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      PDGF受體β結(jié)合多肽的制作方法

      文檔序號:3481640閱讀:389來源:國知局
      PDGF受體β結(jié)合多肽的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供以高親和性特異性結(jié)合于靶抗原(例如人類抗原,例如人類PDGFRβ)的結(jié)合多肽(例如抗體或其片段)。本發(fā)明亦提供結(jié)合多肽的文庫、藥物組合物,以及編碼結(jié)合多肽的核酸、重組表達載體及用于制造這樣的結(jié)合多肽的宿主細胞。本發(fā)明亦涵蓋使用本發(fā)明的結(jié)合多肽以診斷及治療疾病的方法。
      【專利說明】PDGF受體β結(jié)合多肽
      [0001] 本申請主張2011年12月5日申請的美國臨時申請61/566, 778以及2012年3月 14日申請的美國臨時申請61/610, 905的優(yōu)先權(quán),所述臨時申請均以全文引用的方式并入 本文中。

      【背景技術(shù)】
      [0002] 血小板源性生長因子(PDGF)是間葉活動來源的細胞中的強力分裂原及化學(xué)引誘 物且涉及許多疾病的病理學(xué)。TOGF以二硫化物連接的二聚物存在,所述二聚物是由兩條可 組合形成三種獨特TOGF同種型AA、BB或AB的同源鏈A或B組成。TOGF的所有同種型均 通過結(jié)合至細胞表面TOGF受體(PDGFR)來介導(dǎo)其促有絲分裂效果。
      [0003] H)GF受體屬于酪氨酸激酶家族且由兩種受體同種型α及β組成。α及β同 種型可通過其獨特配體結(jié)合特異性加以區(qū)分。H)GFi3受體可僅結(jié)合至Β鏈(同種型ΒΒ及 AB),而TOGF α受體可結(jié)合至TOGF的所有同種型。
      [0004] H)GF與細胞表面TOGFR的結(jié)合引起受體二聚化及反式自體磷酸化,進而又引起細 胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件,所述事件尤其引起細胞增殖及細胞遷移。因此,阻斷TOGF結(jié)合和/或 受體二聚化的TOGFR拮抗劑可用以治療或預(yù)防與TOGFR活化相關(guān)的疾病。
      [0005] 因此,在本領(lǐng)域中需要可用以治療與TOGFR活化相關(guān)的疾病的新穎TOGFR拮抗劑。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006] 本發(fā)明提供以高親和性特異性結(jié)合于靶抗原(例如人類抗原,例如人類roGF)的 結(jié)合多肽(例如抗體或其片段)。在一優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明提供以高親和性結(jié)合于 roGFRii (例如人類roGFRii)且拮抗roGFRii活化的結(jié)合多肽。這樣的結(jié)合多肽尤其適用 于治療roGFRii相關(guān)疾病或病癥(例如年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD))。本發(fā)明亦提供結(jié)合多 肽的文庫、藥物組合物,以及編碼結(jié)合多肽的核酸、重組表達載體及用于制造這樣的結(jié)合多 肽的宿主細胞。本發(fā)明亦涵蓋使用本發(fā)明的結(jié)合多肽來檢測H)GFRi3及調(diào)節(jié)H)GFRi3活性 的方法。
      [0007] 因此,在一方面,本發(fā)明提供經(jīng)分離結(jié)合多肽,其包含VH域,其中作為分離域,VH 域以小于ΙΟΟρΜ的Kd結(jié)合于抗原。
      [0008] 在另一方面,本發(fā)明提供特異性結(jié)合于H)GFRi3的經(jīng)分離結(jié)合多肽,其包含如SEQ ID NO: 1中所示的CDR3序列。
      [0009] 在某些實施方案中,結(jié)合多肽包含VH域,所述VH域包含SEQ ID N0:1所示的HCDR3 氨基酸序列。VH域可進一步包括包含選自SEQ ID NO :2-32的氨基酸序列的HCDR2和/或 包含選自SEQ ID N0:33-62的氨基酸序列的HCDR1。
      [0010] 在某些實施方案中,多肽包含VH域,所述VH域包含與選自SEQ ID N0:318-368的 VH 域氨基酸序列享有至少 80% (例如 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)氨基酸同一性的氨基酸 序列。
      [0011] 在某些實施方案中,多肽包含VH域,所述VH域包含選自SEQ ID NO: 318-368的氨 基酸序列。
      [0012] 在某些實施方案中,結(jié)合多肽包含VL域。VH域可進一步包括包含選自SEQ ID NO:63-147的氨基酸序列的LCDR3、包含選自SEQ ID NO: 148-232的氨基酸序列的LCDR2和 /或包含選自SEQ ID N0:233-317的氨基酸序列的LCDR1。
      [0013] 在某些實施方案中,多肽包含VL域,所述VL域包含與選自SEQ ID N0:369-453的 VL 域氨基酸序列享有至少 80% (例如 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)氨基酸同一性的氨基酸 序列。
      [0014] 在某些實施方案中,多肽包含VL域,所述VL域包含選自SEQ ID N0:369-453的氨 基酸序列。
      [0015] 在其它方面,本發(fā)明提供結(jié)合多肽,其與包含SEQ ID No:318所示的VH域氨基酸 序列的結(jié)合多肽結(jié)合于H)GFRi3上的相同表位。在一優(yōu)選實施方案中,結(jié)合多肽包含與選 自SEQ ID N0:318-368的VH域氨基酸序列享有至少80%氨基酸同一性(例如80%、81 %、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99%)的VH域氨基酸序列。
      [0016] 在另一方面,本發(fā)明提供結(jié)合多肽,其與包含如SEQ ID N〇:318所示的VH域氨基 酸序列的結(jié)合多肽競爭結(jié)合于H)GFRi3。在一優(yōu)選實施方案中,結(jié)合多肽包含與選自SEQ ID N0:318-368的VH域氨基酸序列享有至少80%氨基酸同一性的VH域氨基酸序列。
      [0017] 在某些實施方案中,本發(fā)明的結(jié)合多肽抑制roGFRii活性。在一實施方案中, roGFRii活性通過拮抗TOGF與roGFRii的結(jié)合來抑制。在另一實施方案中,roGFRii活性 通過拮抗roGFRii二聚化來抑制。
      [0018] 在某些實施方案中,本發(fā)明的結(jié)合多肽以小于100pM的Kd和/或以小于10?的 解離速率結(jié)合于roGFRe。
      [0019] 在某些實施方案中,本發(fā)明的結(jié)合多肽特異性結(jié)合于小鼠及人類roGFRii。
      [0020] 在某些實施方案中,本發(fā)明的結(jié)合多肽以小于5nM的IC50拮抗TOGF與roGFRii 的結(jié)合、以小于4nM的IC50抑制TOGFRP的配體誘導(dǎo)性酪氨酸磷酸化、以小于6nM的IC50 抑制視網(wǎng)膜周細胞遷移,和/或具有至少68°C的熔融溫度(Tm)。
      [0021] 在另一方面,本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的結(jié)合多肽的經(jīng)分離核酸。
      [0022] 在另一方面,本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明的結(jié)合多肽的經(jīng)分離核酸的重組表達載 體。
      [0023] 在另一方面,本發(fā)明提供表達本發(fā)明的結(jié)合多肽的宿主細胞。
      [0024] 在另一方面,本發(fā)明提供制造特異性結(jié)合于人類H)GFR0的結(jié)合多肽的方法,其 包括將能夠表達本發(fā)明的結(jié)合多肽的宿主細胞在使得所述宿主細胞產(chǎn)生結(jié)合多肽的條件 下進行培養(yǎng)。
      [0025] 在另一方面,本發(fā)明提供藥物組合物,其包含本發(fā)明的結(jié)合多肽及一種或更多種 藥學(xué)上可接受的載體(carrier)。
      [0026] 在另一方面,本發(fā)明提供用于治療疾病或病癥roGFRP相關(guān)疾病或病癥(例如年 齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)或癌癥)的方法,所述方法包括向有需要的受試者施用本發(fā)明的 藥物組合物。
      [0027] 在另一方面,本發(fā)明提供不成對VH域的多樣文庫,其中文庫各成員結(jié)合于人類 H)GFRi3。在一優(yōu)選實施方案中,文庫各成員包含SEQ ID NO: 1所示的⑶R3氨基酸序列及 在于FR1-FR3區(qū)域的多樣性。在一優(yōu)選實施方案中,文庫為核酸展示文庫(例如DNA展示 文庫)。
      [0028] 在另一方面,本發(fā)明提供穩(wěn)定VH/VL對的多樣文庫,其中文庫各成員結(jié)合于人類 H)GFRi3。在一優(yōu)選實施方案中,文庫各成員包含VH域,所述VH域包含SEQ ID N0:1所示 的CDR3氨基酸序列。在一優(yōu)選實施方案中,VL域為人類VL域。在一優(yōu)選實施方案中,文 庫為核酸展示文庫(例如DNA展示文庫)。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0029] 圖1為用于所公開方法的示范性VH域核酸展示文庫構(gòu)建的示意圖。
      [0030] 圖2描繪量測XB1511VH域、未經(jīng)選擇的XB1511⑶R3/構(gòu)架改組DNA展示文庫(R0) 及XB1511⑶R3/構(gòu)架改組DNA展示文庫池在四輪選擇(R4)后與人類或小鼠 H)GFRi3的結(jié) 合的體外結(jié)合分析結(jié)果。
      [0031] 圖3描繪量測XB1511及構(gòu)架改組衍生物XB2202及XB2708與人類PDGFR0的結(jié) 合動力學(xué)的表面等離子體共振結(jié)合研究的結(jié)果。
      [0032] 圖4描繪量測XB2202與人類(A)及小鼠(B)H)GFRi3的結(jié)合動力學(xué)的表面等離子 體共振結(jié)合分析的結(jié)果。
      [0033] 圖5描繪量測XB2708與人類(A)及小鼠(B)H)GFRi3的結(jié)合動力學(xué)的表面等離子 體共振結(jié)合分析的結(jié)果。
      [0034] 圖6為用于所公開方法的示范性VL核酸展示文庫的構(gòu)建的示意圖。
      [0035] 圖7描繪量測包含自VH/VL成對DNA展示篩選的第二輪篩選池分離的VL域的 XB1511/VL scFv與人類TOGFRP的結(jié)合的ELISA分析的結(jié)果。
      [0036] 圖8描繪量測包含自VH/VL成對DNA展示篩選的第三輪篩選池分離的VL域的 XB1511/VL scFv與人類TOGFRP的結(jié)合的ELISA分析的結(jié)果。
      [0037] 圖9描繪量測包含自VH/VL成對DNA展示篩選的第二輪篩選池分離的VL域的 XB2202/VL scFv與人類TOGFRP的結(jié)合的ELISA分析的結(jié)果。
      [0038] 圖10描繪量測來自圖9中所示的XB1511/VL scFv的不成對VL域與人類TOGFRe 的結(jié)合的ELISA分析的結(jié)果。
      [0039] 圖11描繪量測35S Met標記的XB1511VH域及獲自VH/VL成對DNA展示篩選的含 XB1511的scFV與人類H)GFRi3的結(jié)合的溶液結(jié)合親和性研究的結(jié)果。
      [0040] 圖12描繪量測35S Met標記的XB2202VH域及獲自VH/VL成對DNA展示篩選的含 XB2202的scFV與人類H)GFRi3的結(jié)合的溶液結(jié)合親和性研究的結(jié)果。
      [0041] 圖13描繪量測在各種濃度的XB2202下TOGF-BB與H)GFRi3結(jié)合的動力學(xué)的表面 等離子體共振競爭結(jié)合分析的結(jié)果。
      [0042] 圖14描繪量測XB2708對周細胞遷移的抑制的體外細胞遷移分析的結(jié)果。
      [0043] 圖15描繪量測含XB1511的IgGl抑制人類包皮纖維母細胞遷移能力的無標記遷 移分析的結(jié)果。
      [0044] 圖16描繪量測XB2202VH域及XB2202/A4scFv在各種溫度下孵育后與人類 TOGFR β的結(jié)合的ELISA分析的結(jié)果。

      【具體實施方式】
      [0045] 本發(fā)明提供以高親和性特異性結(jié)合于靶抗原(例如人類抗原)的結(jié)合多肽(例如 抗體或其片段)。在一優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的結(jié)合多肽以高親和性結(jié)合于H)GFRi3 (例 如人類H)GFRi3)且抑制H)GFRi3活性。這樣的結(jié)合多肽尤其適用于治療H)GFRi3相關(guān)疾 病或病癥(例如年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD))。本發(fā)明亦提供結(jié)合多肽的文庫、藥物組合物、 以及編碼結(jié)合多肽的核酸、重組表達載體及用于制造這樣的結(jié)合多肽的宿主細胞。本發(fā)明 亦涵蓋使用本發(fā)明的結(jié)合多肽來檢測H)GFRi3及調(diào)節(jié)H)GFRi3活性的方法。
      [0046] I :定義
      [0047] 為使本發(fā)明可較容易地理解,首先定義某些術(shù)語。
      [0048] 如本文所用,術(shù)語"PDGFRii"指血小板源性生長因子受體β。本領(lǐng)域中熟 知H)GFRi3核苷酸及多肽序列。示范性人類H)GFRi3氨基序列闡述于GenBank保藏 GI :4505683中,且示范性小鼠 TOGFRP氨基序列闡述于GenBank保藏GI :226371752中。
      [0049] 如本文所用,術(shù)語"roGF"指血小板源性生長因子。本領(lǐng)域中熟知TOGF核苷酸及 多肽序列。示范性人類roGF氨基序列闡述于GenBank保藏GI:4505681中,且示范性小鼠 FOGF氨基序列闡述于GenBank保藏GI: 400744中。
      [0050] 如本文所用,術(shù)語"結(jié)合多肽"指含有抗體的抗原結(jié)合位點的全部或一部分(例如 重鏈和/或輕鏈可變域的全部或一部分,例如重鏈可變域的至少HCDR3)以使結(jié)合多肽特異 性識別靶抗原的多肽。結(jié)合多肽的非限制性實例包括抗體或其片段,及已變?yōu)榘贵w的 抗原結(jié)合位點的全部或一部分的免疫球蛋白樣域(例如纖連蛋白域)。
      [0051] 如本文所用,術(shù)語"抗體"指包含四條多肽鏈,即通過雙硫鍵互連的兩條重鏈(H) 鏈及兩條輕(L)鏈的免疫球蛋白分子,以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈包含重鏈可變區(qū) (縮寫為VH)及重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個域,即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈 可變區(qū)(縮寫為VL)及輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個域(CL1)。VH及VL區(qū)可進一步 細分成稱為互補決定區(qū)(CDR)的高變區(qū),穿插有稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)。
      [0052] 如本文所用,術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"包括特異性結(jié)合抗原以形成復(fù)合物的任 何天然存在的以酶促方式可獲得的合成或基因工程化的多肽或醣蛋白??贵w的抗原結(jié)合 片段可使用任何適合的標準技術(shù)例如源于完整抗體分子,所述標準技術(shù)諸如為蛋白水解消 化或重組遺傳工程化技術(shù),其涉及操作及表達DNA編碼抗體可變及任選的恒定域??乖Y(jié) 合部分的非限制性實例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab')2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段; (v)單鏈Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段;及(vii)由模擬抗體高變區(qū)(例如經(jīng)分離互補決定 區(qū)(CDR))的氨基酸殘基組成的最小識別單元。表述"抗原結(jié)合部分"亦涵蓋其它工程化的 分子,諸如雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)、四抗體(tetrabody)及微型抗體。
      [0053] 如本文所用,術(shù)語"VH域"及"VL域"分別指單一抗體可變重鏈及輕鏈域,其包含 FR(構(gòu)架區(qū))1、2、3及4及CDR(互補決定區(qū))1、2及3 (參見Kabat等人,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH 出版第 91-3242 期,Bethesda)。
      [0054] 如本文所用,術(shù)語"FR1-FR3"指涵蓋FR1、CDR2、FR2、CDR2及FR3但排除CDR3及 FR4區(qū)的VH區(qū)。
      [0055] 如本文所用,術(shù)語"不成對"指VH或VL分別未連接(共價或非共價)于互補VL或 VH域。
      [0056] 如本文所用,術(shù)語"互補VL或VH域"指分別與VH或VL域相聯(lián)以形成VH/VL對的 VL或VH域。
      [0057] 如本文所用,術(shù)語"VH/VL對"指單一 VH與單一 VL域的非共價二聚體,其中VL與 VH域以類似于在完整四聚免疫球蛋白分子中所觀察到的方式相聯(lián),且所述二聚體可特異性 結(jié)合于至少一種靶抗原。"穩(wěn)定VH/VL對"為不顯示取代基VH與VL域在生理條件下顯著解 離的VH/VL對。
      [0058] 如本文所用,術(shù)語"⑶R"或"互補決定區(qū)"意思是見于重鏈與輕鏈多肽兩者的可變 區(qū)內(nèi)的非連續(xù)的抗原結(jié)合位點。Kabat等人,J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)及Kabat 等人,Sequences of protein of immunological interest. (1991),及 Chothia 等人,J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)及MacCallum等人,J. Mol. Biol. 262:732-745(1996)已描述 了這些特定區(qū)域,其中所述定義包括當彼此相比較時氨基酸殘基的重迭或子集。闡述涵蓋 如上文引用的參考文獻各自所定義的CDR的氨基酸殘基以便比較。優(yōu)選地,術(shù)語"CDR"為 如Kabat基于序列比較所定義的⑶R。
      [0059] 如本文所用,術(shù)語"構(gòu)架(FR)氨基酸殘基"指免疫球蛋白鏈的構(gòu)架區(qū)中的那些氨 基酸。如本文所用,術(shù)語"構(gòu)架區(qū)"或"FR區(qū)"包括作為可變區(qū)的部分而非CDR(例如,使用 Kabat定義的CDR)的部分的氨基酸殘基。
      [0060] 如本文所用,術(shù)語"特異性結(jié)合于"指結(jié)合多肽以至少約1Χ1(Γ6Μ、1Χ1(Γ 7Μ、 1 X 1(Γ8Μ、1 X 1(Γ9Μ、1 X KT1qM、1 X 1(ΓηΜ、1 X 1(Γ12Μ或更多的Kd結(jié)合于抗原,和/或以比其對 非特異性抗原的親和性至少兩倍大的親和性結(jié)合于抗原的能力。然而應(yīng)了解,結(jié)合多肽能 夠特異性結(jié)合于兩種或更多在序列中相關(guān)的抗原。舉例而言,本發(fā)明的結(jié)合多肽可特異性 結(jié)合于人類與非人類(例如小鼠或非人類靈長動物)兩者的roGFRe。
      [0061] 如本文所用,術(shù)語"抗原"指由結(jié)合多肽所識別的結(jié)合位點或表位。
      [0062] 如本文所用,術(shù)語"核酸展示文庫"指任何技術(shù)上公認的體外無細胞表型-基因型 連接的展示,其包括(不限于)例如以下所示:美國專利第7, 195, 880號;第6, 951,725號; 第 7, 078, 197 號;第 7, 022, 479 號;第 6, 518, 018 號;第 7, 125, 669 號;第 6, 846, 655 號; 第 6, 281,344 號;第 6, 207, 446 號;第 6, 214, 553 號;第 6, 258, 558 號;第 6, 261,804 號; 第 6, 429, 300 號;第 6, 489, 116 號;第 6, 436, 665 號;第 6, 537, 749 號;第 6, 602, 685 號;第 6, 623, 926 號;第 6, 416, 950 號;第 6, 660, 473 號;第 6, 312, 927 號;第 5, 922, 545 號;及第 6, 348, 315號,及W02010/011944,所述專利均以全文引用的方式并入本文中。
      [0063] 如本文所用,術(shù)語"載體"意欲指能夠輸送其已連接的另一核酸的核酸分子。一種 類型的載體為"質(zhì)粒",其指可連接其它DNA區(qū)段的圓形雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體為病 毒載體,其中其它DNA區(qū)段可連接至病毒基因組。某些載體能夠在其被引入的宿主細胞(例 如,具有細菌復(fù)制起點的細菌載體,及游離型哺乳動物載體)中自體復(fù)制。其它載體(例如 非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞的基因組中,由此連同宿 主基因組一起復(fù)制。此外,某些載體能夠指導(dǎo)其可操作地連接到的基因的表達。這樣的載 體在本文中稱作"重組表達載體"(或簡稱"表達載體")。一般而言,表達載體在重組DNA 技術(shù)中的效用經(jīng)常呈質(zhì)粒形式。術(shù)語"質(zhì)粒"與"載體"可互換使用。然而,本發(fā)明意欲包 括這樣的表達載體的其它形式,諸如病毒載體(例如,復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及腺相 關(guān)病毒),其提供等效功能。
      [0064] 如本文所用,術(shù)語"宿主細胞"意欲指已引入重組表達載體的細胞。應(yīng)了解,此術(shù)語 不僅意欲指特定受試細胞,而且指這樣細胞的子代。因為后代中可能因突變或環(huán)境影響而 出現(xiàn)某些修改,所以此子代實際可能不與親本細胞相同,但仍包括于如本文所用的術(shù)語"宿 主細胞"的范疇內(nèi)。
      [0065] 如本文所用,術(shù)語"治療(treat) "、"治療的(treating) "、"治療(treatment) "指 本文所述的治療或預(yù)防措施。"治療"方法采用向受試者,例如患有FOGFRP相關(guān)疾病或病 癥(例如AMD)或易患此疾病或病癥的受試者施用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分,以預(yù)防、 治愈、延遲疾病或病癥或復(fù)發(fā)性疾病或病癥、降低其嚴重性,或改善其一種或更多種癥狀, 或以延長受試者存活期以超出無此治療時的預(yù)期存活期。
      [0066] 如本文所用,術(shù)語"TOGFRβ相關(guān)疾病或病癥"包括與TOGFRβ活性相關(guān)的疾病病 況和/或癥狀。示范性H)GFRi3相關(guān)疾病或病癥包括(但不限于)年齡相關(guān)的黃斑變性 (AMD)及癌癥。
      [0067] 如本文所用,術(shù)語"有效量"指當向受試者施用時足以實現(xiàn)如本文所述的H)GFRi3 相關(guān)疾病或病癥的治療、預(yù)后或診斷的結(jié)合多肽的量。治療有效量將視所治療的受試者及 疾病病狀、受試者體重及年齡、疾病病狀的嚴重性、施用方式等而變化,其可由本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員輕易確定。施用劑量可介于例如本發(fā)明的結(jié)合多肽的約lng至約10, 〇〇〇mg、約 1 μ g至約5, OOOmg、約lmg至約1,OOOmg、約10mg至約100mg范圍內(nèi)??烧{(diào)整給藥方案以提 供最佳治療反應(yīng)。有效量亦為結(jié)合多肽的任何毒性或有害作用(亦即副作用)均已減到最 小和/或有利效果更重要的量。
      [0068] 如本文所用,術(shù)語"受試者"包括任何人類或非人類動物。
      [0069] 如本文所用,術(shù)語"表面等離子體共振"指光學(xué)現(xiàn)象,其允許通過例如使用 BIAcore?系統(tǒng)(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)來 檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度變化來分析實時相互作用。
      [0070] 如本文所用,術(shù)語"KD"指特定結(jié)合多肽/抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。
      [0071] 如本文所用,術(shù)語"解離速率"指特定結(jié)合多肽/抗原相互作用的解離速率。
      [0072] 如本文所用,術(shù)語"表位"指在本發(fā)明的結(jié)合分子中與特異性抗原結(jié)合位點相互作 用的抗原決定簇。單一抗原可具有一個以上表位。因此,不同抗體可結(jié)合于抗原上的不同 區(qū)域且可具有不同生物作用。表位可為構(gòu)象的或線性的。構(gòu)象表位通過來自線性多肽鏈的 不同區(qū)段的空間并列氨基酸產(chǎn)生。線性表位為通過多肽鏈中相鄰氨基酸殘基產(chǎn)生的表位。
      [0073] II.結(jié)合多肽
      [0074] 在一方面,本發(fā)明提供包含VH域的結(jié)合多肽,其中作為經(jīng)分離域,VH域以小于約 200pM(例如約 200、190、180、175、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、80、75、70、 65、60、55、50、40、30、20、10、5 或 ΙρΜ 或更少)的 Kd 結(jié)合于抗原。
      [0075] 在另一方面,本發(fā)明提供特異性結(jié)合于H)GFRi3且抑制H)GFRi3活性的結(jié)合多肽 (例如,抗體或其抗原結(jié)合片段)。這樣的結(jié)合多肽尤其適用于治療H)GFRi3相關(guān)疾病或病 癥(例如年齡相關(guān)的黃斑變性或AMD)。
      [0076] -般而言,本發(fā)明的roGFRe結(jié)合多肽包含特異性結(jié)合于roGFRe的重鏈 ⑶R3(HCDR3)氨基酸序列。一種適用于本發(fā)明的結(jié)合多肽的非限制性HCDR3序列為如SEQ ID NO: 1 (HGGDRSY)所示的重鏈⑶R3氨基酸序列。在其它實施方案中,重鏈⑶R3序列為SEQ ID NO: 1的變體,其相對于SEQ ID NO: 1包含至少一個(例如一、二或三個)保守氨基酸取 代。
      [0077] 可合并特異性結(jié)合于TOGFR β的重鏈⑶R3氨基酸序列(例如SEQ ID NO: 1 (HGGDRSY)所示的CDR3氨基酸序列)的任何結(jié)合多肽均可用于本發(fā)明的結(jié)合多肽 中,包括(不限于)抗體或其片段,及免疫球蛋白樣域。適合的免疫球蛋白樣域包括(不 限于)纖連蛋白域(參見例如Koide等人,(2007),Methods Mol. Biol. 352:95-109,其 以全文引用的方式并入本文中)、DARPin(參見例如Stumpp等人,(2008)Drug Discov. Today 13(15-16):695-701,其以全文引用的方式并入本文中)、蛋白質(zhì)A的Z域(參見 Nygren等人,(2008)FEBS J. 275(11) :2668-76,其以全文引用的方式并入本文中)、脂 質(zhì)運載蛋白(Lipocalin)(參見,例如 Skerra 等人,(2008)FEBS 275(11) :2677-83, 其以全文引用的方式并入本文中)、Affilin(無對應(yīng)中譯文)(參見例如Ebersbach等 人,(2007) J. Mol. Biol. 372(1) : 172-85,其以全文引用的方式并入本文中)、Affitin(參 見例如 Krehenbrink 等人,(2008). J. Mol. Biol. 383 (5) : 1058-68,其以全文引用的方 式并入本文中)、Avimer(無對應(yīng)中譯文)(參見例如Silverman等人,(2005)Nat. Biotechnol. 23(12) : 1556-61,其以全文引用的方式并入本文中)、Fynomer (無對應(yīng)中譯 文)(參見例如Grabulovski 等人,(2007)J Biol Chem 282(5):3196-3204,其以全文引用 的方式并入本文中)及庫尼茲(Kunitz)域肽(參見,例如Nixon等人,(2006)Curr Opin Drug Discov Devel 9(2) :261-8,其以全文引用的方式并入本文中)·
      [0078] 在一優(yōu)選實施方案中,H)GFRi3結(jié)合多肽為抗體或其抗原結(jié)合片段,其包含VH域 和/或VL域。表1-4中闡述適用于本發(fā)明的示范性⑶R、VH及VL氨基酸序列。因此,在某 些實施方案中,結(jié)合多肽可包含HCDR3(SEQ ID N0:1)以及HCDR2和/或HCDR1序列,其獨 立地選自表1中所示的重鏈Η⑶R2或HCDR1序列中任一者。在某些實施方案中,本發(fā)明的 結(jié)合多肽可進一步包含輕鏈⑶R,其獨立地選自表2中所示的輕鏈⑶R1XDR2或⑶R3序列 中任一者。舉例而言,本發(fā)明的結(jié)合多肽可包含表3中所示的重鏈可變(VH)域中任一者, 任選地與表4中所示的輕鏈可變(VL)域中任一者配對。
      [0079] 表1 :示范性抗TOGFR β抗體的重鏈⑶R氨基酸序列
      [0080]

      【權(quán)利要求】
      1. 一種特異性結(jié)合于roGFRii的經(jīng)分離結(jié)合多肽,其包含SEQ ID N0:1所示的⑶R3序 列。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合多肽,其包含VH域,所述VH域包含SEQ ID NO: 1所示的 ⑶R3氨基酸序列。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合多肽,其中所述VH域進一步包含⑶R2,所述⑶R2包含 選自SEQ ID NO :2-32的氨基酸序列。
      4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合多肽,其中所述VH域進一步包含⑶R1,所述⑶R1包含 選自SEQ ID NO :33-62的氨基酸序列。
      5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)合多肽,其包含與選自SEQ ID NO: 318-368的VH域氨基酸 序列享有至少80%氨基酸序列同一性的VH域氨基酸序列。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)合多肽,其中所述VH域包含選自SEQ ID N0:318-368的氨 基酸序列。
      7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其包含VL域,所述VL域包含CDR3,所 述CDR3包含選自SEQ ID NO :63-147的氨基酸序列。
      8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合多肽,其中所述VL域進一步包含CDR2,所述CDR2包含 選自SEQ ID NO: 148-232的氨基酸序列。
      9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合多肽,其中所述VL域進一步包含⑶R1,所述⑶R1包含 選自SEQ ID NO:233-317的氨基酸序列。
      10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)合多肽,其包含與選自SEQ ID NO: 369-453的VL域氨基 酸序列享有至少80%氨基酸序列同一性的VL域氨基酸序列。
      11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)合多肽,其中所述VL域包含選自SEQ ID NO: 369-453的 氨基酸序列。
      12. -種結(jié)合多肽,其與包含SEQ ID No. 318所示的VH域氨基酸序列的結(jié)合多肽結(jié)合 于roGFRP上的相同表位。
      13. -種結(jié)合多肽,其與包含SEQ ID No. 318所示的VH域氨基酸序列的結(jié)合多肽競爭 結(jié)合于PDGFR3。
      14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的結(jié)合多肽,其包含VH域氨基酸序列,所述VH域氨基 酸序列與選自SEQ ID N0:318-368的VH域氨基酸序列享有至少80%氨基酸序列同一性。
      15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其抑制H)GFRi3的活性。
      16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的結(jié)合多肽,其中TOGFR β的活性通過拮抗TOGF與TOGFR β 的結(jié)合來抑制。
      17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的結(jié)合多肽,其中H)GFRi3的活性通過拮抗H)GFRi3二聚化 來抑制。
      18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其以小于250pM的Kd結(jié)合于 PDGFR β。
      19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其以小于ΙΟΟρΜ的Kd結(jié)合于 PDGFR β。
      20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其以小于ΚΓ3^1的解離速率結(jié)合于 PDGFR β。
      21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其特異性結(jié)合于小鼠及人類 PDGFR β。
      22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其以小于5ηΜ的IC50拮抗TOGF與所 述TOGFRP的結(jié)合。
      23. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其以小于4nM的IC50抑制H)GFRi3 的配體誘導(dǎo)性酪氨酸磷酸化。
      24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其以小于6nM的IC50抑制視網(wǎng)膜周 細胞遷移。
      25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其包含熔融溫度(Tm)為至少68°C的 VH域。
      26. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其為抗體。
      27. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽,其為scFv。
      28. -種經(jīng)分離核酸,其編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合多肽。
      29. -種重組表達載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求28所述的核酸。
      30. -種宿主細胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求29所述的重組表達載體。
      31. -種產(chǎn)生特異性結(jié)合于人類TOGFRii的結(jié)合多肽的方法,其包括將根據(jù)權(quán)利要求 30所述的宿主細胞在使得所述宿主細胞產(chǎn)生特異性結(jié)合于人類H)GFRi3的結(jié)合多肽的條 件下進行培養(yǎng)。
      32. -種藥物組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項所述的結(jié)合多肽及一種或 更多種藥學(xué)上可接受的載體。
      33. -種用于治療疾病或病癥H)GFRi3相關(guān)疾病或病癥的方法,所述方法包括向有需 要的受試者施用根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物組合物。
      34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法,其中所述疾病或病癥為年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD) 或癌癥。
      35. -種不成對VH域的多樣文庫,其中所述文庫的各成員結(jié)合于人類TOGFRe。
      36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的文庫,其中多樣性處于FR1-FR3區(qū)中,且其中所述文庫的各 成員包含SEQ ID NO: 1所示的⑶R3氨基酸序列。
      37. -種穩(wěn)定VH/VL對的多樣文庫,其中所述文庫的各成員結(jié)合于人類H)GFRi3。
      38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的文庫,其中所述文庫的各成員包含VH域,所述VH域包含 SEQ ID NO: 1所示的CDR3氨基酸序列。
      39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的文庫,其中所述VL域為人類VL域。
      40. 根據(jù)權(quán)利要求35至39中任一項所述的文庫,其中所述文庫為核酸展示文庫。
      41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的文庫,其中所述核酸展示文庫為DNA展示文庫。
      【文檔編號】C07K14/705GK104105708SQ201280068404
      【公開日】2014年10月15日 申請日期:2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月5日
      【發(fā)明者】陳巖, R·W·瓦格納, C·帕茲馬尼 申請人:X博迪生物科學(xué)公司
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