一種分離免疫球蛋白抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取免疫球蛋白抗體的方法。所述方法包括如下步驟：步驟1，用pH值4.0～8.0的緩沖液和去離子水稀釋含有免疫球蛋白的原料得到上樣液；步驟2，將預(yù)處理過(guò)的上樣液以0.1～20cm/min流速上樣到晶膠柱，進(jìn)行吸附；步驟3，以去離子水或pH值4.0～8.0的緩沖液為沖洗液，沖洗掉晶膠柱內(nèi)未被吸附的雜質(zhì)；步驟4，用含有0.01～4M堿金屬鹽的pH值4.0～8.0緩沖溶液為洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，收集含免疫球蛋白的洗脫峰，得到所述的免疫球蛋白。本發(fā)明提供的免疫球蛋白分離方法，所用的陰離子交換型晶膠介質(zhì)具有超大孔隙，孔內(nèi)對(duì)流擴(kuò)散，傳質(zhì)效率高，實(shí)現(xiàn)了高純度IgG的分離，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，適應(yīng)性好，提取成本低。
【專利說(shuō)明】一種分離免疫球蛋白抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離免疫球蛋白抗體(IgG)的方法，尤其是一種利用陰離子晶膠吸附層析技術(shù)從牛奶中分離免疫球蛋白抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]IgG普遍存在于動(dòng)物的血液、組織液及外分泌液中，其中動(dòng)物乳汁是IgG的重要來(lái)源，具有重要的免疫和生理調(diào)節(jié)作用。牛奶作為生產(chǎn)原料優(yōu)勢(shì)在于原料豐富、廉價(jià)且牛乳清中IgG的含量較高(約9.6%~10.8% )。從乳清中提取IgG工業(yè)過(guò)程主要包括離心、鹽析、超濾、濃縮和陰離子交換層析等多個(gè)結(jié)合的步驟，工業(yè)過(guò)程復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。常規(guī)陰離子交換樹脂層析從乳清中提取IgG時(shí)，由于孔隙尺寸在納米級(jí)范圍內(nèi)，在層析多組分蛋白時(shí)對(duì)于大分子的IgG較難吸附。本發(fā)明所用的陰離子交換型晶膠介質(zhì)具有超大孔隙，其傳質(zhì)利用對(duì)流擴(kuò)散，實(shí)現(xiàn)了高純度IgG的分離。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明提供了一種用晶膠柱吸附層析技術(shù)快速高效提取免疫球蛋白抗體的新分離方法。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0005]一種IgG的層析分離方法，包括如下步驟:
[0006](I)用pH值4.0~8.0的緩沖液和水稀釋含有IgG的混合液得到上樣液，以0.1~20cm/min的流速上樣晶膠柱,進(jìn)行吸附；
[0007](2)以去離子水或pH值4.0~8.0的緩沖液為沖洗液，沖洗掉晶膠柱內(nèi)未被吸附的雜質(zhì)；
[0008](3)用含有0.01~4M堿金屬鹽的pH值4.0~8.0的緩沖溶液為洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，收集含IgG的洗脫峰，得到所述的IgG ；
[0009]在所述的晶膠吸附層析分離過(guò)程中，通常在上樣前，先以pH值4.0~8.0的緩沖溶液平衡晶膠柱。
[0010]進(jìn)一步，步驟(1)所述晶膠柱床中的晶膠介質(zhì)優(yōu)選為陰離子交換型，其功能基團(tuán)為胺基。
[0011]進(jìn)一步，步驟(1)中所述的含有IgG的混合液為牛奶或預(yù)處理后的乳清。
[0012]進(jìn)一步,步驟(2)中所述沖洗液的流速在0.1~20cm/min。
[0013]進(jìn)一步,步驟(3)中的洗脫優(yōu)選梯度洗脫,洗脫液流速0.1~20cm/min,先用含堿金屬鹽0.01~0.2M的pH值4.0~8.0的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，再用堿金屬鹽含量相應(yīng)更高
0.2~4M的pH值4.0~8.0的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，收集含IgG的洗脫峰，得到所述的IgG。
[0014]進(jìn)一步,步驟(3)所述的堿金屬鹽優(yōu)選為NaCl或KC1。
[0015]本發(fā)明在步驟(3)洗脫完畢后，依次用0.1M HC1、1~2M NaCl和去離子水對(duì)使用過(guò)的晶膠柱床進(jìn)行再生。[0016]本發(fā)明具體推薦所述方法按照如下步驟進(jìn)行:
[0017](a)以pH值4.0~8.0的緩沖溶液平衡晶膠床柱；所述晶膠柱的基礎(chǔ)柱制備體系為AAm或HEMA，得到的晶膠介質(zhì)為陰離子交換型，其功能基團(tuán)為胺基；
[0018](b)用pH值4.0~8.0的緩沖溶液稀釋牛奶或預(yù)處理后的乳清得到上樣液，以0.1~20cm/min的流速上晶膠柱,進(jìn)行吸附；
[0019](c)以去離子水或pH值4.0~8.0的緩沖液為沖洗液，以0.1~20cm/min的流速?zèng)_洗掉晶膠柱內(nèi)未被吸附的雜質(zhì)；
[0020](d)用含有0.01~4M堿金屬鹽的pH值4.0~8.0的緩沖溶液為洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，先用含堿金屬鹽0.01~0.2M的pH值4.0~8.0的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，再用堿金屬含量相應(yīng)更高的pH值4.0~8.0的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液流速0.1~20cm/min，收集含IgG的洗脫峰，得到所述的IgG ;所述的堿金屬鹽為NaCl或KCl ；
[0021](e)依次用0.1M HC1、1~2M NaCl和去離子水對(duì)晶膠柱進(jìn)行再生。
[0022]與現(xiàn)有IgG分離技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法特色是利用晶膠層析實(shí)現(xiàn)了 IgG的直接分離。晶膠層析分離方法是一種新型的層析分離技術(shù)，晶膠介質(zhì)內(nèi)嵌有許多尺寸在數(shù)十至數(shù)百微米的超大孔隙 ，可從含目標(biāo)生物分子的復(fù)雜料液中直接分離生物物質(zhì)。IgG在分離介質(zhì)內(nèi)的吸附傳質(zhì)主要依靠對(duì)流，具有吸附容量大，吸附分離迅速和層析分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。本方法將現(xiàn)有IgG分離工藝過(guò)程中的離心、鹽析、超濾、濃縮和陰離子交換層析等多個(gè)結(jié)合或復(fù)雜的步驟簡(jiǎn)化為通過(guò)晶膠吸附層析一步實(shí)現(xiàn)。
[0023]本發(fā)明方法的價(jià)值主要體現(xiàn)在:工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，處理量大。得到的IgG純度高，且晶膠介質(zhì)再生方便，可重復(fù)使用，是一種低成本的IgG分離純化方法。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下以具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此:
[0025][實(shí)施例1]取5mL的牛乳清，用20mM的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH= 5.8)和去離子水稀釋6倍，以lcm/min流速進(jìn)行晶膠連續(xù)床層析，然后用PBS緩沖液沖洗，并用含NaCl分別為40mM、100mM、200mM、300mM、IM的洗脫液(緩沖液配置)進(jìn)行梯度洗脫，收集40mM洗脫液對(duì)應(yīng)的洗脫峰，得到免疫球蛋白抗體IgG ;經(jīng)SDS~PAGE電泳檢測(cè)純度約大于95%，總蛋白吸附容量達(dá)0.259mg/mL床層。
【權(quán)利要求】
1.一種適于免疫球蛋白抗體(IgG)的層析分離方法，包括如下步驟: (1)用pH值4.0~8.0的緩沖液和水稀釋含有IgG的混合液得到上樣液，以0.1~20cm/min的流速上樣吸附； (2)以去離子水或pH值4.0~8.0的緩沖液為沖洗液，沖洗掉柱子內(nèi)未吸附的雜質(zhì)； (3)用含有0.01M~4M堿金屬鹽的pH值4.0~8.0的緩沖液為洗脫液，進(jìn)行洗脫，收集含IgG的洗脫峰，得到所述的IgG。
2.如權(quán)利要求1所述的IgG的層析分離方法中的分離介質(zhì)為晶膠柱，其基礎(chǔ)柱由AAm或HEMA體系制備。
3.如權(quán)利要求1所述的IgG的層析分離方法，柱床中的晶膠介質(zhì)為陰離子交換型，其功能基團(tuán)為胺基。
4.如權(quán)利要求1所述的IgG的層析分離方法，其特征在于步驟(1)中所述的含有IgG的混合液為牛奶或預(yù)處理后的乳清。
5.如權(quán)利要求1所述的IgG的層析分離方法，其特征在于步驟(2)中所述沖洗液的流速在 0.1 ~20cm/min。
6.如權(quán)利要 求1所述的IgG的層析分離方法，其特征在于步驟(3)中的洗脫為梯度洗脫，洗脫液流速為0.1~20cm/min，先用含堿金屬鹽0.01~0.2M的pH值4.0~8.0的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，再用堿金屬鹽含量相應(yīng)更高的pH值4.0~8.0的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，收集含IgG的洗脫峰，得到所述的IgG。
7.如權(quán)利要求1所述的IgG的層析分離方法，其特征在于所述的堿金屬鹽為NaCl或KCl。
8.如權(quán)利要求1~7之一所述的IgG的層析分離方法，其特征在于依次用0.1M HCl、I~2MNaCl和去離子水對(duì)步驟(3)使用過(guò)的晶膠柱床進(jìn)行再生。
9.如權(quán)利要求1所述的IgG的層析分離方法，其特征在于所述方法按照如下步驟進(jìn)行: (1)以pH值4.0~8.0的緩沖溶液平衡晶膠床柱；所述晶膠柱的基礎(chǔ)柱制備體系為AAm或HEMA，得到的晶膠介質(zhì)為陰離子交換型，其功能基團(tuán)為胺基； (2)用pH值4.0~8.0的緩沖溶液稀釋牛奶或預(yù)處理后的乳清得到上樣液，以0.1~20cm/min的流速上晶膠柱,進(jìn)行吸附； (3)以去離子水或pH值4.0~8.0的緩沖液為沖洗液，以0.1~20cm/min的流速?zèng)_洗掉晶膠柱內(nèi)未被吸附的雜質(zhì)； (4)用含有0.01~4M堿金屬鹽的pH值4.0~8.0的緩沖溶液為洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，先用含堿金屬鹽0.01~0.2M的pH值4.0~8.0的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，再用堿金屬含量相應(yīng)更高的pH值4.0~8.0的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液流速0.1~20cm/min，收集含IgG的洗脫峰，得到所述的IgG ;所述的堿金屬鹽為NaCl或KCl ； (5)依次用0.1M HClU~2M NaCl和去離子水對(duì)晶膠柱進(jìn)行再生。
【文檔編號(hào)】C07K1/22GK103936851SQ201410142237
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】代斌, 贠軍賢, 陳良, 張海燕, 董莎莎 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)