專利名稱：L－谷氨酰胺的分離純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥用氨基酸制備領(lǐng)域，具體涉及一種L-谷氨酰胺的分離純化工藝。
谷氨酰胺曾經(jīng)被認(rèn)為是一種非必需性氨基酸，近年來，隨著對谷氨酰胺的生理、生化、臨床等方面研究的深入和發(fā)展，谷氨酰胺對生命活動(dòng)的重要性正日漸突出，目前，谷氨酰胺已被普遍認(rèn)為是一種條件必需性氨基酸。我國至今沒有實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺的發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)，作為下游過程的分離純化技術(shù)不過關(guān)乃是最重要的原因之一。谷氨酰胺發(fā)酵過程中的主要副產(chǎn)物是谷氨酸，而谷氨酰胺和谷氨酸兩者分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相近，分離困難，而且谷氨酰胺不穩(wěn)定，分離過程中酸性下容易轉(zhuǎn)化成谷氨酸。
國內(nèi)外一般采用陽離子交換樹脂直接吸附、陽離子和陰離子交換樹脂組合處理等。日本專利說明書(昭62-148459)公開了一種用銨型強(qiáng)酸性離子交換樹脂分離發(fā)酵液中的谷氨酰胺的方法，但該方法的發(fā)酵液谷氨酸濃度很低因而分離容易，而且銨型強(qiáng)酸樹脂對氨基酸的交換容量比其氫型要小得多，此外該方法的實(shí)驗(yàn)規(guī)模也很小(φ32×250mm的交換柱)。1994年《工業(yè)微生物》第2期第1頁提出谷氨酰胺提取的工藝如下發(fā)酵液除菌體→732柱(H型)吸附→0.4N氨水洗脫→717柱(OH型)吸附→0.1NHCl洗脫→減壓濃縮→乙醇沉淀此工藝存在的問題是谷氨酰胺在與強(qiáng)酸H型樹脂交換時(shí)發(fā)生向谷氨酸的轉(zhuǎn)化，大大影響收率。此外用鹽酸洗脫使得谷氨酰胺和谷氨酸洗脫峰重疊嚴(yán)重而影響分離。
上述分離提取工藝，或是被處理發(fā)酵液中谷氨酸等雜質(zhì)濃度很低因而容易分離、或是被處理發(fā)酵液中谷氨酸等雜質(zhì)含量高造成分離不良，因而成品質(zhì)量差、總收率低，此外還普遍存在試驗(yàn)規(guī)模過小等不足。
本發(fā)明的目的是提出一種在較大的提取規(guī)模下，僅采用一種陰離子交換樹脂，以雙柱串聯(lián)分別交換吸附谷氨酰胺發(fā)酵液中的谷氨酸等雜質(zhì)和谷氨酰胺，然后弱酸選擇性洗脫一柱，最終分離提取出符合藥用標(biāo)準(zhǔn)谷氨酰胺的工藝。
本發(fā)明的工藝包括下述順序的步驟(1)發(fā)酵液絮凝除菌體將谷氨酰胺發(fā)酵液調(diào)節(jié)至pH2.0-5.0，緩慢攪拌下以1-10毫升/升發(fā)酵液的量加入濃度為2-3％的高分子絮凝劑，然后加入500-2000ppm的金屬鹽，緩慢攪拌混合30-60分鐘后靜置30-60分鐘，離心或過濾除去固相，用2-5倍固相體積的去離子水洗滌固相，收集濾液和洗滌水，合并后待用。
(2)離子交換樹脂的處理強(qiáng)堿性離子交換樹脂按常規(guī)方法處理后裝柱，然后轉(zhuǎn)成OH型后待用。
(3)發(fā)酵液除去谷氨酸等雜質(zhì)由步驟(1)處理得到的合并液以0.1-4.0BV/小時(shí)的流速通入步驟(2)處理好的強(qiáng)堿性離子交換柱，通完液后同流速下用0.6-2倍床層體積的去離子水頂出柱中液體，收集所有離子交換柱的流出液待用。
(4)離子交換吸附谷氨酰胺由步驟(3)處理得到的料液以0.1-4.0BV/小時(shí)的流速通入步驟(2)處理好的強(qiáng)堿性離子交換柱，通完液后，相同流速下用0.5-5倍樹脂床體積的去離子水洗柱，洗完后以0.1-3.0BV/小時(shí)的流速用0.01-2.0N的弱酸洗脫，收集谷氨酰胺高流份洗脫液待用。
(5)谷氨酰胺洗脫液的真空濃縮由步驟(4)處理得到的谷氨酰胺洗脫液在40℃-80℃下真空濃縮至谷氨酰胺濃度50-100克/升，保溫待用。
(6)谷氨酰胺濃縮液的脫色將步驟(5)處理得到的谷氨酰胺濃縮液調(diào)至pH3.0-6.0，按0.1％-1.0％的比例加入藥用級活性炭，50℃-80℃保溫下攪拌0.5-1小時(shí)，然后同溫下保溫過濾數(shù)次至濾液中無炭粒。
(7)谷氨酰胺濃縮液的結(jié)晶將步驟(6)處理得到的谷氨酰胺脫色液調(diào)至pH4.0-6.5，然后以1-3℃/小時(shí)的降溫速率降溫，溫度每降低10℃，停止降溫并同溫下保溫2-6小時(shí)，然后繼續(xù)以同樣速率降溫，直至液溫降至0℃-5℃后，同溫下維持結(jié)晶8-14小時(shí)后過濾，收集晶體待用。
(8)谷氨酰胺的晶體洗滌將步驟(7)處理得到的谷氨酰胺晶體以1-4毫升/克晶體的比例加入有機(jī)溶劑，35℃-45℃保溫下攪拌1-3小時(shí)，過濾，收集晶體待用。
(9)谷氨酰胺晶體的干燥將步驟(8)處理得到的谷氨酰胺晶體在40℃-60℃下干燥6-8小時(shí)，然后80℃干燥1-4小時(shí)，冷卻后即得谷氨酰胺成品。
上述過程所用的去離子水都須經(jīng)脫二氧化碳處理，上柱方式為正上柱。
步驟(1)所述的谷氨酰胺發(fā)酵液的pH用鹽酸、硫酸、硝酸之一調(diào)節(jié)。
步驟(1)所述的高分子絮凝劑是陰離子型、陽離子型、非離子型聚丙烯酰胺之一。
步驟(1)加入的金屬鹽是硫酸鋁、硫酸鋅、氯化鋅、三氯化鐵之一。
步驟(2)中強(qiáng)堿性離子交換樹脂是717#、711#、D2004、201×2、JK204、JK206、D201、D202、D241、D293、JK208、D290、D296、D261之一。
步驟(4)所述的弱酸是甲酸、醋酸、檸檬酸之一。
步驟(8)所述的有機(jī)溶劑是甲醇、無水乙醇、95％乙醇、丙酮之一。
采用上述工藝處理不同批次的谷氨酰胺發(fā)酵液，有效地避免了谷氨酰胺在陽離子交換柱上向谷氨酸的轉(zhuǎn)化、強(qiáng)酸洗脫陰離子柱時(shí)谷氨酰胺和谷氨酸之間分離不良的問題，谷氨酰胺的總收率為70％左右，而且得到的谷氨酰胺產(chǎn)品質(zhì)量符合日本藥典。
下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1谷氨酰胺發(fā)酵液主要成分谷氨酰胺41克/升，谷氨酸8.3克/升，硫酸銨11克/升，玉米漿、葡萄糖、無機(jī)鹽少量，pH6.5，發(fā)酵液體積10升。
離子交換樹脂的處理強(qiáng)堿性離子交換樹脂JK204先用清水漂洗干凈，用過量的1N鹽酸處理，去離子水漂洗干凈后再用過量的1N氫氧化鈉處理，這樣用酸堿反復(fù)處理3次后，用去離子水漂洗干凈，樹脂在真空下脫氣30分鐘后裝入φ100×1000毫米的玻璃層析柱中，最后用過量的1N氫氧化鈉處理成羥型，去離子水漂洗柱后待用。
發(fā)酵液用1.5N硫酸調(diào)節(jié)pH至5.0，緩慢攪拌下以10毫升/升發(fā)酵液的量加入濃度2％的陽離子型聚丙烯酰胺，混勻后加入500ppm的氯化鋅，繼續(xù)緩慢攪拌30分鐘混均勻后靜置30分鐘，過濾，固相用2倍固相體積的去離子水洗滌并過濾，合并收集濾液和洗滌水。
合并收集的料液以0.5BV/小時(shí)流速通入第一個(gè)JK204陰離子交換柱，第一個(gè)交換柱床層體積4升，上完液后用一倍床層體積的去離子水以相同流速頂出柱中料液。第一個(gè)柱的流出液以1.0BV/小時(shí)的流速通入第二個(gè)JK204陰離子交換柱，第二個(gè)交換柱床層體積7升，上完液后用一倍床層體積的去離子水相同流速下水洗第二個(gè)柱，洗完后用0.1N醋酸1.0BV/小時(shí)流速洗脫第二柱，收集谷氨酰胺高流分洗脫液。
收集的谷氨酰胺高流分洗脫液70℃真空濃縮至谷氨酰胺濃度60克/升，70℃保溫下用1N硫酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.0，并按0.5％的量加入醫(yī)用活性炭，緩慢攪拌30分鐘脫色，過濾三次，濾液用1N氫氧化鈉調(diào)pH至5.0后，以2℃/小時(shí)的降溫速率降溫，每降溫10℃維持4小時(shí)，降溫至0℃后維持溫度結(jié)晶12小時(shí)。過濾，晶體以1毫升/克的量加入甲醇，35℃下攪拌1小時(shí)后過濾，晶體60℃干燥6小時(shí)，80℃干燥4小時(shí)，冷卻后得谷氨酰胺成品。谷氨酰胺總收率為70.3％。
整個(gè)過程所用的去離子水都須經(jīng)脫二氧化碳處理，上柱方式為正上柱。
實(shí)施例2谷氨酰胺發(fā)酵液主要成分為谷氨酰胺35.6克/升，谷氨酸10.1克/升，氯化銨1升，葡萄糖、玉米漿、無機(jī)鹽少量pH6.7，發(fā)酵液體積10升。
發(fā)酵液用1.5N鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，緩慢攪拌下以1毫升/升發(fā)酵液的量加入濃度3％的陰離子型聚丙烯酰胺，混勻后加入2000ppm的硫酸鋅，繼續(xù)緩慢攪拌45分鐘混均勻后靜置45分鐘，過濾，固相用4倍固相體積的去離子水洗滌并過濾，合并收集濾液和洗滌水。
合并收集的料液以4BV/小時(shí)流速通入第一個(gè)717陰離子交換柱，上完液后用0.6倍床層體積的去離子水以相同流速頂出柱中料液。第一個(gè)柱的流出液以0.1BV/小時(shí)的流速通入第二個(gè)717陰離子交換柱，上完液后用三倍床層體積的去離子相同流速下水洗第二個(gè)柱，洗完后用0.01N檸檬酸3.0BV/小時(shí)流速洗脫第二柱，收集谷氨酰胺高流分洗脫液。
收集的谷氨酰胺高流分洗脫液40℃真空濃縮至谷氨酰胺濃度50克/升，40℃保溫下用1.5N鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.0，并按0.1％的量加入醫(yī)用活性炭，緩慢攪拌45分鐘脫色，濾紙過濾四次，濾液用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.0后，以1℃/小時(shí)的降溫速率降溫，每降溫10℃維持2小時(shí)，降溫至3℃后維持溫度結(jié)晶8小時(shí)。過濾，晶體以2.5毫升/克的量加入95％乙醇，40℃下攪拌2小時(shí)后過濾，晶體50℃干燥7小時(shí)，80℃干燥2小時(shí)，冷卻后即得谷氨酰胺成品。其他同實(shí)施例1。谷氨酰胺的總收率為69.0％。
實(shí)施例3谷氨酰胺發(fā)酵液主要成分為谷氨酰胺21克/升，谷氨酸17.5克/升，氯化銨11克/升，葡萄糖、玉米漿、無機(jī)鹽少量，pH6.7，發(fā)酵液體積10升。
發(fā)酵液用1.5N硝酸調(diào)節(jié)pH至3.0，緩慢攪拌下以5毫升/升發(fā)酵液的量加入濃度2％的陽離子型聚丙烯酰胺，混勻后加入1000ppm的硫酸鋁，繼續(xù)緩慢攪拌60分鐘混均勻后靜置60分鐘，過濾，固相用5倍固相體積的去離子水洗滌并過濾，合并收集濾液和洗滌水。
合并收集的料液以0.1BV/小時(shí)流速通入第一個(gè)711陰離子交換柱，上完液后用2倍床層體積的去離子水以相同流速頂出柱中料液。第一個(gè)柱的流出液以4.0BV/小時(shí)的流速通入第二個(gè)711陰離子交換柱，上完液后用五倍床層體積的去離子相同流速下水洗第二個(gè)柱，洗完后用2.0N甲酸0.1BV/小時(shí)流速洗脫第二柱，收集谷氨酰胺高流分洗脫液。
收集的谷氨酰胺高流分洗脫液80℃真空濃縮至谷氨酰胺濃度100克/升，80℃保溫下用1.5N硝酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0，并按1.0％的量加入醫(yī)用活性炭，緩慢攪拌60分鐘脫色，濾紙過濾二次，濾液用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.5后，以3℃/小時(shí)的降溫速率降溫，每降溫10℃維持6小時(shí)，降溫至5℃后維持溫度結(jié)晶14小時(shí)。過濾，晶體以4毫升/克的量加入丙酮，45℃下攪拌3小時(shí)后過濾，晶體40℃干燥8小時(shí)，80℃干燥1小時(shí)，冷卻后即得谷氨酰胺成品。其他同實(shí)施例1。谷氨酰胺的總收率為71.6％。
權(quán)利要求
1．一種L-谷氨酰胺的分離純化工藝，該工藝包括下述順序的步驟(1)發(fā)酵液絮凝除菌體將谷氨酰胺發(fā)酵液調(diào)節(jié)至pH2.0-5.0，緩慢攪拌下以1-10毫升/升發(fā)酵液的量加入濃度為2-3％的高分子絮凝劑，然后加入500-2000ppm的金屬鹽，緩慢攪拌混合30-60分鐘后靜置30-60分鐘，離心或過濾除去固相，用2-5倍固相體積的去離子水洗滌固相，收集濾液和洗滌水，合并后待用；(2)離子交換樹脂的處理強(qiáng)堿性離子交換樹脂按常規(guī)方法處理后裝柱，然后轉(zhuǎn)成OH型后待用；(3)發(fā)酵液除去谷氨酸等雜質(zhì)由步驟(1)處理得到的合并液以0.1-4.0BV/小時(shí)的流速通入步驟(2)處理好的強(qiáng)堿性離子交換柱，通完液后同流速下用0.6-2倍床層體積的去離子水頂出柱中液體，收集所有離子交換柱的流出液待用；(4)離子交換吸附谷氨酰胺由步驟(3)處理得到的料液以0.1-4.0BV/小時(shí)的流速通入步驟(2)處理好的強(qiáng)堿性離子交換柱，通完液后，相同流速下用0.5-5倍樹脂床體積的去離子水洗柱，洗完后以0.1-3.0BV/小時(shí)的流速用0.01-2.0N的弱酸洗脫，收集谷氨酰胺高流份洗脫液待用；(5)谷氨酰胺洗脫液的真空濃縮由步驟(4)處理得到的谷氨酰胺洗脫液在40℃-80℃下真空濃縮至谷氨酰胺濃度50-100克/升，保溫待用；(6)谷氨酰胺濃縮液的脫色將步驟(5)處理得到的谷氨酰胺濃縮液調(diào)至pH3.0-6.0，按0.1％-1.0％的比例加入藥用級活性炭，50℃-80℃保溫下攪拌0.5-1小時(shí)，然后同溫下保溫過濾數(shù)次至濾液中無炭粒；(7)谷氨酰胺濃縮液的結(jié)晶將步驟(6)處理得到的谷氨酰胺脫色液調(diào)至pH4.0-6.5，然后以1-3℃/小時(shí)的降溫速率降溫，溫度每降低10℃，停止降溫并保溫2-6小時(shí)，然后繼續(xù)以同樣速率降溫，直至液溫降至0℃-5℃后，維持結(jié)晶8-14小時(shí)后過濾，收集晶體待用；(8)谷氨酰胺的晶體洗滌將步驟(7)處理得到的谷氨酰胺晶體以1-4毫升/克晶體的比例加入有機(jī)溶劑，35℃-45℃保溫下攪拌1-3小時(shí)，過濾，收集晶體待用；(9)谷氨酰胺晶體的干燥將步驟(8)處理得到的谷氨酰胺晶體在40℃-60℃下干燥6-8小時(shí)，然后80℃干燥1-4小時(shí)，冷卻后即得谷氨酰胺成品；上述過程所用的去離子水都須經(jīng)脫二氧化碳處理，上柱方式為正上柱。
2．如權(quán)利要求1中所述的L-谷氨酰胺的分離純化工藝，其特征在于，步驟(1)所述的谷氨酰胺發(fā)酵液的pH用鹽酸、硫酸、硝酸之一調(diào)節(jié)。
3．如權(quán)利要求1中所述的L-谷氨酰胺的分離純化工藝，其特征在于，步驟(1)所述的高分子絮凝劑是陰離子型、陽離子型、非離子型聚丙烯酰胺之一。
4．如權(quán)利要求1中所述的L-谷氨酰胺的分離純化工藝，其特征在于，步驟(1)加入的金屬鹽是硫酸鋁、硫酸鋅、氯化鋅、三氯化鐵之一。
5．如權(quán)利要求1中所述的L-谷氨酰胺的分離純化工藝，其特征在于，步驟(2)所述的強(qiáng)堿性離子交換樹脂是717#、711#、D2004、201×2、JK204、JK206、D20`、D202、D241、D293、JK208、D290、D296、D261之一。
6．如權(quán)利要求1中所述的L-谷氨酰胺的分離純化工藝，其特征在于，步驟(4)所述的弱酸是甲酸、醋酸、檸檬酸之一。
7．如權(quán)利要求1中所述的L-谷氨酰胺的分離純化工藝，其特征在于，步驟(8)所述的有機(jī)溶劑是甲醇、無水乙醇、95％乙醇、丙酮之一。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種L－谷氨酰胺的分離純化工藝,它有效地解決了谷氨酰胺在分離過程中向谷氨酸轉(zhuǎn)化、強(qiáng)酸洗脫谷氨酰胺和谷氨酸洗脫峰重疊嚴(yán)重等影響收率和成品純度及操作規(guī)模過小的問題。本發(fā)明僅用一種陰離子交換樹脂,以雙柱串聯(lián)的方式分別交換吸附谷氨酸等雜質(zhì)和谷氨酰胺,弱酸選擇性洗脫一柱而分離提取出谷氨酰胺。本發(fā)明方法簡練,收率較高,產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到藥品標(biāo)準(zhǔn),而且工藝的規(guī)模較大,有利于放大到工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07C227/40GK1224711SQ9812215
公開日1999年8月4日 申請日期1998年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月28日
發(fā)明者沈亞領(lǐng), 許平, 孫際賓, 馬翠卿, 錢新民 申請人:山東大學(xué)