五味子中木脂素單體的提取分離制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種五味子中木脂素單體的提取分離制備方法：五味子藥材粉末經(jīng)CO2超臨界提取，得粗提物進(jìn)行第一次高速逆流色譜分離，以體積比2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成溶劑體系A(chǔ)，上相A為固定相A，下相A為流動(dòng)相A，制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙；將分離后的固定相A回收，作為待測(cè)樣品進(jìn)行第二次高速逆流色譜分離，以體積比1-10:0-4:0-9:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成溶劑體系B，上相B為固定相B，下相B為流動(dòng)相B，制得五味子甲素和五味子乙素。本發(fā)明采用超臨界流體提取結(jié)合高速逆流色譜分離的方法，提取后無(wú)需復(fù)雜的樣品處理即可直接用于后續(xù)單體的分離純化，提取分離步驟簡(jiǎn)單高效。
【專利說(shuō)明】五味子中木脂素單體的提取分離制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種快速高效的聯(lián)合制備方法從五味子中提取、分離純化木脂素單體成分。具體涉及用超臨界提取法結(jié)合高速逆流色譜法提取分離制備五味子中的單體成分。
【背景技術(shù)】
[0002]五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill或華中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的成熟果實(shí)。前者習(xí)稱“北五味子”，后者習(xí)稱“南五味子”。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。五味子性溫，味甘、酸，歸肺、心、腎經(jīng)。具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心的功效?？捎糜谥委熅每忍摯?、自汗盜汗、久瀉不止、津傷口渴、心悸、失眠多夢(mèng)等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明五味子具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保肝、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用。
[0003]五味子中含有木脂素、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、三萜及倍半萜等多種化學(xué)成分，其中木脂素為主要有效成分。木脂素類成分中含量較高的包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素等。隨著研究的深入，以上幾種主要的木脂素類成分均被證實(shí)具有良好的藥理活性，如五味子醇甲具有抗氧化、抗衰老、保肝等藥理作用，五味子甲素具有保肝等藥理活性，五味子乙素具有護(hù)肝、抗癌、抗病毒、抗?jié)?、抗氧化、神?jīng)保護(hù)等作用，因此，開(kāi)發(fā)一種快速、高效、低成本的制備方法對(duì)該類成分的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。
[0004]通過(guò)長(zhǎng)期研究，對(duì)五味子中總木脂素類成分的提取工藝已較為成熟，但對(duì)木脂素單體類成分的制備大多集中在五味子醇甲、五味子醇乙的分離純化上，而對(duì)五味子甲素、五味子乙素、五味子酯乙等單體的分離純化報(bào)道較少。文獻(xiàn)中有以溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法、酶解法輔助超聲波提取法、超高壓提取法等方法對(duì)五味子中木脂素類成分進(jìn)行提取，以硅膠柱色譜法、大孔樹(shù)脂柱色譜法、高速逆流色譜法對(duì)木脂素單體進(jìn)行分離的。大多提取分離 的流程是以回流法提取，采用一定的方法對(duì)木脂素進(jìn)行富集除雜，進(jìn)而再以柱色譜對(duì)其進(jìn)行分離純化。如申請(qǐng)?zhí)枮?01210144871.1的發(fā)明專利公開(kāi)了 “一種純化五味子醇甲的新方法”。采用微波逆流提取、大孔樹(shù)脂分離純化和柱層析進(jìn)一步純化，最終得到了五味子醇甲單體(含量98%以上)。如申請(qǐng)?zhí)枮?00910010631.0的發(fā)明專利中公開(kāi)了 “一種制備五味子醇甲和五味子醇乙的新工藝”，提取工藝為將含有五味子醇甲和五味子醇乙的提取液用有機(jī)溶劑萃取，萃取物經(jīng)過(guò)反復(fù)柱層析分離后，收集含有五味子醇甲和五味子醇乙的流份，得到純度均大于98%五味子醇甲和五味子醇乙。再如申請(qǐng)?zhí)枮?01010510828.3的發(fā)明專利中公開(kāi)了“一種從五味子中提取五味子甲素的工藝”，使用超聲輔助石油醚提取和堿醇反萃取的方法制備木脂素總提物，再兩次通過(guò)硅膠氧化鋁混合柱層析，洗脫，回收溶劑，石油醚-丙酮或環(huán)己烷-乙醇重結(jié)晶，干燥，最終獲得五味子甲素單體。
[0005]不難看出，五味子中木脂素單體的提取分離純化工藝存在步驟繁瑣，制備周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力，得率低等各種弊端。專利號(hào)為ZL200910242188.X的發(fā)明專利中公開(kāi)了一種“五味子單體成分的分離制備方法”，該專利較之前方法，純化步驟采用高速逆流色譜，使得純化周期得到了縮短，可同時(shí)制備多個(gè)木脂素單體。但樣品前處理繁瑣，需通過(guò)提取、萃取、硅膠柱層析等多步，使得整個(gè)制備過(guò)程仍較復(fù)雜。
[0006]超臨界流體萃取作為一種環(huán)保、快速、且可工業(yè)化的提取手段，目前正廣泛用于各種天然產(chǎn)物的提取中。五味子中的木脂素類成分極性較小，用該方法對(duì)其進(jìn)行提取具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)。如專利號(hào)為ZL200610041566.4、ZL201010119871.7的發(fā)明專利中均采用了超臨界流體萃取法提取五味子中的總木脂素類成分。但至今未有將超臨界提取與高速逆流色譜分離純化五味子中木脂素單體的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有工藝中的不足，提供一種從五味子藥材中聯(lián)合使用超臨界萃取和高速逆流色譜提取、分離純化木脂素單體五味子甲素、五味子乙素、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙的方法，該方法工藝簡(jiǎn)便，效率高，快速，產(chǎn)品純度大于92%。
[0008]本發(fā)明公開(kāi)了一種以超臨界流體萃取五味子藥材粉末，所得超臨界萃取物以高速逆流色譜進(jìn)行分離純化，最終可同時(shí)獲得純度高于92%的五味子甲素、五味子乙素、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙單體木脂素成分。這種方法較傳統(tǒng)的提取分離純化方法更為快速、簡(jiǎn)便、高效。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:[0010]一種五味子中木脂素單體的提取分離制備方法，所述方法為:10~65目的五味子藥材粉末經(jīng)CO2超臨界提取，制得五味子粗提物，五味子粗提物先進(jìn)行第一次高速逆流色譜分離，以體積比為2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系A(chǔ)，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相A為固定相A，下相A為流動(dòng)相A，取五味子粗提物，用上相A、下相A體積比1:1的混合溶劑溶解，作為供試品溶液進(jìn)樣，設(shè)定高速逆流色譜儀，轉(zhuǎn)速500~1000r/min，流動(dòng)相的流速0.1~10ml/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)180~400nm，分別收集紫外檢測(cè)光譜圖上各色譜峰的流出液、濃縮、干燥，分別制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙；將第一次高速逆流色譜分離后的固定相A取出回收，除去溶劑、干燥后，作為待測(cè)樣品進(jìn)行第二次高速逆流色譜分離，以體積比為1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系B，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相B為固定相B，下相B為流動(dòng)相B，將待測(cè)樣品用上相B、下相B體積比1:1的混合溶劑溶解，作為待測(cè)樣品溶液進(jìn)樣，設(shè)定高速逆流色譜儀，轉(zhuǎn)速500~1000r/min，流動(dòng)相的流速
0.1~10ml/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)180~400nm，分別收集紫外檢測(cè)光譜圖上各色譜峰的流出液、濃縮、干燥，分別制得五味子甲素和五味子乙素。
[0011]進(jìn)一步，優(yōu)選本發(fā)明所述方法包括以下步驟:
[0012](I)稱取五味子果實(shí)粉碎后過(guò)10~65目篩，得五味子藥材粉末，進(jìn)行CO2超臨界提取，提取溫度35~60°C，提取壓力14~30MPa，提取時(shí)間0.5~6h，制得五味子粗提物；
[0013](2)步驟(I)所得五味子粗提物進(jìn)行第一次高速逆流色譜分離，首先以體積比為2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系A(chǔ)，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相A為固定相A，下相A為流動(dòng)相A，取五味子粗提物，用上相A、下相A體積比1:1的混合溶劑溶解，作為供試品溶液，將固定相A充滿高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱,設(shè)定高速逆流色譜儀,在500~1000r/min轉(zhuǎn)速下，以0.1~10ml/min的流速注入流動(dòng)相A，以波長(zhǎng)180~400nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)明顯有流動(dòng)相流出時(shí)，取供試品溶液進(jìn)樣，根據(jù)紫外檢測(cè)器光譜圖，對(duì)分離的各個(gè)色譜峰的對(duì)應(yīng)流出液進(jìn)行收集，經(jīng)HPLC檢測(cè)，合并相同成分的流出液，濃縮、干燥，分別制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙；
[0014](3)將步驟(2)第一次高速逆流色譜分離后的固定相A取出回收，除去溶劑、干燥后，作為待測(cè)樣品進(jìn)行第二次高速逆流色譜分離，以體積比為1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系B，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相B為固定相B，下相B為流動(dòng)相B，將待測(cè)樣品用上相B、下相B體積比1:1的混合溶劑溶解，作為待測(cè)樣品溶液，將固定相B充滿高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱，設(shè)定高速逆流色譜儀，在500~1000r/min轉(zhuǎn)速下，以0.1~10ml/min的流速注入流動(dòng)相B,以波長(zhǎng)180~400nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)明顯有流動(dòng)相流出時(shí)，取待測(cè)樣品溶液進(jìn)樣，根據(jù)紫外檢測(cè)器光譜圖，對(duì)分離的各個(gè)色譜峰的對(duì)應(yīng)流出液進(jìn)行收集，經(jīng)HPLC檢測(cè)，合并相同成分的流出液，濃縮、干燥，分別制得五味子甲素和五味子乙素。
[0015]所述步驟(I)中，提取溫度優(yōu)選35~55°C。提取時(shí)間優(yōu)選I~4h。
[0016]所述的供試品溶液中含有的五味子粗提物的質(zhì)量與高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱的體積比為0.1~0.5:300g/ml。
[0017]所述的待測(cè)樣品溶液中含有的待測(cè)樣品的質(zhì)量與高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱的體積比通常為0.1~0.5:300g/ml。
[0018]所述步驟(2)中，所述流動(dòng)相A的流速優(yōu)選為I~3mL/min,更優(yōu)選1.8mL/min。
[0019]所述步驟(3)中，所述流動(dòng)相B的流速優(yōu)選為I~3mL/min,更優(yōu)選1.8mL/min。
[0020]所述步驟(2 )或步驟(3 )中，所述轉(zhuǎn)速優(yōu)選800r/min。
[0021]所述步驟(2)或步驟(3)中，所述紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選210_280nm，更優(yōu)選254nm。
[0022]所述步驟(2)或步驟(3)中，高速逆流色譜分離通常在常溫下進(jìn)行，優(yōu)選恒溫25。。。
[0023]本發(fā)明所述體積比為2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系A(chǔ)，其中乙酸乙酯、甲醇的組分比例中的O代表可以為0，即溶劑體系中可以不含有乙酸乙酯或甲醇。即所述高速逆流溶劑體系A(chǔ)可以為以下四種體系之一:
[0024](a)體積比為2-10:5的正己烷和水；
[0025](b)體積比為2-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、水，其中的O代表無(wú)限接近于O但不為O ;
[0026](c)體積比為2-10:0-10:5的正己烷、甲醇、水，其中的O代表無(wú)限接近于O但不為
O；
[0027](d)體積比為2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，其中的O代表無(wú)限接近于O但不為0.[0028]同樣的，所述體積比為1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系B，其中乙酸乙酯、甲醇的組分比例中的O代表可以為0，即溶劑體系中可以不含有乙酸乙酯或甲醇。即所述高速逆流溶劑體系B可以為以下四種體系之一:
[0029](i)體積比為1-10:1的正己烷和水；[0030](ii)體積比為1-10:0-5:1的正己烷、乙酸乙酯、7jC，其中的O代表無(wú)限接近于O但不為O ;
[0031](iii)體積比為1-10:0-10:1的正己烷、甲醇、水，其中的O代表無(wú)限接近于O但不為O ;
[0032](iv)體積比為1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，其中的O代表無(wú)限接近于O但不為O ;
[0033]較為優(yōu)選的，所述高速逆流溶劑體系A(chǔ)中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為
5~8:2 ~5:4 ~5:5，更優(yōu)選為 6:4:5:5、7:3:5:5、10:9:9:10 或 8:2:5:5。
[0034]較為優(yōu)選的，所述高速逆流溶劑體系B中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為2 ~4:1 ~2:2 ~4:1，更優(yōu)選為 7:3:7:3、6:4:7:3、7:3:8:2 或
所述將第一次高速逆流色譜分離后的固定相A取出回收，通常使用氮?dú)饣蚩諝鈱⒎蛛x柱中的固定相吹出收集即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知此技術(shù)。
[0036]本發(fā)明的有益效果在于:
[0037]1、首次采用超臨界流體技術(shù)結(jié)合高速逆流色譜法對(duì)五味子中的五種主要木脂素類成分(包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素)進(jìn)行提取、分離及純化。
[0038]2、采用的超臨界流體萃取技術(shù)不僅環(huán)保、快速，同時(shí)，對(duì)五味子中木脂素選擇性提取效果，有利于木脂素單體后續(xù)的分離純化。僅需一次提取即可直接用于后續(xù)單體的分離純化，提取步驟簡(jiǎn)單高效，比現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)化了前處理的提取步驟。
[0039]3、采用高速逆流色譜法進(jìn)行分離純化，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度較高。
[0040]4、該方法快速、高效、簡(jiǎn)便、低成本、環(huán)保，與現(xiàn)有技術(shù)相比，提取步驟簡(jiǎn)單，周期短，分離純化效率高，實(shí)現(xiàn)了技術(shù)創(chuàng)新和提升，對(duì)五味子中木脂素類成分的開(kāi)發(fā)研究起到了重要的借鑒作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041]圖1為本發(fā)明方法的工藝流程示意圖。
[0042]圖2為實(shí)施例6的高速逆流色譜圖，圖中峰I為五味子醇甲，峰2為五味子醇乙，峰3為五味子酯乙。
[0043]圖3為實(shí)施例6制得的五味子醇甲的HPLC色譜圖。
[0044]圖4為實(shí)施例6制得的五味子醇乙的HPLC色譜圖。
[0045]圖5為實(shí)施例6制得的五味子酯乙的HPLC色譜圖。
[0046]圖6為實(shí)施例9的高速逆流色譜圖，圖中峰4為五味子甲素，峰5為五味子乙素。
[0047]圖7為實(shí)施例9制得的五味子甲素的HPLC色譜圖。
[0048]圖8為實(shí)施例9制得的五味子乙素的HPLC色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
[0050]實(shí)施例1:超臨界流體提取[0051 ] 取北五味子果實(shí)，粉碎，得五味子藥材粉末，粒徑為50~65目，取五味子藥材粉末2g，放入超臨界流體萃取罐，提取溫度40°C，提取壓力25MPa，CO2流量為2L/min，提取時(shí)間為lh，得五味子粗提物。以五味子醇甲為代表，計(jì)算其提取率為0.5294%。
[0052]實(shí)施例2:超臨界流體提取
[0053]取北五味子果實(shí)，粉碎，得五味子藥材粉末，粒徑為10~20目，取五味子藥材粉末3g，放入超臨界流體萃取罐，提取溫度35°C，提取壓力14MPa，CO2流量為2L/min，提取時(shí)間為2h，得五味子粗提物。以五味子醇甲為代表，計(jì)算其提取率為0.3926%。
[0054]實(shí)施例3:超臨界流體提取
[0055]取北五味子果實(shí)，粉碎，得五味子藥材粉末，粒徑為50~65目，取五味子藥材粉末3g，放入超臨界流體萃取罐，提取溫度35°C，提取壓力30MPa，CO2流量為2L/min，提取時(shí)間為2h，得五味子粗提物。以五味子醇甲為代表，計(jì)算其提取率為0.6001%。
[0056]實(shí)施例4:超臨界流體提取
[0057]取北五味子果實(shí)，粉碎，得五味子藥材粉末，粒徑為50~65目，取五味子藥材粉末3g，放入超臨界流體萃取罐，提取溫度55°C，提取壓力25MPa，CO2流量為2L/min，提取時(shí)間為2h，得五味子粗提物。以五味子醇甲為代表，計(jì)算其提取率為0.5650%。
[0058]實(shí)施例5:超臨界流體提取工藝
[0059]取北五味子果實(shí)，粉碎，得五味子藥材粉末，粒徑為20~40目，取五味子藥材粉末3kg，放入超臨界流體萃取罐，提取溫度36°C，提取壓力15MPa，CO2流量為40±5kg/h，提取時(shí)間為4h，得五味子粗提物。以五味子醇甲為代表，計(jì)算其提取率為0.2806%。
[0060]實(shí)施例6:第一次高速逆流色譜分離純化
[0061]取五味子粗提物(以實(shí)施例5中提取工藝制備所得提取物)300mg，溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體積比為6:4:5:5，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，五味子粗提物300mg用上下相各7mL溶解，作為供試品溶液。以溶劑體系的上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相。將固定相充滿高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱，分離柱的柱體積為300ml，設(shè)定高速逆流色譜儀，流動(dòng)相流速1.8mL/min,離心分離儀轉(zhuǎn)速800rpm，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，恒溫循環(huán)水箱25°C。當(dāng)明顯有流動(dòng)相流出時(shí)，取供試品溶液進(jìn)樣，根據(jù)紫外檢測(cè)器光譜圖，如圖2所示，峰1為五味子醇甲，峰2為五味子醇乙，峰3為五味子酯乙。對(duì)分離的各個(gè)色譜峰的對(duì)應(yīng)流出液進(jìn)行收集，用HPLC檢測(cè)，合并相同成分的流出液，減壓濃縮，冷凍干燥，分別得到五味子醇甲23.2mg,五味子醇乙2.3mg,五味子酯乙1.4mg,用高效液相色譜對(duì)三種分離產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，純度分別為98.61%、99.03%、94.30%，HPLC色譜圖分別如圖3_5所示。高效液相色譜的檢測(cè)條件是:乙腈-水體系，梯度洗脫(O~lOmin，45%~58%乙腈；10~15min，58% ~60% 乙腈；15 ~25min，60% ~70% 乙腈；25 ~35min，70% ~75% 乙腈；35 ~45min，75%~95%乙腈；45~50min, 95%~100%乙腈)，進(jìn)樣量為10 μ L，流動(dòng)相流速為lmL/min,柱溫為30°C,檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm,洗脫時(shí)間為68min。色譜柱為:phenomenex Gemini C18,250 X 4.6mm，5 μ m。
[0062]實(shí)施例7:第一次高速逆流色譜分離純化
[0063]取五味子粗提物(以實(shí)施例5中提取工藝制備所得提取物)300mg，用溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(8:2:5:5, v/v)上下相各7mL溶解。其他操作條件同實(shí)施例6。所獲得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙組分，減壓濃縮，冷凍干燥，得到五味子醇甲19.lmg，五味子醇乙1.9mg，五味子酯乙1.0mg，純度分別為95.36%,95.24%,92.87%。
[0064]實(shí)施例8:第一次高速逆流色譜分離純化
[0065]取五味子粗提物(以實(shí)施例5中提取工藝制備所得提取物)250mg，用溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10:9:9:10，v/v)上下相各7mL溶解。其他操作條件同實(shí)施例
6。所獲得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙組分，減壓濃縮，冷凍干燥，得到五味子醇甲13.lmg，五味子醇乙3.3mg，五味子酯乙0.9mg，純度分別為98.50%,94.89%,93.44%。
[0066]實(shí)施例9:第二次高速逆流色譜分離純化
[0067]按照實(shí)施例6方法分離兩次，用空氣吹出固定相，合并兩次實(shí)例6分離后所得固定相，除去溶劑，干燥作為待測(cè)樣品，備用。溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體積比7:3:7:3，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相。待測(cè)樣品113mg用上下相各7mL溶解，得待測(cè)樣品溶液。其他色譜的操作條件同實(shí)施例6。當(dāng)明顯有流動(dòng)相流出時(shí)，取待測(cè)樣品溶液進(jìn)樣，根據(jù)紫外檢測(cè)器光譜圖，如圖6所示，峰4為五味子甲素，峰5為五味子乙素。對(duì)分離的各個(gè)色譜峰的對(duì)應(yīng)流出液進(jìn)行收集，經(jīng)HPLC檢測(cè)，合并相同成分的流出液，經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥，得到五味子甲素2.5mg，五味子乙素3.lmg，用高效液相色譜對(duì)兩種分離產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，純度分別為97.22%,95.28%，HPLC色譜圖分別如圖7-8所示。
[0068]實(shí)施例10:第二次高速逆流色譜分離純化
[0069]按照實(shí)施例6方法分離兩次，用空氣吹出固定相，合并兩次實(shí)例6分離后所得固定相，除去溶劑，干燥作為待測(cè)樣品，備用。待測(cè)樣品119mg用溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(6:4:7:3, v/v)上下相各7mL溶解。其他色譜操作條件同實(shí)施例9。所獲得五味子甲素、五味子乙素組分，減壓濃縮，冷凍干燥，得到五味子甲素2.1mg,五味子乙素3.3mg,純度分別為 95.59%、95.97%。
[0070]實(shí)施例11:第二次高速逆流色譜分離純化
[0071]按照實(shí)施例6方法分離兩次，用氮?dú)獯党龉潭ㄏ?，合并兩次?shí)例6分離后所得固定相，除去溶劑，干燥作為待測(cè)樣品，備用。待測(cè)樣品109mg用溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7:3:8:2, v/v)上下相各7mL溶解。其他色譜操作條件同實(shí)施例8。所獲得五味子甲素、五味子乙素組分，減壓濃縮，冷凍干燥，得到五味子甲素1.9mg,五味子乙素2.9mg,純度分別為 93.59%、92.07%。
【權(quán)利要求】
1.一種五味子中木脂素單體的提取分離制備方法，其特征在于所述方法為:10~65目的五味子藥材粉末經(jīng)CO2超臨界提取，制得五味子粗提物，五味子粗提物先進(jìn)行第一次高速逆流色譜分離，以體積比為2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系A(chǔ)，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相A為固定相A，下相A為流動(dòng)相A，取五味子粗提物，用上相A、下相A體積比1:1的混合溶劑溶解，作為供試品溶液進(jìn)樣，設(shè)定高速逆流色譜儀，轉(zhuǎn)速500~1000r/min，流動(dòng)相的流速0.1~10ml/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)180~400nm，分別收集紫外檢測(cè)光譜圖上各色譜峰的流出液、濃縮、干燥，分別制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙；將第一次高速逆流色譜分離后的固定相A取出回收，除去溶劑、干燥后，作為待測(cè)樣品進(jìn)行第二次高速逆流色譜分離，以體積比為1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系B，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相B為固定相B，下相B為流動(dòng)相B，將待測(cè)樣品用上相B、下相B體積比1:1的混合溶劑溶解，作為待測(cè)樣品溶液進(jìn)樣，設(shè)定高速逆流色譜儀，轉(zhuǎn)速500~1000r/min，流動(dòng)相的流速0.1~10ml/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)180~400nm，分別收集紫外檢測(cè)光譜圖上各色譜峰的流出液、濃縮、干燥，分別制得五味子甲素和五味子乙素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于本發(fā)明所述方法包括以下步驟: (1)稱取五味子果實(shí)粉碎后過(guò)10~65目篩，得五味子藥材粉末，進(jìn)行CO2超臨界提取，提取溫度35~60°C，提取壓力14~30MPa，提取時(shí)間0.5~6h，制得五味子粗提物； (2)步驟(I)所得五味子粗提物進(jìn)行第一次高速逆流色譜分離，首先以體積比為2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系A(chǔ)，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相A為固定相A，下相A為流動(dòng)相A，取五味子粗提物，用上相A、下相A體積比1:1的混合溶劑溶解，作為供試品溶液，將固定相A充滿高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱,設(shè)定高速逆流色譜儀,在500~1000r/min轉(zhuǎn)速下，以0.1~10ml/min的流速注入流動(dòng)相A，以波長(zhǎng)180~400nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)明顯有流動(dòng)相流出時(shí)，取供試品溶液進(jìn)樣，根據(jù)紫外檢測(cè)器光譜圖，對(duì)分離的各個(gè)色譜峰的對(duì)應(yīng)流出液進(jìn)行收集，經(jīng)HPLC檢測(cè)，合并相同成分的流出液，濃縮、干燥，分別制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙； (3)將步驟(2)第一次高速逆流色譜分離后的固定相A取出回收，除去溶劑、干燥后，作為待測(cè)樣品進(jìn)行第二次高速逆流色譜分離，以體積比為1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成高速逆流溶劑體系B，混合充分后靜置，按上下兩相分開(kāi)，取上相B為固定相B，下相B為流動(dòng)相B，將待測(cè)樣品用上相B、下相B體積比1:1的混合溶劑溶解，作為待測(cè)樣品溶液，將固定相B充滿高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱，設(shè)定高速逆流色譜儀，在500~1000r/min轉(zhuǎn)速下，以0.1~10ml/min的流速注入流動(dòng)相B,以波長(zhǎng)180~400nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)明顯有流動(dòng)相流出時(shí)，取待測(cè)樣品溶液進(jìn)樣，根據(jù)紫外檢測(cè)器光譜圖，對(duì)分離的各個(gè)色譜峰的對(duì)應(yīng)流出液進(jìn)行收集，經(jīng)HPLC檢測(cè)，合并相同成分的流出液，濃縮、干燥，分別制得五味子甲素和五味子乙素。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，提取溫度35~55°C，提取時(shí)間I~4h。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的供試品溶液中含有的五味子粗提物的質(zhì)量與高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱的體積比為0.1~0.5:300g/mL.5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的待測(cè)樣品溶液中含有的待測(cè)樣品的質(zhì)量與高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱的體積比為0.1~0.5:300g/mL.6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為210-280nm。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的待測(cè)樣品溶液中含有的待測(cè)樣品的質(zhì)量與高速逆流色譜儀多層線圈分離柱的體積比為0.1-0.5:300g/ml。
6，如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為210-280nm
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述高速逆流溶劑體系A(chǔ)中，所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為5~8:2~5:4~5:5。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述高速逆流溶劑體系B中，所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為2.~4:1~2:2~4:1。
【文檔編號(hào)】C07C43/21GK103467438SQ201310431854
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】楚楚, 顏繼忠, 章詩(shī)迪, 童勝?gòu)?qiáng), 李行諾 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)