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      一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法

      文檔序號:3493683閱讀:423來源:國知局
      一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法
      【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液,將其濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高分子量多糖肽。用濃度為1%的冬蟲夏草多糖肽溶液,緩慢滴加無水乙醇至1∶0.5(V/V),離心,分級沉淀,干燥得第1級成分為冬蟲夏草多糖肽1。取上清液再滴加無水乙醇至1︰1(V/V)同上處理,收集33~50%的沉淀,干燥得第2級成分為冬蟲夏草2;將上清液繼續(xù)再加乙醇至1︰1.5(V/V),得第3級成分冬蟲夏草3,取冬蟲夏草3以1∶10比例加水微熱溶解,通過多次柱分離,透析12~20h,取袋內(nèi)液濃縮,沉淀,離心,收集沉淀部分,冷凍干燥,得冬蟲夏草多糖肽。本發(fā)明自行制備冬蟲夏草多糖肽對照品,可將其應(yīng)用于該類產(chǎn)品的測定。
      【專利說明】一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及一種多糖肽,尤其是一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法。

      【背景技術(shù)】
      [0002] 冬蟲夏草是極為名貴的補(bǔ)益藥和保健極品,因含有蟲草素、蟲草酸、腺苷、蟲草多 糖、S0D等多種已知和尚在被發(fā)現(xiàn)生物活性物質(zhì)以及氨基酸、多種微量元素和維生素等有 效成分,具有鎮(zhèn)靜、止咳化痰和抑制腫瘤細(xì)胞生長、增加機(jī)體對健身防病有著特有免疫的功 效,是與人參、鹿茸齊名的三大珍品。
      [0003] 肽是蛋白質(zhì)的初級形式,幾乎涉及人體激素、神經(jīng)、生長、生殖等生命的全過程,具 有調(diào)節(jié)機(jī)體功能,維持生命活動的活性物質(zhì)。
      [0004] 多糖肽是一種糖蛋白,是多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合體。一般含有很高比例的多糖,它們 被看做是糖胺多糖,具有很高的分子量,由雙糖的重復(fù)單元組成。多糖肽具有很強(qiáng)生物活 性,初步研究多糖肽能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,具有抗腫瘤作用和抗氧化作用。
      [0005] 冬蟲夏草是我國青藏高原雪域地帶特有的一種天然、野生、具有珍貴知識產(chǎn)權(quán)的 蟲草,也稱極草。任何人工培育蛹蟲草或蟲草菌絲體都無法與其相提并論,更不能被冠以 "冬蟲夏草"。自行制備冬蟲夏草多糖肽對照品(純度大于95%),并將其應(yīng)用于該類產(chǎn)品 的測定,該研究尚未見記載。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006] 本發(fā)明目的是提供一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,自行制備冬蟲夏草多糖 肽對照品(純度大于95% ),并將其應(yīng)用于該類產(chǎn)品的測定,且通過蒸發(fā)光散射檢測器 (HPLC-ELSD)對冬蟲夏草樣品中的多糖肽成分進(jìn)行定性與定量分析。
      [0007] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,該方法包括以下步 驟:
      [0008] 步驟1 :取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液,將其濃縮、離心、透析、截留而獲得 的含有高分子量多糖肽;
      [0009] 步驟2 :取步驟1中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液, 在不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 0.5 (V/V),置:TC?5°C溫度下存放 12-20h,用10000-12000rpm離心,用無水乙醇分級沉淀,收集33%乙醇沉淀部分,置冰箱真 空干燥得第1級成分為冬蟲夏草多糖肽1 ;
      [0010] 步驟3:取步驟2中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至1 : 1(V/V),用 無水乙醇分級沉淀,收集33?50%的沉淀,置:TC?5°C溫度下存放12-20h,真空干燥后得 第2級成分為冬蟲夏草2;將冬蟲夏草2上清液繼續(xù)再加乙醇至1 : 1.5 (V/V),得第3級成 分冬蟲夏草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。
      [0011] 步驟4 :取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例(V/V)加水微熱溶解,離心去雜,通 過聚丙烯胺凝膠至少2次柱分離,用含50mol ?L-lNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液, 透析12?20h,取袋內(nèi)液濃縮,用三倍無水乙醇沉淀,離心,收集沉淀部分,在-16°C?-20°C 溫度下干燥,得淺褐色粉末狀物質(zhì)為冬蟲夏草多糖肽。
      [0012] 經(jīng)HPLC制備單峰,并用HPLC-PDA/ELSD檢測結(jié)果為冬蟲夏草多糖肽單峰,純度在 95%以上。
      [0013] 上述步驟⑷中采用10000-12000rpm離心去雜。
      [0014] 上述步驟(4)中含50mol · LlaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 5. 8-6. 0,濃度為0· 2mol/L時效果最佳。
      [0015] 上述步驟(4)中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
      [0016] 上述對本發(fā)明結(jié)構(gòu)和方法的描述可知,和現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):其 一,本發(fā)明自行制備冬蟲夏草多糖肽對照品(純度大于95%),可將其應(yīng)用于該類產(chǎn)品的測 定。其二,本發(fā)明可通過蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)對冬蟲夏草樣品中的多糖肽成分 進(jìn)行定性與定量分析。其三,本發(fā)明樣品前處理簡單快捷、省時省力,有利于冬蟲夏草產(chǎn)品 中多糖肽成分的準(zhǔn)確定性與定量。其四,本發(fā)明的方法操作簡便,回收率高,重復(fù)性好,結(jié)果 準(zhǔn)確可靠,有利于冬蟲夏草產(chǎn)品中保健功能因子的鑒定分析。

      【具體實(shí)施方式】
      [0017] 實(shí)施例一:
      [0018] 一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,該方法包括以下步驟:
      [0019] 步驟1 :取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液,將其濃縮、離心、透析、截留而獲得 的含有高分子量多糖肽;
      [0020] 步驟2 :取步驟1中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液,在 不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 0.5(v/v),置:TC溫度下存放12h,用 lOOOOrpm離心,用無水乙醇分級沉淀,收集33 %乙醇沉淀部分,置冰箱真空干燥得第1級成 分為冬蟲夏草多糖肽1 ;
      [0021] 步驟3:取步驟2中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至1 : 1(V/V),用 無水乙醇分級沉淀,收集33?50%的沉淀,置:TC溫度下存放12h,真空干燥后得第2級成 分為冬蟲夏草2;將冬蟲夏草2上清液繼續(xù)再加乙醇至1 : 1.5 (V/V),得第3級成分冬蟲夏 草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。
      [0022] 步驟4 :取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例加水微熱溶解,采用lOOOOrpm離心 去雜,通過聚丙烯胺凝膠至少2次柱分離,用含50mol ?PNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 緩沖液,透析12h,取袋內(nèi)液濃縮,用三倍無水乙醇沉淀,離心,收集沉淀部分,在-16°C溫 度下干燥,得淺褐色粉末狀物質(zhì)為冬蟲夏草多糖肽。
      [0023] 經(jīng)HPLC制備單峰,并用HPLC-PDA/ELSD檢測結(jié)果為冬蟲夏草多糖肽單峰,純度在 95%以上。
      [0024] 步驟⑷中含50mol · LlaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 5. 8,濃 度為0.2mol/L時效果較佳。
      [0025] 步驟(4)中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
      [0026] 本發(fā)明自行制備冬蟲夏草多糖肽對照品(純度大于95% ),可將其應(yīng)用于該類產(chǎn) 品的測定。本發(fā)明可通過蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)對冬蟲夏草樣品中的多糖肽成分 進(jìn)行定性與定量分析。本發(fā)明樣品前處理簡單快捷、省時省力,有利于冬蟲夏草產(chǎn)品中多糖 肽成分的準(zhǔn)確定性與定量。本發(fā)明的方法操作簡便,回收率高,重復(fù)性好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,有 利于冬蟲夏草產(chǎn)品中保健功能因子的鑒定分析。
      [0027] 實(shí)施例二:
      [0028] 步驟1 :取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液,將其濃縮、離心、透析、截留而獲得 的含有高分子量多糖肽;
      [0029] 步驟2 :取步驟1中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液,在 不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 〇.5(V/V),置4°C溫度下存放16h,用 llOOOrpm離心,用無水乙醇分級沉淀,收集33%乙醇沉淀部分,置冰箱真空干燥得第1級成 分為冬蟲夏草多糖肽1 ;
      [0030] 步驟3:取步驟2中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至1 : 1(V/V),用 無水乙醇分級沉淀,收集33?50%的沉淀,置4°C溫度下存放16h,真空干燥后得第2級成 分為冬蟲夏草2;將冬蟲夏草2上清液繼續(xù)再加乙醇至1 : 1.5 (V/V),得第3級成分冬蟲 夏草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。
      [0031] 步驟4 :取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例加水微熱溶解,采用llOOOrpm離心 去雜,通過聚丙烯胺凝膠4次柱分離,用含50mol 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖 液,透析16h,取袋內(nèi)液濃縮,用三倍無水乙醇沉淀,離心,收集沉淀部分,在-18°C溫度下干 燥,得淺褐色粉末狀物質(zhì)為冬蟲夏草多糖肽。
      [0032] 經(jīng)HPLC制備單峰,并用HPLC-PDA/ELSD檢測結(jié)果為冬蟲夏草多糖肽單峰,純度在 95%以上。
      [0033] 步驟⑷中含50mol · LlaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 5. 9,濃 度為0.2mol/L時效果較佳。
      [0034] 步驟(4)中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
      [0035] 該冬蟲夏草多糖肽可在測定冬蟲夏草產(chǎn)品質(zhì)量中應(yīng)用。
      [0036] 實(shí)施例三:
      [0037] -種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,該方法包括以下步驟:
      [0038] 步驟1 :取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液,將其濃縮、離心、透析、截留而獲得 的含有高分子量多糖肽;
      [0039] 步驟2 :取步驟1中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液,在 不斷攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 〇.5(V/V),置5°C溫度下存放20h,用 12000rpm離心,用無水乙醇分級沉淀,收集33 %乙醇沉淀部分,置冰箱真空干燥得第1級成 分為冬蟲夏草多糖肽1 ;
      [0040] 步驟3:取步驟2中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至1 : 1(V/V),用 無水乙醇分級沉淀,收集33?50%的沉淀,置5°C溫度下存放20h,真空干燥后得第2級成 分為冬蟲夏草2;將冬蟲夏草2上清液繼續(xù)再加乙醇至1 : 1.5 (V/V),得第3級成分冬蟲夏 草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品。
      [0041] 步驟4 :取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例加水微熱溶解,采用12000rpm離心 去雜,通過聚丙烯胺凝膠6次柱分離,用含50mol 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖 液,透析20h,取袋內(nèi)液濃縮,用三倍無水乙醇沉淀,離心,收集沉淀部分,在-20°C溫度下干 燥,得淺褐色粉末狀物質(zhì)為冬蟲夏草多糖肽。
      [0042] 經(jīng)HPLC制備單峰,并用HPLC-PDA/ELSD檢測結(jié)果為冬蟲夏草多糖肽單峰,純度在 95%以上。
      [0043] 上述步驟(4)中含50mol ?PNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 6. 0, 濃度為〇. 2mol/L時效果較佳。
      [0044] 步驟(4)中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
      [0045] 該冬蟲夏草多糖肽可在測定冬蟲夏草產(chǎn)品質(zhì)量中應(yīng)用。
      [0046] 上述僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】,但本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思并不局限于此,凡利用此 構(gòu)思對本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的改動,均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。
      【權(quán)利要求】
      1. 一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,其特征在于,該方法包括以下步驟: (1) 取以冬蟲夏草純粉為原料的水提取液,將其濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高 分子量多糖肽; (2) 取步驟(1)中濃度為1 %的含有高分子量多糖肽的冬蟲夏草多糖肽溶液,在不斷 攪拌中緩慢滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 0. 5,置3°C?5°C溫度下存放12-20h,用 10000-12000rpm離心,用無水乙醇分級沉淀,收集33%乙醇沉淀部分,置冰箱真空干燥得 第1級成分為冬蟲夏草多糖肽1 ; (3) ?。?)步驟中的冬蟲夏草多糖肽1上清液再滴加無水乙醇至體積百分比為1 : 1, 用無水乙醇分級沉淀,收集33?50%的沉淀,置:TC?5°C溫度下存放12-20h,真空干燥后 得第2級成分為冬蟲夏草2 ;將冬蟲夏草2上清液繼續(xù)再加乙醇至體積百分比為1 : 1. 5, 得第3級成分冬蟲夏草3,置真空干燥得冬蟲夏草多糖肽粗品; (4) 取冬蟲夏草多糖肽粗品以1 : 10比例加水微熱溶解,離心去雜,通過聚丙烯胺凝 膠至少2次柱分離,用含50mol · L-lNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液,透析12? 20h,取袋內(nèi)液濃縮,用三倍無水乙醇沉淀,離心,收集沉淀部分,在-16°C?-20°C溫度下干 燥,得淺褐色粉末狀物質(zhì)為冬蟲夏草多糖肽。
      2. 按照權(quán)利要求1所述的一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,其特征是:經(jīng)HPLC制備單 峰,并用HPLC-PDA/ELSD檢測結(jié)果為冬蟲夏草多糖肽單峰,純度在95%以上。
      3. 按照權(quán)利要求1所述的一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,其特征是:所述步驟(4) 中采用10000-12000rpm離心去雜。
      4. 按照權(quán)利要求1所述的一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,其特征是:所述步驟(4) 中的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液其pH = 5. 8-6. 0,濃度為0. 2mol/L時效果最佳。
      5. 按照權(quán)利要求1所述的一種制備冬蟲夏草多糖肽的方法,其特征是:所述步驟(4) 中聚丙烯胺凝膠采用Bio-Gel系列時效果最佳。
      【文檔編號】C07K1/36GK104151395SQ201410213401
      【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
      【發(fā)明者】黃宏南, 林冬梅, 王賽貞, 羅虹建, 林樹錢 申請人:黃宏南
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