專利名稱：一種整合膜蛋白的多克隆抗體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種細菌表層黏附蛋白及其用途。
背景技術：
黏附是細菌與腸上皮細胞(IEC)相互作用的第一步，人腸道內(nèi)含有500-1000種 不同的微生物，尤其是結(jié)腸內(nèi)細菌的數(shù)量達到1012/g糞便，面臨著最高的細菌負荷。越來越多證據(jù)表明相對糞便內(nèi)的其它細菌，只有能同腸粘膜緊密連接及黏附的細菌才能影響人類的健康。乳酸桿菌作為一種非侵襲性的細菌，其在腸道內(nèi)的黏附、定植對抑制致病菌的定植、移位和感染，維護腸道黏膜屏障的完整性具有特別重要的意義。目前認為乳酸桿菌可識別宿主表面特異受體，而宿主表面的蛋白、糖蛋白和糖脂可能就是受體，其黏附過程的第一步是非特異性的，由菌體結(jié)構(gòu)所決定；第二步是在非特異性結(jié)合的基礎上，菌體特異性配體進一步與宿主細胞相應的受體之間特異性的結(jié)合。該配體通常是存在于細菌表面或分泌至細胞外的黏附活性分子，不但可以介導細菌對靶細胞的黏著，激發(fā)繼發(fā)于黏附的細胞內(nèi)信號傳導途徑；并且通過競爭抑制等機制阻斷具有類似配體結(jié)構(gòu)的病原菌的黏附活性。近來研究較多的黏附分子包括脂磷壁酸(LTA)、細胞外多糖(EPS)、細胞表層蛋白等，其中細胞表層蛋白起著關鍵性的作用。自從1994年Bernet MF在乳酸桿菌與致病菌之間對腸上皮細胞頂端受體競爭黏附實驗中，提出黏附成分可能是細菌表面的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，據(jù)此研制了含凍干培養(yǎng)上清成分的活菌制劑，臨床效果較單純活菌為優(yōu)，但黏附分子的本質(zhì)未闡明(Bernet MF等，Lactobacillus acidophilus LA I binds to Cultured intestinal cell Lines andinhibits cell attachment cell invasion by enterovirulen bacteria. Gut，1994 ;35
(4):483 - 9)。研究發(fā)現(xiàn)多種具有黏附特性的乳酸桿菌在通過化學及生物方法祛除或破壞表層蛋白后，其和宿主上皮的黏附能力也降低了。還有研究顯示單用L. crispatus的表層蛋白提取物也可以達到抑制腸致病性大腸桿菌對宿主上皮細胞的黏附的效果。由于表層的膜蛋白特有的親疏水性結(jié)構(gòu)所導致的生化純化及結(jié)構(gòu)功能分析的困難，使其相比可溶性蛋白，深入研究較少。受此影響，國內(nèi)外對細菌如乳酸桿菌同腸上皮黏附過程中的起作用的靶蛋白的報道尚少。因此，本領域非常有必要進一步研究細菌的黏附機制，找到與黏附相關的蛋白或黏附機制，用于微生物的改良或良種篩選等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種細菌表層黏附(又稱為“粘附”)蛋白及其用途。本發(fā)明的另一目的在于提供所述細菌表層黏附蛋白的特異性抗體。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種整合膜蛋白的用途，用于制備促進細胞黏附的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的整合膜蛋白是
(i)如SEQID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列的蛋白；
(ii)如SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白；
(iii)(i)或(ii)指定的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1_20個；較佳的1-10個；更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進細胞黏附功能的由(i)或(ii)衍生的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是細菌細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是乳酸菌細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的促進細胞黏附是促進細胞在消化道(特別是腸道)上的黏附性能。特別是，所述的促進細胞黏附是促進細胞與消化道上皮細胞的黏附。在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的蛋白，所述的蛋白是
(a)如SEQID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列的蛋白；
(b)Ca)指定的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-20個；較佳的1-10個；更佳地1_5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進細胞黏附功能的由(a)衍生的蛋白。在本發(fā)明的第三方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼所述的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸是通過SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示序列的引物從植物乳酸菌CGMCC NO. 1258基因組中擴增獲得。在本發(fā)明的第四方面，提供一種質(zhì)粒載體，它含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第五方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體；或其基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第六方面，提供一種所述的蛋白的制備方法，該方法包含
Ca)在適合表達的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細胞；
(b)從培養(yǎng)物中分離出所述的蛋白。在本發(fā)明的第七方面，提供一種促進細胞黏附的方法，所述方法包括使所述細胞重組表達整合膜蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供一種抑制細胞(如植物乳酸桿菌細胞)黏附的方法，所述方法包括利用特異性結(jié)合整合膜蛋白的抗體處理所述的細胞，從而封閉細胞中的整合月吳蛋白。在本發(fā)明的第九方面，提供一種抗體，所述的抗體特異性地結(jié)合所述的整合膜蛋白。在另一優(yōu)選例中所述的整合膜蛋白是
(i)如SEQID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列的蛋白；
(ii)如SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白；
(iii)(i)或(ii)指定的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1_20個；較佳的1-10個；更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進細胞黏附功能的由(i)或(ii)衍生的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是如下制備的用所述的整合膜蛋白免疫動物，從動物體內(nèi)分離多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的多克隆抗體如下制備用純化的所述的整合膜蛋白(優(yōu)選地加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化)免疫兔子(優(yōu)選通過多點注射)；免疫量600±200μ g每只每次；初次免疫14±3天后，每14±3天用純化的所述的整合膜蛋白加強免疫I次，免疫量是300±100 μ g每只每次，至少加強免疫2次；從兔血清中分離多克隆抗體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1.整合膜蛋白序列分析(TMHMM2分析)。其中，紅色區(qū)域為跨膜區(qū)域，紫色區(qū)域為膜外區(qū)域，藍色為膜內(nèi)區(qū)域。圖2a.表層蛋白的SDS-PAGE電泳，其中，泳道I表示Marker蛋白電泳結(jié)果；泳道2表不表層蛋白電泳結(jié)果。圖2b.表層蛋白的Western印跡(泳道3,4, 5)結(jié)果。圖3.表層黏附蛋白的表達和鑒定。A. L Plantarum CGMCC Nol258目的基因的PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定；其中，泳道1-7 分別是 Marker、PO、GBP、CD、IMP2, MP3)、IMPl 基因的電泳結(jié)果。B.表達蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果；其中，泳道1_7分別是Marker、GBP、
PO、CD、IMP2, MP3、IMPl蛋白的電泳結(jié)果。C. Western印跡鑒定黏附蛋白(HRP_mucin)的結(jié)果；其中，泳道1_7分別是Marker、GBP、PO、CD、IMP2, MP3、IMPl 蛋白的印跡結(jié)果。圖4. Western鑒定抗MP2抗體的靈敏度。其中，泳道1. Marker，泳道2.1MP2(Ipg),泳道 3.1MP2 (10pg)，泳道 4· IMP2 (IOOpg)0圖5.通過Wetern印跡驗證IMP2。其中泳道I為Marker,泳道2為全菌體黏附蛋白。圖6顯示了各試驗組的EPEC黏附率。圖7顯示了各試驗組的Lacto黏附率。圖8乳酸桿菌黏附蛋白的篩選過程。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)整合膜蛋白STY，特別是整合膜蛋白STY的MP2段是一種有助于細胞黏附的蛋白片段。基于上述發(fā)現(xiàn)，可利用該蛋白來改變細胞的黏附性能，如使得有益菌重組表達該黏附蛋白以促進其腸道黏附性能，或利用特異性封閉該黏附蛋白的試劑來抑制表達該種黏附蛋白的有害菌的腸道黏附性能。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，抗體的“特異性”是指抗體能結(jié)合于所述的整合膜蛋白STY蛋白片段；特別指那些能與哺乳動物整合膜蛋白STY或蛋白片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關抗原分子的抗體。整合膜蛋白或其生物活性片段
在分析植物乳酸桿菌表層蛋白的過程中，本發(fā)明人首次分離出一種整合膜蛋白，并且經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)該整合膜蛋白是乳酸桿菌細胞發(fā)揮黏附作用的重要蛋白，本發(fā)明人將之命名 為整合膜蛋白STY。在本發(fā)明中，所用的整合膜蛋白STY可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動物。此外，所述的整合膜蛋白STY也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術來生產(chǎn)重組整合膜蛋白STY。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的整合膜蛋白STY。任何適合的整合膜蛋白STY均可用于本發(fā)明。所述的整合膜蛋白STY包括全長的整合膜蛋白STY或其生物活性片段(或稱為活性片段)。較佳地，所述的整合膜蛋白STY的氨基酸序列可以與SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的整合膜蛋白STY的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。整合膜蛋白STY或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領域公知的技術，所述技術可以很容易地被實施，并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術使本領域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene,第四版，1987,The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224。任何一種整合膜蛋白STY的生物活性片段都可以應用到本發(fā)明中。在這里，整合膜蛋白STY的生物活性片段的含義是指作為一種蛋白，其仍然能保持全長的整合膜蛋白STY的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長整合膜蛋白STY的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長整合膜蛋白STY的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或 100% 的活性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的整合膜蛋白STY的生物活性片段具有SEQ ID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列或其的蛋白。經(jīng)驗證，整合膜蛋白STY 10的上述生物活性片段是發(fā)揮黏附特性的關鍵性區(qū)域，該片段保留了全長整合膜蛋白STY的全部生物活性，甚至比全長整合膜蛋白STY具有更優(yōu)異的生物活性。所述的整合膜蛋白STY的上述生物活性片段更易于被細胞重組表達。一旦分離獲得了所述蛋白的序列，就可以用重組法來大批量地獲得該蛋白。這通常是將其編碼基因克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到。此外，對于較短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關序列，人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的蛋白。
本發(fā)明還包括了編碼所述的整合膜蛋白STY的生物活性片段的分離的核酸，也可以是其互補鏈。編碼整合膜蛋白STY的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴增的方法獲得。在獲得了編碼所述的整合膜蛋白STY的生物活性片段的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞。最后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，通過分離純化得到所要的蛋白。本發(fā)明還包括了包含編碼所述整合膜蛋白STY的生物活性片段的核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達調(diào)控序列，以便于蛋白的表達。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。本領域的技術人員熟知的方法能用于構(gòu)建含整合膜蛋白STY編碼基因的序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、 體內(nèi)重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，含有編碼所述整合膜蛋白STY的生物活性片段核酸序列的重組細胞也包括在本發(fā)明中?！八拗骷毎卑ㄔ思毎驼婧思毎３Ｓ玫脑怂拗骷毎ù竽c桿菌、枯草桿菌等；例如可為大腸桿菌細胞(E. coli)，如大腸桿菌HMS174 (DE3)、或BL21 (DE3)。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的“宿主細胞”是一類有益菌(如益生菌)細胞，包括但不限于乳酸菌細胞。整合膜蛋白STY的用途
基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了整合膜蛋白STY或其生物活性片段的用途，用于制備促進細胞黏附的試劑。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的促進細胞黏附的方法包括使所述細胞重組表達整合膜蛋白STY。在得知了所述的整合膜蛋白STY的氨基酸序列之后，本領域人員可以方便地制備重組表達整合膜蛋白STY的細胞，這通常是將整合膜蛋白STY的編碼基因克隆入載體，再轉(zhuǎn)入所述細胞。將外源的整合膜蛋白STY的編碼基因?qū)氲剿黾毎麅?nèi)的方法是本領域人員熟知的。通常的方法是，獲得編碼所述的整合膜蛋白STY或其生物活性片段的基因序列，將其連入合適的表達載體，再轉(zhuǎn)入細胞。更具體的步驟是(i)提供一重組表達載體，該重組表達載體含有一基因表達盒，所述表達盒含有外源的整合膜蛋白STY或其生物活性片段的編碼基因；(ii)將(i)的重組表達載體轉(zhuǎn)化到細胞內(nèi)，從而使得所述細胞內(nèi)含有所述重組表達載體或者其基因組中整合有所述外源的整合膜蛋白STY。通過選擇合適的表達載體，或者在表達載體上選擇合適的啟動子或增強子等以促進整合膜蛋白STY的表達是本領域人員熟知的。由于全長的整合膜蛋白STY氨基酸序列特別長(含有多于1000個氨基酸)，蛋白表達效率通常不如相對氨基酸序列較短的蛋白。因此，優(yōu)選的是使細胞重組表達整合膜蛋白STY上決定黏附作用的關鍵區(qū)域。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，30使所述細胞重組表達具有整合膜蛋白STY的第455-755位氨基酸序列的蛋白，這將大大提高蛋白的表達效率。當所述的細胞穩(wěn)定地表達所述的整合膜蛋白STY后，所述的整合膜蛋白STY可起到促進細胞黏附，特別是促進細胞在腸道中黏附的作用。當所述的細胞是一種有益菌的細胞時，該有益菌在腸道中良好的黏附作用將有利于阻止一些腸道有害菌在腸道中的黏附，從而保障了腸道的健康。當需要抑制一些有害菌(表達所述整合膜蛋白STY的有害菌)的細胞黏附作用是，所述方法通常包括利用特異性封閉整合膜蛋白STY的試劑處理所述的細胞，從而封閉細胞中的整合膜蛋白STY。所述的特異性封閉整合膜蛋白STY的試劑優(yōu)選地例如是特異性結(jié)合整合膜蛋白STY的抗體(包括單克隆抗體和多克隆抗體)。結(jié)合整合膜蛋白STY的試劑
在得知了所述整合膜蛋白STY及其序列之后，可基于此來篩選或制備特異性封閉該整合膜蛋白STY的試劑，例如特異性結(jié)合整合膜蛋白STY的抗體。如利用所述整合膜蛋白STY制備一系列抗體，從這些抗體中找到結(jié)合特異性良好的可用于抑制整合膜蛋白STY，從而抑制相關細胞黏附作用的抗體。
在基于一些蛋白制備抗體的過程中，由于全長蛋白一般序列較長，制備特異性抗體的效率并不高，獲得的抗體經(jīng)常存在結(jié)合能力差、結(jié)合位點不確定等問題。因此需要針對相應蛋白找到其發(fā)揮相關作用的關鍵性位點，從而更有針對性地來制備抗體。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，基于整合膜蛋白STY上決20定黏附作用的關鍵區(qū)域來設計結(jié)合整合膜蛋白STY的試劑。例如，以具有所述整合膜蛋白STY上第455-755位氨基酸序列的蛋白片段作為抗原，來制備特異性抗體。所述的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的本發(fā)明的多肽可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達本發(fā)明的多肽的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人,Nature 256 ;495，1975 ;Kohler等人,Eur. J.Tmmunol · 6 :511,1976 ;Kohler 等人,Eur. J. Tmmunol · 6 :292,1976 ;Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, Ν· Υ· , 1981 )。多克隆抗體的生產(chǎn)可用本發(fā)明的多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明提供了一種多克隆抗體，所述的多克隆抗體特異性地結(jié)合所述的整合膜蛋白STY。所述的抗體是如下制備的用所述的整合膜蛋白STY免疫動物，從動物體內(nèi)分離多克隆抗體。更優(yōu)選地，所述的多克隆抗體如下制備用純化的所述的整合膜蛋白STY (優(yōu)選地加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化)免疫兔子(優(yōu)選通過多點注射);免疫量600±200μ g每只每次；初次免疫14±3天后，每14±3天用純化的所述的整合膜蛋白STY加強免疫I次，免疫量是300 ± 100 μ g每只每次，至少加強免疫2次；從兔血清中分離多克隆抗體。所述的多克隆抗體特異性良好，對于整合膜蛋白STY具有優(yōu)異的封閉效果，且對于整合膜蛋白STY以外的其它蛋白不發(fā)生交叉結(jié)合。篩選調(diào)節(jié)細胞黏附的潛在物質(zhì)的方法
在得知了所述的整合膜蛋白STY對于調(diào)節(jié)細胞黏附的用途后，可以基于該特征來篩選調(diào)節(jié)整合膜蛋白STY的表達或活性，從而調(diào)節(jié)細胞黏附作用的物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供一種篩選可用于調(diào)節(jié)細胞黏附作用的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達整合膜蛋白STY (或其生物活性片段，如具有整合膜蛋白STY第455-755位氨基酸序列的蛋白)的體系接觸；和檢測候選物質(zhì)對整合膜蛋白STY的影響；若所述候選物質(zhì)可提高整合膜蛋白STY的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于促進細胞黏附的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低整合膜蛋白STY的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于抑制細胞黏附的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到整合膜蛋白STY表達或活性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達整合膜蛋白STY的體系。所述的體 系包括(但不限于)溶液體系、亞細胞體系、細胞體系、組織體系、器官體系、或動物體系。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于調(diào)節(jié)細胞黏附作用真正有用的物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于調(diào)節(jié)細胞黏附的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谡{(diào)節(jié)細胞黏附真正有用的物質(zhì)。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
(O首次發(fā)現(xiàn)整合膜蛋白STY是一種有助于細胞黏附的蛋白，具有良好的促進細胞黏附的作用。(2)首次鑒定出了所述整合膜蛋白STY上發(fā)揮黏附作用的關鍵區(qū)域，即該整合膜蛋白STY氨基酸序列的第455-755位，找到了抑制黏附的靶點，從而有利于設計特異性針對整合膜蛋白STY上該氨基酸區(qū)域的阻止黏附作用的試劑。3)利用所述的整合膜蛋白STY，可方便地改變特定細胞的黏附特性，產(chǎn)業(yè)應用價值不可估量。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。1.材料與方法 材料
植物乳酸桿菌(Lactobacillus pi ant arum CGMCC NO. 1258)獲自交大昂立微生物研究所。超速離心機購自Beckman公司。Mucin購自sigma公司。蛋白Marker及生物素標記Marker購自吉泰公司。表達質(zhì)粒pET16b購自Novagen公司，并且通過常規(guī)方法在其多克隆位點添加了 BglII和XhoI酶切位點。限制性內(nèi)切酶、連接酶、及Taq DNA聚合酶和IPTG均購自MBI公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒AXgen和HRP標記的山羊抗鼠IgG購于北京中杉生物工程公司。植物乳酸桿菌的培養(yǎng)和表層蛋白的提取
將植物乳酸桿菌CGMCC NO. 1258接種于新鮮配置的MRS液體培養(yǎng)基，37°C 200轉(zhuǎn)/hr培養(yǎng)24hr。將菌液3500g、4°C離心20min，去除上清，再用PBS混勻3500g，4°C離心20min，去除上清后加入2M鹽酸胍室溫200轉(zhuǎn)/hr，3小時。將菌液6000g，4°C離心20min取上清液置半透膜內(nèi)O. OlM的PBS透析過夜，加入離心管放進4°C超速離心機40000g，離心60min,小心抽去上清。沉淀溶于O.1M的PBS,放于70°C恒溫水槽孵育30min, 16 OOOg,4°C離心20min,上清液移出后即可進行后續(xù)Western印跡操作。對黏蛋白作辣根過氧化酶(HRP )標記
根據(jù) Rojas.M 的方法(Rojas M 等；Purification and characterization of asurface protein from Lactobacillus fermentum 104R that binds to porcine small10 intestinal mucus and gastric mucin. Appl Environ Microbiol2002 ；68 (5):2330-6)，取黏蛋白溶解于0. lmol/L碳酸鹽緩沖液中(PH9. 5)，配置成4mg/ml的黏蛋白溶液。將辣根過氧化物酶(HRP)8mg溶解于2ml蒸餾水中，配置成HRP溶液，然后加入至400 μ I新鮮配置的0. lmol/L過碘酸鈉溶液中，混合物室溫下攪拌20min，然后置于0. 001mol/L(PH4. 4)乙酸鹽緩沖液中，4°C透析過夜。取出透析后的HRP，加入0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液中(PH9. 5)20 μ I調(diào)節(jié)PH至9. 0-9. 5，取Iml黏蛋白和Iml HRP溶液混合，置于室溫下混合攪拌2h,然后加入新鮮配置的4mg/L硼氫化鈉溶液100 μ I以去除連接反應?；旌弦褐糜?.1 mol/L (PH7. 4)的硼酸緩沖液中4°C透析過夜，標記好的黏蛋白等體積加入80%甘 油，-20°C保存。表層蛋白的Western印跡分析
表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，采用10%分離膠和5%濃縮膠的不連續(xù)濃度梯度，恒壓60V30min，后改120V 90min。電泳完畢后，部分膠用考馬斯亮藍進行染色，另一部分膠移至電轉(zhuǎn)膜儀上，100V 120min，用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，根據(jù)同細菌表面黏附蛋白可以同黏蛋白特異性結(jié)合的原理，加入I 600稀釋的HRP標記的粘蛋白作為抗體，同PVDF膜上的相關蛋白進行雜交，4°C孵育過夜，TBST洗膜3次，每次30分鐘，ECL顯色檢測目的蛋白。LC-MS/MS
根據(jù)Western印跡結(jié)果，選取PAGE膠上蛋白條帶，通過液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)測定氨基酸序列，并通過Sequest軟件做初步分析。根據(jù)質(zhì)譜分析的結(jié)果，通過蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件(Trans-proteomics Pipeline,TPP)軟件包及FASTA軟件進一步篩選分析相關蛋白。初篩蛋白基因的克隆
MS結(jié)果發(fā)現(xiàn)相關蛋白可能是(I) A型GTP結(jié)合蛋白(GTP-Binding Protein TypA,GBP) ； (2)丙酮酸氧化酶(Pyruvate Oxidase, PO) ； (3)細胞分裂激活蛋白(Cell Divisioninitiation protein FtsQ, CD) ; (4)整合膜蛋白(Integral Menbrane Protein, IMP) ； (5)后期能力蛋白(Late Competence Protein, LCP)。分別對其進行克隆和表達(見表I);應用expasy (http://cn. expasy. org/)中的TMHMM工具,顯示跨膜區(qū)。并根據(jù)蛋白質(zhì)序列分析對整合膜蛋白的膜外部分作分段表達(見圖1)。以Genbank中各蛋白對應的基因序列為模板，設計引物，通過PCR反應獲取相應的基因產(chǎn)物。反應程序為基因組DNA經(jīng)94°C變性3分鐘；隨后按94°C 30秒，550C 30秒，72°C 2分鐘進行30個循環(huán)；最后72°C 10分鐘。PCR結(jié)束后1%瓊脂糖電泳鑒定。表1. PCR 引物
權利要求
1.一種整合膜蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，用整合膜蛋白免疫動物，從動物體內(nèi)分離多克隆抗體，其中，所述的整合膜蛋白是 (i)如SEQID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列的蛋白；或 (ii)如SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白；或 (iii)(i)或(ii)指定的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進細胞黏附功能的由(i)或(ii)衍生的蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的動物為家兔、小鼠或大鼠。
3.根據(jù)權利要去2所述的制備方法，其特征在于，用純化的所述的整合膜蛋白免疫兔子；免疫量600 ±200 u g每只每次；初次免疫14±3天后，每14±3天用純化的所述的整合膜蛋白STY加強免疫I次，免疫量是300 ± 100 u g每只每次，至少加強免疫2次；從兔血清中分離多克隆抗體。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的制備方法，其特征在于，所述的整合膜蛋白在免疫動物之前，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化。
5.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述氨基酸殘基為1-20個。
6.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述氨基酸殘基為1-10個。
7.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述氨基酸殘基為1-5個。
8.—種如權利要求1所述制備方法制備的整合膜蛋白的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細菌表層黏附蛋白及其用途。本發(fā)明公開了一種整合膜蛋白STY的用途，用于制備促進細胞黏附的試劑。本發(fā)明還公開了利用所述整合膜蛋白STY改變細胞黏附特性的方法。本發(fā)明還公開了所述整合膜蛋白STY的特異性抗體。
文檔編號C07K16/06GK103012585SQ20131000799
公開日2013年4月3日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權日2008年12月25日
發(fā)明者秦環(huán)龍, 沈通一 申請人:上海市第六人民醫(yī)院