一種緩解鉛毒性的富硒米肽酶解制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于富硒稻米深加工領(lǐng)域，涉及一種緩解鉛毒性的富硒米肽酶解制備方法。本發(fā)明利用新鮮富硒稻米為原料，將原料磨粉、過(guò)篩、脫脂后過(guò)夜風(fēng)干，以堿法提取蛋白質(zhì)，酸沉后水洗凍干，制成富硒米蛋白。富硒米蛋白經(jīng)酶解、滅酶活后所得多肽凍干保存，即得本發(fā)明產(chǎn)品。本發(fā)明的富硒米肽在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，能拮抗鉛對(duì)細(xì)胞的毒性作用，明顯提高鉛中毒細(xì)胞的存活率和受試物的半數(shù)致死量(IC50值)。本發(fā)明所得的富硒米肽具有緩解鉛對(duì)細(xì)胞毒性的作用，制備方法簡(jiǎn)單、易行，可應(yīng)用于功能食品的研制和開發(fā)。
【專利說(shuō)明】一種緩解鉛毒性的富砸米肽酶解制備方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及富硒稻米深加工領(lǐng)域，尤其涉及一種緩解鉛毒性的富硒米肽的酶解制備方法，屬于保健食品開發(fā)領(lǐng)域。
二、【背景技術(shù)】
[0002]鉛是一種對(duì)動(dòng)物和植物均具有嚴(yán)重毒害作用的重金屬元素，已被證明在進(jìn)入人體后主要在骨骼、內(nèi)臟、血液以及神經(jīng)系統(tǒng)中蓄積，造成血鉛超標(biāo)與鉛中毒，并可致癌與致突變，直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。水體、土壤、大氣以及糧農(nóng)作物等極易受到鉛的污染，蓄積的鉛毒通過(guò)皮膚與消化道直接進(jìn)入人體，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)分布并沉積在人體內(nèi)。由于代謝與排泄都極為緩慢，鉛對(duì)靶器官造成的損傷持續(xù)且不可逆轉(zhuǎn)。鉛中毒已成為最為嚴(yán)峻的重金屬危害之一。近年來(lái)重金屬鉛的致毒機(jī)制與鉛毒的預(yù)防和解除受到了醫(yī)學(xué)與營(yíng)養(yǎng)健康領(lǐng)域的高度關(guān)注，尋找能夠驅(qū)鉛，拮抗鉛的毒性作用的功能食品是緩解鉛中毒的理想解決方案。
[0003]硒是一種人類和動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，具有調(diào)控生物體生殖、發(fā)育、代謝、免疫等過(guò)程的生物學(xué)機(jī)能，被譽(yù)為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的“奇效元素”。硒在生物活性成分中大多以硒代氨基酸，硒多肽以及硒蛋白的形式存在，其參與構(gòu)成的25種硒酶與硒蛋白，與抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防心腦血管及地方性疾病，尤其是近年來(lái)頗受關(guān)注的減弱重金屬毒性等生物學(xué)功能密切相關(guān)。已有學(xué)者的研究證明，硒具有緩解重金屬中毒，拮抗鉛毒，促進(jìn)排鉛的特殊生理功能。利用天然含硒產(chǎn)物深加工以制備緩解鉛對(duì)生物體的毒理作用具有現(xiàn)實(shí)性的研究?jī)r(jià)值。
[0004]富硒米蛋白具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，過(guò)敏性低，生物活性明顯高于普通稻米蛋白等突出優(yōu)勢(shì)，選用優(yōu)質(zhì)高值富硒農(nóng)產(chǎn)品——富硒稻米為提取原料，是一種前景廣闊的富硒作物深加工產(chǎn)品。目前稻米蛋白的提取方法已經(jīng)十分成熟，相較酶法與超聲輔助等方法，堿法提取因原材料損失少，蛋白得率高、提取成本低，工藝條件簡(jiǎn)單可控而得到廣泛的應(yīng)用。許多研究表明，將稻米蛋白酶解后得到的稻米多肽甚至小分子氨基酸殘基，其生物活性均高于未酶解的稻米蛋白。在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，普遍選用反應(yīng)溫和、天然成分不受破壞的體外酶解條件制備稻米多肽。稻米蛋白酶解物抗氧化、抗衰老與預(yù)防疾病、免疫調(diào)節(jié)的作用已受到許多學(xué)者的關(guān)注，研究攜帶硒元素為活性中心的富硒米肽在生物醫(yī)學(xué)與營(yíng)養(yǎng)保健領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問(wèn)題
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種緩解鉛毒性的富硒米肽的酶解制備方法，對(duì)富硒稻米進(jìn)行合理有效深加工，可應(yīng)用于保健食品的研發(fā)。
[0007]技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明的一種·緩解鉛毒性的富硒米肽是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009](I)原料預(yù)處理:選取新鮮富硒稻米為原料，磨成粉末后過(guò)80目篩；[0010](2)脫脂:將富硒米樣品按照料液比1: 4~1: 6配比后，借助磁力攪拌器(JB-5，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)浸提脫脂兩次，每次3~4h，4500g離心15min，收集沉淀，置于鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35°C下，通風(fēng)2h至干燥；
[0011](3)堿法提取蛋白質(zhì):將干燥后的富硒米粉按照料液比1: 15~1: 20與濃度為0.02~0.07mol / L的NaOH溶液配比后，攪拌均勻，設(shè)置溫度35~40°C，于恒溫振蕩器(SHA-B，金壇市榮華儀器制造有限公司)上恒溫震蕩提取2.5~3h，4500g離心15min，收集上清液，重復(fù)此法堿提2~3次，合并上清液；
[0012](4)酸沉:用0.01~0.02mol / L的HCl溶液調(diào)(3)中蛋白液pH至等電點(diǎn)(4.8)，待大量蛋白質(zhì)沉淀析出后，4500g離心15min,收集沉淀；
[0013](5)水洗:將上述沉淀用去離子水按照料液比1: 10~1: 20洗滌后，4500g離心15min,棄去上清液,重復(fù)水洗2~3次；
[0014](6)凍干:將(5)所得富硒米蛋白分裝入培養(yǎng)皿，表面用保鮮膜包裹，在_20°C冰箱中預(yù)凍12~15h，取出放入冷凍干燥機(jī)(Lg-5A，上海離心機(jī)械研究所)24h，將所得富硒米蛋白保存于-4°C冰箱備用；
[0015](7)酶解:將(6)中所述富硒米蛋白制成底物濃度3%~5%的懸濁液，按照酶比底物濃度8%~12%加入胰蛋白酶，用0.05mol / LNaOH調(diào)節(jié)體系pH至8.0~9.0附近，置磁力攪拌器(JB-5，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)攪拌同時(shí)，控制溫度45~50°C水浴
3.5 ~4h ;
[0016](8)滅酶活:升溫至90~95°C，保持10~15min，將胰蛋白酶滅活；
[0017](9)凍干:待(8)所得富硒米肽懸濁液冷卻后分裝入培養(yǎng)皿，表面用保鮮膜包裹，在_20°C冰箱中預(yù)凍12~15h，取出放入冷凍干燥機(jī)(Lg-5A，上海離心機(jī)械研究所)24h，將所得富硒米肽產(chǎn)品保存于-4°C冰箱備用。
[0018]有益效果
[0019](I)本發(fā)明選取富硒稻米作為原材料，提取富硒稻米蛋白并進(jìn)一步酶解，制備出能緩解鉛毒性的富硒米肽(制備工藝見(jiàn)圖1)，合理的利用了富硒碎米和富硒米糠等稻米加工副產(chǎn)物，避免農(nóng)產(chǎn)品廢棄物的資源浪費(fèi)。
[0020](2)本發(fā)明制備的富硒米肽比普通米肽的硒含量高，可作為硒缺乏地區(qū)以及缺硒人群的膳食補(bǔ)充劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑進(jìn)行推廣。表1為富硒米肽與普通米肽的硒含量對(duì)比。
[0021]表1富硒米肽與普通米肽的硒含量
[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種緩解鉛對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7毒性的富硒米肽的酶解制備方法，其特征在于包括以下制備步驟和工藝條件: (1)原料預(yù)處理:選取新鮮富硒稻米為原料，磨成粉末后過(guò)80目篩； (2)脫脂:將富硒稻米樣品按照料液比1: 4~1: 6配比后，借助磁力攪拌器(JB-5，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)浸提脫脂兩次，每次3~4h，4500g離心15min，收集沉淀，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35°C下通風(fēng)2h至干燥； (3)堿法提取蛋白質(zhì):將干燥后的富硒米粉按照料液比1: 15~1: 20與濃度為0.02~0.07mol / L的NaOH溶液配比后，攪拌均勻，設(shè)置溫度35~40°C，于恒溫振蕩器(SHA-B，金壇市榮華儀器制造有限公司)上提取2.5~3h，4500g離心15min，收集上清液，重復(fù)此法堿提2~3次，合并上清液； (4)酸沉:用0.01~0.02mol / L的HCl溶液調(diào)(3)中蛋白液pH至等電點(diǎn)(4.8)，待大量蛋白質(zhì)沉淀析出后，4500g離心15min,收集沉淀； (5)水洗:將上述沉淀用去離子水按照料液比1: 10~1: 20洗滌后，4500g離心15min,棄去上清液，重復(fù)水洗2~3次； (6)凍干:將(5)所得富硒米蛋白分裝入培養(yǎng)皿，表面用保鮮膜包裹，在_20°C冰箱中預(yù)凍12~15h，取出放入真空冷凍干燥機(jī)(Lg-5A，上海離心機(jī)械研究所)24h，將所得富硒米蛋白保存于_4°C冰箱備用； (7)酶解:將(6)中所述富硒米蛋白制成底物濃度3%~5%的懸濁液，按照酶比底物濃度8%~12%加入胰蛋白酶，用0.05mol / LNaOH調(diào)節(jié)體系pH至8.0~9.0附近，置磁力攪拌器(JB-5，金壇市精達(dá)儀`器制造有限公司)攪拌的同時(shí)，控制溫度45~50°C水浴3.5~4h ； (8)滅酶活:升溫至90~95°C，保持10~15min，將胰蛋白酶滅活； (9)凍干:待⑶所得富硒米肽懸濁液冷卻后分裝入培養(yǎng)皿，表面用保鮮膜包裹，在_20°C冰箱中預(yù)凍12~15h，取出放入冷凍干燥機(jī)(Lg-5A，上海離心機(jī)械研究所)24h，將所得富硒米肽產(chǎn)品保存于-4°C冰箱備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富硒米肽的制備方法，其特征在于(3)堿法提取蛋白質(zhì):將脫脂后的富硒大米用0.02~0.07mol / L的NaOH溶液，按照料液比1: 15~1: 20均勻混合后，35~40°C震蕩提取2.5~3h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富硒米肽的制備方法，其特征在于⑷酸沉:0.01~0.02mol / L的稀HCl調(diào)節(jié)富硒米蛋白懸濁液至等電點(diǎn)(4.5~5.5)，待有大量蛋白質(zhì)沉淀析出后，4500g離心15min,收集沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富硒米肽的制備方法，其特征在于(7)酶解:用胰蛋白酶對(duì)底物濃度3 %~5 %的富硒米蛋白懸濁液，按照酶比底物濃度8 %~12 %進(jìn)行酶解，0.05mol / LNaOH調(diào)節(jié)體系pH至8.0~9.0附近，磁力攪拌的同時(shí)，控制溫度45~50°C水浴3.5~4h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，獲得的具有緩解鉛對(duì)細(xì)胞毒性作用的富硒米肽產(chǎn)品O
6.一種緩解鉛對(duì)細(xì)胞毒性的方法，其特征在于:以一定濃度按照權(quán)利要求1方法提取的富硒米肽作為拮抗添加物加入細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基中，緩解和拮抗?jié)舛确秶?~..1600 μ mo / L的重金屬鉛(PbCl2)對(duì)于小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的毒害作用；
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的緩解鉛對(duì)細(xì)胞毒性的方法，其特征在于:所述富硒酶解肽的濃度在80~100mg/L之間，既能很好地緩解5~1600 μ mol / L濃度范圍內(nèi)鉛(PbCl2)對(duì)細(xì)胞的毒性作用，又符合在大米硒肽對(duì)細(xì)胞的安全作用濃度范圍(10~UOyg / L)。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK103667409SQ201410003832
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】方勇, 陳悅, 胡秋輝, 陳曦, 許姿, 邱偉芬, 徐衛(wèi)東, 徐迅, 楊文建, 馬寧, 鞠興榮 申請(qǐng)人:南京財(cái)經(jīng)大學(xué)