專利名稱：一種核苷酸疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種技術和方法，藉此，當應用病毒的和基于DNA的疫 苗時，可獲得更快、更寬泛和更強的免疫應答。
背景技術：
盡管在免疫學領域中已具備當前的知識尤其是關于疫苗的技術，但是 尚未獲得適于抗多種病原體的疫苗。廣泛傳播的HIV (人免疫缺陷病毒)、 HTLV (人T細胞親淋巴病毒)、結核病和HCV (丙型肝炎病毒)的大流 行病仍然是有效接種力所未及的，同時禽流感和其他出現(xiàn)的病原體威脅著 顛覆我們的衛(wèi)生健康體系。同樣地，世界范圍恐怖主義的爆發(fā)已將潛在的 流行病擴大到包括外來的且致命的病原體諸如埃博拉病毒、拉沙病毒和馬 爾堡病毒。
疫苗可以是預防性的它們是在實際感染發(fā)生前就神皮施用，或是治療 性的這樣它們引起或促進對已在體內病原體的免疫應答。接種的兩種方 法都需要建立穩(wěn)固的免疫應答。由感染或接種激活的免疫應答依賴于幾種 細胞類型的交互作用，該細胞類型諸如T、 B和抗原呈遞細胞以及幾種不 同的分子，主要是抗原、MHC分子、T和B細胞受體，等等。
抗原是肽片段，由MHC分子在抗原呈遞細胞表面上呈遞。抗原可以 是外來的，即病原性來源，或者源自生物體本身，因而稱作自身或自體抗 原。MHC分子是由特定染色體區(qū)域編碼的多態(tài)性基因家族的代表，被稱為"主要組織相容性復合體"，即MHC。存在兩種類型的MHC分子，MHC I型(MHC-I)和MHC II型(MHC-II )。
輔助性T細胞是由存在于抗原呈遞細胞表面上的MHC II型(MHC-II) 分子所呈遞的抗原而刺激。MHC-II分子是在內質網(wǎng)內合成的。在合成過 程中，它們以防止MHC-II分子被與自身或自體抗原 一起負載的方式與恒 定鏈(Ii)組合在一起。MHC-II分子經(jīng)恒定鏈中的信號序列被轉運至特定 細胞室(compartment)內的細胞表面。隨著該室經(jīng)處理它的內容物的成熟， 它從溶酶體進展到次級內體(在與內吞嚢泡融合后)再到MHC II類室 (MIIC)。內吞嚢泡包含外源抗原，即蛋白酶切割的細菌肽片段。這些片 段是經(jīng)它們的降解而制備的，以便被負載到MHC-II分子。MHC-II分子是 由恒定鏈以兩部分處理而釋放的，恒定鏈首先被蛋白酶降解，在MHC-II 結合域內只留下被稱作CLIP的肽，然后用HLA-DM分子除去CLIP。此 時，MHC-II分子是游離的，以便于結合外源抗原并且在MIIC嚢泡融合至 質膜后將這些呈遞在細胞表面。這啟動了體液的免疫應答，因為被呈遞的 抗原刺激了輔助性T細胞的激活，反過來又以多種方式激活B細胞，它最 終分化為抗體分泌細胞。
細胞免疫應答被啟動，當T細胞毒性細胞的T細胞受體識別了在抗原 呈遞細胞上^f皮結合至MHC I類分子的抗原時。MHC-I分子不與功能性類 似于恒定鏈(其與MHC-II締合)的分子締合。另外，MHC-I至抗原呈遞 分子的加工不同于MHC-II分子的加工，區(qū)別之處在于MHC-I分子已在內 質網(wǎng)中與抗原一起被負載。由MHC-I分子呈遞的抗原主要是蛋白質的蛋白 酶體切割的肽片段，它已由抗原呈遞細胞自身合成。這些蛋白可以是在細 胞內擁有的DNA編碼的異常蛋白，或者是衍生于病毒或已感染細胞并寄 生于它的蛋白質合成機器的其他病原體的蛋白。涉及MHC I類的蛋白酶解 系統(tǒng)存在于幾乎所有的細胞中。
兩種類型T細胞的功能是明顯不同的，如它們的名稱所隱含的。細胞 毒性T細胞消除細胞內病原體和腫瘤，是通過直接的細胞溶解和通過分泌 細胞因子諸如Y-干擾素。主要的細胞毒性T細胞是CD8+T細胞，它還是抗 原特異性的。輔助性T細胞也可以溶解細胞，但是它們的主要功能是分泌細胞因子，該細胞因子提高了 B細胞(產生抗體的細胞)和其他T細胞的 活性，因此它們廣泛地增強了對外源抗原的免疫應答，包括抗體介導的和
細胞毒性T細胞介導的應答機制。CD4+T細胞是免疫應答中的主要輔助性 T細胞表型。
傳統(tǒng)的疫苗依靠于完整的生物體，即已被殺滅的病原性菌抹或者減弱 病原性的菌抹。 一方面，這些疫苗冒著引入它們被設計去預防的疾病的風 險，如果減毒不充分或者如果在疫苗制備過程中足夠多的生物體經(jīng)殺滅步 驟而存活下來。另一方面，這種疫苗已減少了傳染性而且常常是免疫原性 不足的，其導致源自接種的保護不充分。
最近，分子生物學技術已被用于開發(fā)新的疫苗，基于來自病原性生物 體的個體抗原性蛋白。概念上，使用抗原性肽而非完整生物體可避免病原 性，同時提供包含最大免疫原性抗原的疫苗。但是，已證明選擇給定蛋白 或多肽的最佳抗原是困難的，此外，已發(fā)現(xiàn)，純的肽或碳水化合物趨于是 弱的免疫原。
遺傳(DNA)疫苗是新的且有希望的候選者，用于預防性和治療性兩 種疫苗的研發(fā)。通過組合載體(即，棵DNA、病毒載體、減毒活病毒，等) 的效能、抗原的表達水平以及重組的抗原本身(即，高的或低的親合性 MHC結合物，結構決定子的選擇用于或多或少地限制T或B細胞庫等) 來確定后來發(fā)生免疫應答的強度。通常這纟皮認為是正確的，即免疫記憶的 有效誘導需要或者得益于CD4+ (輔助性細胞)T細胞與CD8+ (細胞毒性 的)T細胞和B細胞的相互作用，它們介導了許多免疫記憶的作用。但是， 常規(guī)DNA疫苗的一種潛在缺點是它們在人體中的低免疫原性。這種低免 疫原性的 一種可能起因是細胞內所形成的抗原限制性進入用于抗原加工 和對輔助性T細力包呈遞的MHC II途徑。
發(fā)明概述
因此，本發(fā)明以提高應答動力學的方式解決了刺激免疫應答的問題， 同時擴展和改善了應答，此外，避免了現(xiàn)有技術中所述接種方法的上述缺點。尤其是，特此提供了一種用于直接的、特異性和快速刺激免疫系統(tǒng)的 新系統(tǒng)，以便改善所有動物的接種。
這種問題是用本發(fā)明的實施方案解決的，它們的特征列于權利要求。 根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)抗原融合至恒定鏈極大地加強了后來發(fā)生的抗病毒CD4+
和CD8+T細胞應答。此外，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，這種作用是通過CD4+T細 胞獨立性機理而獲得的。進一步還發(fā)現(xiàn)，這種保護在急性局部化且致命性 感染中不僅被加速而且被加強，和在高劑量系統(tǒng)性感染中被加強。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種核酸構建體，其包含編碼以下的 序列至少一個恒定鏈，該恒定鏈在操作上被連接至至少一個抗原性蛋白 或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。
一方面，本發(fā)明還提供了一種腺病毒載體，其包含編碼以下的核苷酸 構建體刺激免疫應答的、至少一個抗原和至少一個蛋白或者肽或者蛋白 或肽的片段。
因此， 一方面，本發(fā)明提供了用腺病毒載體刺激MHC-I介導的免疫應 答的手段，該載體包含編碼至少一個抗原和至少一個蛋白或者肽或者蛋白 或肽的片段的核苷酸構建體。
另一方面包括了用腺病毒載體刺激MHC-II應答，該載體包含編碼至 少一個抗原和至少一個蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段的核苷酸構建體。
另一方面，本發(fā)明提供了刺激核酸構建體、腺病毒載體、任意這些或 任意這些的任意部分內所編碼蛋白的細胞間傳播的手段。
本發(fā)明的另 一個目的是提供一種包含如這里所詳述核酸構建體的傳 輸媒介物，特別是與本發(fā)明相關的一種傳輸媒介物，例如復制缺陷腺病毒 載體。
本發(fā)明的另一個目的和方面是提供一種細胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的核 酸構建體或腺病毒載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種嵌合蛋白，如這里所述核酸構建體所 編碼的或者這里所述腺病毒載體所編碼的。本發(fā)明的另 一方面是提供一種抗體，其識別由這里所述的核酸構建體 或腺病毒載體所編碼的嵌合蛋白。
本發(fā)明的 一個方面是提供一種疫苗，其包含如這里所詳述的核酸構建 體或腺病毒載體。本發(fā)明特別涉及一種疫苗，在該疫苗中至少一個恒定鏈 在操作上被連接至刺激MHC-I應答的、至少一個蛋白或者肽或者蛋白或肽 的片段。這可以經(jīng)由在操作上將至少一個恒定鏈與至少 一個抗原性蛋白或 者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段相連接而實現(xiàn)。
本發(fā)明的另一個方面是提供一種疫苗，其包含如這里所詳述的核酸構 建體或腺病毒載體內所編碼的嵌合蛋白。
本發(fā)明的另一個方面是提供一種成套試劑盒(kit mparts),所述試劑 盒包括包含如這里所述腺病毒載體或核酸構建體的疫苗組合物，同時帶有 醫(yī)療儀器或者將所述疫苗施用的其他手段，以及另外的關于如何使用成套 試劑盒的說明書。
此外，本發(fā)明提供了用于在動物中誘導免疫應答的手段，其借助對動 物施用 一種包含如下所詳述核酸構建體或腺病毒載體的疫苗進行。


圖1:在腺病毒載體中插入的示意圖。
圖2: CD8+和CD4+ T細胞對編碼表位腺病毒的應答。
圖3:在Ft雜種小鼠中CD8+和CD4+ T細胞對編碼表位腺病毒的應答。
圖4: Ad-IiGP發(fā)揮與CD4+ T細胞無關的CD8+ T細胞刺激作用。
圖5: Ad-IiGP賦予快速和上佳的保護，防止致命性LCMV感染。
圖6: Ad-IiGP有效地保護，防止高劑量、靜脈內LCMV感染。
圖7:對具有優(yōu)勢免疫表位中突變的致命性LCMV變體，Ad-IiGP賦 予上佳保護。
圖8:在Ad-IiGP接種和用帶有優(yōu)勢免疫表位中突變的LCMV變體攻 擊之后，CD8+或CD4+ T細胞對特異性LCMV表位反應的頻率。圖9: CD8+和CD4+ T細胞對用棵DNA-IiGP和DNA-GP接種的應答。
圖10:用Ad-Ii-GP預防性接種增加腫瘤的排斥。
圖11:用Ad-Ii-GP治療性接種在攜帶腫瘤小鼠中增加平均壽命。
圖12:用Ad-Ii-VSVGP或Ad-VSVGP接種后的存活率。
圖13: CD8+和CD4+T細胞對更多編碼表位腺病毒的應答。
圖14:用CD8+T細胞對編碼表位腺病毒的應答測量Ad-Ii-GP構建體 相比于Ad-GP-Lamp-l構建體的有效性。
圖15:基于框內多聚接頭(polylinker)的載體。
圖16:具有IRES2位點的載體。
發(fā)明的詳述 定義
腺病毒 一組含有雙鏈DNA的病毒。腺病毒可進行遺傳上修飾，使 得它們成為無能力的復制體或者有條件的無能力復制體。在這種形式中， 作為腺病毒構建體或腺病毒載體(adenovector)，它們可^^皮用作基因傳輸々某 介物，用于接種或基因療法。
佐劑任意物質，它與被施用的免疫原性決定子/抗原/核酸構建體的 混合物增加或以其他方式修飾對所述決定子的免疫應答。
氨基酸任意的、合成或天然的氨基羧酸，包括在肽和多肽(包括體 內合成的蛋白質和酶)中存在的任意氨基酸，因此包括修飾的氨基酸。術 語氨基酸在這里是與術語"氨基酸殘基"同義地使用，"氨基酸殘基"的含義 預期包括規(guī)定的氨基酸，該氨基酸已與至少一個其他種類，諸如2,例如 3,諸如多于3個的其他種類發(fā)生了反應。通用術語氨基酸既包括天然的 也包括非天然的氨基酸，其任一個可以是"D"或"L"異構體的形式。
抗體免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分?？贵w是例如完 整的免疫球蛋白分子或其保留免疫原活性的片段。抗原任何的能結合至克隆分布免疫受體(T細胞或B細胞受體)的 物質。通常為肽、多肽或多聚多肽(multimeric polypeptide )?？乖瓋?yōu)選地 能引起免疫應答。
加強用追加注射或用藥以增強是指規(guī)定在初次用藥之后的一l殳時間 給予額外劑量的免疫劑例如疫苗，以便持續(xù)早期相同藥劑用藥所引起的免 疫應答。
載運體(Carrier):與抗原偶合以有助于誘導免疫應答的實體或化合物。
嵌合蛋白 一種遺傳工程蛋白，它是由兩種或以上完整的或部分的基 因或者一系列(非)隨機的核酸剪接在一起制造的核苷酸序列所編碼的。
補體 一種復合系列的血蛋白，其作用"互補(complement)"抗體的 工作。補體破壞細菌，產生炎癥，而且調節(jié)免疫反應。
細胞因子生長或分化調節(jié)劑，這里是非限定性使用，并且不應當用 于限制本發(fā)明及權利要求的解釋。除了細胞因子，粘附或附屬分子，或者 它們的任意組合物，可以單獨地利用或與細胞因子組合使用。
CTL:細胞毒性T淋巴細胞。 一個亞組的T細胞，其與T細胞受體一 起表達CD8，因而能夠對I類分子呈遞的抗原應答。
傳輸媒介物 一種實體，藉此核苷酸序列或多肽或兩者可被從至少一 種介質轉運至另一種。
片段用于表示非全長部分的核酸或多肽。因此，片段本身也分別是 核酸或多肽。
個體任意物種或亞種的鳥、哺乳動物、魚、兩棲動物或爬4于動物。
恒定鏈 一種整合的膜蛋白糖蛋白，其締合于和穩(wěn)定內質網(wǎng)及隨后細 胞室的MHC II分子。這里的術語恒定鏈涵蓋了所有天然的或人工產生的 全長或者片段化同源基因以及一定程度近似于人恒定鏈的蛋白質。這里， 恒定鏈簡化為Ii。
分離出的(Isolated ):與此處所公開的核酸、多肽和抗體聯(lián)合使用的"分離出的"是指這些已被鑒別和從它們天然的(主要是細月包的)環(huán)境分開和/ 或回收。本發(fā)明的核酸、多肽和抗體優(yōu)選地是分離出的，而且，本發(fā)明的 疫苗和其他組合物優(yōu)選地包含分離出的核酸、多肽或者分離出的抗體。
MHC:主要組織相容性復合體，存在MHC的兩個主要亞類，I類和 II類。
核酸傳達遺傳信息的核苷酸鏈或序列。就本發(fā)明而言，核酸是脫氧 核糖核酸(DNA)。
核酸構建體 一種遺傳工程核酸。 一般地包含幾種元件，例如基因或 其片段、啟動子、增強子、終止子、聚A尾、接頭、多聚接頭、操作接頭 (operative linker)、多克隆位點(MCL)、標記、終止密碼子，其他的調節(jié) 元件、內部核糖體進入位點(IRES)或其他。
操作接頭 一種核苷酸或氨基酸殘基序列，其將兩部分核酸構建體或 (嵌合)多肽結合在一起，可以保證核酸或多肽的生物學加工。
病原體 一種特異性疾病致因劑，尤其是生物劑，例如病毒、細菌、 朊病毒或能引起它的宿主生病的寄生物，也被稱為傳染劑。
肽多種共價連接的氨基酸殘基所限定的序列并且以酰胺鍵連接。該 術語與寡肽和多肽近似地使用。天然和/或非天然氨基酸可以肽鍵或者以非 肽鍵相連。術語肽還包括翻譯后的修飾，通過化學的或酶催化的反應而引 入，如本領域已知的。該術語可以指多肽的變異體或片段。
藥物載運體也被稱作賦形劑或穩(wěn)定劑，對細胞或者個體是無毒性的， 當以所用劑量和濃度使細胞或個體暴露于它們時。通常，生理學上可接受 的載運體是含水的pH緩沖溶液。生理學上可接受載運體的實例包括緩沖 劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽，以及其他的有機酸類；抗氧化劑，包括抗壞血酸； 低分子量(少于約10個殘基)的多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠 或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨 酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖及其他的破水化 合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖醇，諸如甘 露醇或山梨醇；成鹽的抗衡離子，諸如鈉離子；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS 。 多個(Plurality):至少兩個。
啟動子在DNA鏈的結合位點，在此RNA聚合酶結合從而起始信使 RNA和一個或多個的鄰近結構基因的轉錄。
信號肽 一種短序列的氨基酸，其決定細胞中蛋白質的最終定位，也 被稱為分選肽。
siRNA:小干擾RNA ( siRNA),其耙向于(以序列特異性的方式)內 源性RNA,用于降解，藉此減少基因產物的量。
表面活性劑表面的活性劑，其能夠降低液體的表面張力，當它溶解 在液體中時。表面活性劑是一種包含親水性極性基團和疏水性非極性基團 的化合物，而且通常由脂肪鏈組成。
疫苗 一種物質或組合物，其能夠在動物中誘導免疫應答。在本發(fā)明 的正文中，也被稱作免疫原性組合物。免疫應答是一種在生物體內誘導記 憶的免疫應答(體液的/抗體和/或細胞的)，產生傳染劑，是由繼發(fā)性而非 初始性應答應付的，因此降低了對宿主生物體的影響。本發(fā)明的疫苗可以 規(guī)定為或者預防性的和/或治療性藥物。該組合物可以包含一種或多種的下 列物質抗原、包含一個或多個在操作上一皮連接至Ii的抗原的核酸構建體、 載運體、佐劑以及藥物載運體。
變體 一種已知的參照核酸或多肽的變體，是指這樣的核酸或多肽一 一其表現(xiàn)一定程度的相對于所述參照核酸或多肽的序列同源性/同一性，但 是與所述參照核酸或多肽不相同。
本發(fā)明涉及一種疫苗，其包含一種核酸構建體諸如DNA構建體，特 別是包含編碼在操作上被連接至抗原性蛋白或者編碼肽的序列的恒定鏈 的序列的核酸構建體。該疫苗刺激免疫應答，特別是以MHC-I依賴型、而 CD4+T細胞獨立型方式的免疫應答。
核酸構建體
一方面，本發(fā)明涉及核酸構建體，其包含編碼至少一個恒定鏈的序列，該恒定鏈在操作上被連接至至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或 肽的抗原性片段，簡言之， 一種抗原。
核酸構建體可理解為一種遺傳工程核酸。該核酸構建體可以是一種非 復制的而且線性的核酸、 一種循環(huán)表達的載體、 一種自主復制質粒或病毒 表達載體。核酸構建體可包含幾種元件，例如但不限于基因或其片段、啟 動子、增強子、終止子、聚-A尾、接頭、聚多接頭、操作接頭、多克隆位
點(MCS)、標記、終止密碼子、內部核糖體進入位點(IRES)以及宿主 同源性整合序列或者其他的已定義元件。工程核酸構建體的方法是本領域 內熟知的(參見，例如，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Sambrook等，編輯，Cold Spring Harbor Laboratory,第 2版，冷泉港，紐約，1989年)。
在圖1、 15和16,以及在鑒定為SEQIDNO: 5、 6、 7、 8、 9和10的 序列中，給出核酸構建體的部分實例。SEQIDNO: 5、 6、 7、 8、 9和10 的部分載體序列已用如上所述的亞克隆各種元件而產生，并且表示于圖1、 15和16中。這些部分序列都被插入pAC-CMVpLpARS(+)載體(Becker等， 1994, A^Z/wA Ce〃說o/. 43 A部分161-189),參見基因庫登錄號 AY590429丄
恒定鏈
恒定鏈(Ii)或CD74,是一種非多態(tài)II型整合膜蛋白，參見分別用于 人和小鼠Ii氨基酸序列的SEQ ID NO: 2和4,以及同樣地分別用于人和 小鼠Ii核酸序列的SEQ ID NO: 1和3。恒定鏈具有多重功能，在淋巴細 胞成熟方面和在適應性免疫應答方面，特別是在靶向于溶酶體室方面，Ii CLIP序列可占用MHCII類分子直至這些與核內體室相融合(Pieters J. 1997: Cmw <9p/". /wmw2o/.， 9:8996)。此外，Ii已顯示作為MHC I類分子伴倡的功 能(Morris等，2004,/mmw"o/.化s. 30:171-179)，而且用它的核內體靶向序 列，以有助于CD4+而非CD8+ T細胞的刺激，針對共價地連接的抗原 (Diebold等，2001 , G麼7fe 8:487- 493 )。
恒定鏈蛋白包含多個域包括信號肽或分選肽的胞質域(又被稱作溶 酶體靶向序列)，跨膜域，以及本身包含CLIP區(qū)、KEY區(qū)、核心域和三聚體域的腔內域。這些域的兩個的側翼存在高彈性區(qū)(Stmmptner-Cuvelette & Benaroch, 2002， 5/oc/2ew. y4cto.， 1542:1-13 )。恒定鏈已被表征于凄t
種生物體，包括脊推動物(例如雞)、哺乳動物(例如，牛、犬、小鼠和 大鼠)和人。
本發(fā)明涉及核酸構建體，它包含其中至少一個恒定鏈是生物體特異性 的或者與特異性生物體相關的序列。優(yōu)選地，至少一個恒定鏈是脊推動物 來源的，更優(yōu)選地，哺乳動物來源的和最優(yōu)選地人來源的。關于這里SEQ ID NO: 1所定義的序列是來源于人的恒定鏈核酸序列。所利用的恒定鏈優(yōu) 選地是待接受接種的生物體恒定鏈。本發(fā)明的一個目的是恒定鏈和宿主生 物體或者治療接受者為相同的物種。
本發(fā)明還涉及一種核酸構建體，其中編碼的至少一個恒定鏈是SEQ ID NO:2所鑒定序列的片段，該片段具有至少40個氨基酸，而且至少85%等 同于SEQ ID NO: 2的相同片段。
所述的片段是一種至少40個氨基酸的片段，來自恒定鏈的任意部分， 如SEQIDNO:2中所列出的。這包括這樣的片^:，包括1至40, 10至50, 20至60, 25至65, 30至70, 35至75， 40至80, 45至85, 50至90, 55至95, 60 至100, 65至105, 70至110, 75至115, 80至120, 85至125, 90至130, 95 至135, 100至140, 105至145， 110至150, 115至155, 120至160, 125至165, 130至170, 135至175, 140至180, 145至185, 150至190, 155至195, 160 至200, 165至205, 170至210以及175至216個殘基。它還包4舌如上述所 列出的每端擴展多達5個的片段。它進一步包括至少50個殘基的、至少 60個殘基的、至少70個殘基的、至少80個殘基的、至少90個殘基的、 至少100個殘基的、至少110個殘基的、至少120個殘基的、至少130個 殘基的、至少140個殘基的、至少150個殘基的、至少160個殘基的、至 少170個殘基的、至少180個殘基的、至少190個殘基的、至少200個殘 基的以及至少210個殘基的片段。
與SEQ ID NO: 2至少85%序列同一性，例如至少90%序列同一性， 例如至少91%序列同一性，諸如至少92%序列同一性，例如至少93%序列 同 一性，諸如至少94%序列同 一性，例如至少95%序列同 一性，諸如至少96%序列同 一性，例如至少97%序列同 一性，諸如至少98%序列同 一性, 例如99%序列同 一性的任意上述片段都包括在本發(fā)明的范圍內。
氨基酸序列間的同 一性/同源性是可以使用熟知的計分矩陣計算的，例 如BLOSUM30、 BLOSUM40、 BLOSUM45、 BLOSUM50、 BLOSUM55、 BLOS而60、 BLOSUM62、 BLOSUM65、 BLOSUM70、 BLOSUM75、 BLOSUM 80、 BLOSUM 85和BLOSUM 90中的葉壬4可一種。
優(yōu)選地，本發(fā)明是一種核酸構建體，其中編碼的至少一個恒定鏈是 SEQIDNO:2片段，該片段具有至少186個氨基酸。這包括如上所定義的 任一序列，以及因此與SEQ ID NO: 2恒定鏈序列共享同 一性的。
本發(fā)明進一 步涉及一種核酸構建體，其中編碼的至少 一個恒定鏈是至 少85%等同于SEQ ID NO :2。
這包括衍生自如SEQ ID NO: 2中所提出的恒定鏈、至少85%序列同 一性的任一序列，與SEQ ID NO: 2例如至少90%序列同 一性，例如至少 91%序列同 一性，諸如至少92%序列同 一性，例如至少93%序列同 一性， 諸如至少94%序列同一性，例如至少95%序列同一性，諸如至少96%序列 同一性，例如至少97%序列同一性，諸如至少98%序列同一性，例如99% 序列同源性都包括在本發(fā)明的范圍內。這包括比SEQEDNO: 2中所述序 列更長或者更短的序列。
最優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種核酸構建體，其中編碼的至少一個恒定鏈 等同于SEQIDNO:2。
上述的任意序列，無論來源、序列同一性或長度，都是來自這里所定 義恒定鏈的變體。
接下來，在本發(fā)明的范圍內的是，來自任意生物體的恒定鏈變體可以 是根據(jù)上述的變體的片段，即，變體可以是生物體恒定鏈的片段，和/或是 至少85%等同于所述的恒定鏈全部序列或者其中的片段。恒定鏈還可以是 來自生物體的相關物種或者是來自較遠相關的物種。
另一方面，本發(fā)明涉及添加、除去或取代核酸構建體所編碼的至少一 個恒定鏈的區(qū)、肽或域。 一個或多個這些區(qū)、肽或域的除去將平截所得的恒定鏈。區(qū)、肽或域的添加或者替代包括從已知來源如天然的蛋白質或多
區(qū)、域或肽的添加包括添加一個、兩個或多個每種類型或不同類型的區(qū)、 域、肽，以及一個、兩個、三個或多個編碼這些區(qū)、i或和肽的核酸。這些 可基于序列彼此相同或不同。區(qū)、肽和域不必源自與支架恒定鏈一樣的生 物體。在本領域中，實現(xiàn)個體的添加、缺失和取代以及編碼最終多肽的核 苷酸延伸都是熟知的。
比對核酸和特別是同源性基因的蛋白質或來自不同生物的蛋白質序 列是非常有幫助的，當確定哪種取代、缺失、重排或其他變更有益于構建 時。如下所示比對人和鼠的恒定鏈序列提供了一種指示，哪些氨基酸殘基 對于這些生物體中恒定鏈的結構和功能是重要的一這些是兩種序列間保 守的殘基。同樣地，預計不重要的殘基是那些其中序列不同的。實現(xiàn)變體 殘基/區(qū)的取代和/或缺失是涉及本發(fā)明的興趣點。當嘗試突變或缺失或以 其它方式變更序列例如人恒定鏈從而改善其免疫應答刺激能力時，檢查保 守殘基和制造例如同源性取代(即，被認為是具有例如相同結構性質、極 性、疏水性或其他的氨基酸取代)也是相關的。
人1 MDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQG 鼠1 MDDQRDLISNHEQLPILGNRPREPE-RCSRGALYTGVSVLVALLLAGQATTAYFLYQQQG
鼠60 RLDKLTITSQNLQLESLRMKLPKSAKPVSQMRMATPLLMRPMSMD畫LLGPVKNVTKYGN
人m
人181 SLEQK-PTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM
鼠179 SLEEKKPTEAPPKEPLDMEDLSSGLGVTRQELGQVTL
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及至少一個恒定鏈，其中信號肽被除去、替 換或添加至編碼恒定鏈的序列。信號肽是一種短的氨基酸序列，其決定細 胞中蛋白質的最后位置，又稱作分選肽。決定蛋白質定位于亞細胞室如內 質網(wǎng)、高爾基體以及包含高爾基體的各種室、核、質膜、線粒體和各種空間和其中膜、過氧化物酶體、溶酶體、內體以及分泌嚢泡等的信號肽都一皮 包括在本發(fā)明的范圍內。
一種優(yōu)選的實施方案包含單獨的溶酶體恒定鏈靶
向序列。另 一種優(yōu)選的實施方案包含單獨的KEY區(qū)恒定鏈。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及至少一個恒定鏈CLIP區(qū)的除去、添加或 替換。如上所述，CLIP區(qū)的添加或替換包括添加或替換在恒定鏈或所選鏈 的變體中已有的CLIP區(qū)，以來自它們或其他生物體的恒定鏈CLIP區(qū)或者 來自(form)它們或其他生物體CLIP區(qū)的變體。變體CLIP區(qū)，根據(jù)上述 的，是特異性產生的CLIP區(qū)突變類型，由單個或多個核酸取代、缺失或 添加所產生。優(yōu)選的實施方案包含單獨的CLIP區(qū)，或者與N-末端相鄰序 列或者C-末端相鄰序列而非恒定鏈任何其他區(qū)或域一起的CLIP區(qū)。其他 優(yōu)選的實施方案包含單獨的N-末端或C末端相鄰于CLIP區(qū)而非CLIP區(qū) 本身的序列。相鄰的含義是在CLIP區(qū)10個殘基內，CLIP區(qū)的20個殘基 內，30個殘基內，40個殘基內，50個殘基內，75個殘基內或者IOO個殘 基內的任意氨基酸。
本發(fā)明的一種實施方案涉及如上所述恒定鏈的而不帶有CLIP區(qū)的片 段。這些片段可以是至少5個氨基酸殘基長度，至少10個殘基，至少15 個殘基，至少20個殘基，至少25個殘基，至少30個殘基或者至少35個 殘基長度。另一種實施方案涉及恒定鏈的片段，其中信號肽被除去而且恒 定鏈片段是至少10個氨基酸殘基長度，至少15個殘基，至少20個殘基， 至少25個殘基，至少30個殘基，至少35個殘基，至少50個殘基，至少 60個殘基，至少70個殘基，至少80個殘基，至少90個殘基，至少100 個殘基，至少110個殘基，至少120個殘基，至少130個殘基，至少140 個殘基，至少150個殘基，至少160個殘基，至少170個殘基，或者至少 180個殘基長度。
抗原
任意的上面恒定鏈變體都以這樣的形式包括在本發(fā)明中，其中至少一 個所述變體是在操作上被連接至至少一個抗原諸如抗原性蛋白或者肽或 者所述蛋白或肽的抗原性片段。
本發(fā)明的一個目的是包括但不限于源自病原性生物體的抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段、癌特異性多肽和抗原，以及與異常生理 學應答相關聯(lián)的蛋白或肽。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的一個目的是包括一種源自下列任一病原體類型的
抗原病毒、微生物和寄生物。這包括任何已知動物的病原體。優(yōu)選的是 具有來自哺乳動物病原體的抗原，即， 一種特異性靶向哺乳動物的病原體。 更優(yōu)選的是具有來自人病原體的抗原?？傊墒褂萌魏伪话l(fā)現(xiàn)與人病原 體相關的抗原。
在優(yōu)選的實施方案中，至少一種抗原可以源自但不限于任意下列病毒 科腺病毒、沙粒病毒科、星狀病毒科、布尼亞病毒科、杯狀病毒科、冠
4大病毒一斗、黃病毒-牛、皰滲病毒牙牛、正l占液病毒-牛、副翁液病毒3牛、小核: 糖核酸病毒科、痘病毒科、呼腸孤病毒科、逆轉錄病毒科、彈狀病毒禾牛和 披膜病毒科。
更具體地，至少一種抗原或抗原性序列可以是衍生自任意下列的病
毒曱型流感諸如H1N1、 H1N2、 H3N2和H5N1(禽流感)、乙型流感、丙 型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病 毒、戊型肝炎病毒、輪狀病毒、諾瓦克病毒組的任意病毒、腸腺病毒、細 小病毒、登革熱病毒、猴痘、馬爾堡病毒、狂犬病毒屬如狂犬病毒、拉各 斯蝙蝠病毒、莫科4立病毒、杜文海4各病毒、歐洲蝙蝠病毒1 & 2以及澳大 利亞蝙蝠病毒、暫時熱病毒屬、水泡病毒屬、水泡性口炎病毒(VSV)、 皰滲病毒諸如單純皰滲病毒1型和2型、水痘帶狀皰瘆病毒、巨細胞病毒、 爰波斯坦-巴爾病毒(EBV)、人皰療病毒(HHV)、人皰滲病毒6型和8 型、人免疫缺陷病毒(HIV)、乳頭瘤病毒、鼠y皰滲病毒、沙粒病毒諸如 阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、薩比亞相關出血熱病毒、委內 瑞4立出血熱病毒、拉沙熱病毒、馬丘波病毒、、淋巴細胞性脈絡叢腦炎病毒 (LCMV)、布尼亞病毒科諸如克里米亞-剛果出血熱病毒、汗他病毒、引 起出血熱伴有腎綜合癥的病毒、裂谷熱病毒、絲狀病毒科(絲狀病毒)包
括埃博拉出血熱以及馬爾堡出血熱、黃病毒科包括科薩努爾森林病毒、鄂 木斯克出血熱病毒、引起蜱傳腦炎的病毒以及副粘液病毒科諸如亨德拉病 毒和尼帕病毒、大天花和小天花(天花)、甲病毒屬諸如委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、SARS-相關的冠狀病毒
(SARS-CoV)、西尼羅病毒和任何引起腦炎的病毒。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，至少一種抗原性蛋白或肽是來自病毒，
該病毒選自下列組HIV、丙型肝炎病毒、流感病毒、皰滲病毒、拉沙、 埃博拉、天花、禽流感、絲狀病毒、馬爾堡以及乳頭瘤病毒。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，至少一種抗原性蛋白或肽是選自下列 的組和/或可以是至少 一種任意下列物質的抗原性片段水泡性口炎病毒糖 蛋白(VSV-GP)、曱型流感NS-1 (非結構性蛋白1 )、曱型流感M1(基質蛋 白1)、甲型流感NP(核蛋白)、LCMVNP、 LCMVGP、埃博4立GP、埃博 拉NP、鼠y皰滲病毒M2、 M3和ORF73 (例如MHV-68 M2、 M3和ORF73)、 雞卵白蛋白(OVA)，或者一種輔助性T細胞表位。將兩種以上這里所提到 的任意抗原組合是在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明的 一種實施方案包括了來自微生物的至少 一種抗原性蛋白或 者肽或者抗原性蛋白或肽的片段。更具體地說，至少一種抗原是衍生自下 列非窮盡目錄中之一炭疽(炭疽桿菌)、分支桿菌結核病、沙門氏菌(雞 沙門氏菌、雛沙門氏菌、傷寒熱沙門氏菌、腸炎沙門氏菌(S. enteridtidis)、 副傷寒熱沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒熱沙門氏菌)、肉毒^^炎菌、 產氣莢膜梭菌、白喉棒狀桿菌、百日咳博德特氏菌、彎曲桿菌屬諸如空腸 彎曲菌、新型隱球酵母、鼠疫耶耶爾森氏桿菌、結腸炎耶爾森氏桿菌、假 結核耶爾森氏桿菌、單核細胞增生李斯特菌、鉤端螺旋體、嗜肺軍團桿菌、 伯氏疏螺旋桿菌、鏈球菌諸如肺炎鏈球菌、腦膜炎內瑟菌、流感嗜血桿菌、 弧菌諸如霍亂弧菌Ol、霍亂弧菌非-Ol、副溶血弧菌、副溶血性弧菌、溶 藻弧菌、弗尼斯弧菌、鯊魚弧菌、霍里斯弧菌、辛辛那提弧菌、梅氏弧菌、 海魚弧菌、擬態(tài)弧菌、河流弧菌、致傷弧菌、芽孢桿菌、親水性氣單胞菌、 豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌&威隆氣單胞菌、志賀鄰單胞菌、志賀氏菌 諸如宋內志賀菌、鮑氏志賀菌、福氏志賀菌、以及痢疾志賀菌、腸道毒性 大腸桿菌EEC(大腸桿菌-產腸毒性(ETEC)、大腸桿菌-腸致病性(EPEC)、 大腸桿菌0157:H7腸出血性(EHEC)、大腸桿菌-腸侵襲性(EIEC ))、葡 萄球菌諸如金黃色葡萄球菌以及特別是萬古霉素中介/抗性種(VISA/VRSA)或者多重藥物抗性種(MRSA)、志賀氏菌諸如福氏志賀 菌、宋內志賀菌、痢疾志賀菌孢子蟲、布魯氏菌諸如牛布魯氏菌、羊布魯 氏菌、綿羊布魯氏菌、豬布魯氏菌和犬布魯氏菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌和 假鼻疽伯克霍爾德氏菌、鷚鵡熱衣原體、貝氏柯克斯體、土拉熱弗朗西絲 菌、普氏立克次體、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌。
在本發(fā)明 一種優(yōu)選的實施方案中，至少一種抗原性蛋白或者肽是來自 微生物，該微生物選自下列組結核分支桿菌、炭疽桿菌、葡萄球菌以及 弧菌。
本發(fā)明的 一種實施方案涉及一種核酸構建體，其中至少一種被編碼的 抗原性蛋白或者肽是來自寄生物。
本發(fā)明的另 一種實施方案涉及一種核酸構建體，其包含來自任意上述 病原體的至少兩種抗原性蛋白或者肽的組合。
優(yōu)選地，抗原是衍生自，但不限于，選自下列組的寄生物瘧原蟲諸 如三日癥原蟲，卵形癥原蟲，間日癡原蟲，惡性癡原蟲，微小內蜒阿米巴， 藍氏賈第鞭毛蟲，溶組織內阿米巴，微小隱孢子蟲，人芽嚢原蟲，陰道毛 滴蟲，弓形蟲，圓孢子蟲，鼠隱孢子蟲，肺孢子蟲，杜氏利什曼原蟲，熱 帶利什曼原蟲，巴西利什曼原蟲，墨西哥利什曼原蟲，棘阿米巴諸如卡氏 棘阿米巴，以及柯氏棘阿米巴，福氏內格勒，克氏錐蟲，布氏羅得西亞錐 蟲，布氏岡比亞錐蟲，貝氏等孢球蟲，大腸纖毛蟲，蛔蟲(似蚓蛔線蟲)， 鉤蟲(美洲鉤蟲，十二指腸鉤口線蟲)，蟯蟲(蠕形住腸線蟲)，蛔蟲(犬 弓首鮰蟲，貓弓首蛔蟲)，心絲蟲(犬惡絲蟲)，類圓線蟲屬(糞類圓線蟲)， 毛線蟲屬(旋毛線蟲)，絲蟲屬(班氏吳策線蟲，馬來布魯線蟲，盤尾絲 蟲，羅阿羅阿絲蟲，鏈尾曼森絲蟲，常規(guī)曼森絲蟲，奧氏曼森絲蟲)，以 及異尖線蟲屬幼蟲(簡單異尖線蟲(鯡魚線蟲)，擬地新(海豹線蟲，鉆 線蟲)線蟲(鱈魚或海豹線蟲)，對盲腸線蟲，以及宮脂蛔屬(鮪蛔線蟲 屬)鞭蟲，牛肉絳蟲(牛帶絳蟲)，豬肉絳蟲(豬帶絳蟲)，魚絳蟲(闊節(jié) 裂頭絳蟲)，以及犬絳蟲(犬復孔絳蟲)，腸吸蟲(布氏姜片吸蟲)，血吸 蟲(日本血吸蟲，曼氏血吸蟲)埃及血吸蟲)，肝吸蟲(華支睪吸蟲)，東 方肺吸蟲(衛(wèi)氏并殖吸蟲)，以及綿羊肝吸蟲(肝片吸蟲)，鮭隱孔吸蟲和希氏侏形吸蟲。
在一種本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，至少一種抗原性蛋白或肽是從選自 下列組的寄生物獲得的癡原蟲、利什曼原蟲以及錐蟲。
一方面，本發(fā)明涉及從疾病或物質衍生的抗原和/或抗原性序列，所述 疾病或物質傳染馴養(yǎng)動物，尤其是商業(yè)上相關的動物，例如，豬、牛、馬、 綿羊、山羊、美洲鴕、家兔、水貂、小鼠、大鼠、犬、貓，家禽諸如雞、 火雞、雉等，魚諸如鱒魚、鮭魚等飼養(yǎng)的品種。至少一種抗原或抗原性序
列可從其中衍生的疾病或物質實例，包括但不限于多重種的疾病諸如 炭疽病、偽狂犬病、藍舌??；布魯氏病諸如牛布魯氏病、羊布魯氏病或 豬布魯氏??；克里米亞剛果出血熱、包蟲病/棘J求蚴病、小核糖核酸病毒科 病毒，引起口蹄疫的口瘡病毒屬，尤其是任意七種免疫學上不同的血清類 型A、 O、 C、 SAT1、 SAT2、 SAT3、亞洲l型，或心水病、日本腦炎、 鉤端螺旋體病、新大陸螺旋蠅蛆病(嗜人錐蠅)、舊大陸螺旋蠅蛆病(倍 氏金蠅)、副結核病、q熱、狂犬病、裂谷熱、牛瘟、旋毛蟲病、野兔病、 水泡性口炎或西尼羅熱；牛疾病諸如牛邊蟲病、牛巴貝西蟲病、牛生殖 性彎曲桿菌病、牛海綿狀腦炎、牛結核病、牛病毒性腹瀉、傳染性牛胸膜 肺炎、牛地方性白血病、出血性敗血癥、牛傳染性鼻氣管炎/傳染性化膿性 外陰道炎、疙瘩皮^^病、惡性卡他熱、泰勒氏梨漿蟲病、毛滴蟲病或錐蟲 病(棘蠅傳播)；綿羊及山羊疾病諸如山羊關節(jié)炎/腦炎、傳染性無乳癥、 傳染性山羊胸膜肺炎、羊地方性流產(綿羊衣原體病)、梅迪-維斯納病、 內羅畢綿羊病、綿羊附睪炎(綿羊布氏桿菌)、小反芻獸疫、沙門菌病(流 產沙門氏菌)、羊癢病、綿羊痘和山羊痘；馬疾病諸如非洲馬疾病、馬 傳染性子宮炎、馬媾疫、馬腦脊髓炎(東方型)、馬腦脊髓炎(西方型)、 馬感染性貧血、馬流感、馬梨漿蟲病、馬鼻肺炎、馬病毒性動脈炎、馬鼻 疽、蘇拉病(伊氏錐蟲)或委內瑞拉馬腦脊髓炎；豬疾病諸如非洲豬瘟、 古典型豬癍、尼帕病毒腦炎、豬嚢尾蚴病、豬生殖呼吸綜合癥、豬水泡病 或者傳染性胃腸炎；禽類疾病諸如禽類衣原體病、禽類感染性支氣管炎、 禽類感染性喉氣管炎、禽類支原體病(敗血支原體)、禽類支原體病(滑 液支原體)、鴨病毒肝炎、禽霍亂、禽傷寒、高致病性禽流感(這是任意甲型或乙型以及特別是H5N1型流感病毒)、感染性囊疾病(甘保羅病)、 馬列克氏病、紐卡斯爾病、稚白痢或火雞鼻氣管炎；兔類及嚙齒動物疾病 諸如病毒腸炎、黏液瘤病或家兔出血熱；魚類疾病i者如地方流4亍性造 血器官壞死、感染性造血器官壞死、鯉春病毒病、病毒性出血性敗血癥、 感染性胰臟壞死、感染性鮭魚貧血癥、地方流行性潰瘍綜合癥、細菌性腎 病(鮭腎桿菌)、三代蟲病(鮭魚三代蟲)、紅海鯛虹彩病毒??；或者其他 疾病諸如駝痘或利什曼病。
在一種本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，至少 一種抗原性蛋白或肽是源于偽 狂犬病、口蹄疫、水泡性口炎病毒、禽流感或者紐卡斯爾病。
另外， 一種本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及至少一種抗原性蛋白或者肽或 者所述蛋白或肽的片段，它是與上述任意抗原具有至少85%同一性的抗原 性肽或蛋白。氨基酸之間的同源性或同一性可以用任意的上述BLOSUM 計分矩陣計算。
本發(fā)明涉及一種核酸構建體，其中至少 一種抗原性蛋白或者肽或者抗 原性蛋白或肽的片段是源自癌特異性多肽或癌抗原。
許多蛋白/糖蛋白已被鑒別而且連接至某些類型的癌；這些被稱作癌特 異性多肽、腫瘤相關抗原或癌抗原。通常，已發(fā)現(xiàn)與癌腫瘤相關的任何抗 原都可被使用。 一種可發(fā)現(xiàn)癌特異性抗原的方法是用減法分析例如各種微 陣列分析，諸如DNA微陣列分析。比較這里的健康者與癌患者之間、癌 患者組之間或者相同患者中健康組織與癌組織之間的基因表達模式(如以 所述基因編碼的蛋白或RNA水平中所見到的)。具有大約相等表達水平的 基因被彼此"減去"，留下健康組織與癌組織間不同的基因/基因產物。這 種方法是本領域中已知的，并且可被用作一種鑒別新癌抗原的方法，或者 創(chuàng)造一種專用于規(guī)定患者或患者組的基因表達概況。這樣所鑒別的抗原， 無論是單個的抗原還是它們已被發(fā)現(xiàn)組合在其中的，都落入本發(fā)明的范圍 內。
優(yōu)選地，至少一種本發(fā)明的抗原是衍生自，但不限于癌特異性多肽， 其選自下列的組MAGE-3、 MAGE-1、即IOO、 gp75、 TRP-2、酪氨酸酶、 MART-1、 CEA、 Ras、 p53、 B-連環(huán)蛋白、gp43、 GAGE-1、 BAGE漏1、 PSA、而C-1,2,3,和HSP-70、 TRP-1、 gp雨pmel17、 p-HCG、 Ras突變體、p53 突變體、HMW黑素瘤抗原、MUC-18、 HOJ-l 、周期素-依賴型激酶4 (Cdk4)、 半胱氨酸蛋白酶(caspase ) 8、 HER-2/neu、人乳頭瘤病毒HPV類型6、 11、 16、 18、 31和33， Bcr-Abl酪氨酸激酶、癌胚抗原(CEA)、端粒酶以及SV40 大T。
一種本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，至少一種抗原性蛋白或者肽或者抗原性 蛋白或肽的片段是源自癌特異性多肽，該多肽選自這樣的組p53、 HER-2/neu、端粒酶以及黑素瘤抗原。
一種本發(fā)明的實施方案涉及核酸構建體，其中至少一種抗原性蛋白或 者肽或者抗原性蛋白或肽的片段是源自與異常生理學應答相關的多肽。這 種異常生理學應答包括，但不限于自身免疫疾病、變態(tài)反應、癌以及先天 性疾病。關于這些的非窮盡性實例目錄包括疾病諸如風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng) 性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、銀屑病和克羅恩病。
操作接頭
一方面，本發(fā)明涉及核酸構建體，其中位于恒定鏈與抗原性蛋白或者 肽或者抗原性蛋白或肽的片段之間的操作接頭或者是直接的連接或者是 由間隔區(qū)介導的連接。術語操作接頭應當被理解為一種核苷酸或氨基酸殘 基序列，其將兩部分核酸構建體或嵌合多肽結合在一起，可以保證核酸或 多肽的生物學加工。如果操作接頭是直接的連接，那么每個編碼開放讀碼 框架或者開放讀碼框架片段的兩個核酸被安置彼此緊密相鄰并且也在框 架內。如果操作接頭是由間隔區(qū)相介導的， 一連串的核苷酸^皮插入分別編 碼至少一個恒定鏈與至少一個抗原性肽的核苷酸之間。具有間隔區(qū)的是屬 于本發(fā)明的范圍內，其中所述間隔區(qū)只是連接至少本發(fā)明兩個元件的一連 串核苷酸，這樣保留了開放讀碼框架，或者該間隔區(qū)可編碼如這里所定義 的、 一種或多種的信號或者分隔元件。
一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包含了操作接頭，其中所述操作接頭 是一種間隔區(qū)。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包含了編碼至少一個MHC II類分子輔助性表位(helper epitope)的間隔區(qū)。輔助性表位的實例是一種免 疫原性決定子如白喉毒素。特別是，白喉毒素B片段COOH-末端區(qū)已被 證明在小鼠中是免疫原性的。此外，HSP70，部分地或者全部地，以及其 他免疫原性肽，例如流感病毒或具有對HLAI類和II類分子錨定基序的免 疫原性序列或者肽，同樣可以^C編碼于核酸構建體的間隔區(qū)內。
在另 一種優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體的間隔區(qū)編碼至少一個蛋白 酶切位點。溶酶體蛋白酶諸如組織蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和鋅蛋白酶以 及其他細胞內蛋白的酶切位點屬于本發(fā)明的范圍內。
在另外一種優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體的操作接頭可包含至少一 個siRNA或miRNA編碼的序列。siRNA (小千擾RNA)和miRNA (微 小RNA)靶向內源的RNA,以序列特異性的方式，用于降解。因此，選 取在本發(fā)明核酸構建體內編碼的siRNA或miRNA，以便靶向不期望的基 因產物。
在更優(yōu)選的實施方案中，操作接頭包含至少一個多聚接頭或者多克隆 位點(MCS)。多聚接頭和MCS是包含限制性酶識別序列的連串核苷酸， 即，這樣的位點——其中限制酶以平頭或交錯的方式酶切DNA,有助于將 DNA的其他片段/序列亞克隆至核酸構建體。多聚接頭/MCS的識別序列通 常具有獨特的含義，即它們在核酸構建體上其他地方未被發(fā)現(xiàn)。此外，操 作4妄頭包含一個或多個停止或終止密碼子，其作出從核糖體釋》丈初始多肽 的信號。操作接頭還可包含至少一個IRES (內部核糖體進入位點)和/或 至少一個啟動子。IRES是一種核苦酸序列，其允許在信使RNA (mRNA) 序列的中部翻譯啟動，作為更大的蛋白合成過程的一部分。啟動子是一個 使基因被轉錄的DNA序列。啟動子是由RNA聚合酶識別的，其隨后啟動 轉錄，參見下面。啟動子可以是單向的或雙向的。
在特別優(yōu)選的實施方案中，跨越恒定鏈與至少一個抗原之間區(qū)的操作 接頭是包含至少一個多聚接頭和至少一個啟動子和任選地同樣地至少一 個IRES的操作接頭。這些元件可以任意次序安置。在一種進一步優(yōu)選的 實施方案中，恒定鏈的終止密碼子已被缺失，而且多聚接頭已被克隆至載 體，以便保留開放的讀碼框架，使得-陂插入至多聚接頭的至少一種抗原在框架內讀碼。這樣的優(yōu)點是有助于以一步或多個克隆步驟將多種抗原亞克 隆至同一構建體，并且允許多種抗原在同一框架內同時表達為恒定^T連。終 止密碼子可以在多聚接頭翻譯終止后被插入。這種實施方案可以與任意的
上述輔助性表位、mi/siRNA或者這里所述的任意其他元件相組合。
本發(fā)明的一種實施方案涉及將操作接頭安置于至少一個恒定鏈和至 少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段，其中抗原性肽編碼序 列^皮安置在在恒定鏈序列內、在恒定鏈序列的前端、在恒定鏈序列的終 止部分。這樣做的目的是，確保構建體開放讀碼框架的可讀性，以便抗原 性肽被至少一種操作接頭前導、環(huán)繞或者結束。
一種優(yōu)選的本發(fā)明實施方案進一步地涉及將操作接頭安置于至少一 個恒定鏈和至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段，其中優(yōu) 選地將至少 一個抗原性肽編碼序列安置于恒定鏈的終止部分而且將操作 接頭插入這里的兩者之間。所述終止部分是恒定鏈或其片段的最初或最后 殘基。
組合
核酸構建體編碼多種元件屬于本發(fā)明的范圍內。該元件是至少一個恒 定鏈和至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段。因此，具有 多種恒定鏈屬于本發(fā)明的保護范圍內，這些中的每一個在操作上被連接至 彼此和被連接至多種抗原性蛋白或者肽或者抗原性蛋白或肽的片段，其中 這些同樣地在操作上被連接。因此，核酸構建體的多個元件在操作上必須 彼此相連接。幾個連串的恒定鏈中每一個在操作上被連接至一個抗原性蛋 白或者肽或者所述蛋白或肽的片段，這些連串的每一個在操作上—皮4皮此相 連接是包括在本發(fā)明之內。
本發(fā)明的優(yōu)點和非常重要的方面涉及這樣的事實，即任意類型的免疫 應答，例如T細胞介導的和抗體介導的應答，既可以用已知為弱抗原的表 位、用未知抗原性特征的多肽來起始，也可以同時用多表位/抗原來起始。
因此，同樣地屬于本發(fā)明保護范圍的是， 一種優(yōu)選的實施方式是編碼 至少一個恒定鏈的核酸構建體，該恒定鏈在操作上被連接至多種抗原性蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七 個、八個、十個、十二個或更多的抗原性蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。
核酸構建體可包含額外的元件。這些包括但不限于內部核糖體進入位點 (IRES),編碼關于抗原呈遞蛋白諸如LAMP、釣網(wǎng)蛋白和Hsp70的基因， 編碼與細胞內擴展相關蛋白諸如VP22、 HIV Tat、 Cx43或者其他接合素以 及細胞間間隙連接的基因，編碼天然殺傷細胞(NK細胞)活化分子諸如 H60和細胞因子、雞卵白蛋白、或者任意T輔助性細胞表位的基因。
在一種優(yōu)選的本發(fā)明實施方案中，核酸構建體包含至少一個編碼關于 抗原呈遞的蛋白如LAMP、 LIMP、鉤網(wǎng)蛋白或Hsp70的基因。
在另外一種優(yōu)選的本發(fā)明實施方案中，核酸構建體包含至少一個編碼 關于細胞內擴展的蛋白如VP22、 Cx43、 HIVTat、其他接合素或細胞間間 隙連接成分的基因。
啟動子
這里所用的術語啟動子是指一組轉錄控制組件，其被簇集在RNA聚 合酶II的起始位點周圍?？紤]比較多的是啟動子如何被組織的，這源自分 析幾種病毒啟動子，包括用于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉錄單元 的那些。這些研究，最近的工作予以擴大，已證明啟動子是由離散功能組 件所組成，每個由大約7-20bpDNA組成，并且包含一個或多個轉錄激活 蛋白識別位點。每個啟動子功能中的至少一種模式是定位RNA合成的起 始位點。最熟知的這種實例是TATA盒，但是在一些啟動子中缺少TATA 盒，諸如用于哺乳動物末端脫氧核苷酰轉移酶基因的啟動子和用于SV40 晚期基因的啟動子，覆蓋起始位點的離散元件本身有助于固定起始的位 置。
另外的啟動子元件調節(jié)轉錄起始的頻率。 一般地，這些位于起始位點 上游的30-110 bp區(qū)，即使大量的啟動子最近已被證明還包含起始位點下 游的功能元件。元件間的間距是彈性的，這樣，當元件被逆向或相對另一 個而被移動時，啟動子功能被保留。在tk啟動子中，元件間的間距在活性 開始下降前可被增加至50 bp間隔。依賴于啟動子，各個元件可能合作性 地或者獨立性地發(fā)揮功能從而激活轉錄。在本發(fā)明中，可使用能夠指示核酸構建體所編碼序列轉錄起始的任意啟動子。
一方面，本發(fā)明包含核酸構建體，其中一個在操作上被連接的恒定鏈 和抗原性蛋白或者肽的編碼序列之前有能夠表達該構建體的啟動子。
另一方面，啟動子選自這樣的組組成型啟動子、誘導型啟動子、生 物體特異性啟動子、組織特異性啟動子以及細胞類型特異性啟動子。
啟動子的實例包括，但不限于組成型啟動子諸如猿猴病毒40( SV40 ) 早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒啟動子、人免疫缺陷病毒長末端重復啟動 子、莫洛尼病毒啟動子、禽白血病病毒啟動子、愛波斯坦-巴爾病毒即時 早期啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、人肌動蛋白啟動子、人肌球 蛋白啟動子、人血紅蛋白啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子和人肌肉月幾 酸啟動子，誘導型啟動子諸如金屬硫蛋白啟動子、糖皮質類啟動子、孕 酮啟動子以及四環(huán)素啟動子(tet-on或者tet-off)，組織特異性啟動子諸如 HER-2啟動子和PSA相關啟動子以及雙向啟動子，即能夠以啟動子的每個 方向起始4爭錄。
使用誘導型啟動子的優(yōu)點包括提供"休眠的"疫苗，根據(jù)需要而被激 活。這是有用的，如果優(yōu)選地僅在體內局部地誘導接種，相對于系統(tǒng)性地 誘導(例如，在涉及癌癥的情況下)，或者在接種時該疫苗對接受者的健 康是有害的。
在一種優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體包含選自下面組的啟動子 CMV啟動子、SV40啟動子和RSV啟動子。
傳輸媒介物
一方面，本發(fā)明包含如上所述的核酸構建體，其被包含在傳輸媒介物 內。傳輸媒介物是一種實體，藉此核苷酸序列或多肽或兩者可被從至少一 種介質轉運至另 一種。傳輸媒介物通常是用于核酸構建體內編碼序列的表 達和/或用于在這里構建體或所編碼多肽的細胞內傳輸。屬于本發(fā)明范圍內 的是，傳輸媒介物是選自下列組的媒介物基于RNA的媒介物、基于DNA 的媒介物/載體、基于脂質的媒介物、基于病毒的媒介物以及基于細胞的媒 介物。這種傳輸媒介物的實例包括，但不限于可生物降解的聚合物微球、基于脂質的制劑諸如脂質體載運體、將構建體包被到膠體金粒子上、脂多 糖、多肽、多糖以及病毒々某介物的聚乙二醇化。
一種優(yōu)選的本發(fā)明實施方案涉及用機械或電學才支術傳輸以棵DNA形
式的核酸構建體。特別是，將核酸構建體包被到金粒子上是有利的實施方 式。應用粒子轟擊設備如基因槍，用彈道轉移而實現(xiàn)將核酸構建體傳輸至 金粒子。
一種更優(yōu)選的本發(fā)明實施方案包括作為傳輸媒介物的病毒，所述病毒
選自下列非窮盡的組腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺相關病毒、皰滲 病毒、牛痘病毒、泡沫狀病毒、巨細胞病毒、西門利克森林病毒、痘病毒、 RNA病毒載體以及DNA病毒載體。這種病毒載體是本領域中熟知的。
病毒載體常常是由兩個組份構成，修飾病毒基因組和環(huán)繞它的外殼結 構，盡管有時病毒載體是以棵形式被引入或者用蛋白而非病毒蛋白包被 的。最新的載體具有類似于野生型病毒的外殼(coat)結構。這種結構包 裝和保護了病毒核酸并且提供了結合和進入靶細胞的手段。
優(yōu)選地，病毒載體是從野生型病毒基因組被修飾為使病毒在靶細胞中 不能生長，同時使病毒能在宿主細胞(例如，諸如包裝或輔助性細胞)中 生長，用于制備感染性粒子。載體核酸通常是基本順式作用的、用于復制 的病毒序列，而且包裝于輔助性細胞系中，和表達控制序列，用于調節(jié)將 多聚核苷酸的表達傳輸至靶細胞。其他病毒功能是以反式在特定包裝或輔 助性細胞系中表達的，如本領域中已知的。
腺病毒
在一種更優(yōu)選的實施方案中，包含如這里所述核酸構建體的載體是腺 病毒。腺病毒基因組的組成為線性雙鏈DNA分子，大約36kb，其攜帶著 完成病毒復制周期所需的超過約三十個基因。早期的基因被分成4個區(qū)(E1 至E4)，這些區(qū)是病毒復制必需的，除了E3區(qū)，它被認為用于調節(jié)抗病毒 宿主免疫應答。El區(qū)(E1A和E1B )編碼負責調節(jié)病毒基因組轉錄的蛋白。 E2區(qū)基因(E2A和E2B)的表達導致病毒復制所需的多肽合成。由E3區(qū) 編碼的蛋白防止細胞毒性T細胞和腫瘤壞死因子造成的細胞溶解。由E4區(qū)編碼的蛋白參與DNA復制、晚期基因表達和剪接以及宿主細胞關閉。
晚期基因通常編碼有助于病毒殼體的結構蛋白。此外，腺病毒基因組攜帶
DNA所必需的順式作用5，和3，ITR (反向末端重復)和包裝序列。ITR容 納DNA復制的起源，同時殼體化區(qū)是將腺病毒DNA包裝為感染性粒子所 需要的(參見實例US 2004/0157307 )。
在最優(yōu)選的本發(fā)明實施方案中，包含如這里所述核酸構建體的載體是 復制缺陷腺病毒或者有條件的復制缺陷腺病毒。腺病毒載體可以是遺傳工 程化為有條件的復制性(CRAd載體)，以便在特定細胞(例如，諸如增殖 細胞)中選擇性復制。在另一方面，腺病毒載體是缺失E1功能的復制(例 如，以全部的或部分的缺失或者E1的誘變)。載體的腺病毒骨架可包含另 外的修飾(在一個或多個病毒基因中缺失，插入或突變)。 一個E2修飾的 實例是以位于DBP (DNA結合蛋白)編碼基因上的熱敏突變來說明。腺 病毒序列還可以是缺失全部或部分E4區(qū)的。在非必要E3區(qū)內的另外缺失 可使被傳輸多肽的大小增加。但是，保留編碼多肽(例如，諸如gpl9k) 的全部或部分E3序列是有利的，Y吏得病毒逃脫免疫系統(tǒng)或炎性反應。同 樣地也可以使用保留ITR和包裝序列而且包含基本上遺傳的修飾以中止病 毒抗原的殘基合成的第二代載體，目的是改善被表達基因在轉導細胞中長 期表達。被引入細胞的核酸構建體可以被插入病毒基因組的任意位置中， 除了順式作用的序列(參見示例US 2004/0157307 )。
腺病毒可以是衍生自任何人類或動物來源，特別是犬、禽類、牛、鼠 類、羊、貓、豬或猿猴的來源，或者可以是雜合病毒?？衫萌魏蔚难?型。但是，人腺病毒是優(yōu)選的，而且這種病毒是可以獲得的，例如，從ATCC (美國典型培養(yǎng)物保藏中心)。
一種優(yōu)選的本發(fā)明實施方案包含腺病毒，諸如羊病毒、犬病毒II型、 {務飾的安卡4立牛痘(MVA)或MVA-BN。
腺病毒粒子或空白腺病毒殼體還可用于通過病毒介導的共內化過程 轉移核酸構建體或基于核酸的傳輸載體。這個過程可在陽離子試劑如聚碳 烯或包含一個或多個脂質層的脂質泡存在下實現(xiàn)。
根據(jù)本領域中常規(guī)的技術，應用互補細胞系或輔助性病毒，它反式地供應病毒復制所需的丟失病毒基因，可制備并繁殖腺病毒粒子。腺病毒粒 子可從培養(yǎng)物上清液回收，同樣地也可從裂解后的細胞，并且任選地根據(jù) 標準技術(例如，色譜法和超離心法)進一步純化。
細胞類型特異性靶向可以用衍生自具有廣泛宿主范圍的腺病毒、通過 修飾病毒表面蛋白而取得。例如，槔病毒感染的特異性是由粘附至存在于 易感細胞表面上細胞受體而確定的。在這點上，存在于腺病毒殼體表面上 的纖維和五鄰體在細胞粘附中發(fā)揮了關鍵作用。因此，腺病毒的細胞靶向 可用編碼纖維和/或五鄰體的病毒基因遺傳修飾而實現(xiàn)，從而產生能與獨特 的細胞表面受體特異性相互作用的修飾纖維和/或五鄰體。
一方面，本發(fā)明涉及一種腺病毒載體，其包含編碼至少一個抗原和刺 激MHC-I應答的、至少一個蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段的核苦酸構建 體。
另一方面，本發(fā)明涉及腺病毒載體，其中核苷酸構建體編碼至少一個
刺激MHC-II應答的蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。
優(yōu)選地，腺病毒載體包含序列，其中至少一個抗原在操作上被連接至 至少一個刺激MHC應答的蛋白或者肽或者刺激MHC應答的蛋白或肽的 片段。刺激MHC應答的蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段優(yōu)選地是MHC 相關的蛋白或者肽。這種MHC相關肽可以是但不限于選自下列的組ER 定位肽、高爾基體定位肽、載有內體肽的室定位肽、溶酶體、MIIC、 CIIV、 黑色素體、分泌顆粒、伯貝克顆粒。
更優(yōu)選地，腺病毒載體包含載有內體肽的室定位肽。這種載有內體肽 的室定位肽可以是，〗旦不限于，選自下面的組分選信號肽、LAMP、 LIMP 和恒定鏈。
最優(yōu)選地，腺病毒載體包含至少一個刺激MHC應答的蛋白或者肽或 者蛋白或肽的片段，而且所迷刺激MHC應答的蛋白或者肽或者蛋白或肽 的片段是恒定鏈。
此外，腺病毒載體可包含協(xié)助擴展病毒或者其中所包含構建體的蛋 白。這種蛋白包括接合素、間隙連接相關蛋白以及形成小孔的蛋白。 一種本發(fā)明的實施方案包含編碼或者以其他方式含有任意一個或多個與細胞
間傳播相關的下列蛋白的腺病毒載體VP22 、 Cx43和HIV Tat。 重纟且細月包
一方面，本發(fā)明涉及包含如所定義核酸構建體的細胞。這種重組細胞 可以用作體外研究的工具，作為核酸構建體的傳輸媒介物或者作為部分的
基因治療方案。根據(jù)本發(fā)明，核酸構建體和基于核酸的載體可用本領域中 熟知的技術引入細胞，包括將DNA顯微注射入細胞核、轉染、電穿孔、 脂轉染/脂質體融合以及粒子轟擊。適合的細胞包括自體的和非自體的細 胞，并且可包括異種的細胞。
在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸構建體是包括在抗原呈遞細 胞(APC)內。任何在其表面上呈遞抗原、與MHC分子相關的細胞都被 認為是抗原呈遞細胞。這種細胞包括但不限于巨噬細胞、樹突細胞、B細 胞、雜種APC以及養(yǎng)育的APC。制造雜種APC的方法是本領域中熟知的。
在更優(yōu)選的實施方案中，APC是專職抗原呈遞細胞，而且最優(yōu)選地， APC是MHC-I和/或MHC-II表達細胞。
才艮據(jù)上面任意一種，APC可以是從患者獲得的干細胞。在引入本發(fā)明 的核酸構建體后，可將干細胞重新引入患者，目的是治療患有醫(yī)學疾患的 患者。優(yōu)選地，從患者中分離出的細胞是一種能夠分化為抗原呈遞細胞的 干細胞。
此外，屬于本發(fā)明范圍內的是，包含本發(fā)明核酸構建體的抗原呈遞細 胞不表達任何的共刺激性信號，而且抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽 的抗原性片段是自體抗原。
嵌合蛋白和抗體
本發(fā)明的一個目的是提供由如上所述核酸構建體編碼的嵌合蛋白，其 包含至少一個在操作上被連接的恒定鏈以及至少一個抗原性蛋白或者肽 或者所述抗原性蛋白或肽的片段。嵌合蛋白被理解為遺傳工程化蛋白，它 是由兩個或以上完整的或者部分的基因剪接在一起或一連串(非)隨機核 酸所制造的核苷酸序列編碼的。一方面，本發(fā)明涉及一種抗體，它能識別如上文所定義的嵌合蛋白。 術語抗體應當被理解為免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的活性部分。 抗體是例如完整的免疫球蛋白分子或其保留免疫學活性的片段。這種抗體 可被用于動物的被動免疫，或者用于檢測抗體所結合蛋白的檢驗中的應 用。
疫苗組合物
一方面，本發(fā)明涉及一種疫苗，其包含編碼以下的核酸序列至少一
個在操作上被連接至至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述抗原性蛋白或 肽的片段的恒定鏈。因此，所述的疫苗包含如上述任一個中所定義的核酸 構建體。此外，所述的疫苗可被用作藥品。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物可根據(jù)已知的方法諸如將一種或多種的藥學 上可接受的載運體(又被稱作賦形劑或穩(wěn)定劑)與活性劑相混合而配制。 這些賦形劑可以是對任意個體/動物，優(yōu)選地對脊推動物和更優(yōu)選地對人給 藥可接受的，因為它們以所用的劑量和濃度暴露于細胞或個體而言是無毒
性的。生理學上可接受的載運體常常是pH緩沖水溶液。這種賦形劑、載 運體以及配制方法的實例可在例如雷明頓氏制藥學(Maack出片反7>司，4尹 斯頓市，賓夕法尼亞州)中找到。生理學上可接受的載運體實例包括但不 限于緩沖劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、以及其他的有機酸；抗氧化劑，包 括抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋 白、明膠、或者免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸諸 如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，雙糖，以及其 他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或者糊精；螯合劑如EDTA;糖 醇如甘露醇或山梨醇；成鹽的抗衡離子，諸如鈉離子；和/或非離子表面活 性劑，諸如tweentm，聚乙二醇(PEG)和PLURONICStm。
為了將藥學上可接受的組合物配制成適于有效給藥的，根據(jù)本發(fā)明， 這種組合物包含有效量的核酸構建體，該核酸構建體被包含在如這里所述 的傳輸媒介物內或者這種組合物包含有效量的在核酸構建體內編碼的嵌 合蛋白。時常，如杲用如本發(fā)明核酸構建體編碼的蛋白或多肽接種，載運 體就-波用作支架偶聯(lián)上該蛋白或肽，因此有助于誘導免疫應答。載運體蛋白可以是任何常規(guī)的載運體，包括任何適于呈遞免疫原性決定子的蛋白 質。適合的載運體一般是大的、緩慢代謝的大分子，例如，蛋白質、多糖、 聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質聚集物(諸如油滴 或脂質體)，以及失活的病毒粒子。這種載運體對于本領域的普通技術人 員而言是熟知的。此外，這些載運體可發(fā)揮如免疫刺激劑("佐劑")的功 能。用佐劑和/或制藥的載運體可完成動物的免疫。常M^的載運體蛋白包括， 但不限于，鑰孔蟲戚血藍蛋白，血清蛋白諸如轉移蛋白，牛血清白蛋白， 或人血清白蛋白，卵白蛋白，免疫球蛋白，或者激素，諸如胰島素。載體 可以與佐劑 一起存在或者在這里各自獨立地存在。
在下文中，疫苗組合物是指包括在預防性和治療性用途(包括在患者 中刺激免疫應答)方面有用的組合物。本發(fā)明進一步地考慮到，本發(fā)明的 疫苗組合物不會誘導任何系統(tǒng)的或局部的毒性反應或者任何其他的副作 用。
在一種優(yōu)選的實施方案中，疫苗的核酸構建體是被包裝的。包裝核酸
構建體的手段包括選自但不限于下面組的手段基于RNA或基于DNA的 載體、基于脂質的載運體、病毒表達載體、病毒傳輸載體、基于細胞的媒 介物、膠體金粒子的包層(coating)、可生物降解的聚合物微球。因此，可 以使用任意的上述傳輸手段，用于疫苗組合物用途的包裝目的。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，用于疫苗的核酸構建體包裝手段是病毒 表達載體，其選自但不限于下面的組腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺 相關的病毒、皰滲病毒、牛痘病毒以及DNA病毒載體。
在一種更加優(yōu)選的實施方案中，疫苗的核酸構建體被包裝至腺病毒載 體中。在最優(yōu)選的實施方案中，如在上面所描述的任何疫苗中的核酸構建 體被包裝在復制缺陷或者有條件的復制缺陷腺病毒載體中。腺病毒載體在 上面進4亍了詳纟田i也4苗述。
一方面，本發(fā)明涉及一種包含至少兩個載體的疫苗。這包括了，任意 一個或兩個不同的如所述的核酸構建體可被包裝至至少兩個載體中，這些 載體屬于在上面任意部分中所描述的類型。此外，本發(fā)明涉及一種包含三
個、四個、五個或六個載體的疫苗。同樣地，這些載體可彼此相區(qū)別或者沒有區(qū)別，并且可載運如上所述的、相同的或不同的核酸構建體。另一方 面，本發(fā)明涉及一種包含至少一個嵌合蛋白(如由這里所述任意核酸構建 體所編碼的)的疫苗。當嵌合蛋白或多肽將^^史用作免疫原時，它可用上述 任意一個或多個DNA構建體在重組細胞中表達而生產，或者它可用本領 域中已知方法化學合成而制備。如上所述，這種嵌合蛋白和/或肽可以被偶 聯(lián)至載運體，從而提高對該蛋白/肽的免疫學應答，并且可以帶有或者沒有 佐劑和/或"武形劑而被施用。
佐劑
在疫苗組合物中可包括佐劑，以增強特異性免疫應答。因此，鑒別佐 劑是特別重要的，當它與抗原/核酸構建體和/或傳輸媒介物如腺病毒媒介 物(任何可同樣被稱作免疫原性決定子的)相組合，得到能夠誘導強特異 性免疫學應答的組合物時。免疫原性決定子還可在進行免疫前與兩個以上 不同的佐劑相混合。疫苗組合物在本文中還被稱作免疫原性組合物。
大量的佐劑已被描述，而且在實驗室動物諸如小鼠、大鼠和家兔中用 于抗體的產生。在這種設定中，副作用的耐受性相當高，主要的目的是獲 得強的抗體應答。為了使用和為了在藥物中使用的批準，特別是為了用于 人，要求疫苗組合物的組份，包括佐劑，進行很好地表征。進一步的要求 是，組合物具有最小風險的任何副反應如肉芽瘤、膿瘡或發(fā)熱。
本發(fā)明的一種實施方案涉及一種包含佐劑的疫苗。在一種優(yōu)選的實施 方案中，疫苗組合物是適于對哺乳動物施用，而且最優(yōu)選地對人使用。因 此優(yōu)選的佐劑是適于對哺乳動物施用，而且最優(yōu)選地是適于對人受治療者 的施用。
進一步地，佐劑的選取是根據(jù)其刺激所需免疫應答類型、B細胞或/ 和T細胞活化的能力而選擇的，并且疫苗組合物可被配制成制劑，以便優(yōu) 化分布以及對相關、淋巴組織的呈遞。
與本發(fā)明有關的佐劑可根據(jù)它們的起源而分組，是礦物的、細菌的、 植物、合成的或者宿主產物。在這種分類下的第一組是礦物佐劑，例如鋁 化合物。為了增加在動物和人中的免疫應答，已廣泛地使用了用鋁鹽沉淀的抗原或者相混合的抗原或者被吸收至成形鋁化合物的抗原。在進行免疫 后七天，已在家兔的區(qū)域性淋巴結中證實了鋁粒子，在它們自己的淋巴結 內將抗原引導到包含T細胞的區(qū)域可能是另 一個重要的功能。佐劑的效力 已證明與引流淋巴結的提示相關。盡管許多研究已確定與鋁鹽一起施用的 抗原導致人免疫性的提高，細胞介導的免疫性可能只是稍稍地提高，如用 延遲型超敏性所測量的。同樣地，氫氧化鋁已被描述為活化互補的途徑。
這種機理可在局部炎性應答以及免疫球蛋白的產生和B細胞記憶中起到作
用。此外，氫氧化鋁可保護抗原免受快速的異化代謝作用。主要地由于它 們的優(yōu)秀安全性記錄，目前鋁化合物是在人類中使用的唯一佐劑。
另 一個大組的佐劑是細菌起源的那些?？梢约兓秃铣删哂屑毦鹪?br> 的佐劑(例如，胞壁酰二肽，脂質A)，而且宿主介質已被克隆(白介素1 和2)。在化學純化幾種細菌起源活性組份的佐劑方面，最近十年已帶來顯 著的進步百日咳桿菌、結核分枝桿菌、脂多糖、弗氏完全佐劑(FCA) 和弗氏不完全佐劑(Difco Laboratories,底特律，密西根州)以及默克佐劑 65(默克公司，羅維市，新澤西州)。根據(jù)本發(fā)明，其他適合的佐劑是， 例如，Titermax經(jīng)典佐劑(SIGMA-ALDRICH), ISCOMS, Quil A, ALUN,參 見US 58767和5,554,372,脂質A衍生物，霍亂毒素衍生物，HSP衍生物, LPS衍生物，合成肽基質，GMDP,以及其他和免疫刺激劑的組合(US 5,876,735)。在本發(fā)明上下文中，百日咳桿菌作為佐劑是讓人感興趣的，由 于它通過作用于T淋巴細胞種群而調節(jié)細胞介導免疫性的能力。關于脂多 糖和弗氏完全佐劑，輔助活性部分已被鑒別和合成，這樣允許研究結構-功能關系。根據(jù)本發(fā)明，這些也被考慮包括在免疫原性組合物中。
脂多糖及其各種衍生物，包括脂質A，已被發(fā)現(xiàn)在與脂質體或其他脂 質乳劑組合中是強力的佐劑。尚未肯定是否可以生產出通常在人中使用而 具有非常低毒性的衍生物。弗氏完全佐劑在多數(shù)實驗研究中是標準。
為了保護抗原免受快速異化代謝作用，可將礦物油添加至免疫原性組 合物。
根據(jù)本發(fā)明，許多其他類型的材料可被用作免疫原性組合物中的佐 劑。它們包括植物產品如皂素，動物產品如曱殼素以及眾多的合成化學品。根據(jù)本發(fā)明，佐劑還可根據(jù)它們的作用機理而分類。這種類型的分類 勢必存在武斷，因為大多數(shù)的佐劑可能通過超出一種的機理發(fā)揮作用。佐 劑可通過抗原的定位和傳輸而起作用，或者通過直接作用于組成免疫系統(tǒng) 的細胞，諸如巨噬細胞和淋巴細胞。根據(jù)本發(fā)明，佐劑增強免疫應答的另 一種機理是通過創(chuàng)造抗原儲庫。這可能有助于鋁化合物、油乳劑、脂質體 以及合成聚合物的佐劑活性。脂多糖和胞壁酰二肽的佐劑活性可能主要是 通過活化巨噬細胞而介導的，然而百日咳桿菌作用于巨噬細胞和淋巴細 胞。根據(jù)本發(fā)明，當摻入免疫原性組合物時可能有用的進一步佐劑實例被
描述于US 5,554,372。
因此，根據(jù)本發(fā)明，在預防性和治療性疫苗中都有用的佐劑可以是礦 物質鹽，諸如氬氧化鋁和磷酸鋁或釣的凝膠，油乳劑和基于表面活性劑的 制劑如MF59(微流體洗滌劑穩(wěn)定化的水包油乳液)，QS21 (純化皂素)，AS02 (SBAS2,水包油乳液+單4木酰脂質A (MPL) + QS21), Montanide ISA51和 ISA-720 (穩(wěn)定化油包水乳劑)，佐劑65(包含花生油，二縮甘露醇單油酸酯 和單石更脂酸鋁)，RIBI ImmunoChem Research Inc.,漢密爾頓市，猶他州), 微粒子佐劑，諸如病毒顆粒(摻入流感血凝素的單層脂質體媒介物 (cehicles )), AS04 (具有MPL的Al鹽)，ISCOMS (皂素和脂質(例如膽固醇) 的結構化復合物)，聚丙交酯共-乙交酯(PLG),微生物衍生物(天然的以及 合成的)諸如單磷酰脂質A (MPL), Detox(MPL+草分歧桿菌(M尸/i/e,)細 胞壁骨架)，AGP(RC-529 (合成的?；瘑翁?),DCJ旦固醇(能夠自身組織成 脂質體的類脂免疫刺激劑)，OM-174 (脂質A衍生物)，CpG基序(包含免疫 刺激性CpG基序的合成寡核苷酸)，具有非毒性佐劑作用的修飾細菌毒素, LT和CT,內源性人免疫調節(jié)劑，例如hGM-CSF或hIL-12或Immudaptin (C3d串聯(lián)陣列)，惰性媒介物諸如金粒子。
佐劑的其他實例包括免疫刺激性油乳劑(例如，油包水，水包油， K包油包水，諸如實例弗氏不完全佐劑如Montainde⑥，Specol，礦物鹽例 如A1(0H)3,A1P04,微生物產物，皂素諸如QualA，合成的產品，以及輔助 性制劑，和免疫刺激性復合物(ISCOM)和細胞因子，熱滅活細菌/組份，納 米珠,LPS,LTA。在W003089471，第6-8頁公開了其他常用佐劑的目錄，特此引入該目錄作為參考)。
才艮據(jù)本發(fā)明，免疫原性組合物還可以含有稀釋劑諸如緩沖液，抗氧化 劑如抗壞血酸，低分子量(少于約10個殘基)多肽，蛋白質，氨基酸，
碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖或糊精，螯合劑如EDTA，谷胱甘肽以及其 他的穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖鹽水或者與非特異性血清白蛋白混合的鹽 水是示例性適宜的稀釋劑。
在免疫原性組合物中通常包括佐劑，其用量根據(jù)制造商的使用說明。
給藥
根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物可以治療上有效量對個體施用。所述有效量 可以根據(jù)各種因素例如個體的疾患、體重、性別和年齡而改變。其他的因
素包括給藥的模式。
本發(fā)明可以各種途徑例如皮下的、局部的、口服的和肌內的來對個體 提供藥物的或獸用的組合物。藥物組合物的給藥是以口服或非胃腸而實現(xiàn) 的。非胃腸遞送的方法包括局部的、動脈內的(直接地進入組織)、肌內 的、皮下的、髓內的、鞘內的、心室內的、靜脈內的、腹膜內的或鼻內的 給藥。本發(fā)明還包括這樣的目的，提供適于局部的、口服的、系統(tǒng)的和非 胃腸的藥物制劑，用于以疫苗組合物的預防和治療方法中的應用。
例如，疫苗組合物可以如下的口服劑型片劑、膠嚢劑(每個都包括 計時釋放和持續(xù)釋放的制劑)、丸劑、粉末劑、顆粒劑、酏劑、酊劑、溶 液劑、混懸劑、糖漿劑和乳劑，或者用注射而施用。同樣地，它們還可以 靜脈內(推注和輸注)、腹膜內、皮下、帶有或沒有閉合的局部、或者肌 內形式而施用，所有的應用形式對于本領域普通技術人員而言是熟知的。 包括這里所迷的任意化合物的有效而無毒性量的疫苗可用作預防性或治 療性藥劑。同樣地，本發(fā)明包括本領域已知的、適于將可注射免疫原性肽 配制成組合物的、任意的和所有的常規(guī)劑型，例如凍干形式和溶液劑，混 懸液或者乳劑形式，根據(jù)需要，它們含有常規(guī)的藥學上可接受的載運體、 稀釋劑、防腐劑、佐劑、緩沖劑組份，等。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的疫苗組合物給藥模式包括，但不限于系統(tǒng)性給藥，諸如靜脈內或皮下給藥、皮內給藥、肌內給藥、鼻內給藥、口服給藥、直 腸給藥、陰道給藥、肺部給藥以及任何通用形式的粘膜給藥。此外，用于 本發(fā)明中這里所提到的任意給藥形式的手段在本發(fā)明的范圍內。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗可被施用一次，或者任意數(shù)目的次數(shù)如兩次、三次、 四次或五次。施用疫苗超過一次具有加強所得免疫應答的作用。憑借以不 同于先前給藥的形式或身體部位的施用可進一步地加強疫苗。追加注射是 同源性或異源性的追加注射。同源性追加注射是指，初次和后續(xù)的4^種包 含了相同的構建體以及更明確地相同的傳輸媒介物尤其是相同的病毒載 體。異源性追加注射是指，相同的構建體被包含在不同的病毒載體中。當 利用腺病毒傳輸時，這是特別感興趣的，因為如果之前已被暴露過，那么 人體提高抗指定腺病毒的免疫應答。因此， 一種優(yōu)選的本發(fā)明實施方案涉 及腺病毒載體聚乙二醇化，提供了用相同的(同源性的)腺病毒載體加強
的選擇。 一種替代的和優(yōu)選的實施方案涉及用包含相同構建體的不同腺病 毒載體持續(xù)地加強疫苗。
根據(jù)本發(fā)明， 一種優(yōu)選的疫苗給藥形式對身體表面、內部或者外部， 最可能地是對已知感染的接受部位施用疫苗。所述感染接受部位是4妄受感 染的身體表面，例如就流感而言，感染接受部位是肺部。
本發(fā)明的疫苗可以被施用至可能對其有益的任何生物體，特別是諸如 脊推動物的任一動物。屬于本發(fā)明范圍內的是，疫苗給藥的手段和模式是 適于接受者的。
一種優(yōu)選的疫苗接受者是哺乳動物，而且在本發(fā)明更優(yōu)選
的實施方案中該哺乳動物選自下面的組牛、豬、馬、綿羊、山羊、美洲
鴕、小鼠、大鼠、犬、貓和人。在最優(yōu)選的實施方案中該哺乳動物是人。 一種本發(fā)明優(yōu)選的實施方案包括進一步包含第二種活性成分的疫苗
組合物。所述第二活性成分選自，但不限于下面的組抗生素、化療藥、 抗過每丈藥、細胞因子、補體因子以及免疫系統(tǒng)的共刺激性分子。
本發(fā)明另一種實施方案包括一種成套試劑盒(kit in parts),其中所述 試劑盒包括至少一種根據(jù)上面的疫苗組合物，用于施用所述疫苗的手段， 以及關于如何使用的說明書。相同疫苗或幾種不同疫苗的多劑量包括在本 發(fā)明范圍內。在優(yōu)選的實施方案中，成套試劑盒進一步地包括第二活性成本發(fā)明進一步地包含一種在動物中誘導免疫應答的方法，包括對動物 施用根據(jù)上面任意一種的疫苗。所述免疫應答是，但不限于任一下列類型
的應答MHC-I依賴型應答、MHC-I和/或MHC-II依賴型應答、T細胞依 賴型應答、CD4 T細胞依賴型應答、CD4+ T細胞獨立型應答、CD8+ T細 胞依賴型應答以及B細胞依賴型免疫應答。落入本發(fā)明范圍內的另一種方 法是這樣的方法，提供了至少一種根據(jù)上面任一的疫苗，和對受治療者施 用所述至少一種疫苗至少一次，用于動物的治療和預防。本發(fā)明還包括根 據(jù)這里所述的核酸構建體用于制備組合物以生產疫苗。所述疫苗可用于但 不限于動物的基因免疫接種，或者用于治療所需患者的臨床疾患。
附圖的詳細描述
圖1:在腺病毒載體中插入的示意圖。A) Ad-GP表達盒示意圖，B) Ad-IiGP表達盒示意圖。還表達各種LCMUGP表位的情況。Ad-GP:腺病 毒-糖蛋白，CMV:巨細胞病毒啟動子，Ii:恒定鏈，LCMVGP1-498:源自 淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒的糖蛋白，終止(STOP):終止密碼子，聚 A: SV40聚腺苷化信號。
圖2: CD8+和CD4+ T細胞對編碼表位腺病毒的應答。用2 x 107感染 單位(IFU)的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部對C57BL/6小鼠進行接種。 在接種后所示的天數(shù)上，用細胞內染色脾細胞的肽誘導IFN-y而測定表位 特異性CD8+或CD4+ T細胞的數(shù)目。豎條表示3-5只動物的平均值(Avg)士 標準偏差(SD)。
圖3:在Fi雜種小鼠中CD8+和CD4+ T細胞對編碼表位腺病毒的應答。 用2 x 107 IFU的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部對C57BL/6 x BALB/c (H-2bxd)F,小鼠進行接種。在接種后21天，用細胞內染色脾細胞的肽誘導 IFN-y而測定表位特異性CD8+或CD4+ T細胞的數(shù)目。豎條表示4-5只動物 的平均值iSD。
圖4: Ad-IiGP發(fā)揮獨立于CD4+ T細胞的CD8+ T細胞刺激性作用。用2 x 107 IFU的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部對MHC-II一或C57BL/6 小鼠進行接種。在接種后21或90天，用細胞內染色脾細胞的肽誘導IFN-y 而測定表位特異性CD8+或CD4+ T細胞的數(shù)目。豎條表示4只動物的平均 值土SD。
圖5: Ad-IiGP賦予了快速和上佳的保護，防止致命性LCMV感染。 用2 x 107 IFU的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部對C57BL/6小鼠進行接 種。在接種后所示的天數(shù)上，用20 pfu (空斑形成單位)LCMV Arm 53b大 腦內(腦內)攻擊動物。記錄共14天的死亡率。每一個組由5至18只動物 組成。ND是指沒有數(shù)據(jù)。
圖6:Ad-IiGP有效地防止了高劑量、靜脈內LCMV感染。用2 x 107 IFU 的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部對C57BL/6小鼠進行接種。在接種后 21天，用lxl()Spfu(空斑形成單位)LCMVArm克隆13靜脈注射(靜脈內) 攻擊動物。測定病毒攻擊器官后8天的病毒滴度。點代表各個動物。虛線 代表檢驗的檢測限度。
圖7: Ad-IiGP賦予對在免疫優(yōu)勢表位中具有突變的、致命性LCMV 變體的上佳保護。用2 x 107 IFU的Ad-GP、 Ad-IiGP或假處理劑感染右后 足底部而對C57BL/6小鼠進行接種。在接種后90天，用20 pfu LCMV Arm 53b (在gp33、 gp276或者兩者的表位中攜帶突變)大腦內攻擊動物。記 錄共14天的死亡率。對于印33近等基因系和gp276近等基因系，每一組 由5只動物組成，對于pg33/gp276雙近等基因系，該組是10只動物。
圖8:在Ad-IiGP接種，而且用在免疫優(yōu)勢表位中具有突變的LCMV 變體攻擊后，CD8+或CD4+T細胞對特異性LCMV表位的反應頻率。對于 從圖7中所描述實驗中存活的動物進行分析，用細胞內染色脾細胞的肽誘 導IFN-y而分析表位特異性CD8+或CD4+ T細胞。豎條表示3-5只動物的 平均j直iSD。
圖9: CD8+和CD4+ T細胞對用棵DNA-IiGP和DNA-GP接種的應答。 用被包被在1.6 nm金粒子上的DNA、濃度為2嗎DNA/mg金接種C57BL/6 小鼠，而且DNA-金復合物被包被到塑料管上，這樣每次注射對小鼠遞送 0.5mg金(每次注射1昭DNA)。在腹部皮膚處，對小鼠進行免疫，應用手持基因槍設備，利用壓縮氦氣(400 psi)作為粒子的動力。以1星期的
間隔對小鼠接種四次，然后在開始研究前使其休息1星期。用細胞內染色
脾細胞的肽誘導IFN-y而測定表位特異性CD8+或CD4+ T細胞的數(shù)目。豎 條表示4-5只動物的平均值士SD。
圖10:用Ad-Ii-GP預防性的接種增加了腫瘤的排斥性。在右后足底 部用2 x 107 IFU的編碼全長LCMV糖蛋白的腺病毒(Ad-GP)或者編碼連 接至恒定鏈的糖蛋白(Ad-Ii-GP)的腺病毒對C57BL/6小鼠進行接種。用 編碼全長p-半乳糖苷酶的腺病毒或者活的LCMV ( 103 PFU的LCMV Armstrong 53b )感染對照。約3個月后，攻擊所有的動物，用皮下注射106 表達衍生GP33表位的LCMV的B16.F10黑素瘤細胞。初期，在所有的動 物中都形成了腫瘤，但是多數(shù)Ad-Ii-GP和LCMV免疫小鼠最終排斥腫瘤。 每個組由7-10只動物組成。
圖11:用Ad-Ii-GP的治療性接種增加了攜帶腫瘤小鼠的平均壽命。攻 擊C57BL/6小鼠，用皮下注射106表達衍生GP33表位的LCMV的B16.F10 黑素瘤細胞。當在所有小鼠中可觸及腫瘤(腫瘤注射后5天)時，在右后 足底部用2 x 107 IFU編碼全長LCMV糖蛋白的腺病毒(Ad-GP)或者編碼 連接至恒定鏈的全長LCMV糖蛋白的腺病毒(Ad-Ii-GP )對動物進行接種； 用編碼全長P-半乳糖普酶的腺病毒或者活的LCMV (103 PFU的LCMV Armstrong 53b )接種對照。當腫瘤超出12 mm長度或者觀察到潰瘍時處死 小鼠。圖中心的加粗的數(shù)目表示經(jīng)腫瘤攻擊后死亡的平均天數(shù)。每個組由 7-10只動物組成。
圖12:經(jīng)過用Ad-Ii-VSVGP或Ad-VSVGP接種后的存活率。在右后 足底部用2 x 107 IFU的編碼全長水泡性口炎病毒糖蛋白的腺病毒 (Ad-VSVGP)或者編碼連接至恒定鏈的全長水泡性口炎病毒糖蛋白的腺 病毒(Ad-Ii-VSVGP )對C57BL/6小鼠進行接種。(A)在所示的天數(shù)，收 集血清樣品，然后用空斑減少數(shù)檢驗法測定體外中和抗體的滴度，圓點代 表各只動物。(B)在所示的天數(shù)，用105 PFU的VSV鼻內攻擊已接種的 小鼠，并且登記超過隨后14天的死亡率。存活的對照(未接種的)小鼠 已包括，用于對比。每個組由5-10只動物組成。圖13: CD8+和CD4+T細胞對更多編碼表位腺病毒的應答。在右后足 底部用2 x ] 07 IFU所示構建體接種C57BL/6小鼠(流感和OVA)或者B6D2 Fi小鼠(MHV-68 M2和M3)。在所示的天數(shù)，用細胞內染色脾細胞的肽誘 導IFN-y而測定表位特異性CD8+或CD4+T細胞的數(shù)目。Iso是確定背景的 同型對照組。豎條表示4-5只動物的平均值士SD。
圖14:用CD8+ T細胞對編碼表位腺病毒的應答測量Ad-Ii-GP構建體 對比于Ad-GP-Lamp-l構建體的有效性。在右后足底部用2 x 107 IFU的所 示構建體接種C57BL/6小鼠。在第21天，用細胞內染色脾細胞的肽誘導 IFN-y而測定表位特異性CD8+細胞的數(shù)目。豎條表示3只動物的平均值 士SD。
圖15:基于框架內多？i接頭的載體。用AsiSl、 Swal、 Ascl、 Pmel、 Fsel以及終止位點包括在3'引物的序列PCR擴增沒有終止密碼子的Ii，并 且克隆至pacCMV載體。得到的載體被編號為770 (參見在SEQ ID NO: 7 中于此的部分序列)。還構建了稱為768 (參見在SEQ ID NO: 8中于此的 部分序列)沒有摻入Ii序列的對應載體。
圖16:帶有IRES2位點的載體。用PCR和限制性酶切將IRES2從 pLP-IRES2-EGFP克隆至770載體，構建了稱為"pacCMV Ii MCS IRES2" (并且編號為1163,參見在SEQ ID NO: 9中于此的部分序列)的載體。 I-scel和Srfl的序列被包括在3 ，引物中。在IRES序列后面的首個ATG位 點啟動了第二個蛋白的表達。還構建了稱為"pacCMV MCS IRES2"且編 號為1165 (參見在SEQ ID NO: 10中于此的部分序列)沒有摻入Ii序列的 對應載體。
實施例
本發(fā)明將參照下面的實施例予以進一步的說明。應當認識到，下列的 只是實例的方式，并且可以作詳細地改進，但是仍然落入本發(fā)明的范圍內。
實施例1
CD8+和CD4+ T細胞對編碼表位腺病毒的應答。'/、底C57BL/6 (H-2b), C57BL/6xBALB/c (H-2bxd) Fl雜種和MHC II-/j_Kt(B6.129-H2-AMtmlGlmN12 (H-2b))是獲得自Taconic M&B (Ry,丹 麥)。所用小鼠都是7-10周齡的，并且飼養(yǎng)在特定的無菌設施里。所有的 實驗操作都是根據(jù)當?shù)氐膶嶒炛改隙M行的。
為了構建缺失E1和E3腺病毒表達、被融合至恒定鏈的 抗原衍生的LCMV,我們進行了2步PCR。首先，我們獲得了含有全長小 鼠恒定鏈和全長LCMV糖蛋白的重疊PCR產物，而且這些^^皮帶有恒定鏈 5'和糖蛋白3，引物的二次PCR所聯(lián)合。表達全長GP的腺病毒在一步PCR 中被擴增。將所得到的片段克隆至pacCMV穿梭載體。所得質粒與pJM17 質粒被共轉染至HEK293細胞中并且得到了病毒溶解物。在測序、大規(guī)模 生產以及用CsCl梯度離心分離純化前，用空斑純化克隆這些，如所述的 (Becker等，1994， M"/^A Ce〃說o/. 43 Pt A: 161 -189 )。用腺苷-X快速滴 度試劑盒(Clontech)確定腺病毒母液的感染性。所有未修飾病毒母液具 有46至201之間的粒子/IFU比率。
在所有的研究中，將待接種的小鼠麻醉并且在右后足底部注射 2xl()7感染單位、0.03ml體積。
4#^染將小鼠感染，腦內用20 pfu的LCMV Armstrong克隆53b、 體積0.03ml或者靜脈內用1()Spfo的LCMV克隆13、 0.3 ml。腦內感染誘 導了致命的CD8+T細胞介導腦膜炎，由此免疫活性小鼠在感染后(p.i.) 7 至 10 天死亡 (Christensen 等,Sc""d/"a由"Jowm"/ /附mwwo/ogy 40:373-382 )。
存活羊^f宏應用死亡率來評價急性LCMV誘導腦膜炎的臨床嚴重 性。在腦內接種后，每天檢查小鼠兩次，最少2星期；將感染后少于3天 發(fā)生的死亡從分析中排除。
器#4#諒產為了確定器官中病毒的滴度，首先在PBS中將這些均 質化從而得到10% (v/w)器官懸浮液，然后制備連續(xù)的IO倍稀釋液。然 后，將每一種稀釋液裝板于MC57G細胞上， 一式兩份。在感染后四十八 小時，檢測被感染的細胞簇，應用單克隆大鼠抗LCMV (VL-4)抗體、過 氧化酶標記的山羊抗大鼠抗體以及鄰苯二胺(底物)(Battegay等，1991,Jowr"a/ Mra/og&a/ M"/ oA 33:191-198 )。計數(shù)pfu的數(shù)目，并且結果表 示為pfu/giE織。敘應^斬務擠壓器官通過細的不銹鋼篩而獲得脾細胞的單細胞混懸液。l于遂4'勿/g農^我謬下面的單克隆抗體(mAb )購自BD PharMingen (圣迭戈市，加州)作為大鼠抗小鼠抗體細胞色素軛合的抗 CD8、 FITC輒合的抗CD44、藻紅蛋白(PE)軛合的抗IFN-y以及PE軛合的 IgGi同型標準品。^;4'勿^嫁農為V^:根據(jù)標準實驗室操作方法，實施用于流式細胞儀的細胞染色(Andersson等，1994, Jow層/ //w聽"o/ogy 152:1237-1245; Andreasen等，1999, /她m油'朋a/ /m廳wo/ogy 11: 1463-1473 )。 為了 LCMV 特異性CD8+ T細胞的計數(shù)，在莫能霉素(3 ^M, Sigma Chemicals co.,圣路 易斯市，密蘇里州)以及鼠重組IL-2(10單位/孔，R&D Systems Europe Ltd, 阿伯頓市，英國)存在下，將脾細胞在具有相關肽(0.1 ng/ml)的5% C02 中于37°C體外培育5小時。經(jīng)培育后，將細胞表面染色，沖洗，固定和 使用0.5%急素滲透化。然后，用抗IFN-y或IgG!同型對照于4°C染色細 胞20分鐘。用流式細胞儀Becton Dickinson FACSCalibur分析樣品，應用 低角度以及側面散射的組合，至少104單核細胞被門控，從而排除了死亡 細胞和碎片。應用Cell Quest Pro (B&D Biosciences)進行數(shù)據(jù)分析。通過標準的方法(Becker等，A/"/20必Ce〃fto/. 43 Pt A:161-189 )可以 產生表達淋巴細胞性脈絡叢腦炎病毒全長糖蛋白(Ad-GP)或N-端被連接 至鼠恒定鏈的淋巴細胞性脈絡叢腦炎病毒全長糖蛋白((Ad-IiGP)表達盒 的示意性表示參見圖1 )的復制缺陷腺病毒載體。然后，用2xl(^感染單 位的Ad-GP或Ad-IiGP在右后爪對C57BL/6小鼠進行接種，并且在5、 7、 11、 14、 21、 28、 90、 180或360天后處死小鼠。然后，分析在脾細胞上 產生的LCMV糖蛋白特異性T細胞。顯然地(參見圖2 )，在所有的檢驗 計時點處，Ad-IiGP誘導了數(shù)量上優(yōu)越的T細胞應答，相比于Ad-GP，而 且這些是加速的并且包括CD4+和CD8+兩種T細胞應答。因此，經(jīng)Ad-IiGP 接種后所產生的T細胞峰數(shù)目是在接種后7-14天獲得的，取決于表位，Ad-GP在接種后21天出現(xiàn)應答高峰。 實施例2
在Fi雜種小鼠中CD8+和CD4+ T細胞對編碼表位腺病毒的應答由于 C57BL/6小鼠在所有的基因座上關于MHC I類和MHC II類分子都是純合 的，所以我們檢驗了 Ad-GP和Ad-IiGP是否也能在表達H-2b和H2d兩種 單倍型的C57BL/6xBALB/cFH、鼠中誘導免疫應答。這些小鼠類似于遠系 繁殖的群體，但是具有確定的單倍型。實驗是按照上面而實施的，但是檢 驗-故限制在接種后21天。如從圖3中所能看到的，Ad-IiGP有效誘導CD8+ T細胞對多數(shù)表位的應答，而Ad-GP似乎比在純合C57BL/6小鼠中表現(xiàn)得 更糟。
實施例3
Ad-IiGP發(fā)揮獨立于CD4+ T細胞的CD8+ T細胞刺激性作用由于在 增強CD8+ T細胞刺激方面Ii功能的潛在機理是能夠運輸至內體和溶酶體 室并且通過MHC II類刺激CD4+ T細胞(Diebold等，2001, 77i" 8:487-493 )，所以我們實施了 MHC II類缺陷小鼠的接種。在右后足底部用 2 x 107 IFU的Ad-GP或Ad-IiGP接種MHC-II;或C57BL/6小鼠。在接種 后21或90天，用細胞內染色脾細胞的肽誘導IFN-y而測定表位特異性CD8+ 或CD4+T細胞的數(shù)目。如從圖4所能看到的，Ad-IiGP有效地誘導CD8+T 細胞針對幾種表位的應答；然而在缺少CD4+ T細胞輔助下，有些應答低 于野生型小鼠中所見的。
實施例4
Ad-IiGP賦予快速的、上佳的和持續(xù)的保護，防止致命性LCMV感染 由于我們觀察到相比于Ad-GP對Ad-IiGP的應答加速，所以我們研究了接 種賦予在接種后21天(Ad-GP的峰值)以及在接種后3、 5、 7、 14、 60、 90、 180和360天(圖5)的保護的能力。引人注目地，我們發(fā)現(xiàn)了接種Ad-IiGP僅3天的動物被保護免受腦內LCMV感染。由Ad-GP賦予的保護 在感染后14和24天只是一部分，而且在60天以后未見保護。此外，Ad-IiGP 所賦予的保護持續(xù)360天，此時，Ad-GP不再防止腦內LCMV感染。實施例5Ad-IiGP有效地防止高劑量、靜脈內LCMV感染由于我們發(fā)現(xiàn) Ad-IiGP防止小鼠急性局部化感染，所以我們打算研究是否高劑量系統(tǒng)性 感染也是這樣的。因此，用Ad-GP、 Ad-IiGP或假處理劑(PBS)接種小鼠， 并且在21天后用靜脈注射106空斑形成單元的快速復制LVMV克隆13菌 抹進行攻擊。5天后，處死動物，并且測定在肺中的感染滴度。盡管Ad-GP 對接種動物賦予了顯著的保護，但是Ad-IiGP是更佳的，而且將滴度減少 到檢驗的檢測限值或之下的水平(圖6)。實施例6對比分析新構建體的動力學、應答的量級、長期的免疫性以及免疫所 需的病毒劑量。下面描述的所有構建體是彼此間地、以及對Ad-GP和Ad-IiGP進行對 比分析的，涉及免疫應答的動力學和量級，例如在實施例1、 2和3中所 描述的，長期免疫性，例如在實施例1、 4和5中所描述的，以及所需免 疫性的病毒劑量。新構建體基于對Ii融合的變更。在每個構建體中，腺病毒編碼的GP 在N-末端^皮融合至l.Ii的溶酶體靶向序列2. Ii的CLIP序列3. K的KEY序列4. CLIP序列以及N-末端鄰近CLP序列的序列5. CLIP序列以及C-末端鄰近CLP序列的序列6. N-末端鄰近CLP序列的序列
7. C-末端鄰近CLP序列的序列
抗原呈遞上下文序列的變更。在每個構建體中，腺病毒編碼的GP被 融合
1. 在C-末端上至LAMP
2. 在N-末端上至釣網(wǎng)蛋白的N-區(qū)域
3. 在C-末端上至鉤網(wǎng)蛋白的N-區(qū)域
4. 在C-末端上至Hsp70
5. 在N-末端上至Ii以及在C-末端上至鈣網(wǎng)蛋白的N-區(qū)域(AdliGPCrt)
6. 在N-末端上至Ii以及在C-末端上至Hsp70 ( AdliGPHsp70 )
此外，所有的這些構建體是一系列構建體的起點，其中GP-融合被內 部核糖體進入位點(IRES )和編碼VP22、 HIV tat或Cx4的基因所跟隨。
關于細胞間傳播的替換。在每個構建體中，腺病毒編碼的GP被融合
1. 在N-末端上至編碼單純皰滲病毒的VP22
2. 在N-末端上至編碼HIV的tat
3. 在N末端上至連接蛋白43 ( Cx43 )
4. 在N-末端上至其他連接蛋白和細胞間間隙連接成分。
此外，制備構建體，其中腺病毒編碼的GP被內部核糖體進入位點 (IRES)和編碼VP22、 HIV tat或Cx43的基因或其他連接蛋白以及細胞 間間隙連接成分所跟隨。
此外，所有的上述構建體都以任一下列方法進行變更
1. 所有的上述構建體被IRES位點和編碼NK-細胞(天然的殺滅細胞) 活化分子例如H60的基因所跟隨。這種變更賦予了共刺激性信號和細胞因 子輔助的傳輸提高。
2. 所有上述涉及IRES位點的構建體，其中下游基因被安置在單獨的 啟動子控制之下。3. 所有上述涉及IRES位點的構建體，其中下游基因是在單獨的載體 上#:編》馬的。
4. 所有上述的構建體安置在誘導型啟動子系統(tǒng)之下。
5. 所有上述的構建體安置在細胞類型特異性和/或誘導型啟動子系統(tǒng) 之下。
6. 所有上述構建體，其中GP抗原性序列用編碼任意下列抗原的序列 所代替，它們中有幾個包含多抗原，參見圖12和13中特異性抗原的實例: VSV-GP、甲型流感NS-1、曱型流感M1、曱型流感NP、 LCMVNP、 LCMV GP、埃博拉GP、埃博拉NP、鼠y皰瘆病毒(MHV-68) M2、 M3 (這對應 于人EBV和HHV8病毒)和ORF73、雞卵白蛋白(OVA )，或者輔助性T
細胞表位。此外，這些抗原性序列被組合在一起，這樣至少2個或更多在 同一載體中^皮編碼。
參見圖14關于Ad-Ii-GPpg33和gp276構建體的有效性對比實例，相 比于Ad-GP-Lamp-l pg33和gp276構建體，如用CD8+ T細胞應答所檢測 到的。如所見到的，Ad-Ii-GP構建體在激發(fā)CD8+ T細胞應答能力方面優(yōu) 于Ad-GP-Lamp-l構建體。
實施例7
關于動力學、應答大小、長期免疫性以及免疫性所需病毒劑量方面， 對比分析新構建體和替代性給藥方法。
實施例6中所述的所有構建體是彼此間地、以及對遵照替換給藥方法 的Ad-GP和Ad-IiGP對比分析的。所做的對比涉及免疫應答的動力學和大 小，例如在實施例l、 2和3中所描述的，長期免疫性，例如在實施例l、 4和5中所描述的，以及所需免疫性的病毒劑量。
替換性給藥方法包括
1.涉及提高共刺激性信號和細胞因子輔助的傳輸，其中在實施例6中 所述的構建體都是與編碼1型干擾素例如四環(huán)素可誘導的IFN-P的腺病毒一起共同注射的。此外，在實施例6中所述的所有構建體都是與編碼細胞因子例如IL-15的腺病毒一起共同注射的。2. Ad-IiGP與Ad-Tet-onGP是在身體的不同部位同時給藥的 (Ad-Tet-onGP在四環(huán)素可誘導的啟動子控制下編碼GP )。3. 實施例6中所述的任一插入物/構建體通過腺病毒進行傳輸，隨后 用相同的插入物/構建體進行同源性病毒載體加強，或者隨后用編碼相同插 入物/構建體的慢病毒或者其他腺病毒的傳輸而進行異源性病毒載體加強。實施例8Ad-IiGP賦予快速的和上佳的保護，防止在缺少主要表位下的致命性 LCMV感染。淋巴細J包性脈絡叢腦炎病毒全長糖蛋白(GP)包含四個不同 抗原性的CD8+特異性表位，用具有單獨表位特異性的CD8+細胞相對于對 GP接種應答的全部CD8+細胞的百分位數(shù)進行檢測?？笹P的大多數(shù)群體 CD8+細胞是對gp33表位特異性的，稍小的群體是對gp276特異性的，而 且少數(shù)群體是對gpl18和對gp92特異性的。由于gp33和gp276是主要的/ 優(yōu)勢免疫表位，所以我們研究了表位單獨地或者兩個同時的近等基因系突 變(nil mutation)如何影響Ad-IiGP融合構建體所提供的保護有效性。用在右后足底部感染2 x 107 IFU Ad-GP和Ad-IiGP或假處理劑接種 C57BL/6小鼠。每個組由5只動物組成。在接種后90天，應用20pfiiLCMV Arm53bi.c.(腦內)構建體攻擊動物，該構建體攜帶gp33近等基因系突變、 gp276近等基因系突變或者即3Wgp276雙近等基因系突變。記錄M天的 死亡率。如從圖7中所看到的，Ad-IiGP賦予上佳的保護，防止致命性LCMV 感染，盡管gp33或gp276近等基因系突變。gp33/gp276雙近等基因系突 變導致動物的存活率為70%，相比于在4姿種Ad-GP和々i處理劑組中無存活 動物。對上述實驗中存活的動物進行分析，用細胞內染色脾細胞的肽誘導 IFN-y而分析表位特異性CD8+或CD4+T細胞。所預期地，如從圖8中所看 到的，在缺少gp33或gp276的情況下，CD8+或CD4+T細胞的主表位特異性分別是即2冗或gp33。在gp33/gp276都缺少的情況下，CD8+或CD4+T 細胞的主表位特異性是gp92。實施例9CD8+和CD4+ T細胞對用棵DNA-IiGP和DNA-GP接種的應答。為了 研究恒定鏈融合疫苗而非腺病毒傳輸?shù)奶娲脚_，我們檢驗了 IiGP和GP 作為棵DNA激發(fā)GP表位特異性CD8+和CD4+ T細胞的能力?？肈NA包 含來自如圖1所示腺病毒載體的GP和Ii-GP片段。用被包被在1.6 nm金粒子上的DNA、濃度為2嗎DNA/mg金接種 C57BL/6小鼠，而且DNA-金復合物被包被在塑料管上，這樣每次注射對 小鼠遞送0.5 mg金(每次注射1嗎DNA )。在腹部皮膚處，對小鼠進行免 疫，應用手持基因槍設備，利用壓縮氦氣(400 psi)作為粒子的動力。以 1星期的間隔對小鼠接種四次，然后在開始研究前使其休息1星期。用細 胞內染色脾細胞的肽誘導IFN-y而確定表位特異性CD8+或CD4+ T細胞的 數(shù)目。如圖9中所能看到的，DNA-IiGP有效地誘導CD8+T細胞針對幾種 表位的應答。實施例10Ad-IiGP賦予上佳保護，防止表達來自LCMV的gp33表位的腫瘤細 胞攻擊。在正常狀況下，胂瘤細胞表達幾種不同的T細胞識別抗原。為了 確定這種應答的有效性，來自LCMV的B16.F10黑素瘤細胞表達的gp33 被用來攻擊被接種的動物。用2 x 107 IFU Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部對C57BL/6小鼠進行接 種。作為對照組， 一些動物是用Ad-P-半乳糖苷酶接種的(陰性對照)或 者用LCMV感染(陽性對照)。在接種/感染后90天，皮下施用106腫瘤細 胞攻擊動物，而且在腫瘤生長后，檢測腫瘤的大小。最初，肺瘤在所有動 物中形成，但是最終針對gp33的免疫應答消除了腫瘤細胞。每個組由7-10 只動物組成。用Ad-Ii-GP的預防性接種導致無腫瘤的小鼠占70%的實例，相比于接種Ad-GP的動物d義為10%，如從圖IO中所能看到的。在許多病例中，當醫(yī)師訪問患者時，腫瘤已經(jīng)形成。為了^f莫擬這種情 形，用106 B16.F10腫瘤細胞對C57BL/6小鼠進行皮下注射。5天后，腫 瘤是可觸摸識別到的，并可測量。在此計時點，用2 x 107 IFU Ad-GP或 Ad-IiGP在右后足底部對動物進行接種。作為對照組， 一些動物是用Ad-P-半乳糖苷酶接種的(陰性對照)或者用LCMV感染(陽性對照)。在腫瘤 生長后^r測肺瘤的尺寸， 一旦尺寸在任意方向大于12mm，就將動物處死。 如從圖11中所看到的，在給予了治療性Ad-IiGP疫苗的小鼠中，腫瘤發(fā)育 的速度大約為在給予Ad-GP作為治療疫苗的小鼠中 一半，如用達到12 mm 尺寸且動物被處死前所經(jīng)過的天數(shù)所檢測的。實施例11為了證實疫苗構建體同樣能誘導保護抗體的應答，使用了 VSV感染。在本研究中始終使用的是印第安納血清型水泡性 口炎病毒(VSV)。將病毒母液在L929細胞(ATCC CCL 1)中增殖，并 貝i存于-70。C直至應用。在單層L929細胞上用空斑檢驗法進行病毒的定量。 簡言之，在含有P/。L-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素、5。/。NaHC03和100/0 胎牛血清的伊格爾氏基本培養(yǎng)基(Fll)中，制備病毒的連續(xù)10倍稀釋液。 將一毫升的每種稀釋液一式兩份地加入至48小時前^皮鋪在培養(yǎng)亞中的單 層L929細胞上。經(jīng)過在5% C02中37°C培育90分鐘后，抽取含有病毒稀 釋物的培養(yǎng)基，而且用2.5 ml 1%瓊脂糖和2.5 ml 2xF11的混合物覆蓋該單 層。然后在5%032中37。C培育單層24小時，此后用含有1%中性紅的1 ml 1%瓊脂糖和1 ml 2xFll混合物染色。在進一步培育24小時后，計數(shù) PFU的數(shù)目。^活羊^f《:基于在CNS中的病毒滴度與臨床癥狀非常相關的早期發(fā) 現(xiàn)(Thomsen等1997, /脫/附w朋o/. 9:1757-1766.)，致死率被用作VSV感 染嚴重性的參數(shù)。每天檢查小鼠vsv誘導的癱瘓體征，當發(fā)現(xiàn)嚴重癱瘓 而且動物在隨后的24小時內無法抵御的，予以處死。業(yè)清#/口檢發(fā)將血清在Fll中的連續(xù)兩倍稀釋液與等體積、被稀釋
至含有大約100 PFU/ml的病毒相混合。經(jīng)室溫培育1小時后，將1 ml每 種血清-病毒混合物一式兩份地加入到培養(yǎng)亞中的單層L929細胞上，并且 用空斑檢驗法(參見病毒和病毒定量)檢驗殘留病毒的存在。減少空斑數(shù) 至少50%的最高血清稀釋被視為中和滴度。
用2 x 107 IFU的編碼全長糖蛋白水泡性口炎病毒(Ad-VSVGP )或者 被連接至恒定鏈的糖蛋白(Ad-Ii-VSVGP )的病毒在右后足底部對C57BL/6 小鼠進行接種。在接種后7天、14天、21天和110天，收集血清樣品，而 且用空白減少檢驗法測定體外中和抗體滴度，圖12a。在接種后3天、7 天、14天、21天和110天，用105 PFU的VSV鼻內地攻擊動物，并且記 錄隨后14天的致死率，圖12b。如圖12中所看到的，在兩個組中可看到 幾乎相同的應答，這表明，盡管不是優(yōu)勢，恒定鏈使得抗體產生，而且對 其產生沒有有害的作用。
參考文獻目錄
Andersson, E. C, J. P. Christensen, 0. Marker牙口 A. R. Thomsen. 1994. Journal of Immunology 152:1237-1245."細胞粘附分子在與系統(tǒng)性病毒感 染相關的T細胞上表達的變化"(Changes in Cell Adhesion Molecule Expression on T Cells Associated with Systemic Virus Infection )。
Andreasen, S. J. P. Christensen, O. Marker和A. R. Thomsen. 1999.International Immunology 11 :1463-1473."誘導非特異性信號的病毒 促使重要CD8+ T細胞的細胞循環(huán)進行而不誘導細胞分化"(Virus induced non-specific signals cause cell cycle progression of primed CD8+ T cells but do not induce cell differentiation )。
Battegay M., S. Cooper, A. Althage, J. Banziger, H. Hengartner,和R. M. Zinckernagel.1991. Journal of Virological Methods 33:191-198."在24或96 孔板上用免疫學焦點檢驗法定性淋巴細胞性脈絡叢腦炎病毒" (Quantification of lymphocytic choriomenigitis vims with an immunological focus assay in 24- or 96- well plates )。Becker, T- C, R. J. Noel, W. S, Coats, A. M. Gomez-Foix, T. Alam, R. D. Gerard，和C. B. Newgard. 1994."重組腺病毒用于代謝遺傳工程的應用" (Use of recombinant adenovirus for metabolic engineering )。
Christensen, J. P., O. Marker, A. R. Thomsen. 1994. Scandinavian Journal of Immunology 40:373-382. "CD4+ T細胞在細胞介導的對LCMV免疫性中 的作用:關于MHC I類和II類缺陷小鼠的研究"(The role of CD4+ T cells in cell-mediated immunity to LCMV: studies in MHC class I and class II deficient mice )。
Diebold, S. S.， M. Gotten, N. Koch,和M. Zenke. 2001."用被轉染的樹 突細胞內源性表達抗原的MHC II類呈遞"(MHC class II presentation of endogenously expressed antigens by transfected dendritic cells ) Gewe 77^ 8:487-493.
Morris, C. R., A. J. Reber, J. L. Petersen, S. E. Vargas,和J. C. Solheim. 2004."與折疊主要組織相容性復合物I類分子相關的細胞內蛋白" (Association of intracellular proteins with folded major histocompatibility complex class I molecules )。
/附聽wo/. 30:171-179.
Pieters, J. 1997. "MHC II類限制性抗原呈遞"(MHC class II restricted antigen presentation). Cw^:0/>z>2. /mwwwo/. 9:89-96.
Sambrook等，主編，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory,第2版，冷泉港，紐約， 1989年。
Strumptner-Cuvelette, R,牙口 P. Benaroch. 2002. Biochem. Biophys. Acta., 1542:1- 13."恒定鏈在MHC II類功能方面的多重作用"(Multiple roles of the invariant chain in MHC class II fimction).
Thomsen, R. A., A. Nansen, C. Andersen, J. Johansen, O. Marker,和J. P. Christensen. 1997. International Immunology 9:1757-1766. "B細胞與T細胞 的合作是感染了水泡性口炎病毒小鼠存活的需要。"(Cooperation of B cells and T cells is required for survival of mice infected with vesicular stomatitis virus).
權利要求
1.一種核酸構建體，其包含編碼以下的序列a)至少一個恒定鏈，其在操作上被連接至b)至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。
2. 根據(jù)權利要求1所述的核酸構建體，其中至少一個恒定鏈是生物體 特異性的。
3. 根據(jù)權利要求1或2任一項所述的核酸構建體，其中至少一個恒定 鏈是脊推動物來源的。
4. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個恒定鏈 是噴乳動物來源的。
5. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個恒定鏈 是人類來源的。
6. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中被編碼的至少一 個恒定鏈是SEQ ID NO: 2的片段，該片段具有至少40個氨基酸，而且85% 同源于SEQ ID NO: 2的相同片段。
7. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中被編碼的至少一 個恒定鏈是SEQIDNO:2的片段，該片段具有至少186個M酸。
8. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中被編碼的至少一 個恒定鏈是85%等同于SEQ ID NO: 2。
9. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中被編碼的至少一 個恒定鏈是等同于SEQ ID NO: 2。
10. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個恒定 鏈的至少一個區(qū)、肽或者域被添加至、被除去或取代所述至少一個恒定鏈 的區(qū)、肽或者域。
11. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個信號 肽被添加至、被除去或替代所述至少一個恒定鏈的信號肽。
12. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，至少一個CLIP區(qū)被添加至、被除去或替代所述至少一個恒定鏈的CLIP區(qū)。
13. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個恒定 鏈或者其片段以CD4+ T細胞依賴型和/或獨立型的方式引起MHC-1和/或 MHC-II依賴型免疫應答。
14. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段選自下列的組病原性生物 體、癌特異性多肽，以及與異常生理學應答相關的蛋白或肽。
15. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中來自病原性生 物體的至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段選自 包括下列的病原體組病毒、微生物和寄生物。
16. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自哺乳動物生物體的 病原體，優(yōu)選地來自人的病原體。
17. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自病毒。
18. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自病毒，該病毒選自下 列組HIV、丙型肝炎病毒、流感病毒、皰滲病毒、拉沙、埃博拉、天花、 禽流感、絲狀病毒、馬爾堡、乳頭瘤病毒。
19. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自微生物，該微生物選 自下列的組結核分支桿菌、炭疽桿菌、葡萄球菌和弧菌。
20. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自寄生物，該寄生物選 自下列的組癥原蟲、利什曼原蟲和錐蟲。
21. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是至少85%等同于權利要求(14, 15或16中任一所述抗原的抗原性肽或者蛋白。
22. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自癌特異性多肽。
23. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自癌特異性多肽，該多 肽選自下列的組p53、端粒酶和黑素瘤抗原。
24. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自與異常生理學應答 相關的多肽。
25. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個抗原 性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自與異常生理學應答 相關的多肽，其中所述異常生理學應答是自體免疫疾病、變態(tài)反應、癌或 者先天性疾病。
26. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中在恒定鏈與抗 原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段之間的操作接頭選自下 列的組直接的連接或者是由間隔區(qū)介導的連接。
27. 根據(jù)權利要求26所述的核酸構建體，其中該操作接頭是間隔區(qū)。
28. 根據(jù)權利要求27所述的核酸構建體，其中該間隔區(qū)編碼至少一個 II類MHC分子的輔助性表位。
29. 根據(jù)權利要求28所述的核酸構建體，其中該間隔區(qū)編碼至少一個 蛋白酶酶切位點。
30. 根據(jù)權利要求26所述的核酸構建體，其包含至少一個siRNA編 碼序列。
31. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個恒定 鏈在操作上被連接至至少兩個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗 原性片段。
32. 根據(jù)權利要求31所述的核酸構建體，其中抗原性蛋白或者肽或者 所述蛋白或肽的抗原性片段的數(shù)目是三個、四個、五個、六個、八個或十個或更多。
33. 根據(jù)權利要求31或32所述的核酸構建體，其中每個恒定鏈元件 和每個抗原性元件在操作上彼此被連接，如權利要求26至30中所定義的。
34. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中至少一個在操 作上被連接的恒定鏈和至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的 抗原性片段的編碼序列之前有能夠表達該構建體的啟動子。
35. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中該啟動子選自 下列的組組成型啟動子、誘導型啟動子、生物體特異性啟動子、組織特 異性啟動子以及細胞類型特異性啟動子、CMV啟動子、SV40啟動子和RSV 啟動子。
36. 根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構建體，其包含與抗原呈遞 和/或細胞間傳播相關的基因。
37. —種傳輸媒介物，其包含根據(jù)上述任一項權利要求所述的核酸構 建體。
38. 根據(jù)權利要求37所述的傳輸媒介物，其中該媒介物選自下列的 組基于RNA的媒介物、基于DNA的媒介物/載體、基于脂質的媒介物、 基于病毒的媒介物以及基于細胞的媒介物。
39. 根據(jù)權利要求37和38所述的媒介物，其中該媒介物是一種病毒， 所述病毒選自下列組腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺相關病毒、皰疹 病毒、牛痘病毒、泡沫病毒、巨細胞病毒、西門利克森林病毒、痘病毒、 RNA病毒載體以及DNA病毒載體。
40. 根據(jù)權利要求37至39所述的Jf某介物，其中該媒介物是腺病毒。
41. 根據(jù)權利要求40所述的媒介物，其中該媒介物是復制缺陷腺病毒 或者有條件地復制缺陷腺病毒。
42. —種細胞，其包含如權利要求1至41任一項所定義的核酸構建體。
43. 根據(jù)權利要求42所述的細胞，其中該細胞是抗原呈遞細胞。
44. 根據(jù)權利要求42和43所述的細胞，其中該抗原呈遞細胞是專職 抗原呈遞細月包。
45. 根據(jù)權利要求42至44任一項所述的細胞，其中該細胞是MHC-I表達細胞。
46. 根據(jù)權利要求42至45任一項所述的細胞，其中該細胞是從患者 獲得的干細胞。
47. 根據(jù)權利要求46所述的細胞，其中所述干細胞能夠分化為抗原呈 遞細月包。
48. 根據(jù)權利要求42至47任一項所述的細胞，其中所述抗原呈遞細 胞不表達任何的共刺激性信號，而且抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽 的抗原性片段是自體抗原。
49. 一種嵌合蛋白，其包含至少一個在操作上被連接的恒定鏈和至少 一個抗原性蛋白或者肽的編碼序列，如在權利要求1至36任一項中任一 核酸構建體所定義的。
50. —種抗體，其能識別權利要求49中所定義的嵌合蛋白。
51. 根據(jù)權利要求50所述的抗體用于動物的被動免疫的用途。
52. 根據(jù)權利要求50所述的抗體在檢驗中用于檢測抗體所結合的蛋 白的用途。
53. —種疫苗，其包含編碼以下的核酸序列a) 至少一個恒定鏈，其在操作上被連接至b) 至少 一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。
54. —種用作藥品的疫苗組合物，其包含編碼以下的核酸序列a) 至少一個恒定鏈，其在操作上被連接至b) 至少一個多肽。
55. 根據(jù)權利要求53和54任一項所述的疫苗，其包含如權利要求1 至36任一項所定義的核酸構建體。
56. 根據(jù)權利要求55所述的疫苗，其中該核酸是被包裝的。
57. 根據(jù)權利要求53至56任一項所述的疫苗，其中核酸構建體是由 選自下列組的包裝手段所包裝的脂質體、包^^皮到膠體金粒子上、病毒表達載體、病毒傳輸載體、聚乙二醇化載體。
58. 根據(jù)權利要求53至57任一項所述的疫苗，其中該包裝手段是病 毒表達載體，該病毒表達載體選自下列的組腺病毒、逆轉錄病毒、慢病 毒、腺相關病毒、皰滲病毒、牛痘病毒、DNA病毒載體。
59. 根據(jù)權利要求53至58任一項所述的疫苗，其中所述核酸構建體 被包裝至腺病毒載體中。
60. 根據(jù)權利要求59所述的疫苗，其中該腺病毒載體是復制缺陷的或 有條件地復制缺陷的。
61. 根據(jù)權利要求53至60任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含至少 兩個載體。
62. 根據(jù)權利要求53至61任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含三個、 四個、五個或六個載體。
63. —種疫苗，其包含至少一個根據(jù)權利要求49的嵌合蛋白，該嵌合 蛋白如權利要求1至36任一項中任一核酸構建體所定義的。
64. 根據(jù)權利要求53至63任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含佐劑。
65. 根據(jù)權利要求53至64任一項所述的疫苗，其中該佐劑選自下列 的組弗氏佐劑、MontanidelSA52、 Montanide ISA720和明礬。
66. 根據(jù)權利要求53至64任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含用于 肌內、靜脈內或皮下給藥的手段。
67. 根據(jù)權利要求53至64任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含用于 口服、直腸或陰道給藥的手段。
68. 根據(jù)權利要求53至64任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含用于 鼻內/肺部給藥的手段。
69. 根據(jù)權利要求53至68任一項所述的疫苗組合物，其包含第二活 性成分。
70. 根據(jù)權利要求69所述的疫苗組合物，其中所述第二活性成分選自 下列的組抗生素、化療藥、抗過敏藥、細胞因子和免疫系統(tǒng)的共刺激性分子。
71. —種成套試劑盒，其包括-疫苗組合物，其包含根據(jù)權利要求53至70任一項的核苷酸構建體； -醫(yī)療儀器或者用于施用疫苗的其他手段； -關于如何使用所述成套試劑盒的說明書。
72. 根據(jù)權利要求71所述的成套試劑盒，其包括第二活性成分。
73. —種在動物中誘導免疫應答的方法，其包括對所述動物施用根據(jù) 權利要求53至70任一項的疫苗。
74. 根據(jù)權利要求73所述的方法，其中該免疫應答是MHC-I依賴型的。
75. 根據(jù)權利要求73或74任一項所述的方法，其中該免疫應答是 MHC-I和/或MHC-II依賴型的。
76. 根據(jù)權利要求73至75任一項所述的方法，其中該免疫應答是T 細胞依賴型的。
77. 根據(jù)權利要求73至76任一項所述的方法，其中該免疫應答是 CD4+T細胞依賴型的。
78. 根據(jù)權利要求73至76任一項所述的方法，其中該免疫應答是 CD4+T細胞獨立型的。
79. 根據(jù)權利要求73至78任一項所述的方法，其中該免疫應答是 CD8+T細胞依賴型的。
80. 根據(jù)權利要求73至79任一項所述的方法，其中該免疫應答是B 細胞依賴型的。
81. 根據(jù)權利要求73至80任一項所述的方法，其包括如下的步驟 -提供至少一種根據(jù)權利要求53至70任一項的疫苗；-對受治療者至少施用一次所述至少一種疫苗； 用于動物的治療或預防。
82. 根據(jù)權利要求81所述的方法，其中至少一種疫苗被施用兩次、三 次、四次或五次中的《壬一次凄丈。
83. 根據(jù)權利要求82所述的方法，其中疫苗是通過以不同于前次施用的形式或身體部位施用而加強的。
84. 根據(jù)權利要求73至83任一項所述的方法，其中疫苗是被施用于 最可能成為已知感染接受部位的區(qū)域。
85. 根據(jù)權利要求73至84任一項所述的方法，其中所述動物是脊推 動物。
86. 根據(jù)權利要求73至85任一項所述的方法，其中所述動物是哺乳 動物。
87. 根據(jù)權利要求73至86任一項所述的方法，其中所述哺乳動物選 自下列的組牛、豬、馬、綿羊、山羊、美洲鴕、小鼠、大鼠、猴和人。
88. 根據(jù)權利要求73至87任一項所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
89. —種用于制備基因免疫接種疫苗的方法，其包括下列步驟 -制備根據(jù)權利要求1至36任一項的核酸構建體，-施用所述核酸構建體。
90. —種治療方法，其包括施用根據(jù)權利要求53至70的疫苗，以便 治療所需個體的臨床疾患。
91. 根據(jù)權利要求1至36所述的核酸構建體用于疫苗生產的用途。
92. —種腺病毒載體，其包含編碼以下的核苷酸構建體a) 至少一個抗原和b) 至少一個蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段， 其能刺激MHC-I應答和/或MHC-II應答和/或細胞間傳播。
93. 根據(jù)權利要求92所迷的腺病毒載體，其中所述核苷酸構建體編碼 刺激MHC-I應答的至少一種蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。
94. 根據(jù)權利要求92和93任一項所述的腺病毒載體，其中至少一個 抗原在操作上被連接至至少一個刺激MHC應答的蛋白或者肽或者刺激 MHC應答的蛋白或肽的片段。
95. 根據(jù)權利要求94所述的腺病毒載體，其中刺激MHC的蛋白或者 肽或者蛋白或肽的片段是MHC相關的蛋白或者肽。
96. 根據(jù)權利要求95所述的腺病毒載體，其中MHC相關的肽選自下 列的組ER定位肽、高爾基體定位肽、載有內體肽的室定位肽、溶酶體、 MIIC、 CIIV、黑色素體、分泌顆粒、伯貝克顆粒。
97. 根據(jù)權利要求96所述的腺病毒載體，其中MHC相關的蛋白或者 肽或者蛋白或肽的片段選自下列的組分選信號肽、LAMP、 LIMP、 Hsp70、 鈣網(wǎng)蛋白和恒定鏈。
98. 根據(jù)權利要求92至97任一項所述的腺病毒載體，其包含與細胞 間傳播相關的蛋白或肽諸如VP22、 Cx43、 fflVTat;其他的連接蛋白或間 隙連接成分。
99. 根據(jù)權利要求92至98任一項所述的腺病毒載體，其中至少一個 刺激MHC應答的蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段是恒定鏈。
100. 根據(jù)權利要求99所述的腺病毒載體，其中至少一個恒定鏈是生 物體特異性的。
101. 根據(jù)權利要求99至100任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個恒定鏈是脊推動物來源的。
102. 根據(jù)權利要求99至101任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個恒定鏈是哺乳動物來源的。
103. 根據(jù)權利要求99至102任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個恒定鏈是人類來源的。
104. 根據(jù)權利要求99至103任一項所述的腺病毒載體，其中被編碼 的至少一個恒定鏈是SEQIDNO:2的片段，該片段具有至少40個氨基酸， 而且85%同源于SEQ ID NO: 2的相同片段。
105. 根據(jù)權利要求99至104任一項所述的腺病毒載體，其中被編碼的至少一個恒定鏈是SEQ ID NO: 2的片段,該片段具有至少186個氨基酸。
106. 根據(jù)權利要求99至105任一項所述的腺病毒載體，其中被編碼 的至少一個恒定鏈是85%等同于SEQ ID NO: 2。
107. 根據(jù)權利要求99至106任一項所述的腺病毒載體，其中被編碼 的至少一個恒定鏈是等同于SEQIDNO: 2。
108. 根據(jù)權利要求99至107任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個恒定鏈的至少一個區(qū)、肽或者域被添加至、被除去或取代所述至少一個 恒定鏈的區(qū)、肽或者域。
109. 根據(jù)權利要求99至108任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個信號肽被添加至、被除去或替代所述至少一個恒定鏈的信號肽。
110. 才艮據(jù)4又利要求99至109任一項所述的腺病毒載體，至少一個 CLIP區(qū)被添加至、被除去或替代所述至少一個恒定鏈的CLIP區(qū)。
111. 根據(jù)權利要求92至110任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段選自下列的組病原 性生物體、癌特異性多肽，以及與異常生理學應答相關的蛋白或肽。
112. 根據(jù)權利要求92至111任一項所述的腺病毒載體，其中來自病 原性生物體的至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片 段選自包括下列的病原體組病毒、微生物和寄生物。
113. 根據(jù)權利要求92至112任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自哺乳動物的 病原體。
114. 根據(jù)權利要求92至113任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自人的病原體。
115. 根據(jù)權利要求92至114任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自病毒。
116. 根據(jù)權利要求92至115任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自病毒，該病毒 選自下列組HIV、丙型肝炎病毒、流感病毒、皰滲病毒、拉沙、埃博拉、天花、禽流感、絲狀病毒、馬爾堡、乳頭瘤病毒。
117. 根據(jù)權利要求92至116任一項所述的腺病毒載體，其中至少一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自微生物，該微生物選自下列組結核分支桿菌、炭疽桿菌、葡萄球菌和弧菌。
118. 根據(jù)權利要求92至117任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自寄生物，該寄 生物選自下列的組癡原蟲、利什曼原蟲和錐蟲。
119. 根據(jù)權利要求92至118任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是至少85%等同于權 利要求14、 15或16中任一所述抗原的抗原性肽或者蛋白。
120. 根據(jù)權利要求92至119任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自癌特異性多肽。
121. 根據(jù)權利要求92至120任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自癌特異性多 肽，該多肽選自下列的組p53、端粒酶和黑素瘤抗原。
122. 根據(jù)權利要求92至121任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自與異常生理 學應答相關的多肽。
123. 根據(jù)權利要求92至122任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是來自與異常生理 學應答相關的多肽，其中所述異常生理學應答是自體免疫疾病、變態(tài)反應、 癌或者先天性疾病。
124. 4艮據(jù)權利要求92至123任一項所述的腺病毒載體，其中在恒定 鏈與抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段之間的操作接頭 選自下列的組直接的連接或者是由間隔區(qū)介導的連接。
125. 根據(jù)權利要求124所述的腺病毒載體，其中該操作接頭是間隔區(qū)。
126. 根據(jù)權利要求125所述的腺病毒載體，其中該間隔區(qū)編碼至少一個II類MHC分子的輔助性表位。
127. 根據(jù)權利要求124所述的腺病毒載體，其中該間隔區(qū)編碼至少一 個蛋白酶酶切位點。
128. 根據(jù)權利要求124所述的腺病毒載體，其包含至少一個siRNA 編碼序列。
129. 根據(jù)權利要求92至128任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個恒定鏈在操作上被連接至至少兩個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或 肽的抗原性片段。
130. 根據(jù)權利要求129所述的腺病毒載體，其中該抗原性蛋白或者肽 或者所述蛋白或肽的抗原性片段的數(shù)目是三個、四個、五個、六個、八個 或十個或更多。
131. 根據(jù)權利要求129和130任一項所述的腺病毒載體，其中每個恒 定鏈元件和每個抗原性元件在操作上彼此被連接，如權利要求124至128 中所定義的。
132. 根據(jù)權利要求92至131任一項所述的腺病毒載體，其中至少一 個在操作上^^皮連接的恒定鏈和抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗 原性片段的編碼序列之前有能夠表達該構建體的啟動子。
133. 根據(jù)權利要求92至132任一項所述的腺病毒載體，其中該啟動 子選自下列的組組成型啟動子、誘導型啟動子、生物體特異性啟動子、 組織特異性啟動子以及細胞類型特異性啟動子。
134. 根據(jù)權利要求92至133任一項所述的腺病毒栽體，其中該啟動 子選自下列的組CMV啟動子、SV40啟動子和RSV啟動子。
135. 根據(jù)權利要求92至134任一項所述的任何媒介物的腺病毒載體， 其中該載體是復制缺陷腺病毒或者有條件地復制缺陷腺病毒。
136. —種細胞，其包含如權利要求92至135任一項中所定義的腺病 毒載體。
137. 根據(jù)權利要求136所述的細胞，其中該細胞是抗原呈遞細胞。
138. 根據(jù)權利要求136和137任一項所述的細胞，其中該抗原呈遞細胞是專職抗原呈遞細胞。
139. 根據(jù)權利要求136至138任一項所述的細胞，其中該細胞是 MHC-I表達細胞。
140. 根據(jù)權利要求136至139任一項所述的細胞，其中該細胞是從患 者獲得的干細胞。
141. 根據(jù)權利要求140所述的細胞，其中所述干細胞能夠分化為抗原 呈遞細胞。
142. 根據(jù)權利要求136至141任一項所述的細胞，其中所述抗原呈遞 細胞不表達任何的共刺激性信號，而且抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或 肽的抗原性片段是自體抗原。
143. —種嵌合蛋白，其包含至少一個在操作上被連接的、刺激MHC-I 應答的蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段，如權利要求92至135任一項中 任一腺病毒載體所定義的。
144. 一種抗體，其能識別權利要求143中所定義的嵌合蛋白。
145. 根據(jù)權利要求144所述的抗體用于動物的被動免疫的用途。
146. 根據(jù)權利要求144所述的抗體在檢驗中用于檢測抗體所結合的 蛋白的用途。
147. —種疫苗，其包含編碼以下的核酸序列a) 至少一個在操作上被連接的、刺激MHC-I應答的蛋白或者肽或者 蛋白或肽的片段；b) 至少 一個抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。
148. —種用作藥品的疫苗組合物，其包含編碼以下的核酸序列a) 至少一個在操作上被連接的、刺激MHC-I應答的蛋白或者肽或者 蛋白或肽的片段，在操作上被連接至b) 至少一個多肽。
149. 根據(jù)權利要求147和148任一項所述的疫苗，其包含如權利要求92至135任一項中所定義的腺病毒載體。
150. 根據(jù)權利要求149所述的疫苗，其中該腺病毒載體是被包裝的。
151. 根據(jù)權利要求147至150任一項所述的疫苗，其中該腺病毒載體 是由選自下列組的包裝手段所包裝的脂質體、包^^到膠體金粒子上、病 毒表達載體、病毒傳輸載體。
152. 根據(jù)權利要求147至151任一項所述的疫苗，其中該包裝手段是 病毒表達載體，該病毒表達載體選自下列組腺病毒、逆轉錄病毒、慢病 毒、腺相關病毒、皰滲病毒、牛痘病毒、DNA病毒載體。
153. 根據(jù)權利要求147至152任一項所述的疫苗，其中所述腺病毒載 體^皮包裝至腺病毒載體中。
154. 根據(jù)權利要求147至153任一項所述的疫苗，其中該腺病毒載體 是復制缺陷的或有條件地復制缺陷的。
155. 根據(jù)權利要求147至154任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含至 少兩個載體。
156. 根據(jù)權利要求147至155任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含三 個、四個、五個或六個載體。
157. —種疫苗，其包含至少一個根據(jù)權利要求143的嵌合蛋白，該嵌 合蛋白如權利要求92至135任一項中任一腺病毒載體所定義的。
158. 根據(jù)權利要求147至157任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含佐劑。
159. 根據(jù)權利要求147至158任一項所述的疫苗，其中該佐劑選自下 列的組弗氏佐劑、MontanidelSA52、 Montanide ISA720和明礬。
160. 根據(jù)權利要求147至159任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含用 于肌內、靜脈內或皮下給藥的手段。
161. 根據(jù)權利要求147至160任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含用 于口服、直腸或陰道給藥的手段。
162. 根據(jù)權利要求147至161任一項所述的疫苗，其中該疫苗包含用于鼻內/肺部給藥的手^^。
163. 根據(jù)權利要求147至162任一項所述的疫苗組合物，其包含第二 活性成分。
164. 根據(jù)權利要求163所述的疫苗組合物，其中所述第二活性成分選 自下列的組抗生素、化療藥、抗過敏藥、細胞因子和免疫系統(tǒng)的共刺激 性分子。
165. —種成套試劑盒，其包括-疫苗組合物，其包含根據(jù)權利要求92至135任一項的腺病毒載體， -醫(yī)療儀器或者施用所述疫苗的其他手段， -關于如何使用所述成套試劑盒的說明書。
166. 根據(jù)權利要求165所述的成套試劑盒，其包括第二活性成分。
167. —種在動物中誘導免疫應答的方法，其包括對所述動物施用根據(jù) 權利要求147至164任一項的疫苗。
168. 根據(jù)權利要求167所述的方法，其中該免疫應答是MHC-I依賴型的。
169. 根據(jù)權利要求167至168任一項所述的方法，其中該免疫應答是 MHC-I和/或MHC-II依賴型的。
170. 根據(jù)權利要求167至169任一項所述的方法，其中該免疫應答是 T細胞依賴型的。
171. 根據(jù)權利要求167至170任一項所述的方法，其中該免疫應答是 CD4+T細胞依賴型的。
172. 根據(jù)權利要求167至171任一項所迷的方法，其中該免疫應答是 CD4+T細i包獨立型的。
173. 根據(jù)權利要求167至172任一項所述的方法，其中該免疫應答是 CD8+T細胞依賴型的。
174. 根據(jù)權利要求167至173任一項所述的方法，其中該免疫應答是 B細胞依賴型的。
175. 根據(jù)權利要求167至174任一項所述的方法，其包括如下的步驟 -提供至少一種根據(jù)權利要求147至164任一項的疫苗；-對受治療者施用所述至少一種疫苗至少一次； 用于動物的治療或預防。
176. 根據(jù)權利要求175所述的方法，其中至少一種疫苗被施用兩次、 三次、四次或五次中的4壬一次凄t。
177. 根據(jù)權利要求175所述的方法，其中該疫苗是通過以不同于前次 施用的形式或身體部位施用而加強的。
178. 根據(jù)權利要求167至177任一項所述的方法，其中該疫苗是纟皮施 用于最可能成為已知感染接受部位的區(qū)域。
179. 根據(jù)權利要求167至178任一項所述的方法，其中所述動物是脊 牙#動物。
180. 根據(jù)權利要求167至179任一項所述的方法，其中所述動物是哺 乳動物。
181. 根據(jù)權利要求167至180任一項所述的方法，其中所述哺乳動物 選自下列的組牛、豬、馬、綿羊、山羊、美洲鴕、小鼠、大鼠、猴子和 人。
182. 根據(jù)權利要求167至181任一項所述的方法，其中所述哺乳動物 是人。
183. —種用于制備基因免疫接種疫苗的方法，其包括下列步驟 -制備根據(jù)權利要求92至135任一項的腺病毒載體，-施用所述腺病毒載體。
184. —種治療方法，其包括施用根據(jù)權利要求147至164的疫苗，以 便治療所需個體的臨床疾患。
185. 根據(jù)權利要求92至135所述的腺病毒載體用于疫苗生產的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疫苗，它包含核酸構建體諸如DNA構建體，特別是包含編碼操作上被連接至抗原性蛋白或者肽編碼序列的恒定鏈的序列的核酸構建體。本疫苗刺激免疫應答，特別是以MHC-I依賴型、而CD4⁺T細胞獨立型方式的免疫應答。
文檔編號C07K14/705GK101321781SQ200680045006
公開日2008年12月10日 申請日期2006年11月30日 優(yōu)先權日2005年11月30日
發(fā)明者彼得·約翰尼斯·霍爾斯特, 簡·普瓦斯哥爾德·克里斯滕森, 艾倫·蘭德魯普·湯姆森 申請人:哥本哈根大學