)合。WS結(jié)合子設(shè)計(jì)成保留BC環(huán)序列為野生型。使用WSl文庫(kù)設(shè)計(jì)(見(jiàn)圖9A)鑒定與靶標(biāo)人PXR的結(jié)合子，使用WS-LIl文庫(kù)設(shè)計(jì)(見(jiàn)圖9A)鑒定與靶標(biāo)鼠IL-17或鼠DLL4的結(jié)合子。靶標(biāo)結(jié)合通過(guò)qPCR進(jìn)行監(jiān)測(cè)，當(dāng)觀察到特異性結(jié)合信號(hào)時(shí)，對(duì)群體進(jìn)行克隆并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。
[0364]實(shí)施例4.能夠結(jié)合鼠DLL4的WS-LI1結(jié)合子破壞DLL4與Notchl的相互作用
[0365]DLL4是Notchl蛋白的配體。采用競(jìng)爭(zhēng)性Biacore實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了具有WS-LI1設(shè)計(jì)的1QFn3多肽破壞Notchl與鼠DLL4之間相互作用的能力。將大約4500RU的Notchl-Fc固定在CM5Biacore芯片上。在HBSP緩沖液和5mM CaCl2中，將2 μ M WS-LIl結(jié)合子用20ηΜ鼠DLL4平衡，同時(shí)對(duì)照中不添加WS-LIl多肽。使每一個(gè)樣品流過(guò)芯片，并將鼠DLL4的結(jié)合與沒(méi)有添加WS-LIl多肽的對(duì)照進(jìn)行比較，信號(hào)的減少對(duì)應(yīng)于Notchl:鼠DLL4相互作用的抑制。在每?jī)纱螛悠愤\(yùn)行之間，通過(guò)用HBSP ρΗ7.4和50mM EDTA進(jìn)行2次30秒清洗對(duì)芯片進(jìn)行再生。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖5所示。發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID N0:3和4序列的多肽分別導(dǎo)致對(duì)Notchl與鼠DLL4之間相互作用的100%競(jìng)爭(zhēng)。具有SEQ ID NO: 5序列的多肽能夠誘發(fā)對(duì)Notchl與鼠DLL4之間相互作用的75%競(jìng)爭(zhēng)。
[0366]實(shí)施例5.能夠結(jié)合鼠DLL4的WS-LIl結(jié)合子的大小排阻色譜分析
[0367]利用大小排阻色譜來(lái)展示實(shí)施例4中觀察到的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果是由于所測(cè)試的WS-LIl結(jié)合子的單體形式所致。具有SEQ ID N0:3或4氨基酸序列的WS-LIl結(jié)合子主要是單體，而具有SEQ ID NO: 5氨基酸序列的WS-LIl結(jié)合子含有單體蛋白和聚集體蛋白的混合物。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，其表明實(shí)施例4中測(cè)試的WS-LIl結(jié)合子作為單體種類發(fā)揮作用，這提示這些結(jié)合子作為穩(wěn)定的、良好折疊的多肽存在。
[0368]實(shí)施例6.能夠結(jié)合鼠DLL4的WS-LIl結(jié)合子的穩(wěn)定性
[0369]通過(guò)基于熒光的熱遷移測(cè)定(TSF)評(píng)估實(shí)施例4所述多肽的穩(wěn)定性。具有SEQ IDNO: 3氨基酸序列的多肽在59°C有躍遷。具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽在49°C有躍遷。具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽沒(méi)有觀察到躍遷。
[0370]實(shí)施例7.通過(guò)能夠結(jié)合鼠IL-17的WS-LI1結(jié)合子破壞鼠IL-17與鼠IL-17RA之間的相互作用
[0371]IL-17是IL-17受體A蛋白IL-17RA的配體。通過(guò)采用競(jìng)爭(zhēng)性Alphascreen實(shí)驗(yàn)對(duì)具有WS-LIl設(shè)計(jì)的uiFr^結(jié)構(gòu)域破壞鼠IL-17和鼠IL-17RA之間相互作用的能力進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)制造商的使用說(shuō)明書(shū)混合鏈霉親和素供體珠子、抗-人IgG受體珠子、1.5nM鼠IL-17RA-FC和2.5nM生物素化的鼠IL-17，以便給出強(qiáng)烈的Alphascreen信號(hào)?？疾炝司哂蠸EQ ID N0:45、46或47的序列的多肽當(dāng)以I μ M濃度加入到該混合物中時(shí)抑制該信號(hào)的能力。具有SEQ ID NO:45的序列的多肽導(dǎo)致83%的Alphascreen信號(hào)抑制，具有SEQ IDNO: 46的序列的多肽導(dǎo)致94 %的Alphascreen信號(hào)抑制，具有SEQ ID NO: 47的序列的多肽導(dǎo)致81%的Alphascreen信號(hào)抑制。這些結(jié)果證明，WS-LIl文庫(kù)設(shè)計(jì)產(chǎn)生了能夠結(jié)合IL-17并可有效抑制IL-17與其受體之間相互作用的kiFM結(jié)構(gòu)域。
[0372]實(shí)施例8.能夠結(jié)合鼠IL-17的WS-LIl結(jié)合子的大小排阻色譜分析
[0373]使用大小排阻色譜展示實(shí)施例7中觀察到的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果是由于所測(cè)試的WS-LIl結(jié)合子的單體形式所致的。具有SEQ ID Ν0:45、46或47氨基酸序列的WS-LIl結(jié)合子主要是單體。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，其表明，實(shí)施例7中測(cè)試的WS-LIl結(jié)合子以單體種類發(fā)揮作用，提示這些結(jié)合子以穩(wěn)定的、良好折疊的多肽的形式存在。
[0374]實(shí)施例9. 能夠結(jié)合鼠IL-17的WS-LIl結(jié)合子的穩(wěn)定性
[0375]通過(guò)TSF評(píng)估實(shí)施例7所述多肽的穩(wěn)定性。具有SEQ ID NO:45氨基酸序列的多肽在51 °C有躍遷。具有SEQ ID NO:46氨基酸序列的多肽在60°C有躍遷。具有SEQ ID NO:47氨基酸序列的多肽沒(méi)有觀察到躍遷。
[0376]實(shí)施例10.能夠結(jié)合人PXR的WSl結(jié)合子的結(jié)合性質(zhì)表征
[0377]用Biacore結(jié)合測(cè)定和帶GST標(biāo)簽的PXR對(duì)能夠結(jié)合PXR的WSl結(jié)合子進(jìn)行表征。將14000RU的抗-GST抗體固定在Biacore芯片上，通過(guò)使50nM溶液以5 μ L/min的速度流過(guò)芯片3分鐘來(lái)捕獲GST-PXR。使WSl結(jié)合子以0.5-2 μ M濃度流過(guò)芯片，觀察相對(duì)于缺少PXR的對(duì)照的結(jié)合。每?jī)纱芜\(yùn)行之間，用1mM甘氨酸、ρΗ2.0進(jìn)行2次30秒清洗，對(duì)芯片進(jìn)行剝離(stripped)，并捕獲新鮮的GST-PXR。在這些條件下，146RU的具有SEQ ID NO:48氨基酸序列的WSl結(jié)合子結(jié)合了 GST-PXR，而81RU的具有SEQ ID NO:49氨基酸序列的WSl結(jié)合子結(jié)合了 GST-PXR。這些結(jié)果證明，具有SEQ ID NO:48或49氨基酸序列的WSl結(jié)合子能夠結(jié)合GST-PXR。
[0378]實(shí)施例11.能夠結(jié)合人PXR的WSl結(jié)合子的大小排阻色譜分析
[0379]使用大小排阻色譜來(lái)展示實(shí)施例10中觀察到的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果是由于所測(cè)試的WSl結(jié)合子的單體形式導(dǎo)致的。具有SEQ ID N0:48或49氨基酸序列的WSl結(jié)合子主要是單體。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，其表明，實(shí)施例10中測(cè)試的WSl結(jié)合子以單體種類發(fā)揮作用，提示這些結(jié)合子作為穩(wěn)定的、良好折疊的多肽存在。
[0380]實(shí)施例12.結(jié)合人PXR的wFM多肽的序列和結(jié)合特征
[0381]本實(shí)施例描述6種其他的可結(jié)合人PXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)的uiFr^多肽。還提供了這6種多肽以及兩種在實(shí)施例10中描述的多肽(具有SEQ ID NO:48和49)的結(jié)合特征。
[0382]通過(guò)篩選各種文庫(kù)鑒定了具有圖10中記載的氨基酸序列的kiFM多肽。例如，從NPl文庫(kù)分離的Adnectin-1 (見(jiàn)圖9C)。kiFM多肽的合成如下。將編碼kiFM多肽的核酸克隆在pET9D載體中，然后在20°C下在大腸桿菌中表達(dá)。裂解物用N1-瓊脂糖親和色譜進(jìn)行一步純化。
[0383]如下所述在Biacore TlOO裝置(GEHealthcare)上進(jìn)行表面等離子體共振(SPR)來(lái)確定1QFn3多肽的Kd值:在固定有抗-GST抗體(GE Healthcare)的芯片上捕獲人PXR-GST(Invitrogen)，在人PXR-GST上注射系列濃度的kiFM多肽，各動(dòng)力學(xué)循環(huán)之間用1mM甘氨酸、pH2再生芯片表面。二者的動(dòng)力學(xué)參數(shù)用Biacore TlOO軟件計(jì)算。結(jié)果如表I所示。
[0384]表1:Adnectin_l—Adnectin-8 與人 PXR 的結(jié)合特征
[0385]
【權(quán)利要求】
1.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述kiFM結(jié)構(gòu)域包含(i)相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的相應(yīng)環(huán)，在從BC、DE和FG環(huán)中選出的至少一個(gè)北極環(huán)的氨基酸序列中的修飾，和Qi)相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)，在從AB、CD和EF環(huán)中選出的至少一個(gè)南極環(huán)的氨基酸序列中的修飾，其中該至少一個(gè)被修飾的北極環(huán)和至少一個(gè)被修飾的南極環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中至少一個(gè)北極環(huán)或至少一個(gè)南極環(huán)具有野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的多肽，其中所述BC環(huán)的至少一部分具有野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的多肽，其中所述BC環(huán)的最先3個(gè)殘基與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
5.權(quán)利要求3的多肽，其中所述BC環(huán)的最先4個(gè)殘基與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
6.權(quán)利要求3的多肽，其中所述BC環(huán)的最先5個(gè)殘基與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
7.權(quán)利要求3的多肽，其中所述BC環(huán)具有野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于在BC環(huán)中具有額外修飾的等價(jià)多肽，該多肽具有降低的免疫原性。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)β-鏈的氨基酸序列相對(duì)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈的氨基酸序列被修飾。
11.權(quán)利要求10的多肽，其中在所述kiFM結(jié)構(gòu)域的線性序列中所述被修飾的β-鏈位于所述被修飾的環(huán)之一的鄰近。
12.權(quán)利要求10的多肽，其中在所述kiFM結(jié)構(gòu)域的線性序列中所述被修飾的β-鏈位于所述被修飾的北極環(huán)和所述被修飾的南極環(huán)之間。
13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的多肽，其中在所述uiFr^結(jié)構(gòu)域的線性序列中所述被修飾的北極環(huán)、所述被修飾的β-鏈和所述被修飾的南極環(huán)彼此鄰近。
14.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的多肽，其中所述被修飾的β-鏈貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
15.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)被修飾的環(huán)的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度已延長(zhǎng)。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)被修飾的環(huán)的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度已縮短。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的多肽，其中C端尾巴的氨基酸序列相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列被修飾。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的多肽，其中最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFnS結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列被修飾。
20.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1)從N端截短了 1-7個(gè)氨基酸，或相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)從C端截短了 1-9個(gè)氨基酸，或二者均有。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的氨基酸序列具有至少50%同一性。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的氨基酸序列具有至少65%同一'丨生。
23.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述kiFM結(jié)構(gòu)域包含⑴相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的相應(yīng)環(huán)，在從BC、DE和FG環(huán)中選出的至少一個(gè)北極環(huán)的氨基酸序列的修飾，和(ii)相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)，在從AB、⑶和EF環(huán)中選出的至少一個(gè)南極環(huán)的氨基酸序列中的修飾。
24.權(quán)利要求23的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽含有不同的kiFM結(jié)構(gòu)域序列。
25.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求23或24的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
26.分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求25的方法鑒定的。
27.權(quán)利要求26的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
28.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述kiFM結(jié)構(gòu)域包含:(i)相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)，在AB、BC、CD、DE、EF、或FG環(huán)中至少一個(gè)的氨基酸序列中的修飾，和(ii)相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β-鏈，在至少一個(gè)鏈的氨基酸序列中的修飾，其中所述至少一個(gè)被修飾的環(huán)和所述至少一個(gè)被修飾的β-鏈貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
29.權(quán)利要求28的多肽，其中在所述kiFM結(jié)構(gòu)域的線性序列中所述被修飾的β-鏈與所述被修飾的環(huán)鄰近。
30.權(quán)利要求28或29的多肽，其中至少兩個(gè)β-鏈具有相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈被修飾的氨基酸序列。
31.權(quán)利要求30的多肽，其中在所述kiFM結(jié)構(gòu)域線性序列中所述被修飾的β-鏈與所述被修飾的環(huán)的每一側(cè)鄰近。
32.權(quán)利要求30或31的多肽，其中所述被修飾的β-鏈均貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
33.權(quán)利要求28-32中任一項(xiàng)的多肽，其中至少兩個(gè)環(huán)具有相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)被修飾的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求33的多肽，其中至少一個(gè)被修飾的環(huán)是從BC、DE和FG環(huán)中選出的北極環(huán)，且至少一個(gè)被修飾的環(huán)是從ΑΒ、⑶和EF環(huán)中選出的南極環(huán)。
35.權(quán)利要求33或34的多肽，其中所述被修飾的環(huán)均貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
36.權(quán)利要求28-35中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)北極環(huán)或至少一個(gè)南極環(huán)具有野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
37.權(quán)利要求28-35中任一項(xiàng)的多肽，其中所述BC環(huán)的至少一部分具有野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
38.權(quán)利要求37的多肽，其中所述BC環(huán)的最先3個(gè)殘基與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
39.權(quán)利要求37的多肽，其中所述BC環(huán)的最先4個(gè)殘基與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
40.權(quán)利要求37的多肽，其中所述BC環(huán)的最先5個(gè)殘基與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
41.權(quán)利要求37的多肽，其中所述BC環(huán)具有野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
42.權(quán)利要求37-41中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽相對(duì)于在BC環(huán)中具有額外修飾的等價(jià)多肽具有降低的免疫原性。
43.權(quán)利要求28-42中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
44.權(quán)利要求28-43中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
45.權(quán)利要求28-44中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)被修飾的環(huán)的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度延長(zhǎng)。
46.權(quán)利要求28-45中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)被修飾的環(huán)的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度縮短。
47.權(quán)利要求28-46中任一項(xiàng)的多肽，其中C端尾巴的氨基酸序列相對(duì)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列被修飾。
48.權(quán)利要求28-47中任一項(xiàng)的多肽，其中最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFnS結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列被修飾。
49.權(quán)利要求28-46中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)從N端截短了 1-7個(gè)氨基酸，或相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)從C端截短了 1-9個(gè)氨基酸，或者兩者均有。
50.權(quán)利要求28-49中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的氨基酸序列具有至少50%同一性。
51.權(quán)利要求28-50中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽與野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的氨基酸序列具有至少65%同一性。
52.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述10Fn3結(jié)構(gòu)域包含⑴相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的相應(yīng)環(huán)，在AB、BCXD、DE、EF、或FG環(huán)中至少一個(gè)的氨基酸序列中的修飾，和(ii)相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈，在至少一個(gè)β -鏈的氨基酸序列中的修飾。
53.權(quán)利要求52的文庫(kù)，其中所述文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽含有不同的10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
54.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求52或53的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
55.一種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求54的方法鑒定的。
56.權(quán)利要求55的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
57.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述kiFM結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在CD和FG環(huán)的氨基酸序列中含有修飾，并且其中所述CD和FG環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
58.權(quán)利要求57的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的⑶環(huán)的序列，⑶環(huán)的11個(gè)氨基酸中有至少4個(gè)被修飾。
59.權(quán)利要求57或58的多肽，其中⑶環(huán)中對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的氨基酸殘基46或47的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與這些位置處的野生型氨基酸相同。
60.權(quán)利要求57-59中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的FG環(huán)的序列，F(xiàn)G環(huán)的13個(gè)氨基酸中有至少11個(gè)被修飾。
61.權(quán)利要求60的多肽，其中FG環(huán)中對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的氨基酸殘基75或87的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與這些位置處的野生型氨基酸相同。
62.權(quán)利要求57-61中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，CD環(huán)、FG環(huán)或兩者的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)。
63.權(quán)利要求57-61中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，CD環(huán)、FG環(huán)或兩者的氨基酸序列的長(zhǎng)度縮短。
64.權(quán)利要求57-61中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)，CD環(huán)和FG環(huán)的至少一個(gè)的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)，并且相對(duì)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 1或6)的相應(yīng)環(huán)，⑶環(huán)和FG環(huán)的至少一個(gè)的氨基酸序列的長(zhǎng)度縮短。
65.權(quán)利要求57-64中任一項(xiàng)的多肽，其中β-鏈C和β -鏈D的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈的序列被修飾。
66.權(quán)利要求57-65中任一項(xiàng)的多肽，其中所述BC環(huán)的至少一部分相對(duì)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的BC環(huán)的序列被修飾。
67.權(quán)利要求66的多肽，其中所述BC環(huán)中對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的氨基酸殘基30和31的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基相對(duì)于這些位置處的野生型氨基酸被修飾。
68.權(quán)利要求57-67中任一項(xiàng)的多肽，其中β-鏈F和β -鏈G的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈的序列被修飾。
69.權(quán)利要求57-68中任一項(xiàng)的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)所述被修飾的β-鏈貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
70.權(quán)利要求69的多肽，其中所有所述被修飾的β-鏈均貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
71.權(quán)利要求57-70中任一項(xiàng)的多肽，其中AB、DE和EF環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)具有野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
72.權(quán)利要求57-71中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
73.權(quán)利要求57-72中任一項(xiàng)的多肽，其中所述BC環(huán)的至少一部分具有野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
74.權(quán)利要求73的多肽，其中所述BC環(huán)的最先3個(gè)殘基與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
75.權(quán)利要求73的多肽，其中所述BC環(huán)的最先4個(gè)殘基與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
76.權(quán)利要求73的多肽，其中所述BC環(huán)的最先5個(gè)殘基與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
77.權(quán)利要求73的多肽，其中所述BC環(huán)的最先6個(gè)殘基與野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的BC環(huán)中的相應(yīng)殘基相同。
78.權(quán)利要求73的多肽，其中所述BC環(huán)具有野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列。
79.權(quán)利要求73-78中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽相對(duì)于在BC環(huán)中具有額外修飾的等價(jià)多肽具有降低的免疫原性。
80.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述10Fn3結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在⑶和FG環(huán)的氨基酸序列中含有修飾。
81.權(quán)利要求80的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的kiFM結(jié)構(gòu)域序列。
82.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求80或81的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
83.一種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求80的方法鑒定的。
84.權(quán)利要求83的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
85.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列，所述wFnS結(jié)構(gòu)域在CD和DE環(huán)的氨基酸序列中含有修飾，并且其中CD和DE環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
86.權(quán)利要求85的多肽，其中EF環(huán)的氨基酸序列相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的EF環(huán)的序列被修飾，并且其中EF環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
87.權(quán)利要求85或86的多肽，其中β-鏈C、β-鏈D和β-鏈F中一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈的序列被修飾。
88.權(quán)利要求87的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)所述被修飾的β-鏈貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
89.權(quán)利要求85-88中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，在對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的殘基36至66的氨基酸之間的31個(gè)殘基中有至少24個(gè)已被修飾。
90.權(quán)利要求85-89中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的CD環(huán)，所述CD環(huán)的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
91.權(quán)利要求85-90中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
92.權(quán)利要求85-91中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
93.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述10Fn3結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在⑶和DE環(huán)的氨基酸序列中含有修飾。
94.權(quán)利要求93的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的kiFM結(jié)構(gòu)域序列。
95.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求93或94的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
96.一種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求95的方法鑒定的。
97.權(quán)利要求96的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
98.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，所述1QFn3結(jié)構(gòu)域在EF和FG環(huán)的氨基酸序列中包含修飾，并且其中所述EF和FG環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
99.權(quán)利要求98的多肽，其中AB環(huán)的氨基酸序列相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的AB環(huán)的序列被修飾，并且其中AB環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
100.權(quán)利要求98或99的多肽，其中相對(duì)于野生型人$113結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1)的相應(yīng)β -鏈的序列，β -鏈A和β -鏈G中一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列被修飾。
101.權(quán)利要求100的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)所述被修飾的β-鏈貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
102.權(quán)利要求98-101中任一項(xiàng)的多肽，其中最先7個(gè)氨基酸的氨基酸序列或?qū)?yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)殘基93至97的氨基酸的氨基酸序列相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基已被修飾。
103.權(quán)利要求102的多肽，其中額外的被修飾的氨基酸貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
104.權(quán)利要求98-103中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)中的相應(yīng)殘基,所述kiFi^結(jié)構(gòu)域的最先15個(gè)氨基酸殘基中有至少14個(gè)已被修飾。
105.權(quán)利要求98-104中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)中的相應(yīng)殘基，所述EF環(huán)的5個(gè)氨基酸殘基中有至少4個(gè)已被修飾。
106.權(quán)利要求98-105中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，在對(duì)應(yīng)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)殘基80-97的氨基酸之間的18個(gè)殘基中有至少15個(gè)已被修飾。
107.權(quán)利要求98-106中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的FG環(huán)，所述FG環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
108.權(quán)利要求98-107中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
109.權(quán)利要求98-108中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
110.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述10Fn3結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在EF和FG環(huán)的氨基酸序列中含有修飾。
111.權(quán)利要求110的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
112.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求110或111的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
113.—種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求112的方法鑒定的。
114.權(quán)利要求113的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
115.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列，1QFn3結(jié)構(gòu)域在AB和FG環(huán)的氨基酸序列中含有修飾，并且其中AB和FG環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
116.權(quán)利要求115的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈和環(huán)的序列，β -鏈Α、環(huán)ΑΒ、β -鏈B、環(huán)FG和β -鏈G的氨基酸序列含有修飾，并且其中被修飾的環(huán)和鏈貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
117.權(quán)利要求115或116的多肽，其中相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，最先7個(gè)氨基酸的氨基酸序列或?qū)?yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的殘基93-97的氨基酸的氨基酸序列已被修飾。
118.權(quán)利要求117的多肽，其中額外的被修飾的氨基酸貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
119.權(quán)利要求115-118中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的AB環(huán)，AB環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
120.權(quán)利要求115-119中任一項(xiàng)的多肽，其中AB環(huán)在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基15和18的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
121.權(quán)利要求115-120中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的FG環(huán)，F(xiàn)G環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
122.權(quán)利要求115 -121中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)的對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)FG環(huán)的氨基酸殘基84-87的部分相對(duì)于野生型CD環(huán)的相同部分具有修飾的氨基酸序列。
123.權(quán)利要求115-122中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基83和88的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
124.權(quán)利要求115-123中任一項(xiàng)的多肽，其中β-鏈B在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基18和20的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
125.權(quán)利要求115-124中任一項(xiàng)的多肽，其中對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的殘基1-19的氨基酸之間的19個(gè)殘基中有至少16個(gè)相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基已被修飾。
126.權(quán)利要求115-125中任一項(xiàng)的多肽，其中對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)殘基84-97的氨基酸之間的14個(gè)殘基中有至少13個(gè)相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基已被修飾。
127.權(quán)利要求115-126中任一項(xiàng)的多肽，其中BCXD、DE或EF環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)具有野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列。
128.權(quán)利要求115-127中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
129.權(quán)利要求115-128中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
130.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述10Fn3結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列在AB和FG環(huán)的氨基酸序列中含有修飾。
131.權(quán)利要求130的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
132.—種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求130或131的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
133.—種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求132的方法鑒定的。
134.權(quán)利要求133的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
135.—種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述kiFM結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的氨基酸序列在⑶環(huán)、EF環(huán)、β -鏈F和β -鏈G的氨基酸序列中包含修飾，并且其中被修飾的環(huán)和鏈貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)入口 ο
136.權(quán)利要求135的多肽，其中相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，對(duì)應(yīng)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)殘基93-97的氨基酸的氨基酸序列已被修飾。
137.權(quán)利要求136的多肽，其中額外的被修飾的氨基酸貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
138.權(quán)利要求135-137中任一項(xiàng)的多肽，其中⑶環(huán)的對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環(huán)的氨基酸氨基37-45的部分具有相對(duì)于野生型⑶環(huán)的相同部分被修飾的氨基酸序列。
139.權(quán)利要求135-138中任一項(xiàng)的多肽，其中⑶環(huán)的對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環(huán)的氨基酸殘基37-45的部分相對(duì)于野生型⑶環(huán)的相同部分含有插入或缺失。
140.權(quán)利要求135-139中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的EF環(huán)，EF環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
141.權(quán)利要求135-140中任一項(xiàng)的多肽，其中β-鏈F在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基68和70的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
142.權(quán)利要求135-141中任一項(xiàng)的多肽，其中對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1)的氨基酸殘基91-97的序列的氨基酸序列具有相對(duì)于野生型序列的相同部分被修飾的氨基酸序列。
143.權(quán)利要求135-142中任一項(xiàng)的多肽，其中該多肽在對(duì)應(yīng)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基90和98的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
144.權(quán)利要求135-143中任一項(xiàng)的多肽，其中AB、BC或DE環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)具有野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列。
145.權(quán)利要求135-144中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
146.權(quán)利要求135-145中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
147.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述10Fn 3結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈和環(huán)的序列，在⑶環(huán)、EF環(huán)、β -鏈F和β -鏈G的氨基酸序列中含有修飾。
148.權(quán)利要求147的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
149.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求147或148的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
150.一種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求149的方法鑒定的。
151.權(quán)利要求150的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
152.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈和環(huán)的序列，所述uiFr^結(jié)構(gòu)域在β -鏈A、AB環(huán)、β -鏈B、⑶環(huán)、β -鏈E、EF環(huán)、和β -鏈F的氨基酸序列中含有修飾，并且其中經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和鏈貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
153.權(quán)利要求152的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:l或6)的CD環(huán)，所述CD環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
154.權(quán)利要求152或153的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的β -鏈G的序列，所述β -鏈G的氨基酸序列被修飾。
155.權(quán)利要求152-154中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1)的C端尾巴的氨基酸序列，C端尾巴的氨基酸序列被修飾。
156.權(quán)利要求152-155中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
157.權(quán)利要求152-156中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
158.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈和環(huán)的序列，所述wFM結(jié)構(gòu)域在β -鏈A、AB環(huán)、β -鏈B、CD環(huán)、β -鏈E、EF環(huán)和β -鏈F的氨基酸序列中含有修飾。
159.權(quán)利要求158的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
160.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求158或159的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
161.一種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求160的方法鑒定的。
162.權(quán)利要求161的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
163.—種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈和環(huán)的序列，所述wFM結(jié)構(gòu)域在AB環(huán)、β -鏈B、⑶環(huán)、β -鏈D、DE環(huán)、β -鏈E和EF環(huán)的氨基酸序列中含有修飾，并且其中經(jīng)過(guò)修飾的環(huán)和鏈貢獻(xiàn)于對(duì)相同靶標(biāo)的結(jié)合。
164.權(quán)利要求163的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:l或6)的AB環(huán)，所述AB環(huán)的氨基酸序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
165.權(quán)利要求163或164的多肽，其中⑶環(huán)的對(duì)應(yīng)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的CD環(huán)的氨基酸殘基40-47的部分相對(duì)于野生型CD環(huán)的相同部分具有被修飾的氨基酸序列。
166.權(quán)利要求163-165中任一項(xiàng)的多肽，其中⑶環(huán)的對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環(huán)的氨基酸殘基40-47的部分相對(duì)于野生型⑶環(huán)的相同部分含有插入或缺失。
167.權(quán)利要求163-166中任一項(xiàng)的多肽，其中β-鏈B在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)殘基18和20的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
168.權(quán)利要求163-167中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)殘基14-19的氨基酸之間的6個(gè)殘基中有至少5個(gè)已被修飾。
169.權(quán)利要求163-168中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基，對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)殘基40-66的氨基酸之間的27個(gè)殘基中有至少18個(gè)已被修飾。
170.權(quán)利要求163-169中任一項(xiàng)的多肽，其中所述BC環(huán)具有野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列。
171.權(quán)利要求163-170中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
172.權(quán)利要求163-171中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)不含有RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
173.—種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)β -鏈和環(huán)的序列，kiFM結(jié)構(gòu)域在AB環(huán)、β -鏈B、⑶環(huán)、β -鏈D、DE環(huán)、β -鏈E和EF環(huán)的氨基酸序列中含有修飾。
174.權(quán)利要求173的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
175.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求173或174的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
176.—種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求175的方法鑒定的。
177.權(quán)利要求176的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
178.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的氨基酸殘基序列77-83，所述1QFn3結(jié)構(gòu)域在FG環(huán)中含有序列修飾，并且其中所述wFM以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
179.權(quán)利要求178的多肽，其中所述FG環(huán)的對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的氨基酸殘基77-83的部分相對(duì)于野生型FG環(huán)的氨基酸殘基序列77-83長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
180.權(quán)利要求178或179的多肽，其中所述FG環(huán)單獨(dú)介導(dǎo)與靶標(biāo)的結(jié)合。
181.權(quán)利要求178-180中任一項(xiàng)的多肽，其中所述AB、BC、CD、DE或EF環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)具有野生型人呷113結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列。
182.—種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的氨基酸殘基序列77-83，所述1QFn3結(jié)構(gòu)域在FG環(huán)中含有序列修飾。
183.權(quán)利要求182的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
184.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求182或183的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
185.—種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求184的方法鑒定的。
186.權(quán)利要求200的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
187.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列，所述wFM結(jié)構(gòu)域在BC環(huán)的一部分和FG環(huán)的一部分中含有序列修飾，并且其中與相對(duì)于野生型BC環(huán)在BC環(huán)的更大部分中具有修飾的等價(jià)wFM結(jié)構(gòu)域相比，該kiFM結(jié)構(gòu)域具有降低的免疫原性。
188.權(quán)利要求187的多肽，其中所述BC環(huán)中被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的BC環(huán)的殘基28和29。
189.權(quán)利要求187的多肽，其中所述BC環(huán)中被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的BC環(huán)的殘基27-29。
190.權(quán)利要求187的多肽，其中所述BC環(huán)中被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的BC環(huán)的殘基24-29。
191.權(quán)利要求187-190中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)中被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的殘基77-83。
192.權(quán)利要求187-190中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)中被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的殘基72-82。
193.權(quán)利要求187-190中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)中被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)的殘基77-86。
194.權(quán)利要求187- 190中任一項(xiàng)的多肽，其中所述FG環(huán)中被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人10Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的FG環(huán)殘基77-79。
195.權(quán)利要求191-194中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的FG環(huán)的相應(yīng)部分，所述FG環(huán)中的被修飾部分具有插入或缺失。
196.權(quán)利要求187-195中任一項(xiàng)的多肽，其中所述BC和FG環(huán)貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。
197.權(quán)利要求187-196中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的DE環(huán)的序列，所述kiFM結(jié)構(gòu)域在DE環(huán)的一部分中進(jìn)一步含有序列修飾。
198.權(quán)利要求197的多肽，其中DE環(huán)中被修飾的部分對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的DE環(huán)的殘基52和53.
199.權(quán)利要求187-198中任一項(xiàng)的多肽，其中與在氨基酸殘基23-27的一個(gè)或多個(gè)中相對(duì)于野生型BC環(huán)中的相應(yīng)位置進(jìn)一步包含修飾的等價(jià)kiFM結(jié)構(gòu)域相比，該wFM結(jié)構(gòu)域具有降低的免疫原性。
200.權(quán)利要求187-199中任一項(xiàng)的多肽，其中所述uiFr^結(jié)構(gòu)域以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
201.一種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人wFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列，所述wFM結(jié)構(gòu)域在BC環(huán)的一部分和FG環(huán)的一部分中含有序列修飾。
202.權(quán)利要求201的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
203.一種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求201或202的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
204.一種用于增加鑒定出結(jié)合靶標(biāo)并具有降低的免疫原性的多肽的可能性的方法，包括篩選權(quán)利要求201或202的文庫(kù)以鑒定出結(jié)合所述靶標(biāo)的多肽。
205.一種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求203或204的方法鑒定的。
206.權(quán)利要求205的分離的多肽，其中所述多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
207.—種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述’113結(jié)構(gòu)域在BC環(huán)和鏈B或β-鏈C中的至少一個(gè)中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)和β -鏈的序列含有序列修飾，并且其中與在β-鏈B或β-鏈C中的至少一個(gè)中相對(duì)于野生型不具有序列修飾的等價(jià)kiFM結(jié)構(gòu)域相比，該kiFM結(jié)構(gòu)域具有降低的免疫原性。
208.權(quán)利要求207的多肽，其中相對(duì)于野生型人1QFn3結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:l或6)的BC環(huán)的氨基酸序列，所述BC環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
209.權(quán)利要求207或208的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述kiFM結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步在最先7個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列中含有修飾。
210.權(quán)利要求207-209中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的相應(yīng)環(huán)的序列，uiFr^結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步在DE環(huán)、FG環(huán)或兩者中含有修飾。
211.權(quán)利要求210的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:l或6)的DE環(huán)的氨基酸序列，所述DE環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
212.權(quán)利要求210或211的多肽，其中相對(duì)于野生型人’113結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:1或6)的FG環(huán)的氨基酸序列，F(xiàn)G環(huán)的氨基酸序列長(zhǎng)度延長(zhǎng)或長(zhǎng)度縮短。
213.權(quán)利要求210-212中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的相應(yīng)β-鏈的序列，所述kiFM結(jié)構(gòu)域在DE環(huán)中含有序列修飾，并進(jìn)一步在β -鏈D、β -鏈E或兩者中含有序列修飾。
214.權(quán)利要求210-212中任一項(xiàng)的多肽，其中相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1或6)的相應(yīng)β-鏈的序列，所述kiFM結(jié)構(gòu)域在FG環(huán)中含有序列修飾，并進(jìn)一步在β -鏈F、β -鏈G或兩者中含有序列修飾。
215.權(quán)利要求207-214中任一項(xiàng)的多肽，其中所述BC環(huán)的對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的BC環(huán)的氨基酸殘基27-31的部分相對(duì)于野生型BC環(huán)的相同部分具有被修飾的氨基酸序列。
216.權(quán)利要求207-215中任一項(xiàng)的多肽，其中所述BC環(huán)在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基26和32的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
217.權(quán)利要求207-216中任一項(xiàng)的多肽，其中β-鏈D在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基48和50的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
218.權(quán)利要求207-217中任一項(xiàng)的多肽，其中β-鏈F在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基72和74的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
219.權(quán)利要求207-218中任一項(xiàng)的多肽，其中β-鏈G在對(duì)應(yīng)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基88和90的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
220.權(quán)利要求207-219中任一項(xiàng)的多肽，其中疏水核心殘基相對(duì)于野生型人uiFr^結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)沒(méi)有被修飾。
221.—種文庫(kù)，其含有多個(gè)包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中相對(duì)于野生型人kiFM結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或6)的相應(yīng)環(huán)和β -鏈的序列，所述wFM結(jié)構(gòu)域在BC環(huán)以及β -鏈B或β -鏈C的至少一個(gè)中包含序列修飾。
222.權(quán)利要求221的文庫(kù)，其中該文庫(kù)包含至少15個(gè)多肽，每一個(gè)多肽包含不同的.10Fn3結(jié)構(gòu)域序列。
223.—種用于鑒定結(jié)合靶標(biāo)的多肽的方法，包括篩選權(quán)利要求221或222的文庫(kù)以鑒定結(jié)合該靶標(biāo)的多肽。
224.—種用于增加鑒定出結(jié)合靶標(biāo)并具有降低的免疫原性的多肽的可能性的方法，包括篩選權(quán)利要求221或222的文庫(kù)以鑒定出結(jié)合所述靶標(biāo)的多肽。 .223.—種分離的多肽，其是通過(guò)權(quán)利要求223或224的方法鑒定的。.224.權(quán)利要求223的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標(biāo)結(jié)合。
【文檔編號(hào)】C07K14/78GK104053670SQ201280065574
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月31日
【發(fā)明者】J.戴維斯, D.利波夫塞克, R.坎福森 申請(qǐng)人:百時(shí)美施貴寶公司