專(zhuān)利名稱(chēng)：酶促生成的二羥乙酸/氨甲基膦酸混合物的氫化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于由在含有氨甲基膦酸(AMPA)和甘醇酸酯氧化酶((S)-2-羥基-酸氧化酶，EC1.1.3.15)及過(guò)氧化氫酶(EC1.11.1.6)的水溶液中乙醇酸和氧氣反應(yīng)生成的混合物氫化制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸的方法。N-(膦?；谆?甘氨酸是一種可用于控制多種植物生長(zhǎng)的廣譜苗后除草劑。
甘醇酸酯氧化酶，一種通常存在于多葉綠色植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的酶，它能催化乙醇酸氧化成二羥乙酸并在氧化過(guò)程中有附隨物質(zhì)過(guò)氧化氫生成
N.E.Tolbert等人，在J.Biol.Chem.，Vol，181，905-914(1949)中首次報(bào)道了一種從煙草葉中萃取得到的酶，它能催化氧化乙醇酸其中經(jīng)過(guò)中間產(chǎn)物二羥乙酸的生成而最終制得甲酸和CO2。某些化合物的加入，例如乙二胺的加入限制了中間產(chǎn)物二羥乙酸的進(jìn)一步氧化。氧化反應(yīng)是在pH值約為8的條件下進(jìn)行，典型的乙醇酸所用的濃度為約3-40mM(毫摩爾)。優(yōu)選的用于甘醇酸酯氧化反應(yīng)的pH值據(jù)報(bào)道應(yīng)為8.9。草酸(100mM)可用來(lái)抑制甘醇酸酯氧化酶的催化作用。同樣，K.E.Richardson和N.E.Tolbert，在J.Biol.Chem.，Vol.236，1280-1284(1961)中揭示了含有三(羥基甲基)氨基甲烷(TRIS)的緩沖劑抑制草酸在乙醇酸的甘醇酸酯氧化酶催化氧化過(guò)程中的生成。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris，在J.Biol.Chem.，Vol.178.977-987(1949)中報(bào)道了用于乙醇酸和氧氣的甘醇酸酯氧化酶催化氧化方法中優(yōu)選的pH值為7.8-8.6，優(yōu)選的溫度為35-40℃。
I.Zelitch和S.Ochoa，在J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)中和J.C，Robinson等人在J.Biol.Chem.，Vol.237，2001-2009(1962)中報(bào)道了在菠菜甘醇酸酯氧化酶催化氧化乙醇酸的過(guò)程中由于H2O2與二羥乙酸的非酶反應(yīng)生成了甲酸和CO2。他們觀察到了過(guò)氧化氫酶即催化H2O2分解的酶的加入由于其抑制了甲酸和CO2的生成從而極大地提高了二羥乙酸的收率。FMN(黃素單核苷酸)的加入還極大地增進(jìn)了甘醇酸酯氧化酶的穩(wěn)定性。
N.A.Frigerio和H.A.Harbury，在J.Biol.Chem.，Vol.231，135-157(1958)中報(bào)道了從菠菜中分離得到的乙醇酸氧化酶的制備方法和性質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)純化的酶在溶液中非常不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定性歸因于黃素單核苷酸(FMN)對(duì)于酶活性位置相當(dāng)微弱的結(jié)合和酶的酶活性四聚物和/或八聚物離解成酶鈍化的單體和二聚物，也就是發(fā)生了可逆的聚集和沉淀，F(xiàn)MN(黃素單核苷酸)加入到酶溶液中將會(huì)極大地增加其穩(wěn)定性，另外，高蛋白濃度或高的離子強(qiáng)度也能使酶維持于四聚物或八聚物。
另外還有其它眾多的參考文獻(xiàn)涉及用乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化的方法。下列參考文獻(xiàn)中描述了酶的分離方法(和分析方法)I.Zelitch，的MethodsinEnzymology，Vol.1，Academic，Pre-ss，NewYork，1955，P.528-532(從菠菜和煙草葉中)，M.Nishimura等人，在Arch.Biochem，Biophys，Vol.222，397-402(1983)中(從南瓜Cotyledons)，H.Asker和D.Davies，Biochim.Biophys.Acta，Vol.761，103-108(1983)(從鼠肝臟中)，和M.J.Emes和K.H.Erismann，在Int.J.Biochem.Vol.16，1373-1378(1984)中LemnaminorL中)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)同樣也有報(bào)道如E.Cederlund等人在Eur，J，Biochem.，Vol.173，523-530(1988)中和Y.Lindquist和C.Branden，J.Biol，Chem.Vol.264.3624-3628(1989)。
現(xiàn)有技術(shù)中已知有多種從氨甲基膦酸和二羥乙酸制備N(xiāo)-(膦酰基甲基)甘氨酸的方法。Rogers等人在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)186，648中就描述了一種這樣的方法，它包括二羥乙酸或其鹽與氨甲基膦酸或其鹽的縮合生成中間產(chǎn)物，通常認(rèn)為該中間產(chǎn)物是醛亞胺(席夫堿)，然后不經(jīng)分離通過(guò)催化加氫將該中間產(chǎn)物還原成N-(膦?；谆?苷氨酸。第二種方法是由Gaertner在美國(guó)專(zhuān)利4，094，928號(hào)中描述的，它包括分離由二羥乙酸酯和氨甲基膦酸酯在無(wú)水溶液中反應(yīng)制得的相同的中間產(chǎn)物羰基醛亞氨甲膦酸酯，在水的共沸精餾和除去溶劑之后，將羰基醛亞氨甲膦酸酯還原并使酯基團(tuán)水解制得了N-(膦?；谆?甘氨酸。
上述N-(膦?；谆?甘氨酸的合成路線的缺點(diǎn)是起始原料二羥乙酸成本太高，因此其它的較為經(jīng)濟(jì)的合成所需起始原料的路線被廣泛地實(shí)踐應(yīng)用?，F(xiàn)存的制備二羥乙酸的方法有，例如二鹵乙酸水解，草酸的電解還原，乙二醛的氧化，乙烯或乙醛的催化氧化和馬來(lái)酸，它的酯或酐的臭氧分解，但這些方法在實(shí)踐中存在一種或多種困難，例如高成本的分離/凈化步驟，低收率或大量的三廢流。Gaertner描述的方法也有缺點(diǎn)，即該方法需要多個(gè)附加步驟(伴隨了相應(yīng)的收率損失)，和中間產(chǎn)物不必要的分離。
另一種合成N-(膦酰基甲基)甘氨酸的方法公開(kāi)在Kleiner的美國(guó)專(zhuān)利4，670，191號(hào)中，它包括氨甲基膦酸或其鹽與約2摩爾當(dāng)量的二羥乙酸在含水介質(zhì)中的反應(yīng)。過(guò)量的二羥乙酸可用作還原劑將二羥乙酸-氨甲基膦酸反應(yīng)的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成所需的N-(膦酰基甲基)甘氨酸，該產(chǎn)物本身的氧化生成了一種或多種包括CO2在內(nèi)的副產(chǎn)物。同樣，F(xiàn)ields等人的美國(guó)專(zhuān)利4，851，159號(hào)中通過(guò)加熱帶有二羥乙酸或其衍生物的N-?；奔谆⑺嶂苽淞薔-(膦?；谆?甘氨酸。二羥乙酸與N-?；被M份的摩爾比優(yōu)選的為2至1，否則較小的摩爾比會(huì)使收率下降。
Kleiner和Fields等人的方法不但具有使用了相當(dāng)昂貴的二羥乙酸的缺點(diǎn)而且還使用這些昂貴的二羥乙酸作為犧牲性的還原劑(計(jì)算值對(duì)于制備每1摩爾N-(膦酰基甲基)甘氨酸需使用一摩爾甘醇酸酯作為還原劑)以及用作氨基-(或N-?；被?甲基膦酸的縮合劑。
根據(jù)本發(fā)明，制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸的方法包括氫化一種混合物，該混合物是在含有氨甲基膦酸(AMPA)和甘醇酸酯氧化酶及過(guò)氧化氫酶的水溶液存在下由乙醇酸和氧氣反應(yīng)而酶促生成的。為了本發(fā)明的目的，在氨甲基膦酸存在下使乙醇酸進(jìn)行酶氧化反應(yīng)來(lái)制備所說(shuō)的混合物是有利的，其結(jié)果是除了所需的二羥乙酸之外氧化副產(chǎn)物有一固有的分布(包括下列這些非限定性的實(shí)例，草酸酯，甲酸酯和二氧化碳)。另外，在該混合物中還存在有未反應(yīng)的甘醇酸酯和各種其它添加劑，如黃素單核苷酸(下面將簡(jiǎn)稱(chēng)為FMN)或類(lèi)似物質(zhì)，所有這些物質(zhì)可能或不可能對(duì)接著所要進(jìn)行的加氫反應(yīng)產(chǎn)生影響(再次說(shuō)明以下非限制性的實(shí)例，在AMPA存在下的二羥乙酸氫化的過(guò)程中當(dāng)有甲酸酯和FMN存在時(shí)將會(huì)降低回收的碳平衡)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了從酶氧化所得的溶液中除去和回收酶以及在加氫步驟前任意地除去FMN。
本發(fā)明提供一種改進(jìn)的制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸的方法，它包括通過(guò)加氫來(lái)還原二羥乙酸和氨甲基膦酸的混合物的步驟;所說(shuō)的混合物是就地在水溶液中通過(guò)下述方法而酶促生成的，該方法是，向水溶液中加入乙醇酸，用于乙醇酸與氧氣制備二羥乙酸和過(guò)氧化氫的氧化反應(yīng)的第一種催化劑和用于過(guò)氧化氫分解的第二種催化劑，溶液的pH值調(diào)節(jié)在6至約10之間，在有效的溫度下和足夠的時(shí)間內(nèi)在氨甲基膦酸存在下使溶液和氧源接觸至少將部分乙醇酸組份轉(zhuǎn)化成二羥乙酸組份并在還原步驟之前停止溶液與氧氣的接觸。
優(yōu)選的催化劑是酶，更優(yōu)選的是，第一種酶是甘醇酸酯氧化酶((S)-2-羥基-酸氧化酶，EC1.1.3.15)，第二種酶是過(guò)氧化氫酶(EC1.11.1.6)。在催化劑/酶存在下停止溶液和O2接觸之后，在該溶液進(jìn)入還原條件制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸之前用過(guò)濾或離心分離的方法除去催化劑/酶。
因此，由于不再需要單獨(dú)的制備二羥乙酸的步驟，本發(fā)明提供了一種更有效更為經(jīng)濟(jì)的制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸的方法。
本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的通過(guò)還原二羥乙酸和氨甲基膦酸混合物制備N(xiāo)-(膦酰基甲基)甘氨酸的方法，該方法不需要獨(dú)立地制備二羥乙酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這樣一種方法，即在該方法中，在氨甲基膦酸存在下就地可由易得的二羥乙酸的前體即乙醇酸酶促生成二羥乙酸，從而使N-(膦?；谆?甘氨酸的制備更有效和更為經(jīng)濟(jì)。
按照本發(fā)明，制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸的改進(jìn)方法包括用氨甲基膦酸(AMPA)(或其適當(dāng)?shù)难苌?還原含有二羥乙酸(或其適當(dāng)?shù)难苌?的混合物，該混合物優(yōu)選的是通過(guò)在AMPA和有效量能催化乙醇酸和O2的反應(yīng)生成二羥乙酸的催化劑存在下由乙醇酸組份和分子氧源接觸而催化氧化乙醇酸組份或其適當(dāng)?shù)柠}制得。所用的催化劑可以是自然生成的酶，甘醇酸酯氧化酶(EC1.1.3.15)，也有人稱(chēng)之為乙醇酸氧化酶，它能在溫和的pH值和溫度條件下含水介質(zhì)中以高收率和高乙醇酸轉(zhuǎn)化率進(jìn)行催化制備二羥乙酸的反應(yīng)，即
乙醇酸或其適當(dāng)?shù)柠}的催化氧化通常是在能催化乙醇酸和O2生成二羥乙酸的反應(yīng)的酶催化劑存在下通過(guò)乙醇酸和分子氧源的接觸而進(jìn)行的。所用的催化劑是甘醇酸酯氧化酶(EC.1.1.3.15)也稱(chēng)作乙醇酸氧化酶。甘醇酸酯氧化酶可以從多種現(xiàn)有技術(shù)中已知的來(lái)源中分離獲得。用于本發(fā)明反應(yīng)中的甘醇酸酯氧化酶應(yīng)以有效的濃度存在，通常為約0.01至約1000IU/ml，優(yōu)選的為0.1至約4IU/ml.IU(國(guó)際單位)的定義為每分鐘催化1微摩爾物質(zhì)轉(zhuǎn)變所需酶的量。測(cè)試這種酶的方法可參閱I.Zelitch和S.Ochoa的J.Biol.Chem;Vol 201，707-718(1953)。該方法也可用于回收或循環(huán)的甘醇酸酯氧化酶活性的測(cè)試。
雖然酶催化乙醇酸和氧氣的反應(yīng)是一種公知技術(shù)，但現(xiàn)有技術(shù)中從未獲得高選擇性的二羥乙酸，以前也從未報(bào)道過(guò)在氨甲基膦酸(AMPA)存在下進(jìn)行乙醇酸的酶促氧化。在先申請(qǐng)國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO91/05868，1991年5月2日“用乙醇酸的酶促氧化制備二羥乙酸”中描述了在氧氣、胺緩沖液、可溶的甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶存在下將乙醇酸酶促轉(zhuǎn)化成二羥乙酸的方法，該方法顯示出預(yù)想不到的同時(shí)使用過(guò)氧化氫酶(破壞了副產(chǎn)物過(guò)氧化氫)和能與制得的二羥乙酸形成化學(xué)加合物的胺緩沖液(抑制了二羥乙酸的進(jìn)一步氧化)的協(xié)同作用。單獨(dú)加入使用過(guò)氧化氫酶或胺緩沖液都不能達(dá)到當(dāng)兩者同時(shí)使用時(shí)獲得的高選擇性，而且當(dāng)同時(shí)使用過(guò)氧化氫酶和胺緩沖液時(shí)獲得的二羥乙酸的收率要大于單獨(dú)使用過(guò)氧化氫酶或胺緩沖液時(shí)所能獲得的二羥乙酸收率。
由于二羥乙酸酯和胺緩沖液生成了抗氧化配合物(其中經(jīng)歷了N-取代半縮膠(hemiaminal)和/或亞胺的形成)而使制得的二羥乙酸酯的收率得到提高是由質(zhì)子化的胺緩沖液的PKa決定的。在30℃和一個(gè)大氣壓氧氣中，在胺緩沖液(0.33M，pH8.3)，甘醇酸酯氧化酶(0.5IU/mL)，過(guò)氧化氫酶(1，400IU/mL)和FMN(0.01mM)存在下氧化乙醇酸(0.25M)含水溶液24小時(shí)所得的結(jié)果列于下表，在表中同時(shí)還列出了使用兩種不和二羥乙酸酯形成配合物的緩沖液(磷酸鹽和N-二(羥乙基)甘氨酸)進(jìn)行的反應(yīng)。
緩沖液PKa%草%二羥%甘醇%甲酸酯乙酸酯酸酯酸酯乙二胺(6.85,9.93)6.885.50.82.4TRIS(8.08)1.181.02.812.0甲胺(10.62)1.053.939.85.1
乙醇胺(9.50)1.869.64.8124.5氯化銨(9.24)1.139.937.718.9異丙醇胺(9.43)2.060.04.837.4N-二(羥乙基)甘氨酸(8.30)1.024.925.643.8磷酸鹽(2.15,7.10,12.3)0.724.552.421.2從試驗(yàn)的胺緩沖液中可以看出，具有近似等于或低于反應(yīng)混合物pH值的PKa的胺(即乙二胺和TRIS)能制得收率比使用那些PKas高于反應(yīng)中pH值的胺緩沖液時(shí)高的多的二羥乙酸酯(和產(chǎn)生少量的甲酸酯的草酸酯)。這些結(jié)果是與非質(zhì)子化胺可能必定與二羥乙酸酯生成抗氧化N-取代半縮胺和/或亞胺配合物的設(shè)想相一致，PKa高于反應(yīng)混合物pH值的胺緩沖液主要以質(zhì)子化的銨離子存在于反應(yīng)混合物中，因此也就不容易與二羥乙酸形成所說(shuō)的配合物。
氨甲基膦酸(AMPA)的質(zhì)子化銨的PKa據(jù)報(bào)導(dǎo)為10.8(Lange’s“HandbookofChemistry”，J.A.Dean，Ed.，McGraw-Hill，NewYork，1979第12版)。因此就不期望AMPA加入到pH為7至9的乙醇酸酶促氧化反應(yīng)中會(huì)得到高收率的二羥乙酸。然而本申請(qǐng)的實(shí)施例卻說(shuō)明了使用這種胺可使二羥乙酸的收率高達(dá)92%。除獲得了意想不到的高收率二羥乙酸之外，與不加入AMPA的反應(yīng)相比(實(shí)施例13)AMPA的使用還改善了甘醇酸 氧化酶的回收和過(guò)氧化氫酶的活性。通常在使用酶催化劑的方法中需要回收用于循環(huán)的催化劑，因?yàn)榇呋瘎┑南臅?huì)明顯地提高總的生產(chǎn)成本。
在使用甘醇酸酯氧化酶作為催化劑氧化轉(zhuǎn)化乙醇酸制備二羥乙酸的方法中的最佳效果是通過(guò)向反應(yīng)溶液中摻入用于過(guò)氧化氫分解的催化劑而獲得的。這種需與甘醇酸酯氧化酶結(jié)合使用才能有效破壞過(guò)氧化物的催化劑之一是過(guò)氧化氫酶(E.C.1.11.1.6)。過(guò)氧化氫酶催化過(guò)氧化氫分解成水和氧氣，它在乙醇酸和O2的甘醇酸酯氧化酶催化反應(yīng)中通過(guò)加速分解伴隨二羥乙酸一同生成的過(guò)氧化氫而提高了本申請(qǐng)方法的二羥乙酸的收率。過(guò)氧化氫酶的濃度應(yīng)為50至50，000IU/mL，優(yōu)選的為500至15，000IU/mL。在上述范圍內(nèi)調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶和甘醇酸酯氧化酶的濃度，以使過(guò)氧化氫酶和甘醇酸酯氧化酶的比率(每種酶以IU計(jì))至少為約250∶1。
在反應(yīng)溶液中的另一種任意的但通常是有益的成份是黃素單核苷酸(FMN)，它通常是以0.0至約2.0mM，優(yōu)選的為0.01至約0.2mM的濃度使用?？梢韵嘈臚MN增加了甘醇酸酯氧化酶的產(chǎn)率即增加了每單位酶可使乙醇酸轉(zhuǎn)化成二羥乙酸的量。應(yīng)當(dāng)明白的是添加的FMN的濃度是除與酶共同存在的FMN之外的，因?yàn)樵诿傅闹苽溥^(guò)程中，也常向酶中添加FMN。FMN的結(jié)構(gòu)和它的分析方法可參閱在本申請(qǐng)中作為參考文獻(xiàn)的K.Yagai的MethodsofBiochemicalAnalysisVolXIntersciencePublishers，NewYork，1962，P.319-355。
乙醇酸(2-羥基乙酸)是商業(yè)上有售的物質(zhì)。在本申請(qǐng)的方法中它的初始濃度為0.10M至2.0M，優(yōu)選的為0.25M和1.0M。它可以以原形或其相容的鹽使用，所說(shuō)的鹽是水溶性的而且它的陽(yáng)離子不會(huì)對(duì)所需的乙醇酸向二羥乙酸的轉(zhuǎn)化或?qū)又M(jìn)行的氨甲基膦酸與二羥乙酸制備N(xiāo)-(膦酰基甲基)甘氨酸的反應(yīng)產(chǎn)生干擾作用。合適的和相容的形成鹽的陽(yáng)離子基團(tuán)易于用實(shí)驗(yàn)方法確定。具有代表性的鹽有堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、取代的銨鹽、磷鹽和取代的磷鹽。
乙醇酸向二羥乙酸的轉(zhuǎn)化較為容易，但優(yōu)選的是在含水介質(zhì)中進(jìn)行。加入氨甲基膦酸(AMPA)或其適當(dāng)?shù)柠}使AMPA/乙醇酸(起始量)的摩爾比達(dá)到0.01/1.0至3.0/1.0，優(yōu)選的為0.25/1.0至1.05/1.0。在水溶液中AMPA和乙醇酸結(jié)合后，將所得混合物的pH值調(diào)至6和10，優(yōu)選的為7.0至9.0。在該pH范圍內(nèi)，確切的值可通過(guò)加入相容的、無(wú)干擾的堿包括堿金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽進(jìn)行調(diào)節(jié)而獲得。反應(yīng)混合物的pH值隨著反應(yīng)的進(jìn)行會(huì)略有下降。因此在反應(yīng)初始將其pH調(diào)至接近于最佳酶活性pH范圍的上端即約為9.0-8.5，并使其中反應(yīng)過(guò)程中下降，由于酶活性是隨pH而變化的，所以為維持反應(yīng)過(guò)程中的pH可任意地通過(guò)單獨(dú)加入無(wú)干擾的無(wú)機(jī)或有機(jī)緩沖液。
已經(jīng)知道乙醇酸和二羥乙酸高度離解在水中，并且，如果不是其實(shí)質(zhì)上全部地以甘醇酸酯或二羥乙酸離子存在的話，在pH為6和10的條件下，這種離解的程度會(huì)更大。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員也知道二羥乙酸(和它的共軛堿、二羥乙酸陰離子)還可以水合物的形式存在，例如(HO)2CHCOOH和/或以半縮醛HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH的形式存在，它們的組合物和陰離子配對(duì)物等同于二羥乙酸并且它的陰離子適合用于本發(fā)明制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸的反應(yīng)物。
用于轉(zhuǎn)化乙醇酸制備二羥乙酸的氧化劑，氧(O2)可以以氣體通過(guò)在氣液界面的液體攪動(dòng)或通過(guò)透氧薄膜加入到反應(yīng)中?？梢韵嘈?，在大多數(shù)反應(yīng)條件下，反應(yīng)的速度至少部分地由氧氣在含水介質(zhì)中的溶解速度所控制。因此，盡管可以用空氣作為氧氣加入到反應(yīng)中，但優(yōu)選的還是使用相對(duì)純的氧氣，甚至使用高壓力。雖然已知對(duì)氧化的壓力上限沒(méi)有限制，但是氧氣壓力最好還是低于50大氣壓，優(yōu)選的上限為15大氣壓。攪動(dòng)對(duì)于保持高的氧氣溶解速度十分重要(由此而使反應(yīng)進(jìn)行)。攪動(dòng)可以是任何常用的形式，如攪拌。另一方面，在酶技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員也熟知，高剪切的攪動(dòng)或攪拌會(huì)產(chǎn)生泡沫而降低酶的活性，因此應(yīng)使其避免。
反應(yīng)溫度是一種重要的可變性條件，它會(huì)影響反應(yīng)速度和酶的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度可以為0℃至40℃，但優(yōu)選的溫度范圍是5℃至15℃。在優(yōu)選的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行操作可使反應(yīng)結(jié)束時(shí)回收酶的活性達(dá)到最大。溫度不應(yīng)太低，不能低至使含水溶液開(kāi)始冷凍?？梢杂闷胀ǖ姆椒刂茰囟龋?不限于此方法)可使用有套反應(yīng)器，其中將具有合適溫度的液體流經(jīng)反應(yīng)器的套層以控制溫度。反應(yīng)器可以由任何對(duì)反應(yīng)成份惰性的材料制成。反應(yīng)結(jié)束后，用過(guò)濾或離心分離的方法分離出酶并重復(fù)使用。也可以通過(guò)加熱例如加熱到70℃5分鐘使酶中毒并沉淀和/或如果它們的存在對(duì)接著要進(jìn)行的二羥乙酸-氨甲基膦酸混合物向N-(膦?；谆?甘氨酸的轉(zhuǎn)化步驟和從所得反應(yīng)混合物中回收N-(膦?；谆?甘氨酸的步驟沒(méi)有不利影響的話，可使它們?nèi)匀涣粼诜磻?yīng)混合物中。
接著，停止反應(yīng)溶液與O2的接觸，然后優(yōu)選的是除去甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶(如有存在的話)，通過(guò)使溶液與活性碳接觸任意地除去黃素單核苷酸(FMN)。還原含有二羥乙酸和氨甲基膦酸(被認(rèn)為與相應(yīng)的亞胺相平衡)制得N-(膦酰基甲基)甘氨酸。
催化加氫是一種優(yōu)選的從二羥乙酸和氨甲基膦酸的混合物制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸的方法，適用的催化劑包括(但并不僅限于這幾種)各種鉑金屬例如銥、鋨、銠、釕、鉑和鈀;也可以是其它各種過(guò)渡金屬如鈷、銅、鎳和鋅。催化劑可以是無(wú)載體的，例如Raney鎳或氧化鉑，或可以是有載體的如碳上的鉑，鋁上的鈀或硅藻土上的鎳，其中碳上的鈀，硅藻土上的鎳和Raney鎳是優(yōu)選的。
加氫反應(yīng)可以在pH為4至11，優(yōu)選的為5至10的條件下進(jìn)行。在該pH范圍內(nèi)，確切的值可通過(guò)加入任何相容的無(wú)干擾的堿或酸來(lái)調(diào)節(jié)以獲得所需的pH。合適的堿包括(但不限于這些堿)堿金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和膦酸鹽。而合適的酸(不只限于這幾種酸)包括鹽酸、硫酸或磷酸。
加氫反應(yīng)的溫度和壓力可以在一個(gè)很寬的范圍內(nèi)變化。溫度通常為0℃至150℃，優(yōu)選的為20℃至90℃，而H2的壓力通常為常壓至約100大氣壓，優(yōu)選的為1至10大氣壓，加氫催化劑可以以在所選的反應(yīng)條件下能足以獲得所需的反應(yīng)速度和起始原料總轉(zhuǎn)化率的最低濃度來(lái)使用。該濃度易于實(shí)驗(yàn)方法來(lái)確定。催化劑的用量可以為每100份反應(yīng)中使用的二羥乙酸和AMPA的重量和需要0.001至20份重量的催化劑或更多。
用作苗后除草劑的N-(膦?；谆?甘氨酸可以用任何現(xiàn)有技術(shù)中已知的回收方法從用任何還原方法制得的還原溶液中回收，所說(shuō)的回收方法已公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利4，851，159和4，670，191中和歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)186，648和413，672中。
下面的實(shí)施例將用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的收率和甘醇酸酯的回收率是以反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的乙醇酸的總量為計(jì)的百分?jǐn)?shù)。反應(yīng)混合物用高壓液相色譜來(lái)分析。用Bio-RadHpx-87H柱進(jìn)行有機(jī)酸分析，用Bio-RadAm-inex草甘膦分析柱分析AMPA和N-(膦?；谆?甘氨酸。N-(膦?；谆?甘氨酸的收率是以二羥乙酸酯或AMPA為計(jì)的，它們是反應(yīng)中限定試劑的依據(jù)。
實(shí)施例1向裝有磁力攪拌棒的3盎司Fisher-Porter玻璃噴霧反應(yīng)器中加入10mL含有乙醇酸(0.25M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.263M)、FMN(0.01mM)、丙酸(HPLc內(nèi)標(biāo)，0.125M)、甘醇酸酯氧化酶(從菠菜中分離得到，1.0IU/mL)和過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中分離得到，1.400IU/mL)的pH為8.5的含水溶液。將反應(yīng)器封閉并使反應(yīng)混合物冷卻至15℃，然后用加壓至70psig的氧氣沖洗反應(yīng)器并隨著攪拌將反應(yīng)器向大氣放空5次。將反應(yīng)器加壓至氧氣的70psig并在15℃下攪拌混合物。每隔一定的時(shí)間通過(guò)反應(yīng)器的取料汽門(mén)用注射器取出等分試樣(0.10)(在反應(yīng)器中沒(méi)有壓力損失)用于HPLc分析以觀察反應(yīng)的進(jìn)程。5小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為70.4%、19.6%和2.2%，并在反應(yīng)混合物中仍有5.3%的甘醇酸酯。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶過(guò)氧化氫酶的活性分別為其最初活性的27%和100%。
實(shí)施例2(比較例)用0.33MK2HPO4代替0.265MAMPA來(lái)重復(fù)實(shí)施例1的反應(yīng)，5小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為34.1%、11.1%和0.2%，反應(yīng)混合物中仍含有58.7%甘醇酸酯。23小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為39.4%、44.7%和15.34%，反應(yīng)混合物中無(wú)甘醇酸酯存在。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為它們最初活性的85%和87%。
實(shí)施例3(比較例)用0.263MN-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液代替0.265MAMPA來(lái)重復(fù)實(shí)施例1的反應(yīng)。5小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為42.5%、49.6%和10.1%，反應(yīng)混合物中仍有0.2%甘醇酸酯。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性為其最初活性的47%和100%。
實(shí)施例4用5，600IU/mL過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中獲得)重復(fù)實(shí)施例1的反應(yīng)。6小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為85.5%、7.6%和3.3%，反應(yīng)混合物中仍有2.5%甘醇酸酯。反應(yīng)后，甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性為其最初活性的36%和100%。
實(shí)施例5用14，000IU/mL從曲霉屬皂腳中獲得的過(guò)氧化氫酶重復(fù)實(shí)施例1的反應(yīng)。6小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為88.0%、3.3%和3.0%，反應(yīng)混合物中仍有3.4%甘醇酸酯。反應(yīng)后，甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為其最初活性的28%和96%。
實(shí)施例6從56，000IU/mL從曲霉屬皂腳中獲得的過(guò)氧化氫酶重復(fù)實(shí)施例1的反應(yīng)。6小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為84.0%、0.4%和2.5%，反應(yīng)混合物中仍有8.4%的甘醇酸酯。反應(yīng)后，甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為其最初活性的16%和76%。
實(shí)施例7向裝有磁力攪抖棒的3盎司Fisher-Porter玻璃噴霧反應(yīng)器中加入10mL含有乙醇酸(0.25M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.20M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLc內(nèi)標(biāo)，0.10M)、甘醇酸酯氧化酶(從菠菜中獲得，1.0IU/mL)、和過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中獲得，14，000IU/mL)的pH為8.5的含水溶液。將反應(yīng)器封閉并使反應(yīng)混合物冷卻至5℃，然后用加壓至70psig的氧氣沖洗并隨著攪拌向大氣放空5次，接著使反應(yīng)器加壓至氧氣的70psig并在5℃下攪拌反應(yīng)混合物。每隔一定的時(shí)間通過(guò)取樣汽門(mén)(在反應(yīng)中沒(méi)有壓力損失)用注射器取出等分試樣(0.10mL)進(jìn)行HPLc分析以觀察反應(yīng)的進(jìn)程，6小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為92.3%、4.36%和5.5%，反應(yīng)混合物中無(wú)甘醇酸酯存在。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為其最初活性的87%和88%。反應(yīng)混合物最終的pH為6.7。
用AmiconCentriprep10濃縮器(10，000摩爾重量斷流)過(guò)濾反應(yīng)得到的二羥乙酸(0.23M)和AMPA(0.20M)的混合物以除去可溶性的酶，然后將濾液置于裝有磁力攪拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中，向該瓶中加入0.100g10%pd/c并封閉該瓶，用氮?dú)鉀_洗，然后用氫氣將其加壓至50psi并在25℃下攪拌。17小時(shí)后N-(膦?；谆?-甘氨酸(用HPLc測(cè)定)的濃度為0.13M(基于AMPA的收率為66%)。
實(shí)施例8向裝有磁力攪拌棒的3盎司Fisher-Porter玻璃噴霧反應(yīng)器中加入含有乙醇酸(0.5M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.40M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLc內(nèi)標(biāo)，0.10M)、甘醇酸酯氧化酶(從菠菜中獲得，1.0IU/mL)和過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中獲得，14，000IU/mL)pH為8.5的10mL含水溶液。將反應(yīng)器封閉并使反應(yīng)混合物冷卻至5℃(而不是以前實(shí)施例所述的15℃)，然后用加壓至70psig的氧氣沖洗并隨著攪拌向大氣放空5次。接著將反應(yīng)器加壓至氧氣的70psig并在5℃下攪拌混合物。每隔一定的時(shí)間從取樣汽門(mén)(在反應(yīng)器中沒(méi)有壓力損失)用注射器取出等分試樣進(jìn)行HPLc分析以觀察反應(yīng)的進(jìn)程。17.5小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯的草酸酯的HPLc收率分別為91.0%、2.9%和2.9%，反應(yīng)混合物仍有4.1%甘醇酸酯存在。反應(yīng)混合物的最終pH為6.7。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性為其最初活性的63%和91%。
AmiconCentriprep10濃縮器(10，000摩爾重量斷流)過(guò)濾反應(yīng)所得的二羥乙酸(0.46M)和AMPA(0.40M)的混合物以除去可溶性酶。然后將濾液置于裝有磁力攪拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中，接著向該瓶中加入0.100g10%的pd/c并將該瓶封閉，用氮?dú)鉀_洗并用氫氣加壓至50psi，在25℃下攪拌反應(yīng)混合物。17小時(shí)后，N-(膦酰基甲基)甘氨酸(用HPLc測(cè)定)的濃度為0.25M(基于AMPA的收率為72%)。
實(shí)施例9用10ml含有乙醇酸(0.75M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.6M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLc內(nèi)標(biāo)，0.10M)、甘醇酸酯氧化酯(從菠菜中獲得，2.0IU/mL)和過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中獲得，14，000IU/mL)的pH為8.5的溶液重復(fù)實(shí)施例8的乙醇酸酯促氧化反應(yīng)。40小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為83.2%、2.3%和7.5%，反應(yīng)混合物中無(wú)甘醇酸酯存在。反應(yīng)混合物的最終pH值為6.8。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為它們最初活性的65%和86%。
用AmiconCentriprep10濃縮器(10，000摩爾重量斷流)過(guò)濾反應(yīng)得到的二羥乙酸(0.62M)和AMPA(0.60M)的混合物以除去可溶性酶，然后將濾液置于裝有磁力攪拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中。接著向該瓶中加入0.100g10%pd/c并封閉該瓶，用氮?dú)鉀_洗，用氫氣加壓至50psi，在25℃下攪拌反應(yīng)混合物。24小時(shí)后，N-(膦?；谆?甘氨酸(由HPLc測(cè)定)的濃度為0.42M(基于AMPA的收率為70%)。
實(shí)施例10用10mL含有乙醇酸(1.0M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.80M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLc內(nèi)標(biāo)，0.10M)、甘醇酸酯氧化酶(從菠菜中獲得，2.0IU/mL)和過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中獲，14，000IU/mL)的pH為8.5的水溶液重復(fù)實(shí)施例8的乙醇酸酶促氧化反應(yīng)。66小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為78.9%、2.2%和12.1%，反應(yīng)混合物中存在有2.0%甘醇酸酯。反應(yīng)混合物的最終pH為6.9。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為其最初活性的64%和87%。
用AmiconCentriprep10濃縮器(10，000摩爾重量斷流)過(guò)濾反應(yīng)得到的二羥乙酸(0.79M)和AMPA(0.80M)的混合物以除去可溶性酶，然后將所得濾液置于裝有磁力攪拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中，接著向該瓶中加入0.100g10%Pd/c并封閉該瓶，用氮?dú)鉀_洗，用氫氣加壓至50psi并在25℃下攪拌，23小時(shí)后N-(膦?；谆?甘氨酸的濃度(由HPLc測(cè)定)為0.51M(基于二羥乙酸的收率為65%)。
實(shí)施例11在pH為8.0的條件下，重復(fù)實(shí)施例8的反應(yīng)。17.5小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為87.0%、2.2%和1.9%，反應(yīng)混合物中仍有8.5%甘醇酸酯存在。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為其最初活性的44%和97%。
實(shí)施例12在pH為7的條件下重復(fù)實(shí)施例8的反應(yīng)。17.5小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為88.0%、1.4%和1.9%，反應(yīng)混合物中仍有8.2%的甘醇酸酯存在。反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為其最初活性的44%和93%。
實(shí)施例13向裝有磁力攪拌棒的3盎司Fisher-Porter玻璃噴霧反應(yīng)器中加入10mL含有乙醇酸(0.50M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLc內(nèi)標(biāo)，0.10M)、甘醇酸酯氧化酶(從菠菜中獲得，1.0IU/mL)和過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中獲得，14，000IU/mL)的pH為8.5的水溶液。將反應(yīng)器封閉并將反應(yīng)混合物冷卻至5℃，然后用加壓至70psig的氧氣沖洗反應(yīng)器并隨著攪拌向大氣放空5次。接著將反應(yīng)器加壓至氧氣的70psig，在5℃下攪拌反應(yīng)混合物。每隔一定的時(shí)間，從取樣汽門(mén)(反應(yīng)器中沒(méi)有壓力損失)用注射器取出等試樣(0.10mL)進(jìn)行HPLc分析以觀察反應(yīng)的進(jìn)程。21小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收論分別為81.7%、1.2%的2.2%，反應(yīng)混合物中仍有7.5%的甘醇酸酯存在，反應(yīng)后甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別為其最初活性的19%和77%。用0.50M乙醇酸和在0.25M、0.375M、0.40M、0.50M或0.625M氨甲基膦酸(AMPA)存在下重復(fù)上述反應(yīng)，它們反應(yīng)產(chǎn)物的收率和從反應(yīng)中回收得到的酶的量列于下表
二羥甲酸草酸甘醇過(guò)氧化[AMPA]甘醇酸酯乙酸酯酯酯酸酯氫酶(M)(%)(%)(%)(%)氧化酶(%)(%)0.0081.71.22.27.519770.2579.42.13.32.548790.37578.32.33.61.757950.4091.02.92.94.163910.5085.21.53.35.549930.62579.61.71.814.04294實(shí)施例14用10mL含有乙醇酸(0.25M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.263M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLc內(nèi)標(biāo)，0.25M)、甘醇酸酯氧化酶(從菠菜中獲得，1.0IU/mL)和過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中獲得，14，000IU/mL)的水溶液，在pH為7.0溫度為15℃的條件下重復(fù)實(shí)施例8的乙醇酸酶促氧化反應(yīng)。8小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為82.8%、0.9%和2.1%，反應(yīng)混合物中仍有13.9%的甘醇酸酯存在。反應(yīng)混合物的最終pH為6.6。
用AmiconCentriprep10濃縮器(10，000摩爾 濾二羥乙酸(0.21M)和AMPA(0.263M)的混合物以酶。然后將該溶液和50mg10%pd/c放入裝有玻璃壓力容器中。將該容器封閉并用氮?dú)鉀_洗，然后用氫1000psi并在25℃下振動(dòng)。在反應(yīng)開(kāi)始的0.5小時(shí)后，容器的壓力降至穩(wěn)定的值，然后再將其加壓至1000psi。4小時(shí)后將容器放空并用氮?dú)鉀_洗。N-(膦?；谆?甘氨酸的濃度(由HPLc測(cè)定)為0.16M(其于二羥乙酸的收率為76%)。
實(shí)施例15在pH為8的條件下重復(fù)實(shí)施例14的乙醇酸的酶促氧化反應(yīng)，8小時(shí)后二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為86.7%、1.8%和4.1%，反應(yīng)混合物中仍有13.2%的甘醇酸酯存在。反應(yīng)混合物的最終pH為6.7。
用實(shí)施例5中描述的方法在1000psi條件下氫化二羥乙酸(0.22M)和AMPA(0.263M)的混合物，4小時(shí)后，N-(膦?；谆?甘氨酸的濃度(由HPLc測(cè)定)為0.14M(基于二羥乙酸的收率為64%)。
實(shí)施例16在pH為9的條件下重復(fù)實(shí)施例14的乙醇酸酶促氧化反應(yīng)。7小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為70.0%、5.6%和11.1%，反應(yīng)混合物中無(wú)甘醇酸酯存在。反應(yīng)混合物的最終pH為6.8。
用實(shí)施例5中描述的方法在1000psi壓力下氫化二羥乙酸(0.18M)和AMPA(0.263M)的混合物。4小時(shí)后N-(膦?；谆?甘氨酸的濃度(由HPLc測(cè)定)為0.094M(基于AMPA的收率為52%)。
實(shí)施例17用初始濃度分別為0.50M和0.40M的乙醇酸和AMPA在pH為8.5的條件下重復(fù)實(shí)施例14的乙醇酸酶促氧化反應(yīng)。16.5小時(shí)后，甘醇酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為85.4%、3.5%的6.3%，在反應(yīng)混合物中仍有1.4%的甘醇酸酯存在。反應(yīng)混合物的最終pH為7.0。
用實(shí)施例5中描述的方法在1000psi壓力下氫化二羥乙酸(0.43M)和AMPA(0.40M)的混合物。4小時(shí)后，N-(膦?；谆?甘氨酸的濃度(由HPLc測(cè)定)為0.30M(基于AMPA的收率為75%)。
實(shí)施例18用10mL含有乙醇酸(0.50M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.375M)，F(xiàn)MN(0.01mM)、丁酸(HPLc內(nèi)標(biāo)，0.10M)、甘醇酸酯氧化酶(從菠菜中獲得，1.0IU/mL)和過(guò)氧化氫酶(從曲霉屬皂腳中獲得，14，000IU/mL)的水溶液在pH為8.5的條件下重復(fù)實(shí)施例8中的乙醇酸的酶促氧化反應(yīng)。17小時(shí)后，二羥乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分別為87.1%、1.9%和2.1%，反應(yīng)混合物中仍有8.9%的甘醇酸酯存在。反應(yīng)混合物的最終pH為6.7。
用AmiconCentriprep10濃縮器(10，000摩爾重量斷流)過(guò)濾二羥乙酸(0.435M)和AMPA(0.375M)反應(yīng)所得的混合物以除去可溶性酶，將所得濾液與50mg脫色碳混合(以除去FMN)并再次過(guò)濾，將所得濾液置于裝有磁力攪拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中，然后向該瓶中加入0.100g10%pd/c并封閉該瓶，用氮?dú)鉀_洗，隨之用氫氣使其加壓至50psi并在25℃下進(jìn)行攪拌。17小時(shí)后，N-(膦酰基甲基)甘氨酸的濃度(由HPLc測(cè)定)為0.372M(基于AMPA的收率為99%)。
權(quán)利要求
1.一種制備N(xiāo)-(膦酰基甲基)甘氨酸的方法，它包括氫化一種混合物，所說(shuō)的混合物是在含有氨甲基膦酸和甘醇酸酯氧化酶和過(guò)氧化氫酶的水溶液存在下由乙醇酸和氧氣反應(yīng)而酶促生成的。
2.一種改進(jìn)的制備N(xiāo)-(膦?；谆?甘氨酸的方法，它包括用加氫方法還原二羥乙酸和氨甲基膦酸的混合物，所說(shuō)的混合物是就地在水溶液中通過(guò)下述方法酶促生成的，即向水溶液中加入乙醇酸和用于乙醇酸與氧氣制備二羥乙酸和過(guò)氧化氫的氧化反應(yīng)的第一種催化劑和用于過(guò)氧化氫分解的第二種催化劑，調(diào)節(jié)溶液的pH至6和10之間，在氨甲基膦酸存在下，在有效的溫度下和足夠的時(shí)間內(nèi)將該溶液與氧源接觸以使至少部分乙醇酸成份轉(zhuǎn)化成二羥乙酸的成分，并在還原步驟前停止氧源與所說(shuō)溶液的接觸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中第一種催化劑為甘醇酸酯氧化酶，第二種催化劑為過(guò)氧化氫酶。
4.權(quán)利要求1的方法，其中加氫反應(yīng)是在加氫催化劑存在下進(jìn)行。
5.權(quán)利要求2的方法，其中還原反應(yīng)是在加氫催化劑存在下進(jìn)行。
6.權(quán)利要求4和5的方法，其中加氫催化劑選自碳上鈀、硅藻土上的鎳和Raney鎳。
7.權(quán)利要求6的方法，其中加氫催化劑的用量為每100份二羥乙酸和氨甲基膦酸的重量和需要0.001至20份重量的催化劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中加氫反應(yīng)的條件是pH為4至11，溫度為0℃至150℃，氫氣壓力為1至約100大氣壓。
9.權(quán)利要求7的方法，其中加氫反應(yīng)的條件是pH為5至10，溫度為20℃至90℃，氫氣壓力為1至約10大氣壓。
10.按照上述任何一個(gè)權(quán)利要求的方法所制得的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種N-(膦酰基甲基)甘氨酸，也稱(chēng)為草甘膦的制備方法，該方法包括氫化二羥乙酸和氨甲基膦酸的混合物，該混合物是就地在含有氨甲基膦酸和甘醇酸酯酶和過(guò)氧化氫酶的水溶液存在下由乙醇酸和氧氣反應(yīng)而酶促生成的。
文檔編號(hào)C07F9/38GK1073482SQ9211438
公開(kāi)日1993年6月23日 申請(qǐng)日期1992年11月6日 優(yōu)先權(quán)日1991年11月6日
發(fā)明者D·L·安頓, R·迪科西莫, E·W·波塔 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司