專利名稱：從赤霉素混合物中分段提取赤霉素a4和a7的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及赤霉素各成份的分離提取工藝，特別是從微生物發(fā)酵的赤霉素過濾液中分段提取赤霉素A4和A7(GA4、GA7)的工藝。
目前已從自然界中發(fā)現(xiàn)82種赤霉素，按順序排列為GA1、GA2、GA3……GA82，還有十多種組合型。這些赤霉素主要來自微生物和植物。目前活性最高的赤霉素這種類都可從微生物中發(fā)現(xiàn)，如GA3、GA4、GA7等等。微生物還具有生長(zhǎng)迅速、制備容易、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，所以商業(yè)赤霉素都來自微生物發(fā)酵所獲得產(chǎn)品。微生物中幾乎都以藤倉赤霉菌(Gibberella fujikuroi)作為生產(chǎn)菌。該菌的多數(shù)菌株都產(chǎn)生多種赤霉素，例如GA3、GA4、GA7、GA9、GA13等。GA3是最早開發(fā)應(yīng)用的一種赤霉素，它對(duì)植物莖葉生長(zhǎng)的促進(jìn)作用活性最強(qiáng)。GA4、GA7對(duì)植物果實(shí)細(xì)胞伸長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯，目前最主要的例子是用于使蘋果果實(shí)增高，稱之謂“高莊蘋果”或“蛇果”的生產(chǎn)。這種“高莊蘋果”由于形狀美觀，顏色鮮艷而深受消費(fèi)者歡迎，售價(jià)高出普通蘋果數(shù)倍至數(shù)十倍。赤霉素A4、A7的商品通常是兩者的混合物，即GA4+7產(chǎn)品中不能混有GA3，否則就會(huì)在增高果實(shí)的同時(shí)引起枝葉的徒長(zhǎng)而帶來落花落果弊病。另一方面，GA7和GA4雖有相同的方面，但也有不同的作用，比如GA7有抑制花芽分化的現(xiàn)象，而GA4沒有;在引起植物單性結(jié)實(shí)的效果方面，GA4大于GA7;此外，還有其它方面的不同作用。為了用戶的不同需要，GA4與GA7的分離也勢(shì)在必行。
GA4+7的分離提取工藝，據(jù)目前所知，有兩個(gè)專利，一是82年的日本專利59106478，二是64年英國(guó)專利1174924。前者的工藝要點(diǎn)是先經(jīng)一般的赤霉素萃取，蒸出大部分乙酸乙脂，加入正丙酮，再加N-芐基甲胺得GA4+7N-芐基甲胺鹽沉淀，分出不發(fā)生沉淀的GA3。GA4+7胺鹽用甲醇水溶解，加酸加水使GA4+7結(jié)晶析出。后一工藝是在發(fā)酵濾液中調(diào)pH4.2-5.5，乙酸乙脂萃取得GA4+7，然后脫色濃縮，再在乙酸乙脂、2乙脂醚中結(jié)晶，萃取過GA4+7的濾液再調(diào)pH2，乙酸乙脂萃取，脫色濃縮得GA3結(jié)晶。
日本工藝需使用N-芐基甲胺、正丙醇、草酸等價(jià)格較高的化合物。其缺點(diǎn)是工序多，不能分離GA4和GA7。英國(guó)工藝的缺點(diǎn)是只分出GA4+7，GA4與GA7也同樣不能分離，純度不夠時(shí)需反復(fù)多次萃取，較繁雜。
本發(fā)明的目的是提供一種從微生物發(fā)酵液的赤霉素混合物中分離提取赤霉素A4和A7(GA4、GA7)的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的工藝是先將赤霉素發(fā)酵液在pH7.0-6.8的條件下濃縮20-30倍，調(diào)pH6.0，使GA4沉淀，分離的濾液調(diào)pH4.5，使GA7沉淀，再次分離出的濾液調(diào)pH2.2，用乙酸乙脂萃取GA3。按這一工藝的特點(diǎn)稱為分段提取法。由于赤霉素發(fā)酵濾液濃縮倍數(shù)高，每段提取過程使用乙酸乙脂很少。純度不夠時(shí)，只需用緩沖液清洗每一段的提取液，而不使用反復(fù)萃取的方法。
本發(fā)明每段分離提取的詳細(xì)工藝過程為赤霉素發(fā)酵液必須清徹透亮，壓濾或離心。得到的濾液經(jīng)薄膜濃縮器減壓濃縮，使其濃縮到原體積的1/20-1/30。開啟攪拌，緩慢加入HCl或H3PO4，使pH達(dá)到6.0，即出現(xiàn)白色至灰白片狀沉淀。分出的沉淀用pH6.0緩沖液洗一次。沉淀用乙酸乙脂溶解，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，如還有少量GA3，GA7，可用pH6緩沖液清洗，清洗合格后，加熱有機(jī)相至60℃并加入活性炭，不斷攪拌以便充分脫色，通過過濾除去炭，過濾液減壓回收乙酸乙脂得GA4結(jié)晶。
沉淀過GA4后的濾液和清洗液，經(jīng)濃縮或不濃縮再用HCl或H3PO4調(diào)pH4.5，使其GA7沉淀。得到的沉淀按上述GA4的操作步驟進(jìn)行清洗，用pH4緩沖液和pH6的緩沖液清洗，以便分別洗去GA3和GA4的殘余，直至檢測(cè)合格為止，然后濃縮獲得GA7結(jié)晶。
沉淀過GA4和GA7的濾液和清洗液，經(jīng)濃縮或不濃縮，調(diào)pH2.2，加乙酸乙脂萃取，然后脫色濃縮得GA3結(jié)晶。
本發(fā)明的生產(chǎn)工藝與以前的專利工藝相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果1、由于發(fā)酵濾液先經(jīng)濃縮，溶液中赤霉素濃度加大。根據(jù)GA3、GA7、GA4在不同pH值時(shí)的分配系數(shù)Kd(水相中的溶質(zhì)重/有機(jī)相中的溶質(zhì)重)，當(dāng)pH6時(shí)，GA3的kd＝50，不出現(xiàn)沉淀，GA7的kd＝0.61，GA4的kd＝0.09，此時(shí)GA4kd為GA7的1/6，GA4首先沉淀，特別在GA7的含量小于GA4時(shí)。pH4.5時(shí)，GA7的kd＝0.27，GA3的kd＝1.37，GA3在水中的溶解度大于GA7五倍，于是出現(xiàn)GA7的沉淀。
2、清除GA4中混入的GA7和GA3以及清除GA7中混入的GA4和GA3，均用緩沖液清洗，而不是采用反復(fù)萃取的方法，極大的簡(jiǎn)化了工藝。
3、發(fā)酵濾液濃縮萃取，只消耗少量乙酸乙脂，清洗代替反復(fù)萃取，不用乙酸乙脂。與N-芐甲胺法相比省去的有機(jī)溶劑更多，從而降低了生產(chǎn)成本。
4、比以前工藝更具特色的是，可以將大部分的GA4和GA7分離，這是以前工藝所沒有的。


圖1從微生物發(fā)酵液中分段提取GA4、GA7工藝流程圖下面用實(shí)施例進(jìn)一步敘述本發(fā)明實(shí)施例1藤倉赤霉菌農(nóng)大17菌株(任何能產(chǎn)GA4、GA7的菌株都可代替)發(fā)酵液60l，過濾得濾液54l，內(nèi)含GA312.49lg，GA713.016g，GA421.199g，其它赤霉素(主要為GA9)7.293g，薄膜濃縮后得濃縮液2.5l，攪拌下緩慢滴加2N HCl，不斷出現(xiàn)白色片狀沉淀，達(dá)到pH6.0后，繼續(xù)攪拌30分鐘，然后靜置30分鐘，使沉淀充分聚集。分出的沉淀加0.5lpH6.0緩沖液，攪拌10分鐘，靜置30分鐘，抽出上清液。清洗過的沉淀，加乙酸乙脂1l，加熱至60℃并加活性炭30g攪拌脫色30分鐘，趁熱過濾，濾渣用少量熱乙酸乙脂洗滌，高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)，GA7已屬微量(<2%)。過濾液減壓濃縮，回收乙酸乙脂得9.8g結(jié)晶和90ml母液(GA4含量6.4%)。
將沉淀過GA4的濃縮液2.5l和清洗液0.5l濃縮至1.5l，攪拌下，緩慢滴入2N HCl調(diào)pH4.5，沉淀GA7。上清液吸去，0.5lpH4.5緩沖液清洗沉淀，700ml乙酸乙脂溶解沉淀，加20g活性炭脫色，除濾渣后，過濾液用pH4.5緩沖液洗5次(0.5l/次)，用pH6.0緩沖液洗二次(0.5l/次)，用HPLC檢測(cè)合格。兩種清洗液分別處理。過濾液回收乙酸乙脂后得GA7結(jié)晶4.3克，母液65ml(含GA75.6%)。
將pH4.5緩沖液洗出的清洗液濃縮至0.4l，加入沉淀過GA7的濃縮液1.5l，繼續(xù)濃縮至1.0l，2NHCl調(diào)pH2.2，加乙酸乙脂萃取，濃縮回收GA3結(jié)晶3.8克(GA3含量70%，其它赤霉素16%)，母液60ml(GA34.5%)。萃余液棄去。
以上得到的GA4、GA7、GA3結(jié)晶，如有更高純度要求，可以按常規(guī)進(jìn)行重結(jié)晶。
實(shí)施例2發(fā)酵濃縮濾液2.1l(濃縮25.7倍)，含GA312.460g，GA714.105g，GA422.418g.GA4的分離和實(shí)施例1操作相同，當(dāng)沉淀溶解脫色過濾后，發(fā)現(xiàn)GA7達(dá)3.2%，于是用pH6.0緩沖液1l進(jìn)行清洗后才達(dá)合格，最后得GA4結(jié)晶9.7克母液90ml(含GA47.2%)。
以上萃余液，清洗液一并濃縮至1.5l，沉淀操作同實(shí)施例1，用pH4.5緩沖液洗5次(0.5l/次)后，即行濃縮得結(jié)晶4.9克，其中GA4占13%，得母液70ml(GA74.7%，GA41.8%)。
GA3回收同實(shí)施例1。
實(shí)施例3發(fā)酵濃縮濾液3.2l(濃縮30倍)，用2NHCl調(diào)pH2.2，按實(shí)施例1中GA3回收的方法，進(jìn)行萃取濃縮，回收乙酸乙脂，得混合結(jié)晶19.2克，母液280ml。
結(jié)晶用pH8緩沖液溶解，19.2克溶于1000ml緩沖液，然后按實(shí)施例1的操作，分離GA4、GA7和GA3，分別得GA49.5g，GA74.7g和GA34.3克。
母液也和結(jié)晶一樣萃取，得GA4母液100ml(含量5.9%)，GA780ml(含量5.3%)，GA360ml(含量4.5%)。
權(quán)利要求
1.一種從赤霉素發(fā)酵液中提取赤霉素A4、A7的方法，其特征在于(1)、先將赤霉素發(fā)酵液在pH7.0-6.8條件下濃縮20-30倍，調(diào)pH6.0，使GA4沉淀，分離濾液；(2)、將上述分離的濾液，調(diào)pH4.5，使GA7沉淀，再次分離出濾液；(3)、將上述再次分離出的濾液，調(diào)pH2.2，用乙酸乙脂萃取GA3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于GA4的提取方法是，赤霉素發(fā)酵液必須清徹透亮，壓濾或離心，得到的濾液經(jīng)薄膜濃縮器減壓濃縮，使其濃縮到原體積的1/20-1/30，開啟攪拌，緩慢加入HCl或H3PO4，使pH達(dá)到6.0時(shí)，即出現(xiàn)白色至灰白片狀沉淀，分出的沉淀用pH6.0緩沖液洗一次，沉淀用乙酸乙脂溶解，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，如還有少量GA3，GA7，可用pH6緩沖液清洗，清洗合格后，加熱有機(jī)相至60℃并加入活性炭，不斷攪拌以便充分脫色，通過過濾除去炭，過濾液減壓回收乙酸乙脂得GA4結(jié)晶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于沉淀過GA4后濾液和清洗液，經(jīng)濃縮或不濃縮，再用HCl或H3PO4調(diào)pH4.5，使其GA7沉淀;得到的沉淀按GA4的操作步驟進(jìn)行清洗，用pH4.5緩沖液和pH6的緩沖液清洗，以便分別洗去GA3和GA4的殘余，直至檢測(cè)合格為止，從而獲得GA7結(jié)晶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于沉淀過GA4和GA7的濾液和清洗液，經(jīng)濃縮或不濃縮，調(diào)pH2.2，加乙酸乙脂萃取，然后脫色濃縮得GA3結(jié)晶。
全文摘要
一種從赤霉素發(fā)酵液中提取赤霉素A
文檔編號(hào)C07D307/93GK1111286SQ95102240
公開日1995年11月8日 申請(qǐng)日期1995年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月16日
發(fā)明者顏方貴 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)