專利名稱：高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫球蛋白抗體，尤其是涉及一種采用糖基轉(zhuǎn)移酶催化增加免疫球蛋白 抗體上的唾液酸含量的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白抗體，如靜脈注射免疫球蛋白G，被廣泛用于治療慢性自我免疫疾病等 (1. Imbach， P.， Barandun, S.， d'Apuzzo，V.， et al, High-dose intravenous gammaglobulin for idiopathic thrombocytopenic purpura in childhood,i， 1228 (1981); 2. Blanchette， V， Imbach, P.， Andrew, M.， et. al. Randomised trial of intravenous immunoglobulin G, intravenous anti-D， and oral prednisone in childhood acute immune thrombocytopenic purpura,丄awc" 344, 703 (1994); 3. Y. Sultan, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Anti-idiotypic suppression of autoantibodies to factor VIII (antihaemophilic factor) by high-dose intravenous gammaglobulin Za"c" ii, 765 (1984); 4. D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox， C. M. Black, C. M. Lockwood， Treatment of systemic vasculitis with pooled intravenous immunoglobulin丄tmc" 337, 1137 (1991) ; 5 . P. LeHoang， N. Cassoux， F. George, N. et.al.D.Kazatchkine, Intravenous immunoglobulin (IVIg) for the treatment of birdshot retinochoroidopathy, (9cw/. /附附wwo/. /",a附m. 8,49 (2000))。免疫球蛋白抗體上的糖基的結(jié)構(gòu)是非均一的，含有不同結(jié)構(gòu)的糖基的免疫球 蛋白抗體有不同的生理活性。比如，靜脈注射免疫球蛋白G含有兩個N-連接糖基，其N-連接糖 基有不同的末端結(jié)構(gòu)，末端結(jié)構(gòu)為唾液'酸的靜脈注射免疫球蛋白G在總的靜脈注射免疫球蛋白 G中的比例低于5M (Routier， F. H.， Hounsell, E. F.， Rudd， P. M., et.al.Quantitation of the oligosaccharides of human serum IgG from patients with rheumatoid arthritis: a critical evaluation of different methods J. Immunol. Methods 213， 113 (1998))。而恰恰是這含量不足5%、含有 唾液酸的靜脈注射免疫球蛋白G是治療抗炎癥的有效成分(Yoshikatsu Kaneko， Falk Nimmerjahn, Jeffrey V. Ravetch ， Anti-Inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation， Sde"ce 313， 670 (2006))，大劑量的靜脈注射免疫球蛋白G在人體內(nèi)會誘發(fā)嚴(yán) 重的副反應(yīng)。因此提高靜脈注射免疫球蛋白G上N-連接糖基末端唾液酸的含量對提高它的藥 效，降低用藥劑量以減輕副反應(yīng)有重要醫(yī)療價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法及其應(yīng)用。 本發(fā)明的技術(shù)方案是采用糖基轉(zhuǎn)移酶催化方法將唾液酸連接到免疫球蛋白抗體的N-連接
糖基上，用于有效提高免疫球蛋白的唾液酸含量，通過把不含有唾液酸的成分轉(zhuǎn)變?yōu)楹型?液酸的有效成分，而提高其活性藥物成分的比例。
本發(fā)明所述的一種高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法的具體步驟為
1) 用胞苷-5'-磷酸-唾液酸合成酶催化唾液酸與胞苷-5'-三磷酸(CTP)反應(yīng)生成胞苷-5'-磷酸-唾液酸；
2) 利用以尿苷二磷酸(UDP)-半乳糖為底物的ei， 4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，催化連接半乳
糖到免疫球蛋白糖基的末端N-乙酰氨基葡萄糖上；
3) 利用以胞苷-5'-磷酸-唾液酸為底物的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，催化連接唾液酸到免疫球蛋白 糖基末端的半乳糖上。
免疫球蛋白可為多克隆免疫球蛋白抗體或單克隆抗體。多克隆免疫球蛋白抗體選自靜脈 注射免疫球蛋白G (Intravenous IgG)等。所述的底物為尿苷二磷酸-半乳糖或尿苷二磷酸陽半 乳糖-4-差向異構(gòu)酶酶催化尿苷二磷酸-葡萄糖生成的尿苷二磷酸-半乳糖等。
唾液酸基轉(zhuǎn)移酶為a2，6唾液酸塞轉(zhuǎn)移酶，a2，3唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，a2,8唾液酸基轉(zhuǎn)移 酶，a 2, 9唾液酸基轉(zhuǎn)移酶或a 2, 8/9多聚唾液酸基轉(zhuǎn)移酶等。
所制備的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體可應(yīng)用于制備治療自身免疫性疾病藥物，如治 療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明的有益效果是通過糖基轉(zhuǎn)移酶催化把唾液酸連接到靜脈注射免疫球蛋白的N-連 接糖基上，把不含有唾液酸的沒有抗炎活性的成分轉(zhuǎn)變?yōu)楹型僖核岬挠行С煞侄岣咂浠?性藥物成分的比例。由于經(jīng)過本發(fā)明處理的靜脈注射免疫球蛋白G有高含量唾液酸(70%)， 因此降低了靜脈注射免疫球蛋白G用于治療自身免疫性疾病的藥劑量，進(jìn)而降低大劑量所帶 來的副作用。


圖l為本發(fā)明實施例的靜脈注射免疫球蛋白的N-連接糖基的不同結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
在100 ml的緩沖溶液(100 mraol磷酸溶液，pH 7. 5,含有2畫ol 二價錳離子和5 mmol 二價鎂離子)中加入靜脈注射免疫球蛋白G (0.5g)，尿苷二磷酸-葡萄糖(0.2g)，胞苷-5'-
三磷酸(0.2g),唾液酸(0.1 g)，尿苷二磷酸-半乳糖4-差向異構(gòu)酶酶(20單位活性)，e 1, 4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶((20單位活性)，胞苷-5'-磷酸-唾液酸合成酶(20單位活性)和a 2, 6唾 液酸基轉(zhuǎn)移酶(20單位活性)。反應(yīng)液在4t:緩慢攪拌12 h。反應(yīng)液通過His-Tag蛋白純化柱 除去所有的糖基轉(zhuǎn)移酶。然后反應(yīng)液通過透析除去沒有反應(yīng)的尿苷二磷酸-葡萄糖等小分子， 緩沖溶液以及金屬離子而得到高含量唾液酸的靜脈注射免疫球蛋白G。經(jīng)過檢測唾液酸的含 量，與沒有反應(yīng)的靜脈注射免疫球蛋白G相比，經(jīng)過糖基轉(zhuǎn)移酶催化的靜脈注射免疫球蛋白 G的唾液酸的含量提高了 10 15倍。
圖1給出本發(fā)明實施例的靜脈注射免疫球蛋白的N-連接糖基的不同結(jié)構(gòu)示意圖，通過糖 基轉(zhuǎn)移酶催化把唾液酸連接到靜脈注射免疫球蛋白G的N-連接糖基上的末端而把把沒有抗炎 活性的成分轉(zhuǎn)化為有效成分(A)。免疫球蛋白抗體含有兩個N-連接糖側(cè)鏈，為了圖示的簡單， 僅畫出一個。ei， 4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶以尿苷二磷酸-半乳糖為底物，催化連接半乳糖(圖l， 圓形)到免疫球蛋白糖基的末端N-乙酰氨基葡萄糖上使得C轉(zhuǎn)化為D;唾液酸基轉(zhuǎn)移酶以胞 苷-5'-磷酸-唾液酸為底物催化連接唾液酸(圖1，菱形)到免疫球蛋白糖基末端的半乳糖上使 得成分B與D轉(zhuǎn)化為A。
經(jīng)實驗，高唾液酸含量的靜脈注射免疫球蛋白G與未經(jīng)本發(fā)明處理的靜脈注射免疫球蛋 白G被分別注射到有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小老鼠體內(nèi)(O. lg/Kg)與靜脈注射免疫球蛋白G相比， 高唾液酸含量的靜脈注射免疫球蛋白G能夠有效地保護(hù)小老鼠的關(guān)節(jié)發(fā)炎程度(藥效提高4 5倍)。
權(quán)利要求
1、高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法，其特征在于其步驟為1)胞苷-5’-磷酸唾液酸合成酶催化唾液酸與胞苷-5’-三磷酸反應(yīng)生成胞苷-5’-磷酸-唾液酸；2)β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶以尿苷二磷酸-半乳糖為底物，催化連接半乳糖到免疫球蛋白糖基的末端N-乙酰氨基葡萄糖上；3)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶以胞苷-5’-磷酸-唾液酸為底物催化連接唾液酸到免疫球蛋白糖基末端的半乳糖上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法，其特征在于免疫 球蛋白為多克隆免疫球蛋白抗體或單克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法，其特征在于多克 隆免疫球蛋白抗體選自靜脈注射免疫球蛋白G。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法，其特征在于單克 隆抗體選自免疫球蛋白M或免疫球蛋白A。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法，其特征在于底物 為尿苷二磷酸-半乳糖，或尿苷二磷酸-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶酶催化尿苷二磷酸-葡萄糖生成的 尿苷二磷酸-半乳糖。 '
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法，其特征在于唾液 酸基轉(zhuǎn)移酶為a2，6唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，a2，3唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，a 2， 8唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，a 2， 9 唾液酸基轉(zhuǎn)移酶或a 2, 8/9多聚唾液酸基轉(zhuǎn)移酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所制備的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體在制備治療自身免疫性疾病 藥物中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的治療自身免疫性疾病藥物為類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎藥物。
全文摘要
高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法與應(yīng)用，涉及一種免疫球蛋白抗體，尤其是涉及一種采用糖基轉(zhuǎn)移酶催化增加免疫球蛋白抗體上的唾液酸含量的方法及其應(yīng)用。提供一種高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體的制備方法及其應(yīng)用。胞苷-5’-磷酸-唾液酸合成酶催化唾液酸與胞苷-5’-三磷酸反應(yīng)生成胞苷-5’-磷酸-唾液酸；β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶以尿苷二磷酸-半乳糖為底物，催化連接半乳糖到免疫球蛋白糖基的末端N-乙酰氨基葡萄糖上；唾液酸基轉(zhuǎn)移酶以胞苷-5’-磷酸-唾液酸為底物催化連接唾液酸到免疫球蛋白糖基末端的半乳糖上。所制備的高唾液酸含量的免疫球蛋白抗體可用于制備治療自身免疫性疾病藥物，尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
文檔編號A61K39/395GK101358225SQ20071000930
公開日2009年2月4日 申請日期2007年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月30日
發(fā)明者韓守法, 韓家淮 申請人:廈門大學(xué)