一組高特異識別鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇和萊克多巴胺的寡核苷酸適配子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一組能同時識別鹽酸克倫特羅和沙丁胺寡核苷酸適配子Apt?1，Apt?2和Apt?3，一條能高特異性識別鹽酸克倫特羅的寡核苷酸適配子CLB?2，一條能高特異性識別沙丁胺醇的寡核苷酸適配子SAL?5，兩條能高特異識別萊克多巴胺的寡核苷酸適配子RAC?5和RAC?6?；贔e3O4磁性納米顆粒分離的SELEX技術(shù)，將隨機寡核苷酸文庫通過生物素化標(biāo)記的互補鏈固定在親和素包被磁性納米顆粒上，經(jīng)過16輪篩選最終獲得高特異親和的寡核苷酸適配子。該適配體具有廣闊的應(yīng)用前景，能通過標(biāo)記功能基團或熒光染料運用于食品中鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺的檢測，為現(xiàn)今依賴抗體的檢測方法提供了新的選擇。
【專利說明】
一組高特異識別鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇和萊克多巴胺的寡 核苷酸適配子
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及食品安全生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到利用SELEX技術(shù)(指數(shù)富集的配體 系統(tǒng)進化技術(shù))分別篩選一組識別鹽酸克倫特羅的寡核苷酸適配子，一組識別沙丁胺醇的 寡核苷酸適配子和一組識別萊克多巴胺的寡核苷酸適配子，為基于寡核苷酸適配子檢測食 品中瘦肉精的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘦肉精作為一種人工合成的β_腎上腺素受體激活劑，可以減少動物脂肪含量，增 加瘦肉率，同時促進動物生長，減少飼料用量，因而被用于畜牧生產(chǎn)。但是瘦肉精在動物體 內(nèi)代謝緩慢，經(jīng)過肉制品進入人體體內(nèi)蓄積，使人體產(chǎn)生頭暈、乏力、心悸，四肢麻木等中毒 癥狀，嚴(yán)重危害人類的健康。市場上主要使用的瘦肉精分子包括:鹽酸克倫特羅(CLB)，沙丁 胺醇（SAL)和萊克多巴胺(RAC)。鹽酸克倫特羅在1964年由美國科學(xué)家首次合成，在臨床上 具有擴張支氣管的作用，對防治支氣管哮喘、慢性支氣管炎，肺氣腫等肺部疾病有良好的治 療效果。后來被發(fā)現(xiàn)有促進肌肉發(fā)育和脂肪分解的作用，因此被大量添加在畜牧的飼料中 促進動物生長。由于非法添加鹽酸克倫特羅受到嚴(yán)格監(jiān)管和有效打擊，沙丁胺醇和萊克多 巴胺作為一種新型的"瘦肉精"逐漸興起，成為鹽酸克倫特羅的替代品，也被人們?yōu)E用在動 物飼料中。鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺在動物體內(nèi)代謝較慢，并大量殘留在動物 體內(nèi)，然后通過肉制品進入人體內(nèi)并蓄積，導(dǎo)致人體中毒甚至死亡。因此，中國及世界各地 其他國家紛紛出臺法律法規(guī)禁止瘦肉精在飼料和畜禽生產(chǎn)中使用。
[0003] 目前，鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺測定方法主要有分為儀器分析法和免 疫學(xué)方法。儀器分析法儀器分析法包括高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、膠束毛細管電色譜(CE)、薄層色譜法(TLC) 等，這些方法已經(jīng)成功地被用于瘦肉精的檢測。儀器分析法雖然具有重現(xiàn)性好，檢測限低， 靈敏度高優(yōu)勢，但是檢測設(shè)備較為昂貴，樣品處理較為復(fù)雜，很難達到現(xiàn)場檢測目的。免疫 學(xué)方法依賴抗原和抗體特異性結(jié)合的檢測方法，該方法具有操作簡單、靈敏度高，特異性 強，無需大型儀器等優(yōu)點。但是，由于鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺都是小分子半抗 原，不具備免疫原性，需將其與 BSA等大分子載體蛋白結(jié)合制備完全抗原后才能刺激動物分 泌抗體，因此抗體制備不僅耗時繁瑣而且成本昂貴，制備出的抗體也易受溫度等環(huán)境因素 的影響。
[0004]寡核苷酸適配子是通過SELEX技術(shù)從體外合成的隨機寡核苷酸單鏈文庫中篩選而 得，能夠以特定的結(jié)構(gòu)與祀標(biāo)高特異親和的一段較短的單鏈DNA序列。如今，寡核苷酸適配 子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于如靶標(biāo)檢測、酶抑制，受體調(diào)節(jié)和藥物傳遞等各種領(lǐng)域。寡核苷酸適配 子相比抗體表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢，除了具有較高的特異親和性，寡核苷酸適配子篩選完全在 體外進行，篩選周期短，合成方便且成本低，易標(biāo)記一些功能基團和報告分子，同時變性與 復(fù)性可逆且速度快，穩(wěn)定好，受環(huán)境條件影響小，可長期保存。隨著SELEX技術(shù)的不斷完善進 步，已經(jīng)篩選出各種靶標(biāo)物的適配子，如小分子物質(zhì)(有機染料，金屬，藥物，氨基酸，核苷酸 和肽等）、蛋白質(zhì)(包括酶、抗體、基因調(diào)控因子，以及外源凝集素）、腫瘤細胞、病毒和致病菌 等。但目前尚無關(guān)于鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺的寡核苷酸適配子制備方法的研 究報道。本發(fā)明以食品或飼料中常見的非法添加劑鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺為 靶標(biāo)，并與固定了隨機寡核苷酸文庫的Fe 304磁性納米顆粒孵育，篩選獲得一組識別鹽酸克 倫特羅的寡核苷酸適配子，一組識別沙丁胺醇的寡核苷酸適配子和一組識別萊克多巴胺的 寡核苷酸適配子，制備的寡核苷酸適配子具有穩(wěn)定性高、合成方便、易標(biāo)記功能基團和報告 分子，將廣泛應(yīng)用于食品和飼料中瘦肉精的快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一組識別鹽酸克倫特羅的寡核苷酸適配子，一組識別沙丁 胺醇的寡核苷酸適配子和一組識別萊克多巴胺的寡核苷酸適配子，為開發(fā)瘦肉精的新型分 離富集或分析檢測工具奠定良好基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備瘦肉精的寡核苷酸適配子的方法，它可以方 便、準(zhǔn)確地獲取與鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺高特異親和的寡核苷酸適配子，效 果顯著。
[0007] 本發(fā)明方法利用基于Fe3〇4磁性納米顆粒分離的SELEX技術(shù)，將隨機寡核苷酸文庫 通過生物素化標(biāo)記的互補鏈固定在親和素包被Fe 304磁性納米顆粒。以鹽酸克倫特羅，沙丁 胺醇，萊克多巴胺作為靶標(biāo)與固定文庫孵育。通過16輪的SELEX反復(fù)篩選后，對富集文庫進 行克隆測序，并分析代表序列的親和力和特異性，最終獲得一組識別鹽酸克倫特羅的寡核 苷酸適配子，一組識別沙丁胺醇的寡核苷酸適配子和一組識別萊克多巴胺的寡核苷酸適配 子。
【附圖說明】
[0008] 圖1是基于Fe3〇4磁性納米顆粒分離的SELEX技術(shù)的原理圖。
[0009] 圖2是序列△?乜、厶?七2、厶?卜3、0^-2、3厶1^-5，1^(：-5，1^(：-6的模擬二級結(jié)構(gòu)圖。
[0010]圖 3 是序列Apt 1、Apt2、Apt-3、CLB-2、SAL-5，RAC-5，RAC-6 寡核苷酸適配體的飽和 結(jié)合曲線圖。
[0011] 圖4是序列4?衍^?七2^?卜3、0^-2、341^-5，1^(：-5，1^(：-6寡核苷酸適配體的特異 性試驗結(jié)果。
【具體實施方式】：
[0012] 以下結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不是限制本發(fā)明。
[0013] 實施例1:鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺特異性結(jié)合寡核苷酸適配子的 SELEX篩選1、體外化學(xué)合成初始隨機寡核苷酸(ssDNA)文庫及引物（由美國Integrated DNA Technologies公司完成），序列如下：
[0014] 5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3' (40N代表40個隨機核 苷酸）；
[0015] 上游引物：：5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'
[0016] 5'磷酸化下游引物:5' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'
[0017] 生物素化的文庫互補短鏈PI :57 -Bio-AGCACGCATAGG-3'
[0018] 將隨機ssDNA文庫和引物均用TE緩沖液配制成100μΜ|￡存液存于-20°C備用。
[0019] 2、隨機ssDNA文庫的固定與孵育
[0020] 第一輪篩選反應(yīng)體系為600yL，lnmol ssDNA文庫和短鏈P1以1:2摩爾量比加入BB 緩沖液（50mM Tris-HCl，5mM KCl，100mM NaCl，lmM MgCl2，pH 7.4)中混合均勻后，在95°C 加熱lOmin，再轉(zhuǎn)移至37°C下雜交互補3h。然后將互補雜交鏈與清洗后的600yg親和素包被 的磁珠在37°C，130rpm下反應(yīng)6h，通過親和素和生物素的特異性結(jié)合，使ssDNA文庫固定在 磁珠上。ssDNA固定化的磁珠采用BB緩沖液多次清洗，以去除非特異性結(jié)合的ssDNA AOOyL ssDNA固定化的磁珠溶液與混合靶標(biāo)(鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺，初始濃度各為 O.lmM)在37°C下孵育2h，與靶標(biāo)特異性親和的ssDNA從磁珠上解離下來。在外加磁場作用 下，特異性親和的ssDNA與靶標(biāo)留在上清液中，并作為模板進行PCR擴增。
[0021] 3、PCR擴增及ssDNA單鏈制備
[0022]將陰性對照組和實驗組孵育體系的上清液作為模板進行PCR擴增，50yL PCR擴增 體系為:5yL模板，lyL正向引物（ΙΟμ mol/L)，lyL磷酸化反向引物（10μηιο1/υ，lyL dNTPmix (5mmol/L)，0.5yL Taq DNA聚合酶(5U/yL)，5yL 10XPCR擴增緩沖液，36.5yL超純水。熱循 環(huán)參數(shù)為:94°C變性5min，接著94°C變性308,56°(：退火30 8,72°(：延伸308，進行20輪循環(huán)，然 后72°C延伸2min，最后4°C冷卻。PCR產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用Gelred染 色后置于Bio-Rad凝膠成像儀拍照，驗證PCR產(chǎn)物dsDNA大小是否為80bp，條帶是否單一。PCR 產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。采用ND-1000微量紫外可見分光光度計測定純化PCR產(chǎn) 物濃度，計算Lambda核酸外切酶加入量，保證Lambda核酸外切酶能夠完全切除5'端磷酸基 團修飾的反向DNA鏈，以獲得下一輪篩選的單鏈DNA。向純化PCR產(chǎn)物中加入Lambda核酸外切 酶和1/10體積的酶切緩沖液在37°C下酶切反應(yīng)lh，75°C下滅酶10min終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物采 用8%變性聚丙烯酰胺凝膠(含7M尿素）電泳在250V下分離20min，凝膠在Gelred染色液中染 色15min后置于Bio-Rad凝膠成像儀下成像拍照，確定酶切是否完全，單鏈產(chǎn)物條帶大小是 否正確。將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中并加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(V:V:V = 25: 24:1)，混合均勻30s呈白色乳狀液體，4°C，2000rpm離心5min，4°C，8000rpm離心lmin，將上 層清液小心取出移至離心管中。再加入等體積氯仿:異戊醇(V:V = 24:1)，混勻，在上述相同 離心條件下離心并收集上清液。上清液中加入1/10體積3M的NaAC，充分混勻后再加入2倍體 積無水乙醇，混勻后放置-20 °C沉淀過夜。沉淀后溶液4 °C，14000rpm離心15min去上清后加 入200yL70%乙醇，上下顛倒洗凈沉淀，再在4°C，14000rpm離心15min，去上清可見白色固體 沉淀，放置在50°C烘箱中干燥后加入200yL TE緩沖液溶解并采用ND-1000微量紫外可見分 光光度計測定純化ssDNA的濃度。
[0023] 4、循環(huán)篩選
[0024]第二輪至第十一輪按照第一輪方法進行篩選，篩選反應(yīng)體系為300yL。為增加篩選 壓力，提高篩選寡核苷酸適配子的親和性，加入固定體系中ssDNA文庫量lOOpmol，并隨著篩 選輪數(shù)的增加逐漸遞減至20pmol，加入孵育體系的靶標(biāo)混合物濃度由O.lmM逐漸遞減至1μ Μ，孵育時間逐漸由2h遞減至lh。為提高寡核苷酸適配子的特異性，從第三輪開始每隔一輪 進行一次反篩，ssDNA文庫固定化磁珠先加入反篩物質(zhì)鹽酸腎上腺素、多巴胺鹽酸鹽、重酒 石酸去甲腎上腺素、硫酸異丙腎上腺素、親和素孵育清洗后再與靶標(biāo)孵育結(jié)合。同時從第十 二輪至十六輪，ssDNA文庫分別單獨與鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺孵育，同時另外 兩種分子加入反篩體系，以獲得分別針對鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇和萊克多巴胺特異性結(jié) 合的寡核苷酸適配子。
[0025] 5、克隆測序與序列分析
[0026]篩選十六輪后，將分別針對鹽酸克倫特羅，萊克多巴胺，沙丁胺醇三種靶標(biāo)篩選的 PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進行DNA序列測定。針對每種靶標(biāo)各測定獲得40條序 列，采用DNAMAN和RNA Structure 4.6軟件分別分析40條序列的同源性信息和二級結(jié)構(gòu)。結(jié) 合軟件分析結(jié)果，針對靶標(biāo)鹽酸克倫特羅將序列分為8個家族，從每個家族中選出1條結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定，自由能級較低的候選寡核苷酸適配子共8條。針對靶標(biāo)沙丁胺醇將序列分為10個家 族，從每個家族中選出1條結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，自由能級較低的候選寡核苷酸適配子共10條。針對靶 標(biāo)萊克多巴胺將序列分為9個家族，從每個家族中選出1條結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，自由能級較低的寡核 苷酸適配子共9條。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apt-l，Apt-2，Apt-3同時出現(xiàn)在鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的候 選寡核苷酸適配子序列中。將挑選的候選寡核苷酸適配子由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有 限公司合成5'端標(biāo)記FAM序列，用于親和力和特異性分析。
[0027] 6、三種瘦肉精寡核苷酸適配子的親和力和特異性分析 [0028] 6.1親和力分析
[0029] 基于氧化石墨烯氧化具有吸附單鏈DNA的特性，構(gòu)建了寡核苷酸適配子親和性驗 證方法。將固定濃度的瘦肉精靶標(biāo)（ΙμΜ)分別與與其對應(yīng)一系列不同濃度（10，25，50，75， 100，150，200ηΜ)的候選寡核苷酸適配子進行孵育，總體積為300yL，37 °C避光孵育2h，并以 BB緩沖液代替靶標(biāo)作為陰性對照組。孵育結(jié)合后加入最佳用量比的G0吸附未與靶標(biāo)結(jié)合的 適配子，離心操作后采用F-7000熒光光度計測定上清液490nm激發(fā)下520nm發(fā)射的熒光強 度，實驗設(shè)置三次平行重復(fù)，實驗采用避光處理。以實驗組相對陰性對照組的熒光強度作為 縱坐標(biāo)，以適配子濃度作為橫坐標(biāo)，采用GraphPad Prism 5.0軟件進行非線性回歸擬合計 算適配子的解離常數(shù)Kd值，并繪制結(jié)合飽和曲線，從而獲得能與鹽酸克倫特羅，沙丁胺醇， 萊克多巴胺親和力較好的寡核苷酸適配子，即解離常數(shù)較低的寡核苷酸適配子。（見表1)。
[0030] 表1.高親和力的寡核苷酸適配子解離常數(shù)Kd值

[0033] 圖3為序列4?衍^?七2^?卜3、0^-2、3六1^-5，1^(：-5及1^(：-6與對應(yīng)靶標(biāo)的飽和結(jié)合 曲線圖。
[0034] 6.2特異性分析
[0035]根據(jù)5.1的分析結(jié)果，獲得與鹽酸克倫特羅親和較好的Apt-1、Apt-2、Apt-3和CLB-2序列，與沙丁胺醇親和較好的Apt-l、Apt-2、Apt-3和SAL-5序列，與萊克多巴胺親和性較好 的RAC-5和RAC-6序列，其中Apt-1、Apt-2、Apt-3對鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇都具有高親和 性。因此，將寡核苷酸適配子Apt-1、Apt-2、Apt-3，CLB-2，SAL-5，RAC-5、RAC-6進行特異性分 析。特異性實驗分析鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的寡核苷酸適配子對反篩物質(zhì) (鹽酸腎上腺素、多巴胺鹽酸鹽、重酒石酸去甲腎上腺素、硫酸異丙腎上腺素、親和素）的結(jié) 合力。反篩物質(zhì)與200nM的寡核苷酸適配子在37°C避光孵育2h，并以BB緩沖液代替靶標(biāo)作為 陰性對照組。孵育結(jié)合后加入最佳用量比的G0吸附未與靶標(biāo)結(jié)合的寡核苷酸適配子，離心 操作后采用F-7000熒光光度計測定上清液490nm激發(fā)下520nm發(fā)射的熒光強度，實驗設(shè)置三 次平行重復(fù)，實驗采用避光處理。結(jié)果顯示Apt-l、Apt-2、Apt-3、CLB-2結(jié)合鹽酸克倫特羅， Apt-Ι ^?丨-2^?丨-3,341^-5結(jié)合沙丁胺醇，1^(：-5和1^(：-6結(jié)合萊克多巴胺能力均強于其他 反篩物質(zhì)，特異性試驗結(jié)果如圖3所示。因此，通過基于Fe 3〇4磁性納米顆粒分離的SELEX技術(shù) 制備一組同時識別鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的寡核苷酸適配子4?卜1^?卜2^?卜3，一條 高特異性識別鹽酸克倫特羅的寡核苷酸適配子CLB-2,一條高特異識別沙丁胺醇的寡核苷 酸適配SAL-5和兩條高特異識別萊克多巴胺的寡核苷酸適配子RAC-5和RAC-6,為開發(fā)瘦肉 精的新型分離富集或分析檢測工具奠定良好基礎(chǔ)。為食品或飼料中鹽酸克倫特羅，沙丁胺 醇，萊克多巴胺的檢測提供重要基礎(chǔ)。
[0036]本發(fā)明包括但不限于以上實施例，凡是在本發(fā)明的精神和原則下進行的任何等同 替換或局部該進，都將視為在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。


【主權(quán)項】
1. 一組能同時識別鹽酸克倫特羅和沙丁胺寡核苷酸適配子Apt-1，Apt-2和Apt-3,一條 能高特異性識別鹽酸克倫特羅的寡核苷酸適配子CLB-2,一條能高特異性識別沙丁胺醇的 寡核苷酸適配子SAL-5,兩條能高特異識別萊克多巴胺的寡核苷酸適配子RAC-5和RAC-6,其 特征在于寡核苷酸適配子序列如序列表中序列1，2,3,4,5,6,7所示的序列。2. 如權(quán)利要求1中所述的寡核苷酸適配子，其特征在于其5'端或3'端可以進行FITC、氨 基、生物素或巰基化學(xué)修飾。3. 如權(quán)利要求1中所述的寡核苷酸適配子在食品或飼料中分離富集及分析檢測鹽酸克 倫特羅，沙丁胺醇和萊克多巴胺的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/115GK105886512SQ201610128853
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月7日
【發(fā)明人】王周平, 鞏文慧, 段諾, 吳世嘉, 夏雨, 馬小媛
【申請人】江南大學(xué)