一種聚乙烯醚羧酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術的制作方法
【專利摘要】一種聚乙烯醚羧酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術，屬于生化分離工程【技術領域】。本發(fā)明步驟為：聚乙烯醚羧酸鹽的制備；雙水相萃取藻藍蛋白；藻藍蛋白水溶液進濃縮和冷凍干燥后獲得藻藍蛋白粉；蛋白回收率可達70～90％。該方法簡單，對螺旋藻破壁液直接使用聚乙烯醚羧酸鹽進行富集分離，簡化了純化過程的步驟，選擇性高，分離得到的藻藍蛋白的光譜純度達到A620/A280>2.7。原料可采用螺旋藻鮮藻或干藻粉，從而提供了一種解決螺旋藻資源高值規(guī)?；玫募夹g方法。
【專利說明】一種聚乙烯醚羧酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術

【技術領域】
[0001]本發(fā)明提供一種聚乙烯醚羧酸鹽的制備方法，用于從螺旋藻破壁清液中萃取藻藍蛋白。屬于生化分離工程【技術領域】。

【背景技術】
[0002]螺旋藻藻藍蛋白存在于螺旋藻的藻膽體中。藻膽體是紅藻和藍藻所特有的一種超分子捕光色素復合體。藻藍蛋白色澤呈明亮的藍色，顏色鮮艷，是食品、高級眼影、唇膏的首選純天然色素。藻藍蛋白還可以調節(jié)和合成人體代謝所需要的多種重要酶，具有明顯的抗氧化、抗炎癥作用，調節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強免疫系統(tǒng)功能。高純度的藻藍蛋白帶有很強的熒光，制成的純天然熒光試劑，用于臨床醫(yī)學診斷，免疫化學及生物醫(yī)學工程等研宄領域。
[0003]在我國，每年的螺旋藻全國總產量已達到7000噸。螺旋藻產量的三分之一用于直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注膠囊的形式當作保健品使用。螺旋藻的規(guī)模化開發(fā)和利用處于初級加工階段，還沒有深加工產品。螺旋藻中藻藍蛋白的提取還處于實驗室研宄階段，沒有適合于工業(yè)化生產的好的工藝方法。目前，市場上銷售的高純度的藻藍蛋白商品都是從國外進口，價格昂貴，在應用上受到限制。
[0004]因此，開發(fā)簡便、快速的螺旋藻藻藍蛋白的提取過程，提高螺旋藻藻藍蛋白產品純度是目前螺旋藻藻藍蛋白的規(guī)模化開發(fā)利用中亟待解決的關鍵問題。聚合物雙水相分離蛋白質具有生物相容性高，操作條件溫和，易于進行連續(xù)化操作等優(yōu)點。已報道的有關制備藻類藻藍蛋白的雙水相萃取分離藻藍蛋白的專利技術，例如中國專利CN103880950A采用價格昂貴的離子液體組成雙水相，增加生產成本，CN102993297A、CN101891809A等采用市售的PEG組成聚合物雙水相，分離藻藍蛋白的選擇性差，需要與鹽析等其它提取手段聯(lián)合使用才能得到高純度產品，過程繁瑣。
[0005]本發(fā)明提供一種對藻藍蛋白具有特異性萃取能力的聚乙烯醚羧酸鹽，可通過兩相萃取方式從螺旋藻破壁液中直接分離純化藻藍蛋白，無需與鹽析等其它提取手段聯(lián)合使用，就能得到高純度藻藍蛋白。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種聚乙烯醚羧酸鹽的制備方法，用于雙水相萃取分離螺旋藻藻藍蛋白，獲得高純度的藻藍蛋白，應用于天然色素、保健食品和新藥的研宄開發(fā)。
[0007]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種聚乙烯醚羧酸鹽的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中萃取分離藻藍蛋白。其方法簡單，快捷，成本低，分離藻藍蛋白具有較高的純度，原料既可采用新鮮螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，從而提供了一種解決螺旋藻藻藍蛋白資源規(guī)?；玫姆椒ā?br> [0008]本發(fā)明的技術方案:一種聚乙烯醚羧酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術，步驟為:
[0009](I)聚乙烯醚羧酸鹽的制備；(2)雙水相萃取分離藻藍蛋白；(3)藻藍蛋白水溶液經濃縮和冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉。
[0010]所述的方案，步驟I中，在圓底燒瓶中放入10g聚乙二醇和鈉塊，鈉塊與聚乙二醇的重量比為0.02?0.05:1，在25°C?45°C和磁力攪拌條件下反應5?8小時，在反應混合物中緩慢滴入無水乙醇，直至燒瓶中的鈉塊消除，然后在反應混合物中加入200?500ml的N, N- 二甲基甲酰胺和5.8?24g氯乙酸鈉，氯乙酸鈉與聚乙二醇之間的重量比為0.06?0.24:1，在90?120°C下反應15?24小時，然后在80?100°C下真空蒸餾I小時，加入500?100ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚羧酸鹽。
[0011]所述的方案，步驟2中，螺旋藻破壁清液的制備:采用水或磷酸緩沖液作提取劑，磷酸緩沖液的濃度為25?100mmol/L，藻粉或鮮藻與提取液的固液比為1:50?1:150，攪拌均勻后，置于-10°C?_20°C下冷凍一定時間后，37°C溶解，如此反復凍融4-6次，融化后離心獲得的破壁清液，破壁清液中蛋白質濃度為1.0?5.6mg/ml，藻藍蛋白純度為0.5?
0.72。
[0012]所述的方案，步驟2中，在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚羧酸鹽和無機鹽，聚乙烯醚羧酸鹽:無機鹽:破壁清液的重量比為0.05?0.25:0.2?0.35:1，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相。將含藻藍蛋白的上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜過濾，去除聚乙烯醚羧酸鹽和無機鹽，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為2.8?3.7，蛋白濃度為 3.15 ?5.6mg/ml。
[0013]所述的方案，步驟3中，將藻藍蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉末。
[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，主要具有以下優(yōu)點:1.聚乙烯醚羧酸鹽對藻藍蛋白的萃取吸附選擇性高，適合不同規(guī)模和場地的工業(yè)化生產要求；2.聚乙烯醚羧酸鹽可直接從螺旋藻破壁清液中萃取獲得高純度的藻藍蛋白，無需其它提取手段配合，生產成本低；3.制備藻藍蛋白的原料可以是螺旋藻鮮藻或者干藻粉，有效地解決螺旋藻資料的利用和高值化問題。

【具體實施方式】
[0015]實施實例I
[0016](I)螺旋藻破壁清液的制備
[0017]取產于江蘇東臺市賜百年生物工程有限公司的鈍頂螺旋藻干粉，用去離子水作提取劑，藻粉與去離子水的固液比為1:50，置于-20°C下冷凍4小時后，37°C融解，如此反復凍融4次，融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質濃度為1.0mg/ml，藻藍蛋白純度A62Q/A28Q為0.72mg/ml?
[0018](2)聚乙烯醚羧酸鹽的制備
[0019]在100ml的圓底燒瓶中放入10g聚乙二醇PEG-1000 (購自海安石油化工廠)和5g鈉塊(購自南京化學試劑有限公司)，在25°C和磁力攪拌條件下反應5小時，在反應混合物中緩慢滴入無水乙醇(購自南京化學試劑有限公司)，直至燒瓶中的鈉塊消除，然后在反應混合物中加入200ml的N，N-二甲基甲酰胺(購自鄭州超安化工有限公司)和5.Sg氯乙酸鈉(購自鹽城錦標化學工業(yè)有限公司)，在90°C下反應15小時，然后在80°C下真空蒸餾I小時，加入500ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚羧酸鹽。
[0020](3)兩相萃取
[0021]在1g螺旋藻破壁清液中加入0.5g聚乙烯醚羧酸鹽和0.2g無水硫酸鎂(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相，上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚羧酸鹽和硫酸鎂，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為2.8，蛋白濃度為3.15mg/mlo
[0022](4)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
[0023]將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A62tlA28tl為2.9，蛋白回收率為75%。
[0024]實施例2
[0025](I)螺旋藻破壁液的制備
[0026]取產于江蘇大豐賜百年生物科技有限公司的新鮮螺旋藻，用50mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:100，置于-10°c下冷凍4小時后，37°C融解，如此反復凍融5次。融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質濃度為3.lmg/ml，藻藍蛋白純度A620ZA280為0.5。
[0027](2)聚乙烯醚羧酸鹽的制備
[0028]在100ml的圓底燒瓶中放入10g聚乙二醇PEG-3000 (購自海安石油化工廠)和3.5g鈉塊(購自南京化學試劑有限公司)，在35°C和磁力攪拌條件下反應7小時，在反應混合物中緩慢滴入無水乙醇(購自南京化學試劑有限公司)，直至燒瓶中的鈉塊消除，然后在反應混合物中加入400ml的N，N-二甲基甲酰胺(購自鄭州超安化工有限公司)和18g氯乙酸鈉(購自鹽城錦標化學工業(yè)有限公司)，在105°C下反應20小時，然后在90°C下真空蒸餾I小時，加入200ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚羧酸鹽。
[0029](3)兩相萃取
[0030]在1g螺旋藻破壁清液中加入1.7g聚乙烯醚羧酸鹽和3g無水硫酸鈉(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相，將上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚羧酸鹽和硫酸鈉，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為3.3，蛋白濃度為4.6mg/ml。
[0031](4)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
[0032]將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A62tlA28tlS 3.6，蛋白回收率55%。
[0033]實施例3
[0034](I)螺旋藻破壁液的制備
[0035]取產于云南麗江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用150mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:150，置于-20°C下冷凍4小時后，37°C融解，如此反復凍融6次。融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中的藻藍蛋白純度\20/%80為0.77，破壁液蛋白質濃度為4.6mg/ml?
[0036](2)聚乙烯醚羧酸鹽的制備
[0037]在100ml的圓底燒瓶中，放入10g聚乙二醇PEG-4000 (購自海安石油化工廠)和5g鈉塊(購自南京化學試劑有限公司)，在45°C和磁力攪拌條件下反應8小時，在反應混合物中緩慢滴入無水乙醇(購自南京化學試劑有限公司)，直至燒瓶中的鈉塊消除，然后在反應混合物中加入300ml的N，N-二甲基甲酰胺(購自鄭州超安化工有限公司)和24g氯乙酸鈉(購自鹽城錦標化學工業(yè)有限公司)，在120°C下反應24小時，然后在100°C下真空蒸餾I小時，加入500ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚羧酸鹽。
[0038](3)兩相萃取
[0039]在1g螺旋藻破壁清液中加入2.2g聚乙烯醚羧酸鹽和3.2g無水磷酸鉀(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相，將上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚羧酸鹽和磷酸鉀，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為3.7，蛋白濃度為5.6mg/ml。
[0040](4)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
[0041]將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A62tlA28tlS 3.7，蛋白回收率75%。
【權利要求】
1.一種聚乙烯醚羧酸鹽雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術，其特征在于步驟為:聚乙烯醚羧酸鹽的制備；雙水相萃取藻藍蛋白；藻藍蛋白水溶液經濃縮和冷凍干燥后獲得藻藍蛋白粉。 (1)聚乙烯醚羧酸鹽的制備:在圓底燒瓶中放入聚乙二醇和鈉塊，鈉塊與聚乙二醇的重量比為0.02?0.05:1，在251:?451:和磁力攪拌條件下反應5?8小時，在反應混合物中緩慢滴入無水乙醇，直至燒瓶中的鈉塊消除，然后在反應混合物中加入200?50001的隊二甲基甲酰胺和5.8?248氯乙酸鈉，在90?1201:下反應15?24小時，然后在80?1001:下真空蒸餾1小時，加入200?50(^1無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚羧酸鹽。 (2)兩相萃取:在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚羧酸鹽和無機鹽，聚乙烯醚羧酸鹽:無機鹽:破壁清液的重量比為0.05?0.25:0.2?0.35: 1，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相。 (3)將上述含藻藍蛋白的上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜過濾，去除聚乙烯醚羧酸鹽和無機鹽，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為2.8?3.7，蛋白濃度為3.15?5.611^/1111。 (4)將藻藍蛋白水溶液在601:下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉末。
2.根據權利要求1所述的聚乙烯醚羧酸鹽的制備方法，其特征在于采用的聚乙二醇的平均分子量可以為500、1000、2000、3000、4000。
3.根據權利要求1所述的兩相萃取方法，其特征在于，用于萃取的無機鹽可以為無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸銨、無水氯化鈉、無水磷酸鉀。
【文檔編號】C07K1/14GK104479009SQ201410682958
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權日:2014年11月24日
【發(fā)明者】張杜炎, 石敏, 覃曉雨, 韓震, 王峰 申請人:江南大學