專利名稱：一種洋蔥成骨肽的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于保健品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提取洋蔥成骨肽的方法，用于高效、高質(zhì)、無(wú)污染地提取洋蔥成骨肽，所得洋蔥成骨肽能有效改善骨質(zhì)疏松癥狀并能預(yù)防骨質(zhì)疏松的發(fā)展。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種系統(tǒng)性骨病，以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨胳疾病。世界衛(wèi)生組織發(fā)出警告骨質(zhì)疏松癥已緊隨心血管疾病之后，成為第二個(gè)威脅人類健康的主要疾病。據(jù)調(diào)查，目前我國(guó)I. 5億60歲以上老年人群約有9000萬(wàn)骨質(zhì)疏松患者(占60%)，60-69歲發(fā)病率女性為50%-70%，男性為30%。骨質(zhì)疏松癥最大的危害是易導(dǎo)致骨折，尤其是中老年人髖部骨折，多數(shù)都不能自理需人照顧，死亡率約為15%。骨質(zhì)疏松癥是一種多因素所致的慢性疾病，內(nèi)分泌失調(diào)、營(yíng)養(yǎng)不良、年齡增加、遺傳因素、煙酒、藥物及疾病均會(huì)引發(fā)骨質(zhì)疏松癥。究其發(fā)病機(jī)制是骨吸收增強(qiáng)和/或骨形成不足導(dǎo)致的骨礦含量下降、骨密度下降。骨骼有兩種主要細(xì)胞一即成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。骨的代謝過(guò)程，在人30歲前伴人的成骨細(xì)胞成骨過(guò)程占優(yōu)勢(shì)因此生長(zhǎng)發(fā)育是以合成代謝為主，人體正常需要補(bǔ)充骨合成的原料鈣制劑。30歲后骨生長(zhǎng)發(fā)育處于相對(duì)穩(wěn)定階段，即成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞處于平衡。這階段維持骨代謝的正常，必須補(bǔ)充正常每日丟失的鈣量。60歲以后人的骨代謝以破骨細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，每天鈣質(zhì)大量丟失，如不能有效補(bǔ)充鈣劑并在骨質(zhì)上沉積就必然產(chǎn)生骨質(zhì)疏松。一直以來(lái)，人們把骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防與治療的重點(diǎn)放在補(bǔ)鈣上，但是鈣是否被體內(nèi)吸收卻是問(wèn)題的關(guān)鍵。增強(qiáng)骨密度是骨細(xì)胞的成骨過(guò)程，作為成骨的原料需要可被體內(nèi)迅速吸收的鈣，還需要補(bǔ)充作為骨基質(zhì)膠原蛋白，以及促進(jìn)鈣吸收與利用的細(xì)胞因子——成骨肽。我們從美國(guó)引進(jìn)最新研究成果，合作開發(fā)了新型防骨質(zhì)疏松補(bǔ)鈣產(chǎn)品。它采用現(xiàn)代
生物提取技術(shù)，從新鮮洋蔥中提取成骨肽-丙谷胱肽(Y -L-glutamyl-trans-S-1-prope
nyl-L-cysteine sulfoxide, GPCS)。丙谷胱肽為小分子寡肽,寡肽最大的優(yōu)點(diǎn)就是易于人體吸收，而且洋蔥成骨肽增加骨密度的這一功效起效快。丙谷胱肽是由丙酰、谷氨酰、半胱氨?；M成的三肽，是促鈣吸收劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，從洋蔥提取的丙谷胱肽能增加骨密度，比單純補(bǔ)鈣高達(dá) 33%[Li, F. &Muhlbauer, R. C. J. Bone Miner. Res. 14，1457 - 1465 (1999) ·]。目前對(duì)于洋蔥有效成分提取方法的發(fā)明專利多涉及洋蔥揮發(fā)油類物質(zhì)的提取，尚無(wú)涉及洋蔥成骨肽提取方法的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠防骨質(zhì)疏松的洋蔥成骨肽——丙谷胱肽的提取方法，該提取方法能夠高效、高質(zhì)、無(wú)污染地提取洋蔥成骨肽。 如未特殊說(shuō)明，本發(fā)明所有比例關(guān)系均為體積比。
本發(fā)明具體提供了一種洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于所述方法為采用低溫醇提工藝，制得洋蔥多肽粗提浸膏，將浸膏依次經(jīng)大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、Sephadex LH20色譜法分離提純，得到含有洋蔥成骨肽的多肽精提物，再經(jīng)冷凍干燥制得干粉保存。本發(fā)明所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于，具體步驟為A)、取新鮮洋蔥，洗凈、切塊、低溫干燥、粉碎；B)、對(duì)洋蔥粉進(jìn)行醇提得浸膏；C)、將浸膏用2 3倍水溶解,然后用與水同體積的有機(jī)溶劑萃取2 4次,濃縮水溶液得到洋蔥多肽粗提物I ;D)、將洋蔥多肽粗提物I上大孔樹脂色譜柱后，用50%乙醇洗脫至柱無(wú)色，洗脫液減壓回收乙醇得洋蔥多肽粗提物2，其中大孔樹脂為非極性或弱極性聚苯乙烯大孔樹脂；E)、將洋蔥多肽粗提物2上硅膠色譜柱后，用體積比為CHCL3 =MeOH H20=7:3:0. 5的洗脫液梯度洗脫，流速為2 3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf為0. 5 0. 6的洗脫液，減壓回收洗脫液得洋蔥多肽粗提物3 ；F)、將洋蔥多肽粗提物3上S印hadex LH20凝膠色譜柱，用CH3OH =H2O=I: I的洗脫液洗脫，流速為I 2ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf為0. 55的洗脫液，減壓濃縮得洋蔥多肽精提物，所述Sephadex LH20為羥丙基葡聚糖凝膠；

G )、洋蔥多肽精提物經(jīng)冷凍干燥制得干粉保存。本發(fā)明所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于洋蔥成骨肽在洋蔥中含量低，且肽類物質(zhì)在溫度高的條件下易破壞，所以在操作步驟B G時(shí)溫度應(yīng)低于80°C。本發(fā)明所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于步驟E和F的薄層色譜條件相同，展開劑優(yōu)選體積比為正丁醇水醋酸=4:5:1，顯色劑是5%硫酸乙醇液。本發(fā)明所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于在步驟C中所用的有機(jī)溶劑優(yōu)選乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、環(huán)己烷中的一種或兩種以上。本發(fā)明所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于在步驟D中所用的大孔樹脂色譜柱優(yōu)選為 HPD-100、D-IOI、AB-8、HP-200 或 HPD-300。本發(fā)明所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于所用洋蔥以紫皮洋蔥為佳。本發(fā)明所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于在醇提時(shí)，最優(yōu)選的方案為用與新鮮洋蔥等重量的體積濃度為70 90%的乙醇常溫浸泡2周，減壓回收乙醇得浸膏。加入70% 90%乙醇的目的是為了使洋蔥干粉更充分的溶解于溶劑中，因?yàn)檠笫[成骨肽一丙谷胱肽為小分子肽，是醇溶性的，能夠溶解于乙醇溶液中，同時(shí)該濃度的乙醇又可以沉淀水解蛋白酶等大分子蛋白質(zhì)，避免了其對(duì)丙谷胱肽的水解。本發(fā)明所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于步驟A所述低溫干燥的溫度應(yīng)低于80°C。洋蔥多肽提取效率計(jì)算洋蔥精制干粉％ (w/w)=(洋蔥精制干粉重量/新鮮洋蔥干燥粉末重量)X 100% ；本發(fā)明所述提取方法的提取效率約為4% 5%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)I)、本發(fā)明所述方法不產(chǎn)生有毒氣體和大量工業(yè)廢渣，無(wú)污染；
2)、全程低溫操作，不破壞目的成分，能夠高質(zhì)、高效的提取洋蔥成骨肽。


圖I洋蔥成骨肽提取流程示意圖；圖2實(shí)施例I洋蔥多肽粗提物3薄層色譜圖；圖3實(shí)施例I洋蔥多肽精提物薄層色譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I洋蔥成骨肽的提取流程示意圖如圖I所示，提取步驟如下A)、取新鮮紫皮洋蔥50kg，去皮洗凈，切塊，在低于80°C的條件下干燥，粉碎并過(guò)60目篩；B)、用50L濃度為75%的乙醇(體積濃度)常溫浸泡2周，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得浸膏IOkg ；C)、將浸膏用25L純凈水溶解，然后用25L 二氯甲烷萃取3次，將三次水層溶液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收二氯甲烷，得到洋蔥多肽粗提物I共6kg ;D)、將洋蔥多肽粗提物I上D-101大孔樹脂色譜柱，用50%乙醇(體積濃度，下同)洗脫至柱無(wú)色(約用50%乙醇30L)，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得洋蔥多肽粗提物2，約4kg;E)、將洋蔥多肽粗提物2上硅膠色譜柱，用體積比為CHCL3 =MeOH H20=7:3:0. 5的洗脫液梯度洗脫，流速為3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf為O. 5 O. 6的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得洋蔥多肽粗提物3，約3kg ；F)、將洋蔥多肽粗提物3上S印hadex LH20凝膠色譜柱，用體積比為CH3OH =H2O=I: I的洗脫液洗脫，流速為Iml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf約為O. 55的洗脫液，減壓濃縮得洋蔥多肽精提物，約2. 5kg ；G)、洋蔥多肽精提物經(jīng)冷凍干燥制得干粉保存，約2kg ； 步驟E和F的薄層色譜條件相同，展開劑是正丁醇水醋酸=4:5:1 (體積比)，顯色劑是5%硫酸乙醇液。洋蔥多肽提取效率計(jì)算洋蔥精制干粉％ (w/w) = (2kg/50kg) X 100%=4%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼喂大鼠洋蔥成骨肽干粉，以考查大鼠消耗洋蔥與骨量增加是否具有相關(guān)性飼喂雄性大鼠洋蔥成骨肽干粉Ig/天，連續(xù)飼喂4周，結(jié)果顯示，與對(duì)照組(正常飲食)相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠的骨礦含量增加17. 7±6. 4% (P < O. 05，n=6)，平均皮質(zhì)厚度增加14. 8±7. 6%，小梁骨的骨密度增加13. 5±3. 1% (P < O. 05)。具體數(shù)據(jù)見表I。實(shí)施例2洋蔥成骨肽的提取流程示意圖如圖I所示，提取步驟如下A)、取新鮮紫皮洋蔥50kg，去皮洗凈，切塊，在低于60°C的條件下干燥，粉碎并過(guò)60目篩； B)、用50L濃度為75%的乙醇常溫浸泡2周，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得浸膏10. 3kg ；C)、將浸膏用25L純凈水溶解，然后用25L氯仿萃取3次，將三次水層溶液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收氯仿，得到洋蔥多肽粗提物I共6. Ikg ；D)、將洋蔥多肽粗提物I上D-101大孔樹脂色譜柱，用50%乙醇洗脫至柱無(wú)色(約用50%乙醇30L)，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得洋蔥多肽粗提物2，約 4. 2kg ；E)、將洋蔥多肽粗提物2上硅膠色譜柱，用體積比為CHCL3 =MeOH H20=7:3:0. 5的洗脫液梯度洗脫，流速為2. 5ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf 為0. 5 0. 6的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得洋蔥多肽粗提物3，約3. Ikg ；F)、將洋蔥多肽粗提物3上S印hadex LH20凝膠色譜柱，用體積比為CH3OH =H2O=I: I的洗脫液洗脫，流速為I. 5ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf 約為0. 55的洗脫液，減壓濃縮得洋蔥多肽精提物，約2. 7kg ；G)、洋蔥多肽精提物經(jīng)冷凍干燥制得干粉保存，約2. Ikg ；步驟E和F的薄層色譜條件相同，展開劑是正丁醇冰醋酸=4:5:1 (體積比)，顯色劑是5%硫酸乙醇液。洋蔥多肽提取效率計(jì)算洋蔥精制干粉％ (w/w) = (2. lkg/50kg) X 100%=4. 2%。實(shí)施例3`洋蔥成骨肽的提取流程示意圖如圖I所示，提取步驟如下A)、取新鮮紫皮洋蔥50kg，去皮洗凈，切塊，在低于80°C的條件下干燥，粉碎并過(guò)60目篩；B)、用50L濃度為75%的乙醇常溫浸泡2周，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得浸膏9. 8kg ；C)、將浸膏用25L純凈水溶解，然后用25L 二氯甲烷萃取3次，將三次水層溶液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收二氯甲烷，得到洋蔥多肽粗提物I共5. 9kg ；D)、將洋蔥多肽粗提物I上AB-8大孔樹脂色譜柱，用50%乙醇洗脫至柱無(wú)色(約用50%乙醇30L)，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得洋蔥多肽粗提物2，約 4. Ikg ；E)、將洋蔥多肽粗提物2上硅膠色譜柱，用體積比為CHCL3 =MeOH H20=7:3:0. 5的洗脫液梯度洗脫，流速為3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf 為0. 5 0. 6的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低于80°C的水浴中回收乙醇，得洋蔥多肽粗提物3，約3kg ；F)、將洋蔥多肽粗提物3上S印hadex LH20凝膠色譜柱，用體積比為CH3OH =H2O=I: I的洗脫液洗脫，流速為Iml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf約為0. 55的洗脫液，減壓濃縮得洋蔥多肽精提物，約2. 6kg ；G)、洋蔥多肽精提物經(jīng)冷凍干燥制得干粉保存，約2. Ikg ；步驟E和F的薄層色譜條件相同，展開劑是正丁醇冰醋酸=4:5:1 (體積比)，顯色劑是5%硫酸乙醇液。洋蔥多肽提取效率計(jì)算洋蔥精制干粉％ (w/w) = (2. lkg/50kg) X 100%=4. 2%。表I洋蔥成骨肽干粉飼喂大鼠對(duì)骨密度的影響
權(quán)利要求
1.一種洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于所述方法為采用低溫醇提工藝，制得洋蔥多肽粗提浸膏，將浸膏依次經(jīng)大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、Sephadex LH20色譜法分離提純，得到含有洋蔥成骨肽的多肽精提物，再經(jīng)冷凍干燥制得干粉保存。
2.按照權(quán)利要求I所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于，具體步驟為 A)、取新鮮洋蔥，洗凈、切塊、低溫干燥、粉碎； B)、對(duì)洋蔥粉進(jìn)行醇提得浸膏； C)、將浸膏用2 3倍水溶解,然后用與水同體積的有機(jī)溶劑萃取2 4次,濃縮水溶液得到洋蔥多肽粗提物I ; D)、將洋蔥多肽粗提物I上大孔樹脂色譜柱后，用50%乙醇洗脫至柱無(wú)色，洗脫液減壓回收乙醇得洋蔥多肽粗提物2，其中大孔樹脂為非極性或弱極性聚苯乙烯大孔樹脂； E)、將洋蔥多肽粗提物2上硅膠色譜柱后，用體積比為CHCL3=MeOH H20=7:3:0. 5的洗脫液梯度洗脫，流速為2 3ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf為O. 5 O. 6的洗脫液，減壓回收洗脫液得洋蔥多肽粗提物3 ； F)、將洋蔥多肽粗提物3上S印hadexLH20凝膠色譜柱，用CH3OH =H2O=I: I的洗脫液洗脫，流速為I 2ml/分鐘，收集薄層色譜紫外光檢測(cè)Rf為O. 55的洗脫液，減壓濃縮得洋蔥多肽精提物，所述Sephadex LH20為羥丙基葡聚糖凝膠； G )、洋蔥多肽精提物經(jīng)冷凍干燥制得干粉保存。
3.按照權(quán)利要求2所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于在操作步驟B G時(shí)溫度低于80°C。
4.按照權(quán)利要求2所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于步驟E和F的薄層色譜條件相同，展開劑是體積比為正丁醇冰醋酸=4:5:1，顯色劑是5%硫酸乙醇液。
5.按照權(quán)利要求2所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于在步驟C中所用的有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、環(huán)己烷中的一種或兩種以上。
6.按照權(quán)利要求2所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于在步驟D中所用的大孔樹脂色譜柱為 HPD-100、D-IOI、AB-8、HP-200 或 HPD-300。
7.按照權(quán)利要求I 6任一所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于所用洋蔥為紫皮洋蔥。
8.按照權(quán)利要求2所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于在醇提時(shí)，用與新鮮洋蔥等重量的體積濃度為70 90%的乙醇常溫浸泡2周，減壓回收乙醇得浸膏。
9.按照權(quán)利要求2所述洋蔥成骨肽的提取方法，其特征在于步驟A所述低溫干燥的溫度低于80 °C。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠防骨質(zhì)疏松的洋蔥成骨肽——丙谷胱肽的提取方法，所述方法為采用低溫醇提工藝，制得洋蔥多肽粗提浸膏，將浸膏依次經(jīng)大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、Sephadex LH20色譜法分離提純，得到含有洋蔥成骨肽的多肽精提物，再經(jīng)冷凍干燥制得干粉保存。該方法不產(chǎn)生有毒氣體和大量工業(yè)廢渣，無(wú)污染；全程低溫操作，不破壞目的成分，能夠高質(zhì)、高效的提取洋蔥成骨肽。
文檔編號(hào)C07K1/16GK103214553SQ20131013184
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者張英杰, 高勁松 申請(qǐng)人:遼寧琦潤(rùn)生物科技有限公司