專利名稱：一種通過層析法制備含因子viii的病毒滅活級分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過層析法制備含因子VIII的一種病毒滅活級分的方法，以及一種可通過按照本發(fā)明的方法得到的含因子VIII的級分。
因子VIII是一種在血凝中起重要作用的至關(guān)重要物質(zhì)。血凝疾患因此可通過施用因子VIII治療。因而，對可施用的因子VIII制劑的需求很大。已作了很多嘗試以便從自然來源分離高度富含形式的因子VIII。因此，用于從冷沉淀物提純因子VIII的層析法已是公知的。冷沉淀物是對血漿進(jìn)行冷沉淀得的一種成分。EP 367840B1涉及一種從血漿中分離因子VIII而不預(yù)先進(jìn)行冷沉淀的層析法。在經(jīng)離子交換基團修飾的親水性材料上經(jīng)層析分離法分離該含因子VIII的成分。EP 0238701涉及一種用于制備超純的、易傳播的抗血友病因子的方法，其中經(jīng)預(yù)處理的級分是一種用乙醇沉淀法從纖維蛋白原、球蛋白、白蛋白和其它干擾成分中分離的冷沉淀物。歐洲專利申請88108458.6描述了在冷沉淀物級分的病毒滅活后用離子交換器層析進(jìn)行分離。EP 0173242A描述了在僅基于碳水化合物的陰離子交換材料上通過層析法取得因子VIII制劑的方法，該碳水化合物基質(zhì)被DEAE基團修飾。特別地，DEAEsepharose和DEAE纖維素按照用途被描述。在GB-A-1178958中，描述了一種使用ECTEOLA纖維素柱的因子VIII提純法。該被修飾的纖維素包含由表氯醇和三乙醇胺反應(yīng)引入的基礎(chǔ)物質(zhì)。上述先有技術(shù)應(yīng)用批量層析或柱層析的形式進(jìn)行層析分離。雖然用這些方法得到了相當(dāng)好的結(jié)果，為經(jīng)濟的和倫理的原因還希望增加有生物學(xué)上價值的因子VIII的產(chǎn)量。
因此，構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題在于提供一種方法，該方法從先有技術(shù)出發(fā)，能夠在使因子VIII的制備在產(chǎn)量和生物活性方面得到提高。
令人驚異地，該問題已得到解決。以冷沉淀物或血液血漿為出發(fā)材料，可選擇隨后進(jìn)行氫氧化鋁處理，將冷沉淀物溶解后使用膜層析法進(jìn)行分離。
本發(fā)明涉及方法的實施可采用商品冷沉淀物或血液血漿。優(yōu)選地，將解凍的冷沉淀物用氫氧化鋁處理，目的是對樣品進(jìn)一步預(yù)提純以便預(yù)濃縮因子VIII。
優(yōu)選地，在實際進(jìn)行層析純化之前，對排列在膜內(nèi)或膜上的材料進(jìn)行病毒滅活。該病毒的滅活按照在EP 131740A1中描述的方法通過用生物相容的有機溶劑(去垢劑)，Triton×100/TNBP，優(yōu)選吐溫/TNBP(三-n-丁基磷酸鹽)處理而進(jìn)行。采用Natriumcholat/TNBP也得到很好的結(jié)果。優(yōu)選地，去污劑的用量最多達(dá)15％重量比。然而，病毒的滅活也可在用膜層析法分離后進(jìn)行。
為提純樣品中的因子VIII，層析步驟可在經(jīng)離子交換基團，特別是陰離子交換劑修飾的基礎(chǔ)材料上進(jìn)行，或在經(jīng)免疫親和配基修飾的材料上進(jìn)行。關(guān)鍵的是，所述這些材料都是排列在膜上的優(yōu)選地，這些膜由基底材料如經(jīng)修飾的纖維素或塑料纖維制成。特別適用的是膜，和由多孔的多聚物(甘油基甲基丙烯酸樹脂)和/或其它具有類似結(jié)構(gòu)的多孔親水聚合物和親水聚苯乙烯所制成的致密盤。
在第一種情況，適用于分離的膜或者由用纖維素或塑料纖維制成的堆積的薄膜組成，或者在第二種情況下它由用二氧化硅凝膠或多聚物載體制成的致密盤組成。該膜或盤的基底材料提供相應(yīng)的陰離子交換基團或免疫親和配基。特別地，陰離子交換基團如季胺或二乙胺乙基基團被當(dāng)作離子交換基團。陽離子交換劑一般采用弱的和強的酸性陽離子交換劑，例如被磺酸或磷酸基團修飾的材料。
該離子交換基團可結(jié)合在基底材料纖維上，帶或不帶所謂的隔離物。提供隔離物的材料也被稱為觸須材料(Tentakelmaterial)。在DE 4204694中提到了相應(yīng)的隔離物和配基。例如，一種糖胺殘基也可用作一個隔離物。陰離子交換基團如DEAE或季胺也可結(jié)合在由多孔多聚物(甘油基甲基丙烯酸樹脂)或其它被提及的材料制成的膜上。該陰離子交換基團的結(jié)合可直接在形成膜的材料上，也可通過一個隔離物如糖胺殘基發(fā)生。
在本發(fā)明涉及的方法的另一實施方案中，使用了應(yīng)用具有對因子VIII的高度親和性的固定物質(zhì)的親和膜層析法。特別地，可能采用單克隆和/或多克隆抗體或抗體的因子VIII結(jié)合片段(免疫親合膜層析)。優(yōu)選該抗體來自人或鼠。
對因子VIII具親和性的物質(zhì)借助于化學(xué)性質(zhì)活潑的基團被固定在載體上。優(yōu)選地，該活潑的基團將攻擊隔離物的末端面非直接攻擊載體材料。對因子VIII的該物質(zhì)的固定通過在活潑的基團例如甲苯磺酸，tresyl，酰肼和其它的結(jié)合而發(fā)生。相應(yīng)的方法見于T.M.philips“層析法”(E.Heftmann，編)第5版；Elsevier，阿姆斯特丹1992中的“親和層析法”。
該抗體也可在帶有蛋白A或蛋白G配基的膜上被預(yù)吸附。通過隨后的共價交聯(lián)，可避免抗體的洗脫(流出柱子)。為在蛋白A或蛋白G膜上交聯(lián)該抗體可使用與松馳的載體類似的方法。在蛋白A或蛋白G上固定的優(yōu)點是該抗體僅被固定在分子的恒定片段(Fc)。因此，該抗原結(jié)合部分(Fab)保持游離并且其與因子VIII的相互作用未被妨礙。
在另一項優(yōu)選的實施方案中，疏水相互反應(yīng)的材料被保證用于分離因子VIII。所使用的疏水材料為開環(huán)的和/或環(huán)烷基鏈，例如C1至C18烷基鏈，和芳香族化合物。提供疏水相互反應(yīng)的合適物質(zhì)優(yōu)選那些具有分級的疏水性者。疏水性可通過引入極性基團，例如質(zhì)子極性或非質(zhì)子極性基團，如羥基、胺基、氰基來分級。優(yōu)選地，根據(jù)相應(yīng)的分離條件選用。
也可通過熱處理進(jìn)行病毒滅活。優(yōu)選地，含因子VIII的該被洗脫樣品經(jīng)第一次膜層析步驟后進(jìn)行巴氏消毒步驟。在P 4318435.9中已提出一個相應(yīng)的步驟。其中，富含因子VIII的級分在穩(wěn)定劑存在下接觸二或三烷基磷酸鹽和可任選的濕潤劑，并同時或隨后在55℃至67℃范圍的升高的溫度下被處理5小時至30小時。將兩種病毒滅活的方法，即用熱和去垢劑處理，結(jié)合起來可能是有利的。
為了去除在巴氏滅菌步驟中置入的化學(xué)物質(zhì)，可隨后進(jìn)行第二次膜層析。優(yōu)選地，采用經(jīng)DEAE或季銨化合物修飾的膜分離添加的穩(wěn)定劑，DEAE和季胺化合物膜經(jīng)隔離物排列在層析載體物質(zhì)表面。另外，有可能將相應(yīng)配基排列在沒有隔離物的載體材料表面。在選擇的條件下該穩(wěn)定劑不被這種陰離子交換材料阻滯，而因子VIII被吸附在該層析材料上。
然后用有梯度上升的鹽濃度的水溶劑系統(tǒng)洗脫因子VIII。
這樣使用常規(guī)的方法，將取得的含因子VIII的級分濃縮，灌裝必要時凍干。
優(yōu)選地采用從具有低離子強度的溶液上樣進(jìn)行第一次膜層析分離步驟中分離得到的因子VIII。優(yōu)選地，該水性系統(tǒng)具有相當(dāng)于0至150mM氯化鈉溶液的離子強度。在這樣的離子強度下，因子VIII仍被吸附在層析材料上，而更弱地結(jié)合的雜質(zhì)在具有相同離子強度的水性系統(tǒng)的洗脫下被洗掉。
本發(fā)明相關(guān)方法另一實施方案中，可使用具有相當(dāng)于200至400mM氯化鈉溶液的離子強度的水性系統(tǒng)進(jìn)行被吸附的材料的提純。然后用具有相當(dāng)于500至1500mM氯化鈉溶液的離子強度的水性系統(tǒng)進(jìn)行因子VIII的解吸和該級分的洗脫，而pH維持在4至9的范圍內(nèi)。如果進(jìn)行陽離子層析，優(yōu)選在pH值小于6進(jìn)行，而陰離子交換層析則宜在6以上的較高pH值下進(jìn)行。
如果因子VIII的提純是用免疫親和膜層析法進(jìn)行的，則，與使用離子交換材料的上述方法不同，洗脫是用離液劑(chaotropenreagenzien)或高濃度鹽溶液進(jìn)行的。優(yōu)選地，在足以破壞對因子VIII具高親和性的物質(zhì)和因子VIII本身之間結(jié)合的離液劑或鹽濃度下進(jìn)行洗脫。在相應(yīng)洗部系統(tǒng)中所述物質(zhì)的濃度取決于因子VIII和其相應(yīng)結(jié)合成分間的親合力的強度。優(yōu)選地，具有不太高的親和力的抗體被用作免疫親和配基。作為結(jié)果是，在具有較低變性能力的水性溶液條件下可發(fā)生洗脫。優(yōu)選地，具有1至6M尿素，特別是2至4M尿素濃度的水性溶性，或相應(yīng)的高濃度的鹽溶液被用于從免疫親和膜上洗脫因子VIII。
在疏水相互反應(yīng)層析中，樣品被加至具有很高離子強度的水性溶液中，如，高濃度的硫酸銨(高至4M的濃度)或氯化鈉(高至5M的濃度)。特別地，洗脫是用較低離子強度的鹽溶液梯度地或線性地進(jìn)行。含有有機溶劑的水性溶液，特別是稀釋的酒精溶液，也可為具有較低離子強度的溶液用于在疏水交叉反應(yīng)膜層析中樣品的洗脫。
本發(fā)明相關(guān)的方法令人驚異地保證了一種因子VIII的快速和不復(fù)雜的提純，并同時得到高純度和高產(chǎn)率。另外，如此得到的因子VIII的比活很高，是因為本發(fā)明相關(guān)的方法中活性因子的低變性。因此，通過本發(fā)明相關(guān)的方法能得到的含因子VIII級分是本發(fā)明的一個目標(biāo)。
權(quán)利要求
1.通過層析方法制備含因子VIII的病毒滅活級分的一種方法，其中一從冷沉淀物或血漿開始一可任選隨后用氫氧化鋁處理，在冷沉淀物溶解后至少進(jìn)行一個使用膜層析的分離步驟。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述分離步驟在膜內(nèi)或膜上排列有離子交換材料上，特別是陰離子交換材料的膜上發(fā)生。
3.按照權(quán)利要求1和/或2的方法，其中病毒滅活是通過用二或三烷基磷酸鹽和非離子表面活性劑處理所述級分進(jìn)行的。
4.按照權(quán)利要求1至3之至少一個的方法，其中病毒滅活通過巴氏滅菌步驟實施，任選隨后進(jìn)行使用膜層析的附加分離步驟。
5.按照權(quán)利要求1至4的之至少一個的方法，其中所述膜層析在對因子VIII具有高親和力的材料上發(fā)生。
6.按照權(quán)利要求1至5之至少一個的方法，其中對因子VIII具有高親和力的該材料被具有高和/或低分子量的配基修飾。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述材料用針對因子VIII的抗體修飾。
8.按照權(quán)利要求5至7之至少一個的方法，其中對因子VIII具有高親和力的該被修飾材料帶有對因子VIII具有高親和力的固定配基。
9.按照權(quán)利要求1至8中任意一項的方法，其中該層析材料能夠與待分離的因子VIII起相互疏水作用或帶有介導(dǎo)相互疏水作用的合適配基。
10.按照權(quán)利要求1至9中至少一個的方法，其中待提純的樣品在具有對應(yīng)于0至150mM氯化鈉的低離子強度的水性系統(tǒng)中上樣于含離子交換材料的膜上，任選用具有對應(yīng)于200至400mM氯化鈉溶液的較高離子強度的水性系統(tǒng)洗滌，然后用具有對應(yīng)于500至1500mM氯化鈉溶液的高離子強度的水性系統(tǒng)洗脫，而pH值維持在4至9。
11.按照權(quán)利要求1至10的至少一個的方法，其中待提純的樣品從允許因子VIII結(jié)合于針對因子VIII的抗體的溶液被上樣到上面帶有被吸附的因子VIII的親和膜被任選地洗滌，然后用相當(dāng)于例如1至6M尿素的濃度的離液劑或用相應(yīng)地更高濃度的鹽溶液洗脫。
12.按照權(quán)利要求1至10的至少一個的方法，其中待提純的樣品溶于具有很高離子強度的溶液，加樣至表面帶有疏水配基的膜上，并用具有低離子強度的溶液系統(tǒng)洗脫。
13.按照權(quán)利要求1至12的至少一個的方法，其中含因子VIII的該被洗脫級分被濃縮，灌裝和/或凍干。
14.按照權(quán)利要求1至13的至少一個的方法，其中所述病毒滅活是通過用重量比最多達(dá)15％的去污劑處理進(jìn)行的。
15.一種含因子VIII的級分，通過應(yīng)用按照權(quán)利要求1至14的至少一個的方法取得。
全文摘要
一種通過層析方法制備含因子Ⅷ的病毒滅活級分的方法，其中——從冷沉淀物或血液血漿開始——可能隨后用氫氧化鋁處理，在冷沉淀物溶解后至少進(jìn)行使用膜層析的一個分離步驟。對該級分進(jìn)行病毒滅活并優(yōu)選進(jìn)行附加的巴氏滅菌步驟。
文檔編號C07K1/22GK1134157SQ94194020
公開日1996年10月23日 申請日期1994年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月4日
發(fā)明者A·斯特蘭卡, M·A·斯塔德勒, D·約斯克 申請人:奧克塔法馬有限公司