專利名稱：用于免疫抑制、抗癌和抗病毒治療的藥物組合物的制作方法
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及用作免疫抑制劑的化合物及其在移植療法中的應用。本發(fā)明具體涉及了雙萜類化合物，特別是槍刀藥素氧化物(hypoestoxide)類化合物，其衍生物及其激動劑在免疫抑制、炎癥、移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、皮膚病以及T細胞介導型自身免疫病治療中的應用，所述T細胞介導型自身免疫病例如是關節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、腎小球性腎炎、糖尿病和變應性變態(tài)反應。本發(fā)明進一步涉及了所述化合物用于抑制癌細胞生長，以及抑制慢病毒屬或皰疹病毒屬(Herpetoviridae)病毒生長的用途。此外，本發(fā)明涉及了所述化合物抑制癌細胞生長的用途。
2.背景技術免疫抑制劑。許多人體疾病的特征在于過度或不適當?shù)拿庖叻磻Ｔ谝浦仓?，免疫系統(tǒng)攻擊主要組織相容性復合體(MHC)—全異的供體組織，從而導致移植排斥。在變應性變態(tài)反應或炎癥中，免疫系統(tǒng)對其它無害的環(huán)境抗原過度敏感。在自身免疫病中，免疫系統(tǒng)攻擊正常的自體組織。在免疫缺陷性疾病如HIV感染和AIDS中，感染物侵蝕了宿主的免疫系統(tǒng)。迄今人們認為免疫抑制療法適合治療上述各種疾病(血液學評論(Blood reviews)1995；9117-133)。將環(huán)孢菌素A(CsA)的天然二級代謝產物、FK506和雷怕霉素開發(fā)成免疫抑制劑，并且通過發(fā)揮其在防止移植排斥(TIBS 1993；18334-338)和GVHD(Ann Hematol 1995；71301-306)中的作用使器官移植發(fā)生了革命性的巨變。然而，這些藥物在使用中存在嚴重的副作用，例如腎毒性、神經(jīng)毒性、肝細胞毒性、內分泌并發(fā)癥以及影響骨骼(新英格蘭醫(yī)學雜志(New Engl.J.Med)(1989)3211725-1738；Kahan BD等人；外科學(1985)97125)。因此，需要為臨床提供一類可有效免疫抑制但無上述副作用的新化合物。
抗癌藥。數(shù)十年腫瘤生物學研究的最大動力在于，期望能夠發(fā)現(xiàn)在細胞毒性水平有效對抗腫瘤細胞的治療性藥物，用于預防和治療癌癥。
惡性黑瘤的發(fā)病率正持續(xù)上升。通常，惡性黑瘤在美國是第5位發(fā)病率最高的癌癥。盡管早期黑瘤通過手術方式極易治愈，但是由于伴隨有較深的損害和/或遷移性疾病，患者的預后仍然不佳(Bezwoda，WR；癌癥治療評論(Cancer Treat Rev.)1997；23(1)17-34)。使用單一藥物作用的常規(guī)化療法具有較低的頻率和較短的反應有效期(癌癥治療評論1997，23(1)17-34；Mayo Clin Proc 1997；72367-371)。
遷移性腎細胞癌(RCC)可以高度耐受多種全身性療法，這已得到廣泛證實(Motzer RJ等人，癌癥中的常見問題，1997；21(4)185-232)。RCC在男子中的發(fā)生率約是女子的兩倍。由于不斷采用改進和高度復雜的診斷方法，如超聲波檢查法和計算機化斷層造影(CT)掃描術(Franklin JR等人，泌尿科腫瘤學討論會1996；14(2)208-215)，人們已能夠揭示出RCC的發(fā)生率正穩(wěn)定上升。子宮頸癌是發(fā)展中國家婦女最常見的惡性腫瘤(Morrow CP等人，細胞生物化學雜志1995；增刊2367-70)，在美國它也是第3位最常見的女性生殖道惡性腫瘤。(MillerBA等人，國家癌癥協(xié)會；NIH出版93-2789，1993)。
所用的后繼的技術改進，包括高劑量療法、處治規(guī)劃、新的同位素、新的影像技術以及新的醫(yī)療器械在臨床上均沒有對子宮頸癌產生可測的治愈效果(Morrow CP等人，細胞生物化學雜志1995增刊2361-70)。
由于神經(jīng)毒性和對化療藥物的耐藥性仍存在一些主要的導致人體癌癥治療失敗的臨床問題(抗癌藥物1995，6(3)369-383；Curr.Opin.Oncol.1997，9(1)79-87)，所從需要研制出新的副作用較少并且療效高的藥物。
抗病毒藥物。病毒和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用不僅復雜且引人關注，而且對于對感染結果作出判斷和制訂預防措施亦是關鍵的。抗病毒化療的目標是在不影響細胞DNA的情況下抑制病毒染色體組的復制。
在許多正在為治療皰疹病毒[單純皰疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)，水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，巨細胞病毒(CMV)，非洲淋巴細胞瘤病毒(EBV)]感染而開發(fā)的藥物中，只有10種藥物明顯能夠到達臨床開發(fā)的階段(Alrabiah FA & Sacks，SL；藥物1996；52(1)17-32)。盡管在治療單純皰疹腦炎(HSV-1)時可選擇無環(huán)尿苷，但死亡率和發(fā)病率仍然成問題(Skoeldenberg B；Scand.J.Infect.Dis.Suppl 1008-13，1996)。同樣的問題也存在于α干擾素(IFN-α)和β干擾素(IFN-β)。盡管干擾素類藥物具有顯著的抗病毒和免疫調節(jié)作用，并成為用于人體的抗病毒藥物，但它們的成功都受到劑量限制副作用的阻礙(Balkwill，F(xiàn)R，干擾素；柳葉刀1989；11060-1063)。HSV-2在發(fā)達國家中是最常見的生殖器潰瘍的感染原因。通常，在美國5個青年中就有1名感染有生殖器皰疹。在八十年代早期一些抗病毒藥物變得有效，它們可以減輕疾病的嚴重程度，但HSV感染是終生的，一旦被感染，沒有方法將其消除(Brugha，R.等人，Int.J.Epidemiol 1997；26298-709)。因此，極其需要開發(fā)出一種新的途徑和藥物來消滅HSV感染。
在美國，被1型人免疫缺損病毒(HIV-1)感染的個體的數(shù)量據(jù)估計為1-2百萬，世界上的發(fā)生率約為20百萬。到2000年時，估計會有3百萬以上的美國人將感染上HIV-1。
迄今為止，對HIV-1感染的治療一直停留在使用病毒逆轉錄酶的核苷抑制劑(RTI)上。盡管這些藥物起初時是有效的，但它們只具有一定程度的抗病毒活性，并且其治療效果受到耐藥性的出現(xiàn)以及劑量限制性毒性作用的制約(McDonald CK等人，Arch Intern Med1997；157(9)951-959)。雖然用核苷類似物RTI和蛋白酶抑制劑治療HIV構成了抗HIV療法的支柱，但未來將在現(xiàn)存種類的藥物中推出非核苷類RTI、免疫調節(jié)劑以及新藥(Hartman AF，Prim Care 1997；24(3)531-560)。雖然采用兩種、三種或多種藥物的聯(lián)合療法已成為關注的標準，但其附加毒性成為主要問題。
本發(fā)明的公開免疫抑制。本申請人的本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)并選擇了一組具有意外免疫抑制效果的槍刀藥素氧化物類似物。
因此，本發(fā)明一方面涉及了下式化合物或其可藥用鹽
其中R是(i)H、PO3-、含有1-12個碳原子及0-6個雙鍵的直鏈或支鏈的取代或未取代烷基、(CH2)n嗎啉其中n＝1-4、嗎啉代甲基苯基、鄰氨基苯基、鄰羥基苯基、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4，
其中R2為H、堿金屬鹽離子、堿土金屬鹽離子、NH4+、N+(R3)4，其中R3獨立地選自由H和具有1-4個碳原子的烷基組成的組；或(ii)COR1，其中R1選自H、(CH2)nCH3其中n＝1-6、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4并且R2如上述定義、(CH2)nN+(R3)4其中n＝1-4和(CH2)nSO3-其中n＝1-4。
本發(fā)明涉及含有在治療上有效免疫抑制量的式IV化合物的藥物組合物。
本發(fā)明涉及用于在需免疫治療的動物中引起免疫抑制的方法，該方法包括給所述動物施用藥物組合物，所述藥物組合物中含有在治療上有效免疫抑制量的槍刀藥素氧化物(在此稱為JO-4并如式I所示)或一種或多種式IV所示的化合物。
抗癌藥物。本申請人的發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)并選擇了一組具有意外抗癌效果的槍刀藥素氧化物類似物。具體而言，本發(fā)明涉及了一種抑制癌細胞或癌性腫瘤生長的方法，該方法包括給需抗癌或抗腫瘤治療的對象施用一種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的式IV化合物或其可藥用鹽
其中R是(i)H、PO3-、含有1-12個碳原子及0-6個雙鍵的直鏈或支鏈的取代或未取代烷基、(CH2)n嗎啉其中n＝1-4、嗎啉代甲基苯基、鄰氨基苯基、鄰羥基苯基、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4，其中R2為H、堿金屬鹽離子、堿土金屬鹽離子、NH4+、N+(R3)4，其中R3獨立地選自由H和具有1-4個碳原子的烷基組成的組；或(ii)COR1，其中R1選自H、(CH2)nCH3其中n＝0-6、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4并且R2如上述定義、(CH2)nN+(R3)4其中n＝1-4和(CH2)nSO3-其中n＝1-4。
本發(fā)明的一個方面涉及了具有式II的槍刀藥素氧化物(在此稱為JO-4A)的給藥方法
抗病毒藥。本申請人的發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)并選擇了一組具有意料外的有效抑制慢病毒屬或皰疹病毒屬病毒生長的槍刀藥素氧化物，其中分別包括HIV-1及HSV-1和HSV-2。具體而言，本發(fā)明涉及一種抑制病毒在給藥對象中生長的方法。該方法包括給需抗病毒治療的對象施用一種藥物組合物，該藥物組合物中含有治療有效量的式IV化合物或其可藥用鹽
其中R是(i)H、PO3-、含有1-12個碳原子及0-6個雙鍵的直鏈或支鏈的取代或未取代烷基、(CH2)n嗎啉其中n＝1-4、嗎啉代甲基苯基、鄰氨基苯基、鄰羥基苯基、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4，其中R2為H、堿金屬鹽離子、堿土金屬鹽離子、NH4+、N+(R3)4，其中R3獨立地選自由H和具有1-4個碳原子的烷基組成的組或(ii)COR1，其中R1選自H、(CH2)nCH3其中n＝0-6、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4并且R2如上述定義、(CH2)nN+(R3)4其中n＝1-4和(CH2)nSO3-其中n＝1-4。
另一方面，本發(fā)明提供一種治療方法，用于緩解慢病毒屬病毒(例如HIV-1)和皰疹病毒屬(HSV-1和HSV-2)病毒在患者中生長時的病理作用。該方法包括給所述對象施用至少一種如式IV所示的槍刀藥素氧化物。所述槍刀藥素氧化物是以足以抑制這些病毒生長的量對患者給藥，從而抑制所述的病理作用。
上面探討的本發(fā)明的特征和本發(fā)明的可變形式以及由此產生的優(yōu)越性將可以通過下文并結合有附圖的詳細描述而更易被理解。
附圖描述

圖1表示JO-4對人體雙向混合淋巴細胞反應的抑制作用。將從兩個個體獲得的PBMC在不同濃度JO-4存在的條件下共同培養(yǎng)5天。用3H-胸腺嘧啶核甙摻入法測定增殖作用，并且表示為CPM和相對于無JO-4的對照孔的抑制百分率。
圖2表示JO-4對由單向MLR產生的人T淋巴細胞介導型細胞溶解的抑制作用。在JO-4存在或不存在的條件下，從單向MLR生產5-7天的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。在培養(yǎng)結束時，收獲CTL并在4個小時的51C釋放分析試驗中測定對活化淋巴細胞的對抗作用，所述活化淋巴細胞在單向MLR中用作刺激劑。將結果表示為裂解單位(LU)和％抑制。
圖3表示JO-4對前-炎癥細胞因子合成的抑制作用。在24孔的微量滴定板中，在1.0μg/ml JO-4存在或不存在的條件下，用5μg/ml LPS將人PBMC培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束時，收集上清液并在IL-β、TNF-α和IL-6存在的條件下利用EIA測定。結果表示為相對于無藥物對照孔的抑制百分率和上清液中存在的細胞因子的量pg/ml。
圖4表示JO-4A對人體雙向混合淋巴細胞反應的抑制作用。將從兩個個體獲得的PBMC在不同濃度JO-4A存在的條件下共同培養(yǎng)5天。用3H-胸腺嘧啶核甙摻入法測定增殖作用并且將結果表示為平均CPM。
圖5表示JO-4對LPS誘發(fā)的鼠淋巴細胞增殖的體外抑制作用。在不存在或存在不同濃度JO-4的條件下與LPS(5μ/ml)一起培養(yǎng)小鼠脾細胞達48小時。利用3H胸腺嘧啶核甙摻入法來測定增殖作用并表示為ACPM。
圖6表示JO-4對PHA誘發(fā)的人外周血單核細胞(PBMC)增殖的體外抑制作用。在不存在或存在不同濃度JO-4的條件下與PHA(植物凝集素)(15μg/ml)一起將人PBMC培養(yǎng)4天。利用3H胸腺嘧啶核甙摻入法來測定增殖作用，并且表示為ACPM和對于空白對照孔(無藥物)的抑制百分率。
圖7表示JO-4對人PBMC的毒性。在不存在或存在不同濃度JO-4的條件下將人PBMC培養(yǎng)4天。在不同的時間間隔，利用臺盼藍不相容試驗來測定存活力，并且表示為相對于計數(shù)細胞總數(shù)的存活百分率。
圖8表示JO-4A對NK細胞(天然殺傷細胞)活性的體內作用。用不同濃度的JO-4A通過靜脈內(A)或口服(B)的給藥方式來處理小鼠。用YAC(酵母人工染色體)-1靶物在4小時的51Cr釋放試驗中測定脾細胞的NK機能。
圖9表示JO-4A對不同人體癌細胞的劑量依賴性細胞毒性。在不含有或含有不同濃度JO-4A的條件下將人子宮頸上皮癌、腎癌和惡性黑素瘤的細胞系培養(yǎng)72小時。用比色(MTT)分析法測定細胞毒性。
圖10表示JO-4A對來源于人體不同組織的正常細胞的劑量依賴型細胞毒性。在不含有或含有不同濃度JO-4A的條件下將正常人子宮頸外上皮細胞、外周血單核細胞、乳腺上皮細胞和臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)72小時。用比色(MTT)分析法測定細胞毒性。
圖11表示JO-4A對小鼠惡性黑素瘤(B16-F1)細胞系的劑量依賴性細胞毒性。在不含有或含有不同濃度JO-4A的條件下將B16-F1細胞培養(yǎng)72小時。用比色(MTT)分析法測定細胞毒性。
圖12A表示口服給藥JO-4A對C57BL/6(B6)小鼠中的小鼠惡性黑素瘤(B16-F1)體積的影響。B6小鼠經(jīng)皮下(s.c.)接受50000個活的B16-F1細胞。在腫瘤植入后第4天，試驗組的小鼠開始每天口服不同濃度的JO-4A。用微卡尺在第12天時測定腫瘤體積。
圖12B表示口服JO-4A對患有惡性黑素瘤(B16-F1)的B6小鼠存活率的影響。B6小鼠經(jīng)皮下(s.c.)接受50000個活的B16-F1細胞。在腫瘤植入后第4-20天中，試驗組的小鼠開始每天口服不同濃度的JO-4A。當未處理對照組的小鼠全部死亡時(第28天)計算出試驗組小鼠的存活百分比。
圖13表示口服JO-4A對患B16-F1黑素瘤的B6小鼠存活率的影響。B6小鼠經(jīng)皮下(s.c.)接受50000個活的B16-F1細胞。試驗組小鼠在第4至20天中每天口服JO-4A(2mg/Kg)。
圖14表示JO-4A與IFN-α的結合對于人惡性黑素瘤生長的體外作用。
圖15A表示JO-4A對經(jīng)培養(yǎng)的人外周血單核細胞(PBMC)中的HIV-1復制的抑制作用。用PHA活化人PBMC并用從患者中分離出的HIV-1感染。在不含有或含有不同濃度(0.0001μM-0.5μM)JO-4A的條件下將被感染的PBMC培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結束時，收集上清液并通過ELISA對存在的p24抗原進行測定。
圖15B表示JO-4A對經(jīng)培養(yǎng)的正常人PBMC的毒性試驗，用PHA將所述人PBMC活化3天。在不存在或存在不同濃度JO-4A(0.0001μM-0.5μM)的條件下，將活化的PBMC用3％IL-2培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結束時，利用臺盼藍不相容試驗來測定PBMC的存活力。
圖16A表示JO-4對單純皰疹-1(HSV-1)復制的抗病毒作用。利用Hybriwix探針系統(tǒng)測定JO-4對HSV-1的抗病毒作用，Hybriwix探針系統(tǒng)是得自Diagnostic Hybrids，Inc.(Athens，OH)的HSV抗病毒易感性試驗試劑盒。
圖16B表示JO-4對HSV-2復制的抗病毒作用。JO-4對HSV-2的抗病毒作用如在以上關于圖16A描述的方式下進行測定。
圖16C表示JO-4A對HSV-2復制的抗病毒作用。JO-4A對HSV-2的抗病毒作用如在以上關于圖16A描述的方式進行測定。
圖17A和17B表示JO-4和JO-4A分別對正常、未感染非洲綠猴腎細胞(CV-1)的毒性試驗結果。在不存在或存在不同濃度藥物時將CV-1細胞培養(yǎng)72小時。通過比色(MTT)分析法測定細胞毒性。
本發(fā)明的實施方式概述和定義本發(fā)明的實踐中采用了所屬領域專業(yè)人員所熟知的分子和細胞免疫學、細胞生物學、生物化學、有機及藥化合成技術。這些技術將在本文中作全面解釋。參見例如Abbas，A.K.等人1994年編輯的第二版《細胞和分子免疫》，W.B.Saunders Co.USA；Harlow，E. & D.Lane.《抗體學，試驗手冊》，Cold冷泉港實驗室(Spring Harbor Laboratory)，1988；Auchincol.Jr.，H. & Sachs，D.H.移植術和移植排異基礎免疫學，Paul，W.E.編輯，1993，Raven出版社出版；Silverman，Richard B.，《藥物設計的有機化學和藥物作用》Academic出版公司，NY(1992)；Smith，Michael B.，《有機合成》，McGraw Hill，Inc.，NY，(1994)。也可參見癌癥的化療原理和實踐，B.A.Chabner編輯，J.M.Collins，Phil，LippincottPubl.，1990；干擾素的作用機理，第II卷，L.M.Pfeffer編輯，CRC出版社出版，Boca Raton，F(xiàn)L 1987；干擾素原理和醫(yī)學用途，S.Baron，D.Coppenhauer，F(xiàn).Dianzani等人編輯，德克薩斯大學醫(yī)學分院，Galveston，1992；Robins，R.K.，Ojo-Amaize，E.A.，Cortam，H.B.等人，基因表達的核苷與核苷酸調控一種新的化療途徑，刊于酶調節(jié)進展，1989，第29卷；癌癥原理和腫瘤學；Vota.Jr.，V.T.，Hellman，S.，& Rosenberg，S.A.，編輯，Lippincott Co.Philadelphia，(1993)；化療原始資料，Perry.M.C.編輯，Williams & Wilkins Publ，Baltimore，1991；Silverman，RichardB.，《藥物設計和藥物作用的有機化學》，Academic Press，Inc.NY(1992)；Smith，Michael B.，《有機合成》，McGraw Hill，Inc.，NY(1994))。此外參見Bauer，D.J.，病毒疾病的特異治療，University ParkPress，Baltimore，MD，1977；Gawler，H.，用于測定抗病毒化合物對人巨細胞病毒DNA復制影響作用的核酸雜交，抗微生物藥化療，1983，24370-374；Collier，L.H. & Oxford，J.編輯的抗病毒治療的進展，Academic Press，倫敦，1980；Coligan，J.E.等人編輯的免疫學中的常見治療方案，1993；Robert B.Belshe編輯的人體病毒學手冊，第2版，1991；Silverman，Richard B.，《藥物設計的有機化學和藥物作用》，AcademicPress，Inc.NY(1992)；Smith，Michael B.，《有機合成》，McGraw Hill，Inc.，NY(1994))。
免疫抑制。本發(fā)明說明書中所用的下列術語如下文所定義。
對于本發(fā)明的目的，術語“免疫抑制治療”是指一種預防和控制疾病和綜合征的途徑，它需要治療性地抑制淋巴細胞和免疫細胞。所述疾病和綜合征包括(但不限于)移植物抗宿主病(GVHD)，自身免疫病，如糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、腎小球性腎炎和變應性變態(tài)反應。應懂得，通常所用的免疫抑制方法包括給需此治療的動物施用治療有效量的免疫抑制劑(例如環(huán)孢菌素A、FK506)，或在此例舉和要求保護的組合物和方法，從而抑制T細胞活性或T細胞反應。
術語“淋巴細胞和免疫細胞”是指介導特異性免疫反應的細胞。此處用該術語表示T淋巴細胞，詳細可參見Abbas等人的描述。
“天然殺傷細胞”或“NK細胞”是一般為粒狀形態(tài)的非T、非B淋巴細胞。NK細胞在對病毒和其他胞內病原體以及抗體依賴型細胞介導的細胞毒性(ADCC)的先天免疫中很重要。NK細胞在很大程度上是移植物抗宿主疾病(GVHD)的原因(Ferrara，J.L.M.，等人(1989)移植4750-54；Ghayur，T等人(1987)移植44261-267；Ghayur，T.，等人(1988)移植45586-590。正如下列實施例所證實的，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物和方法抑制了NK細胞的體內活性，還發(fā)現(xiàn)其適用于防止或克服需此治療的動物中的GVHD。
術語“移植”通常是指將從一個個體中取出的細胞、組織或器官(稱作移植物)放置在不同的、遺傳相異的受體中。提供移植物的個體稱作供體，接受移植物的個體稱作受體或宿主。移植可引起特異性免疫反應，這種免疫反應被稱作排異作用，它會損壞移植物。移植的組織包括固體器官，如肝臟、心臟和腎臟；和其他組織，如皮膚和骨髓。體內的排異作用是由T細胞介導的。通過給受體(宿主)施用治療有效量的化合物如環(huán)孢菌素A或FK506以及此處所例舉的組合物，可以免疫抑制受體(宿主)，從而防止或治療的排異作用。絕大多數(shù)免疫抑制針對的是T細胞反應，這些免疫抑制采用的是特異性免疫抑制劑，但與本發(fā)明組合物不是不相似。此外，對供體中的NK細胞機能進行免疫抑制可在疾病如移植物抗宿主(GVHD)的治療中發(fā)揮重要的治療作用。因此，需要對移植供體進行預備性免疫抑制，這可在供體捐獻移植物前通過給其施用治療有效量的免疫抑制劑，從而防止受體體內的移植物抗宿主。
術語“動物”是指人體以及其他動物。
在此所用的術語“JO-4”是指雙環(huán)[9，3，1]十五烷雙萜類化合物，如在Z.Naturforsc 37c558-561(1982)中和在《雜環(huán)》202125-2128(1983)中所述，在這些文獻中將這種化合物命名為“槍刀藥素氧化物”，JO-4的化學結構如式I所示。
應懂得，式IV所示的化合物屬于JO-4A的前藥。就式IV而言，JO-4A衍生自R為H時的JO-4。JO-4A的結構如式II所示
此處所用的術語“前藥”是指不具有藥理學作用的化合物，它可通過代謝轉化作用轉變成一種活性藥物。(Silverman，Richard B.，藥物設計的有機化學，Academic Press，Inc.NY(1992))。在藥物設計中有許多理由使用前藥策略，其中最常見的理由是克服與化合物有關的問題，如溶解度、吸收作用和分布、位點特異性、不穩(wěn)定性、緩釋、毒性、利用度較差以及與制劑有關的問題?？色@得指導無需進行大量實驗就能判斷藥物組合物中的化合物如何到達靶位以發(fā)揮其作用，并且如何在作用位點獲得免疫抑制所需的治療有效量的文獻(Harnden，M.R.等人，醫(yī)學和化學雜志321738-1743(1989)；Lake-Bakaar，D.M.，等人，抗微生物藥和化療33110-112(1989)；Baker，D.C.等人，醫(yī)學化學211218-1221(1978)；Hussain，M.A.等人，藥物科學雜志，76356-358(1987)；Varia，S.A.等人，藥物科學雜志731068-1073(1984))。
多數(shù)含有羥基或羧酸官能團的常見藥物的前藥形式是酯。利用所屬領域專業(yè)人員的知識，可以通過改變化合物的結構來改進其藥物動力學性質，從而將其轉化成適于動物或人體治療性給藥的有效藥物。因此，所要求保護的前藥JO-4A的醫(yī)藥活性(即引起免疫抑制)的原理也就是JO-4本身作為天然產物是一種有效的免疫抑制劑，在存在血清酯酶的體內環(huán)境中JO-4也是JO-4A的前藥，而且，在體外環(huán)境中若培養(yǎng)基含有附加血清(這是最常見的情況)則JO-4同樣是JO-4A的前藥。免疫抑制劑的優(yōu)選實施方案是代謝產物JO-4A，它是游離的JO-4的醇類衍生物。JO-4充當一種適合傳遞JO-4A的酯類前藥形式，在將JO-4對細胞或動物給藥后，JO-4A在一定時間后生成。以同樣的方式，許多JO-4A的酯類前藥也可以用于傳遞JO-4A。所述前藥形式及其制備方法是所屬領域熟知的，如上所引用的文獻。已知這些前藥在與動物和人體血清中常見的酯酶接觸時生成母體藥物。應懂得，在此要求保護的JO-4A的前藥生成了JO-4A，并且就誘發(fā)免疫抑制作用來說，其具有等于或強于天然產物JO-4的活性。
在此所用的術語“激動劑”是指能夠引起與式IV所示化合物相同反應的物質(即在需此治療的動物中誘發(fā)免疫抑制)。式IV化合物的激動劑包括但不限于JO-4A的前藥，所述前藥如式IV所示。
所要求保護的化合物的改性形式，即前藥和/或所要求保護的化合物的激動劑，在動物中具有引起免疫抑制的能力，或抑制動物體內癌癥生長的能力，或抑制需此治療的動物中的慢病毒屬和皰疹病毒屬病毒生長的能力，用于判斷或篩選上述能力的方法是已知的。
本發(fā)明所述的方法涉及采用式IV化合物以及式I化合物(JO-4，即槍刀藥素氧化物)的免疫抑制療法。本發(fā)明的方法具體涉及了給需此治療的動物施用治療有效量的式I或IV化合物。所述方法的實施方案涉及將式I或IV化合物與藥物載體或稀釋劑施用于動物的給藥。
本發(fā)明所述方法尋找到了在抑制動物移植物排異中的用途，通過如下所述的單向和雙向混合淋巴細胞反應(MLR)試驗說明了JO-4或JO-4A對細胞免疫作用的影響。因此，本發(fā)明所述方法可有效抑制免疫細胞或淋巴細胞的形成或增殖，由此適于治療自身免疫疾病，抑制對移植物的排異作用，所述移植物例如是器官移植物，如皮膚、骨髓、腎臟、肝臟和心臟移植物。JO-4或JO-4A的作用在下列試驗中得到確定。
如圖1-8所示，本發(fā)明的化合物及方法發(fā)現(xiàn)了在治療動物自身免疫病中的用途。應懂得，T細胞的免疫抑制劑如環(huán)孢菌素A(Forsell，T等人，J.Urol，1996，51591-3；Yocum，D-E.等人，Rheum.Dis.Clin.North.Am.，1995，3835-44)或tacrolimus(Ketel，B.L.，等人，Transplant.Proc.，1996，2899)抑制了免疫反應，并且由此抑制或緩解自身免疫性疾病。已知T細胞及其產物(細胞因子)參與體內自身免疫反應的產生。
顯然，對于上述的用途，所述治療有效量或劑量是不同的，這取決于所用的化合物、給藥方式和預期的治療。但是，以約1mg-約600mg/kg動物體重的日劑量口服給藥時將得到滿意的結果，所述口服給藥的日劑量一般是每天分1-4次或以緩釋形式給藥。若通過注射給藥，以約1mg-約200mg/kg動物體重的日劑量給藥時將得到滿意的結果，所述注射給藥的日劑量一般是每天分1-4次或以緩釋形式給藥。對于較大型的哺乳動物，全天劑量可以在約5mg-約500mg的范圍內，適于口服給藥的劑型含有約5mg-約500mg的所述化合物以及與之相混合或結合的固體或液體藥物載體或稀釋劑。用于測定本發(fā)明化合物的治療有效量的方法是所屬領域技術人員已知的。這些方法包括分析藥物在免疫抑制療法中用于引起免疫抑制、抑制淋巴細胞和免疫細胞的形成、對自身免疫疾病的治療以及抑制動物移植物排異或其它適應癥的藥學/藥物動力學參數(shù)(移植醫(yī)學的最新發(fā)展，第一卷新的免疫抑制藥D.Przepiorka & H.Sollinger編輯，Physicians & Scientists Pub.Co.，Glenview，IL，1994)。
本發(fā)明所述方法包括施用藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的式I、II或IV的化合物，所述化合物可以是純凈形式，或是與可藥用載體或稀釋劑組合的可藥用的粗品濃縮物。所述組合物通常含有1％(重量)以上的式I、II或IV化合物，并且可以通過常規(guī)技術制備成常規(guī)劑型，例如膠囊、片劑、栓劑、可分散粉末、糖漿劑、酏劑、混懸劑或用于腸道或腸胃外給藥的溶液。適用的藥用稀釋劑或載體包括，例如水，醇，天然或硬化油或蠟，碳酸鈣和碳酸鈉，磷酸鈣，高嶺土，滑石和乳糖以及適當?shù)姆栏瘎┤鐚αu基苯甲酸乙酯，懸浮劑如甲基纖維素，黃芪膠和藻酸鈉，濕潤劑如卵磷脂，聚氧化亞乙基硬脂酸酯和聚氧化亞乙基脫水山梨糖醇單油酸酯，造粒和崩解劑如淀粉和藻酸，粘合劑如淀粉、明膠和阿拉伯膠，以及潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石，從而提供美觀和可口的藥物制劑?？梢岳贸Ｒ?guī)技術對片劑形式的組合物進行包衣，以延緩片劑的崩解和活性組分在胃腸道內的吸收，由此提供長時間的緩釋作用。其它所屬領域專業(yè)人員已知的用于延緩崩解或將活性組分延時或定時給藥的化合物和方法也適合配制本發(fā)明方法所用的活性成分。例如，式I、II或IV的化合物可以與脂質體或其它緩釋載體物質結合，以保護化合物不發(fā)生降解直至它們到達其靶位，和/或使所述化合物易于透過組織屏障進行運動。
從易于給藥的角度考慮，優(yōu)選的組合物是固體組合物，特別是填充有固體的明膠膠囊或片劑。
還應懂得，本發(fā)明所述方法的另一個實施方案包括將一種或多種藥物以不同的給藥方案(包括預防方案)合用，同時本發(fā)明所述的方法是將含有式I、II或IV的化合物的藥物組合物施用給需免疫抑制治療的動物。聯(lián)合用藥方案和測定其功效的方法(包括治療藥物的監(jiān)測)均是已知的(Lazarus，H.M.等人，血液評論，1995，9117-133；Aggarwal，B.B.等人編輯，1995，人細胞因子其在疾病和治療中的作用，BlackwellScience，Inc.，Cambridge，MA；Ambrus，J.L.等人，1993，外科學、婦科學和產科學，176588)。適用于免疫抑制療法并且可以與本發(fā)明所述方法中所用的式I、II或IV化合物聯(lián)合給藥的免疫抑制劑或藥物的例子包括(但不限于)皮質類固醇、氨甲蝶呤、環(huán)孢菌素、雷怕霉素、FK506(PrografTM)、抗胸腺細胞球蛋白、單克隆抗體制劑、多克隆抗體制劑、白介素-1拮抗劑、白介素-2拮抗劑、TNF拮抗劑、免疫毒素、沙利度胺、干擾素、一氧化氮、咪唑立賓、去氧精胍菌素、來氟米物和抗粘附分子。
應進一步懂得，本發(fā)明涉及一種含有治療有效量的一種或多種式I、II或IV化合物以及一種或多種適用于免疫抑制療法的免疫抑制劑或藥物的藥物組合物，所述免疫抑制劑或藥物選自皮質類固醇、氨甲蝶呤、環(huán)孢菌素、雷怕霉素、FK506(PrografTM)、抗胸腺細胞球蛋白、單克隆抗體制劑、多克隆抗體制劑、白介素-1拮抗劑、白介素-2拮抗劑、TNF拮抗劑、免疫毒素、沙利度胺、干擾素、一氧化氮、咪唑立賓、去氧精胍菌素、來氟米物和抗粘附分子。用于確定本發(fā)明藥物組合物中的式I、II或IV化合物的治療有效量的方法，以及如何選擇與本發(fā)明式I、II或IV化合物合用的適于免疫抑制療法的免疫抑制劑或藥物的治療有效量的方法均是已知的。(Lazarus，H.M.等人，血液評論，1995，9117-133；Aggarwal，B.B.等人編輯，1995，人細胞因子其在疾病和治療中的作用，Blackwell Science，Inc.，Cambridge，MA；Ambrus，J.L.等人，1993，外科學、婦科學和產科學，176588)。
抗癌。本發(fā)明說明書中的下列術語如下文所定義。
盡管“腫瘤”簡單地含義是“腫大”，該術語通常等于“贅生物”，其字面含義是“新生物”。贅生物是一種異常的組織塊，其在致癌物去除后持續(xù)增殖，其表觀開始變化。贅生物或腫瘤存在兩種類型，良性和惡性。所有惡性腫瘤通常被稱作“癌”。近乎所有良性腫瘤均是包在莢膜內的。與此相反，癌性腫瘤幾乎不可能包在莢膜內，而且通過浸潤破壞性生長侵入到鄰近組織。在不連續(xù)位點植入腫瘤細胞可隨后發(fā)生侵入性生長，同時原發(fā)腫瘤經(jīng)?？梢酝ㄟ^淋巴和/或血源性途徑使癌細胞擴散。這種過程稱作“遷移”，腫瘤并不等同于惡性，因為盡管許多癌癥可以遷移，但良性腫瘤絕不會遷移(刊于疾病的病理學基礎，第4版，PhiladelphiaWB Saunders，1989；239-305)。應懂得，本發(fā)明所述的抑制癌細胞或癌性腫瘤生長的方法包括，抑制癌細胞的侵入性生長，同時抑制由遷移癌細胞產生的遷移性腫瘤生長。
術語“對象”是指人體或其它動物。
在此所有的術語“JO-4”是指雙環(huán)[9，3，1]十五烷雙萜類化合物，如在Z.Naturforsc 37c558-561(1982)中和在《雜環(huán)》202125-2128(1983)中所述，在這些文獻中將這種化合物命名為“槍刀藥素氧化物”，JO-4的化學結構如式I所示
應懂得，式IV所示的化合物屬于JO-4A的前藥。就式IV而言，JO-4A衍生自R為H時的JO-4。JO-4A的結構如式II所示
此處所用的術語“前藥”是指不具有藥理學作用的化合物，它可通過代謝轉化作用轉變成一種活性藥物。(Silverman，Richard B.，藥物設計的有機化學，Acad.Press，Inc.1992)。在藥物設計中有許多理由使用前藥策略，其中最常見的理由是克服與化合物有關的問題，如溶解度、吸收作用和分布、位點特異性、不穩(wěn)定性、緩釋、毒性、利用度較差以及與制劑有關的問題。指導如何判斷藥物組合物中的化合物到達靶位發(fā)揮其作用，如何在作用位點獲得抑制癌性腫瘤生長的治療有效量的文獻是可得到的，無需進行大量的實驗(Brunda，M.J.Wright，R.B.Luistro，L.等人，采用白介素-1α和干擾素-α的聯(lián)合療法提高對小鼠的抗腫瘤功效，免疫學雜志，(1994)15233-241；Bezwoda，W.R.，對干擾素類作用具有特定參比意義的散播性黑素瘤治療，Vinca Alkaloids &Tamoxifen，癌癥治療評論，(1997)2317-34；Wedge，S.R.，Porteous，J.K.，Newlands，E.S.，單劑量和多劑量O6-芐基鳥嘌呤/temozolomide混合物給藥的作用一個對人黑素瘤異種移植模型的評估，癌癥的化療和藥理學，(1997)40266-272)。
多數(shù)含有羥基或羧酸官能團的常見藥物的前藥形式是酯。利用所屬領域專業(yè)人員的知識，可以通過改變化合物的結構來改進其藥物動力學性質，從而將其轉化成適于動物或人體治療性給藥的有效藥物。在存在血清酯酶的體內環(huán)境中JO-4是JO-4A的前藥，而且，在體外環(huán)境中若培養(yǎng)基含有附加血清(這是最常見的情況)則JO-4同樣也是JO-4A的前藥。本發(fā)明所述方法中用于抑制癌性腫瘤生長的槍刀藥素氧化物的優(yōu)選例子是代謝產物JO-4A，它是游離的JO-4的醇類衍生物。JO-4充當一種適合傳遞JO-4A的酯類前藥形式，在將JO-4對細胞或動物給藥后，JO-4A在一段時間后生成。以相同的方式，許多JO-4A的酯類前藥可用于JO-4A的傳遞。所述前藥形式及其制備方法是所屬領域熟知的，如上所引用的文獻。已知這些前藥適合在與動物和人體血清中常見的酯酶接觸時生成母體藥物。應懂得，在所要求保護的JO-4A的方法中可用的生成了JO-4A，并且就抑制癌性腫瘤的生長來說，其是有活性的。
在此所用的術語“激動劑”是指能夠引起與式IV所示化合物相同反應的物質(即在需此治療的動物中抑制癌性腫瘤的生長)。式IV化合物的激動劑包括(但不限于)JO-4A的前藥，所述前藥如式IV所示。
槍刀藥素氧化物的改性形式，即所要求保護的前藥和/或其激動劑，在需此治療的動物中具有抑制癌性腫瘤生長的能力，用于判斷或篩選這種能力的方法是已知的(Stinson，S.，Alley，M.C.Kopp，W.C.等人，在定向抗癌藥物篩選中使用的人腫瘤細胞系的形態(tài)學和免疫細胞化學特性，抗癌研究(991)121035-1054)。
本發(fā)明所述方法涉及了抗癌或抗腫瘤療法，即抑制癌細胞生長，由此，當癌細胞生長造成一種或多種腫瘤發(fā)生時，可利用式IV化合物，特別是式II化合物(JO-4A，即槍刀藥素氧化物)抑制癌性腫瘤的生長。特別是，本發(fā)明所述方法涉及了對需此治療的對象施用治療有效量的至少一種式IV所示的槍刀藥素氧化物類化合物，特別是式II所示的化合物(JO-4A)。所述方法的實施方案涉及了用式IV或具體而言是式II化合物以及可藥用載體或稀釋劑對所述對象進行給藥。
本發(fā)明所述方法尋找到了在體外抑制小鼠癌性細胞生長(如圖9所述)和癌細胞或癌性腫瘤生長(如圖12和13所示)的用途。因此，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述方法對癌性細胞或癌性腫瘤具有細胞毒性和生長抑制作用，并且在同樣的劑量水平時對正常細胞相對無毒性作用(圖10)，這種不同的毒性作用似乎抑制了癌性腫瘤生長，并且由此適合于對不同類型的癌癥進行抗腫瘤治療(圖9)。JO-4A的作用通過下列試驗加以證實，如圖9-13所示，其表明本發(fā)明所述方法可有效治療需抗癌治療的對象。
顯然，對于上述用途，治療有效量或劑量取決于所用的化合物、給藥方式和所需的治療。但是，通常，以約0.01mg-約1000mg/kg動物體重的日劑量口服給藥時將得到滿意的結果，所述口服給藥的日劑量一般是每天分1-4次或以緩釋形式給藥。若通過注射給藥，以約0.01mg-約200mg/kg動物體重的日劑量給藥時將得到滿意的結果，所述注射給藥的日劑量一般是每天分1-4次或以緩釋形式給藥。對于較大型的哺乳動物，全天劑量可以在約1mg-約1000mg的范圍內，適于口服給藥的劑型含有約1mg-約1000mg的所述化合物以及與之混合的相關的固體或液體藥物載體或稀釋劑。用于確定本發(fā)明方法中所用化合物的治療有效劑量的方法在本領域是已知的。所述方法包括了對抗癌或抗腫瘤療法(即抑制癌性腫瘤生長)中藥理學/藥物動力學參數(shù)的分析(Wedge.S.R.，Porteus，J.K.，Newlands，E.S.，癌癥的化療和藥理學，(1997)40266-272；Legha，S.S，腫瘤學研討(1997)24S4-24-31；Motzer，R.J.，Vogelzang，N.J.腎細胞癌的化療，Raghaven，D.，Scher，H.I.，Leibel，S.A.，等人泌尿生殖腫瘤學的原理和實踐，Lippincott-Raven Publ.，Philadephia，885-96，1997；Bloom，H.J.，在遷移性腎癌治療中的醋酸甲羥孕酮(Provera)，英國癌癥雜志(1971)25250-65)。
本發(fā)明所述方法包括施用一種藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的一種或多種式IV的化合物，特別是式II化合物(JO-4A)以及可藥用載體或稀釋劑，所述化合物可以是純凈形式，或是可藥用的粗品濃縮物。所述組合物通常含有1％(重量)以下，優(yōu)選約0.2％(重量)的式IV化合物，特別是式II化合物，并且可以通過常規(guī)技術制備成常規(guī)劑型，例如膠囊、片劑、栓劑、可分散粉末、糖漿劑、酏劑、混懸劑或用于腸道或腸胃外給藥的溶液。適用的藥用稀釋劑或載體包括，例如水、醇、天然或硬化油或蠟、碳酸鈣和碳酸鈉、磷酸鈣、高嶺土、滑石和乳糖以及適當?shù)姆栏瘎┤鐚αu基苯甲酸乙酯，懸浮劑如甲基纖維素、黃芪膠和藻酸鈉，濕潤劑如卵磷脂、聚氧化亞乙基硬脂酸酯和聚氧化亞乙基脫水山梨糖醇單油酸酯，造粒和崩解劑如淀粉和藻酸，粘合劑如淀粉、明膠和阿拉伯膠，以及潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石，從而提供美觀和可口的藥物制劑。可以利用常規(guī)技術對片劑形式的組合物進行包衣，以延緩片劑的崩解和活性組分在胃腸道內的吸收，由此提供長時間的緩釋作用。其它所屬領域專業(yè)人員已知的用于延緩崩解或將活性組分延時或定時給藥的化合物和方法也適合用來配制本發(fā)明方法所用的活性成分。例如，式IV化合物，特別是式II化合物可以與脂質體或其它緩釋載體物質結合，以保護化合物在它們到達其靶位前不發(fā)生降解，和/或使所述化合物易于透過組織屏障進行運動。
從易于給藥的角度考慮，優(yōu)選的組合物是固體組合物，特別是填充有固體的明膠膠囊或片劑。
還應懂得，本發(fā)明所述方法的另一個實施方案包括將一種或多種藥物以不同的給藥方案(包括預防性方案)合用，同時本發(fā)明所述的方法是將含有式IV，特別是式II化合物的藥物組合物施用給需要抑制癌性腫瘤生長的治療對象。聯(lián)合用藥的方案和測定其功效的方法(包括治療藥物的監(jiān)測)均是本領域已知的。適合在治療中抑制癌性腫瘤生長并與本發(fā)明方法所用的式IV，特別是式II化合物聯(lián)合給藥的抗癌藥或其他藥物的例子包括(但不限于)放療藥、干擾素-α、白介素-1、白介素-2、長春花生物堿、三苯氧胺、紫杉醇、deearbazine、生物反應調節(jié)劑、鉑類化合物、vinvlatine、博來霉素、dexverapaimil、nifedioine、雙嘧達莫、卡氮芥、順鉑。
應進一步懂得，本發(fā)明涉及一種抑制癌性腫瘤生長的方法，該方法包括將含有治療有效量的一種或多種式IV和/或式II(JO-4A)化合物以及抗癌藥或一種或多種適于抑制或預防癌性腫瘤生長的藥物的藥物組合物施用給需要抗癌治療的對象，所述抗癌藥物可選自放療藥、干擾素-α、白介素-1、白介素-2、長春花生物堿、三苯氧胺、紫杉醇、decarbazine、生物反應調節(jié)劑、鉑類化合物、vinvlatine、博來霉素、dexverapaimil、nifedioine、雙嘧達莫、卡氮芥、順鉑。用于確定本發(fā)明藥物組合物中的式IV或II化合物的治療有效量的方法，以及如何選擇抗癌藥或與本發(fā)明藥物組合物中式IV或II化合物合用的適于抗癌治療的藥物的方法均是本領域已知的(William S.D.編輯，癌癥中的常見問題，第21卷，第4期，1997；第186-221頁Bezwoda，W.R.，癌癥治療評論，1997，2317-34)。
抗病毒。本發(fā)明說明書中的下列術語如下文所定義。
在此所用術語“抑制生長”是針對對人體或其他哺乳動物有病理學作用的慢病毒屬和皰疹屬病毒而言的。例如，對于慢病毒屬的HIV，“抑制生長”是指抑制該病毒的生產，這是通過病毒培養(yǎng)物中HIVp24減少的水平來測定的。抑制HIV的生長將使病毒量減少，由此可減輕HIV感染的病理作用。應懂得，此處所用“刺激生長”是指有效減少所述DNA或RNA病毒的病毒含量，從而改善DNA或RNA病毒所致感染的病理作用。
可以用慢病毒HIV的生活周期及其在宿主中的作用來說明此處所用術語“病理作用”。可以理解，慢病毒屬病毒包括HIV-1、HIV-2，和HTIV，本發(fā)明所述方法涉及了刺激HIV-1，HIV-2或HTLV在對象中的生長。1型人免疫缺損病毒(HIV-1)作為一種反轉錄病毒是一種單鏈RNA，其染色體組被包封在蛋白質核芯顆粒內并包裹在脂質被膜中，在該被膜中鑲嵌有外克(被膜)蛋白質gp120。T-輔助(CD4+)的淋巴細胞和單核細胞的感染始于將病毒粒子吸附到細胞表面，這是由病毒被膜蛋白與CD4分子在細胞表面上的特異性反應介導的。病毒侵入后，病毒脫殼并復制，單鏈RNA染色體組在病毒酶-反轉錄酶(RT)的作用下反轉錄成雙鏈DNA染色體組。在HIV-1染色體轉錄和轉譯后其整合到宿主DNA中(Arch.Intern，Med，1997，157951-959)HIV的病理性/致細胞病的作用包括細胞融合以及形成合胞體并繼發(fā)細胞死亡(Belshe，R.B.編輯，人病毒學手冊，第2版，1991)，從而導致免疫缺損的惡化。AIDS(獲得性免疫缺損綜合征)的前期包括淋巴結綜合征以及全身綜合征的出現(xiàn)(AIDS相關綜合征或ARC)。淋巴結病綜合征被定義為由HIV感染以外的其他可識別誘因導致的淋巴結肥大。隨機性感染包括由許多普遍存在的寄生物導致的疾病，這些寄生蟲對有免疫能力的人體無害，而只有在免疫缺損存在的條件下才可能產生致病性。較高百分比的HIV感染病患顯示出神經(jīng)病學變化，這無法用隨機感染或腫瘤來解釋。經(jīng)常還可以觀察到皮膚病學癥狀。帶狀皰疹是較早的臨床表現(xiàn)。
皰疹屬病毒具有若干成員，其是廣泛散播的人體病原體。其中包括單純皰疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)和帶狀皰疹病毒。應理解，本發(fā)明所述方法涉及了對皰疹屬病毒生長的抑制作用，其中包括HSV-1或-2、CMV和帶狀皰疹病毒。迄今已在分子水平對1型和2型HSV進行了詳細的研究，這是因為它們復制周期快并且在組織培養(yǎng)物中產率高(Belshe，R.B.編輯，人病毒學手冊，第2版，1991)。對于HSV，術語“刺激生長”是指抑制病毒的復制周期，減少了病毒生成率或生產率。復制周期包括附著、侵入、脫殼、早期轉錄、DNA復制、后期轉錄以及病毒裝配。當細胞被感染時復制就產生了病理作用。HSV感染從兩個水平改變了細胞結構，換言之，改變了胞內結構以及細胞的相互作用。病毒蛋白質抑制了細胞蛋白質和DNA的合成。感染期間，染色體片段和殘余物重新位于核膜的內表面上，由此清除了病毒復制所需的核心。在另一水平，細胞間的相互作用由于HSV的感染而改變，HSV感染的影響方式是通過病毒株或細胞型，或兩者兼具。圓形細胞聚集程度和細胞融合程度的改變表明了這一點。用不同HSV的變型感染的培養(yǎng)細胞經(jīng)常表現(xiàn)出已改變了的細胞-細胞關聯(lián)，同時合胞體形成的凝塊增加。
1型HSV的病理作用可引起單純皰疹腦炎(HSE)，這是具有高死亡率并且幸存者中死亡率很高的威脅生命的疾病。急性病灶、壞死性腦炎包括腦部炎癥和帶有瘀斑的腫大，其會造成大量出血，這種疾病是HSE病理學的構成特征(Scand.J.Infect，Dis Suppl，1008-13，1996)。HSV-2的病理學作用在發(fā)達國家中引起生殖器潰瘍。存在于所有人群中的皰疹病毒包括單純皰疹病毒，帶狀皰疹病毒，EBV，CMV和人皰疹病毒-6、7和8。
在此所用的術語“改善”、“減緩”、“減輕”是指減弱或減少或使其更耐受。
術語“對象”是指人體或其它動物。
此處所用的術語“前藥”是指不具有藥理學作用的化合物，它可通過代謝轉化作用轉變成一種活性藥物。(Silverman，Richard B.，藥物設計的有機化學，Acad.Press，Inc.1992)。在藥物設計中有許多理由使用前藥策略，其中最常見的理由是克服與化合物有關的問題，如溶解度、吸收作用和分布、位點特異性、不穩(wěn)定性、緩釋、毒性、利用度較差以及與制劑有關的問題。指導如何判斷藥物組合物中的化合物到達靶位發(fā)揮其作用，如何在作用位點分別獲得抑制病理性RNA或DNA病毒(包括HIV或HSV)生長的治療有效量的文獻是可得到的，無需進行大量的實驗。(McDonald，C.K.，Kuritzkes，D.R.，1型人免疫缺損病毒蛋白質酶抑制劑，Arch.Intern.Med.，，1997 157951-959；Klagstaff，A.J.，F(xiàn)aulds，D.，Goa，K.L.無環(huán)鳥苷對其抗病毒活性、藥物動力學性質和治療功效的重新估價，藥物，1994，47(1)153-205；Hayashi，K.，等人，倍半萜和tiptofordin的抗病毒活性的特性，抗微生物和化療雜志，1996，37759-768)。
多數(shù)含有羥基或羧酸官能團的常見藥物的前藥形式是酯。利用所屬領域專業(yè)人員的知識，可以通過改變化合物的結構來改進其藥物動力學性質，從而將其轉化成適于動物或人體治療性給藥的有效藥物。在存在血清酯酶的體內環(huán)境中JO-4是JO-4A的前藥，而且，在體外環(huán)境中若培養(yǎng)基含有附加血清(這是最常見的情況)則JO-4同樣也是JO-4A的前藥。本發(fā)明所述方法中用于抑制所述對象體內HIV或HSV生長的槍刀藥素氧化物的優(yōu)選例子是代謝產物JO-4A，它是游離的JO-4的醇類衍生物。JO-4充當一種適合傳遞JO-4A的酯類前藥形式，在將JO-4對細胞或動物給藥后，JO-4A在一段時間后生成。以相同的方式，許多JO-4A的酯類前藥可用于JO-4A的傳遞。所述前藥形式及其制備方法是所屬領域熟知的，如上所引用的文獻。已知這些前藥適合在與動物和人體血清中常見的酯酶接觸時生成母體藥物。應懂得，在所要求保護方法中可用的JO-4A的前藥生成了JO-4A，并且就抑制HIV或HSV的生長來說，它是有活性的。
在此所用的術語“激動劑”是指能夠引起與式IV所示化合物相同反應的物質(即在需此治療的對象中抑制HIV或HSV的生長)。式IV化合物的激動劑包括(但不限于)JO-4A的前藥，所述前藥如式IV所示。
所述槍刀藥素氧化物的改性形式，即所要求保護的化合物的前藥和/或其激動劑，在需此治療的對象中具有抑制HIV或HSV生長的能力，用于判斷或篩選這種能力的方法是已知的(Belshe，R.B.編輯，人體病毒學手冊第2版1991)。
本發(fā)明所述方法涉及了利用式IV，特別是式II(JO-4A)化合物的抗病毒療法，即抑制慢病毒屬或皰疹病毒屬病毒生長。本發(fā)明所述的方法包括給需此治療的對象施用治療有效量的至少一種式IV的槍刀藥素氧化物。本發(fā)明所述方法中優(yōu)選采用的槍刀藥素氧化物是JO-4(式II)和JO-4A(式II)。本發(fā)明所述方法另一方面包括治療一對象以分別改善由于慢病毒屬或皰疹病毒屬病毒(如HIV或HSV)生長造成的病理作用。HIV和HSV的病理作用是該領域中熟知的，在此將作描述。應懂得，抑制對象中HIV或HSV的生長可以改善與這些感染有關的病理，正如文獻中所公開的(Belshe，R.B.編輯，人體病毒學手冊第2版1991)。
本發(fā)明所述方法的一個實施方案包括將式IV化合物以及藥物載體或稀釋劑施用給所述對象。
如下列實施例詳細描述那樣，將JO-4A施用給受HIV-1感染的PBMC可以體外抑制HIV-1的生長(如圖15A和15B所示)。以相同的劑量水平給藥時，JO-4A對PBMC無毒(如圖15B所示)。圖16C說明了JO-4A對HSV-2生長的抑制作用。
顯然，對于上述在感染了慢病毒屬或皰疹病毒屬病毒(分別例如HIV或HSV)對象中的用途，治療有效量或劑量取決于所用的化合物、給藥方式和所需的治療。但是，通常，以約0.001mg-約1000mg/kg動物體重的日劑量口服給藥或靜脈內給藥時將得到滿意的結果，所述日劑量一般是每天分1-4次或以緩釋形式給藥。若通過注射給藥，以約0.001mg-約200mg/kg動物體重，優(yōu)選約50mg-約200mg/kg體重的日劑量給藥時將得到滿意的結果，所述注射給藥的日劑量一般是每天分1-4次或以緩釋形式給藥。對于較大型的哺乳動物，全天劑量可以在約0.00amg-約200mg的范圍內，適于口服給藥的劑型含有約0.001mg-約1000mg的所述化合物以及與之相混合的相關的固體或液體藥物載體或稀釋劑。用于測定本發(fā)明方法所用化合物的治療有效量的方法是所屬領域技術人員所熟知的。所述方法還包括分析抗病毒，即抑制慢病毒屬或皰疹病毒屬病毒(例如(但不限于)HIV或HSV)生長的治療中的藥理學/藥物動力學參數(shù)(Elion，G.B.，無環(huán)尿苷發(fā)現(xiàn)、作用機理和選擇性，J.Med.Virol，Suppl.12-6，1997；Wagstaff，A.J.等人，藥物，1994，47(1)153-205)。
本發(fā)明所述方法包括施用一種藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的一種或多種式IV的化合物。優(yōu)選的實施方案將與藥用載體或稀釋劑結合的JO-4A用于HIV或HSV-2感染，所述JO-4A可以是純凈形式，或是可藥用的粗品濃縮物；并且將JO-4用于HSV-1或HSV-2感染。所述組合物通常含有1％(重量)以下，優(yōu)選約0.2％(重量)的式I化合物，并且可以通過常規(guī)技術制備成常規(guī)劑型，例如膠囊、片劑、栓劑、可分散粉末、糖漿劑、酏劑、混懸劑或用于腸道或腸胃外給藥的溶液。適用的藥用稀釋劑或載體包括，例如水，醇，天然或硬化油或蠟，碳酸鈣和碳酸鈉，磷酸鈣、高嶺土，滑石和乳糖以及適當?shù)姆栏瘎┤鐚αu基苯甲酸乙酯，懸浮劑如甲基纖維素，黃芪膠和藻酸鈉，濕潤劑如卵磷脂，聚氧化亞乙基硬脂酸酯和聚氧化亞乙基脫水山梨糖醇單油酸酯，造粒和崩解劑如淀粉和藻酸，粘合劑如淀粉、明膠和阿拉伯膠，以及潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石，從而提供美觀和可口的藥物制劑?？梢岳贸Ｒ?guī)技術對片劑形式的組合物進行包衣，以延緩片劑的崩解和活性組分在胃腸道內的吸收，由此提供長時間的緩釋作用。其它所屬領域專業(yè)人員已知的用于延緩崩解或將活性組分延時或定時給藥的化合物和方法也適合用來配制本發(fā)明方法所用的活性成分。例如，式IV化合物，特別是式II化合物可以與脂質體或其它緩釋載體物質結合，以保護化合物不發(fā)生降解直至它們到達其靶位，和/或使所述化合物易于透過組織屏障進行運動。
從易于給藥的角度考慮，優(yōu)選的組合物是固體組合物，特別是填充有固體的明膠膠囊或片劑。
還應懂得，本發(fā)明所述方法的另一個實施方案包括將一種或多種藥物以不同的方案(包括預防性方案)合用，同時本發(fā)明所述的方法是將含有式IV化合物的藥物組合物施用給需要抑制慢病毒屬或皰疹病毒屬病毒生長的治療對象，或施用給須需緩解上述病毒生長所致的病理作用的對象。聯(lián)合用藥的方案和測定其功效的方法(包括治療藥物的監(jiān)測)均是已知的(Belshe，R.B.編輯，人體病毒學手冊第2版1991)。適合在治療中抑制HIV或HSV生長并且可與本發(fā)明方法所用的式IV化合物聯(lián)合給藥的抗病毒藥或其他藥物的例子包括(但不限于)泛西洛維、無環(huán)尿苷、索力夫定(BV-arall)、BW882C87、甘西絡維、溴夫定、cidofovir(HPMPC)、lobucavir、ISIS-2922、噻喹努佛、ritonavir、indinavir、nelfinavir(蛋白酶抑制劑)；干擾素-α/β，疊氮胸苷(AZT，疊氮脫氧胸苷，齊多夫定)、二脫氧胸苷(DDC)、二脫氧腺苷、二脫氧肌苷(DDI)、三氮唑核苷、多肽T、可溶性重組CD4受體。用于確定本發(fā)明藥物組合物中的式IV化合物的治療有效量的方法，以及如何選擇抗癌藥或與本發(fā)明藥物組合物中式IV化合物合用的適于抗病毒治療的藥物的方法均是已知的。
實施例下列非限定實施例采用如下的材料和方法。
免疫抑制作用供血者通過靜脈穿刺術從捐獻者抽取肝素化的血樣(30cc)。混合白細胞培養(yǎng)(MLC)通常需要兩個具有不同遺傳背景的供體。
培養(yǎng)基在RPMI-1640培養(yǎng)基(Fisher Scientific Co.，Santa Clara，CA)中補加20％的熱滅活的人AB血清和1％的青霉素/鏈霉素混合物。
單核白細胞的分離通過將存在于Hanks-平衡鹽溶液(H-BSS)中適當稀釋的血液在菲可帕克梯度液上分層并且隨后離心，可從血液中分離出單核白細胞。將回收的白細胞用培養(yǎng)基洗滌3次，通過臺盼藍染料不相容法測定存活力。將細胞濃度調至為2×106/ml完全培養(yǎng)基。
混合白細胞反應(MLR)MLR是一種為所屬領域技術人員熟知的分析試驗，它是體內免疫抑制活性的一個體外預測試驗。MLR是T細胞對外源主要組織相容性復合體(MHC)基因產物識別的體外模型，并且作為一種細胞介導型移植排異反應的預測性試驗(Abbas，A.K.等人編輯，1994，第2版，細胞和分子免疫學，W.B.Saunders Co.USA)。移植排異是由于T細胞對MHC分子的識別并破壞移植物造成的。該過程可以是體內的研究試驗，但深入的分析試驗，尤其是對人的分析試驗，需要開發(fā)出例如MLR般的體外移植排異相關試驗法(Janeway，Chas. & Travers，Paul.免疫生物學，第2版，Garland Pubishing，Inc，New York(1996))。已知MLR是通過將從一個個體獲得的單核白細胞與從另一個體衍生的單核白細胞共培養(yǎng)來誘發(fā)的。若兩個個體之間存在的MHC基因的等位基因不同，則大部分單核細胞將在4-7天的時間內增殖，這被視作同種異基因的MLR。通過將3H-胸腺嘧啶核苷在細胞復制期間摻混到DNA中可以測定出增殖反應的水平。由于從各個供體獲得的細胞彼此反應并增殖，因此所得反應被視作“雙向MLR”。在MLR中試驗JO-4以測定其“免疫抑制”的能力。
在微量滴定板中建立“雙向MLR”首先將各個供體的單核細胞(2×106/ml)在50ml試管內以1∶1的體積比混合完全。將該混合物以100μl/孔的體積分配在96孔的U形底的微量滴定板中。分別將化合物或待測免疫抑制劑以100μl/孔的體積以1.0、0.5或0.25μg/ml的不同濃度加入到培養(yǎng)基中。將無藥物的100μl培養(yǎng)基加入到對照孔內。將培養(yǎng)物保存在氣氛為5％CO2、溫度為37℃的加濕培養(yǎng)箱中達5天。在收獲前的第4小時，在各個孔的培養(yǎng)物內加入1μCi氚代胸腺嘧啶(比活性為719.5mCi/mg；Dupont，Wilmington，DE)。將細胞收獲到帶有96孔自動細胞收集器(TOMTECHamden，CT)的玻璃纖維過濾器(Packard，Downers Grove，IL)上，并且在Matrix 9600β計數(shù)器(Packard)上直接計數(shù)。結果如圖1所示。
數(shù)據(jù)按照下列公式表示為抑制百分率(％抑制)％抑制＝100-[(含藥培養(yǎng)孔的每分鐘計數(shù)(CPM))/無藥物孔的CPM]×100“單向人MLR”培養(yǎng)物中MHC限制的溶細胞CD8+T淋巴細胞的生成在含有得自于不同供體的單核細胞的組織培養(yǎng)瓶中以上述“雙向MLR”建立“單向MLR”。但是，在“單向MLR”中，在培養(yǎng)前將兩種單核白細胞群中的一種通過用絲裂霉素C(一種抗有絲分裂藥)處理使其無法增殖。在此“單向MLR”中，被處理細胞僅充當刺激物，同時，未經(jīng)處理的細胞仍然能夠增殖并充當反應物。反應物細胞在5-7天地培養(yǎng)期中表達為CD8+表型，而不是CD4+。這些CD8+細胞僅充當溶細胞T淋巴細胞(CTL)，其將來源于與原始刺激物細胞群相同的個體的靶細胞溶解。在移植中，這些MHC限制的細胞毒性CD8+T細胞溶解了MHC全異(MHC-disparate)的供體靶組織，導致移植排異(Abbas，A.K.編輯，第2版，細胞和分子免疫學，W.B.Saunders Co.USA；Imagawa，D.K.等人，Aggarwal，B.B.等人編輯，人體細胞因子其在疾病和治療中的作用，Blackwell Science，Inc.Cambridge，MA)。結果如圖2所示。
在組織培養(yǎng)瓶中建立“單向”MLR首先，在15ml包裹有鋁箔的試管中用絲裂霉素C(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)(50μg/50×106細胞)處理一個供體的單核細胞并在37℃的水浴中保溫1小時。保溫結束時，用組織培養(yǎng)基將細胞洗滌3次并調成2×106/ml的濃度，充當刺激物。將未用絲裂霉素C處理的得自另一供體的單核細胞調至2×106/ml并用作反應物。將反應物和刺激物以1∶1的體積比混合，并在1.0μg/mlJO-4存在或只有培養(yǎng)基存在的條件下，將其在組織培養(yǎng)瓶中保溫5-7天。在CTL分析試驗中，將一些刺激物細胞(未經(jīng)絲裂霉素C處理)用PHA活化，進而在作為靶物的經(jīng)IL-2調節(jié)的介質中培養(yǎng)5或7天。
JO-4A對天然殺傷(NK)細胞活性的抑制作用-細胞毒性分析試驗用不同劑量的JO-4A以不同的處理期通過靜脈內或口服給藥處理小鼠。在處理階段結束后，取出脾臟用于測試脾對YAC-1腫瘤細胞(一種小鼠NK-易感細胞系(Ojo-Amaize，E.等人，Scand.J.Immuno.(1978)7297-306))的NK活性，4小時的51C釋放分析試驗用于描述離體小鼠CTL分析試驗。結果表示為％溶解/LU和％胞溶抑制作用(Ojo-Amaize，E.等人，(1994)，臨床感染疾病18(增刊1)S157-9)。
CTL試驗在培養(yǎng)階段結束時，用51Na2CrO4(51C)標記靶細胞并調至0.5×106/ml。收集效應器細胞(即反應細胞)，用培養(yǎng)基洗滌2次并將肝臟細胞調至2.5×106/ml。將效應器細胞和靶細胞以效應器細胞∶靶細胞(E∶T)為25∶1的比例在96孔U底微量滴定板中混合并在37℃/5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。在培養(yǎng)結束時，基本按照上述用于51C釋放分析試驗(Ojo-Amaize，E.等人，(1994)，臨床感染疾病18(增刊1)S157-9)的方法對胞溶靶細胞進行測定，并且結果表示為％特異性胞溶作用。
JO-4對誘發(fā)的前-炎癥細胞因子合成的抑制作用在1μg/ml JO-4或培養(yǎng)基存在的條件下，用B細胞促細胞分裂劑LPS(Gibco BRL，Grand Island，NY，3μg/ml)在24孔平板中對每1.0ml體積2×106/ml的人外周血單核細胞(PBMC)培養(yǎng)48小時。在5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)結束時收集培養(yǎng)物上清液并在細胞因子存在的條件下進行酶免疫測定，所用細胞因子為白介素-1β，-6和TNF-α。結果表示為對細胞因子生產的抑制作用。結果如圖3所示。
JO-4A對人MLR的抑制作用在不存在JO-4A或存在不同濃度JO-4A(0.1、1.0、10和100μM)的條件下建立雙向MLR。結果如圖4所示。
JO-4對LPS誘發(fā)的鼠淋巴細胞組織增殖的體外抑制作用LPS是一種小鼠B細胞的促細胞分裂劑，并且已知其在鼠和人體單核細胞中均可誘發(fā)前-炎癥細胞因子，如TNF-α，IL-6和IL-1β(Cunningham，A.J.編輯；理解免疫學1978；Academic Press，Inc.，NY，USA)。在JO-4不存在或以不同濃度(1.5、2.5、5.0、10.0和50.0μg/ml)存在的條件下，用LPS體外刺激鼠淋巴細胞。結果如圖5所示。
JO-4對PHA誘發(fā)的人外周血單核細胞增殖作用的體外抑制作用在不存在JO-4或以不同濃度(1.25、2.5、5.0、10.0和50.0μg/ml)存在的條件下將人PBMC培養(yǎng)4天。結果如圖6所示。PHA是一種有效的T細胞促細胞分裂劑，可以刺激T細胞生產IL-2。
JO-4對人PBMC的無毒性為了測定JO-4對人體體外細胞是否有毒，在JO-4不存在或以不同濃度(1.25、2.5和5μg/ml)存在的條件下將人PBMC培養(yǎng)不同的天數(shù)(2、5和7天)。在各個培養(yǎng)期結束時，通過臺盼藍染料不相容法(trypanblue dye exclusion method)測定細胞的存活力。結果如圖7所示。本發(fā)明的化合物本發(fā)明所述方法中試驗的化合物包括JO-4A(式II)、JO-4(式I)(JO-4A的酯)，和JO-4B(式V)?；衔锏闹苽銳O-4A的制備將JO-4結晶(82mg，0.22mmol)溶解在加熱的甲醇(3ml)和二氧六環(huán)(3ml)的混合物中，隨后冷卻至室溫。加入新制的甲醇鈉粉末以達到pH10。將該混合物在室溫下攪拌過夜，并且用Dowex-50H+樹脂中和澄清、橘黃色的反應混合物，過濾并真空蒸發(fā)，得到淺黃色糖漿，該糖漿在冰箱內過夜使其緩慢結晶。生成65mg，90％。
JO-4B的制備(E.J.Corey & G.Schmidt，的方法，Tetrahedron Letter，399-402，1979)。將JO-4A(50mg，0.15mmol)溶解在二氯甲烷(1ml)并冷卻至0℃，在有效的攪拌下加入1.5mol當量的重鉻酸吡啶鎓鹽。在室溫下將反應混合物攪拌6小時并隨后用乙醚稀釋，過濾并蒸發(fā)，生成米色固體(30mg，60％)。
JO-4的酯類化合物如式IV所示，本發(fā)明所述化合物包括JO-4A的酯類化合物，但不包括公開在雜環(huán)學202125-2128(1983)和Z.Naturoorsch 37c558-561(1982)中的槍刀藥素氧化物(JO-4)。但應注意，本發(fā)明所述的引起免疫抑制的方法包括施用式II的化合物，其中包括槍刀藥素氧化物。
因此，本發(fā)明的一方面涉及了式IV的化合物或其可藥用鹽。
R是
(i)H，PO3-，含有1-12個碳原子及0-6個雙鍵的直鏈或支鏈的取代或未取代烷基，(CH2)n嗎啉其中n＝1-4，嗎啉代甲基苯基，鄰氨基苯基，鄰羥基苯基，(CH2)nCOOR2其中n＝1-4其中R2為H、堿金屬鹽離子、堿土金屬鹽離子、NH4+、N+(R3)4，其中R3獨立地選自由H和1-4個碳原子的烷基組成的基團，或(ii)COR1，其中R1選自H，(CH2)nCH3，其中n＝1-6，(CH2)nCOOR2，其中n＝1-4，并且R2如上述定義，(CH2)nN+(R3)4，其中n＝1-4，和(CH2)nSO3-，其中n＝1-4。本發(fā)明一方面涉及了含有治療上免疫抑制有效量的式IV化合物的藥物組合物。
本發(fā)明所述用于在動物中引起免疫抑制的方法包括給需此治療的動物施用一種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的式IV化合物或其可藥用鹽。
從槍刀藥中分離JO-4從干燥的槍刀藥(Hypoestes rosea)植物原料中分離純凈JO-4的常見方法包括在大型索格斯利特萃取器中用沸騰的己烷進行固體/液體萃取。槍刀藥是一種刺(Acantheceae)科灌木(Okugun，J.I.等人，Z.Naturforsch 37c558-561(1982))。將蒸發(fā)己烷得到的粗產物進行閃式硅膠柱層析，采用的分步梯度溶劑系統(tǒng)是從石油醚(30-60bp)開始并逐步采用的石油醚中含5％乙酸乙酯，進而10％乙酸乙酯，隨后20％乙酸乙酯。當含有30％乙酸乙酯時，JO-4從層析柱被洗脫出來。將適當?shù)酿s分合并并濃縮至干，加入石油醚或己烷，得到結晶JO-4。一個這種過程可從植物葉子的10g粗提物中生產出240mg純JO-4。
應著重注意首先將粗提物溶解在盡可能少的乙酸乙酯中并吸附在硅膠上，在上樣到預含在石油醚中的層析柱前將其蒸發(fā)至干。對植物特定部分的提取表明，葉子而不是莖含有主要的JO-4。
結果
如上所述，發(fā)現(xiàn)式IV化合物具有意料外的作為免疫抑制藥物和抗炎藥物的功效，這得自于其在標準的體外和體內試驗中所顯示出的對細胞免疫性的作用，所述標準體外和體內試驗是指預測化合物在人體或其他動物中的免疫抑制活性的試驗。
式IV和II化合物，特別是在此所驗證的JO-4A和JO-4化合物，它們免疫抑制了免疫細胞或淋巴細胞的形成或增殖或機能，并由此抑制了移植組織如器官移植物(如皮膚、骨髓、腎臟、心臟和肺)的排異；同時適用于預防移植物抗宿主疾病(GVHD)和T細胞介導的自身免疫病如多發(fā)性硬化(MS)、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性心肌炎、全身性紅斑狼瘡(SLD)、類風濕性關節(jié)炎(RA)，阿耳茨海默氏病(AD)、糖尿病和腎小球性腎炎。
由于本發(fā)明所述化合物抑制了前-炎癥細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)的合成，因此發(fā)現(xiàn)了此類化合物在抑制變應性反應、哮喘、接觸性皮炎和皮膚病(如牛皮癬)中的用途。
本發(fā)明所述化合物的免疫抑制作用是在上述試驗中測定，其結果如上所示。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述化合物在體外和小鼠體內試驗中所顯示的免疫抑制活性構成了本發(fā)明人結論的基礎，該結論是所述化合物以及含有其的藥物組合物在動物或人體宿主中對其免疫系統(tǒng)具有體內抑制功效。
圖1是利用不同對的供體進行各個試驗的若干實驗中的代表性結果。該結果證實，JO-4抑制雙向MLR?？梢缘贸鲆种茲舛?0(IC50)，即達到50％抑制作用時的藥物濃度，是在0.5μg/ml-5.0μg/ml間。
圖2表示JO-4對MHC不同的刺激靶細胞胞溶作用的抑制作用，所述胞溶作用是有I型MHC限制的細胞毒性T細胞介導的。在組織排異反應中，抑制MHC限制的細胞毒性CD8+T使MHC不同的供體組織胞溶，導致移植物排異(Abbas等人，細胞和分子免疫學，1994，W.B.Saunders Co.USA；Imagawa D.K.等人，InAggarwal，B.B.，等人，人體細胞因子其在疾病和治療中的作用，Blackwell Science，Inc，CambridgeMA，1995)。在此實驗中，已證實，JO-4顯著(82％)抑制了這種細胞毒性T細胞的溶細胞能力，細胞毒性T細胞得自“單向人MLR”，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明所述化合物體外免疫抑制作用，以及對動物或人體宿主的免疫系統(tǒng)的體內抑制功效。
圖3是得自于3個實驗的代表性結果，所述實驗證實了JO-4對前-炎癥細胞因子合成(IL-1α、TNF-β和IL-6)的抑制或免疫抑制作用。已知這些細胞因子參與了炎癥和內毒素休克綜合征(Watkins等人，Pain1995，63289-302免疫作用前-炎癥細胞因子在炎癥、疾病反應和病理疼痛態(tài)中的作用)。
圖4表示JO-4A對人體雙向MLR的抑制作用。JO-4A的IC50似乎在5.0μM～10.0μM間，在10.0μM時，JO-4A對雙向MLR產生64％抑制作用。
圖5表示JO-4對LPS-誘發(fā)型鼠科淋巴細胞增殖的體外抑制作用。在所有被測濃度(1.5μg/ml-50μg/ml)下增殖作用均被抑制50％以上。由于LPS是一種有效的鼠科B淋巴細胞粗細胞分裂劑，所以B淋巴細胞是可抗體分泌的血漿細胞的產物(Cunningham，A.J.編輯，Academic Press，Inc；理解免疫學)，JO-4和本發(fā)明的化合物適用于在自身免疫疾病(例如但不限于全身性紅斑狼瘡，類風濕性關節(jié)炎)中防止自身抗體的產生。
圖6表示JO-4對PHA誘發(fā)的人淋巴細胞增殖的體外抑制作用。PHA活化的淋巴細胞導致IL-2生成，IL-2是維持或引起MLR反應所必需的。因此，可以作為解釋而不是限定的是，JO-4對PHA誘發(fā)的人淋巴細胞增殖的抑制作用可能是對MLR的抑制作用。
圖7表示JO-4在抑制淋巴細胞增殖的濃度下對淋巴細胞無毒。由此，JO-4對淋巴細胞增殖作用的抑制應歸因于其抑制DNA合成的能力，而不是使其中毒。
圖8表示通過靜脈內或口服給藥的JO-4A可以抑制體內的NK活性。該發(fā)現(xiàn)證實，本發(fā)明化合物可有效地通過抑制供體中NK細胞的體內活性來抑制移植物抗宿主疾病，所述NK細胞在全身急性移植物抗宿主疾病中是重要的效應器細胞。因此，本發(fā)明化合物以及JO-4適用于預防移植受體中的GVHD的方法，該方法包括給移植供體施用一種藥物組合物，該組合物含有治療有效量的所述化合物。治療有效量的所述化合物足以抑制供體內的NK細胞的機能，從而當NK細胞被移植到受體體內時避免或防止或緩解了GVHD。對于所屬領域專業(yè)人員來說，如何測定所述化合物對供體的最佳劑量和給藥時間，從而達到緩解、避免或防止移植受體中發(fā)生GVHD是已知的。
抗癌下列非限定實施例中采用如下所述的材料和方法。
腫瘤細胞由ATCC(Rockville，MD)預購得人子宮頸上皮癌(HeLa)，人腎清除細胞癌(CAKI-1)、人惡性黑素瘤(RPMI-7951)和小鼠惡性黑素瘤(B16-F1)，并體外保存在補加有10％熱滅活胎牛血清(American Qualex，San Clemente，CA)、10mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Sigma Chemicals，Saint Louis，MO)的MEM介質(Mediatech，Inc，Hemdon，VA)(完全培養(yǎng)基)內。
正常細胞由Clonetics(San Diego，CA)得到正常人子宮頸上皮細胞(CrEc-Ec)、正常人乳腺上皮細胞(HMEC)和正常人臍靜脈內皮細胞，并且將它們分別培養(yǎng)在Clonetics推薦和獲得的組織培養(yǎng)基中。
外周血單核細胞(PBMC)從健康成年志愿者獲得肝素化的靜脈血并通過在菲可帕克(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上離心分離出PBMC。所述細胞用HBSS(Hanks平衡鹽溶液)洗滌3次，并精細地重新懸浮在完全培養(yǎng)基中。通過臺盼藍染料不相容實驗來測定細胞的存活性，并且將細胞數(shù)量調至所需的濃度。
MTT比色法利用比色法(Mosmann，T.，免疫學方法雜志6555-63，1983)體外測定式I和II(JO-4A)所示的槍刀藥素氧化物類化合物的細胞毒性作用。簡單地說，在96孔平底平板的每個孔內加入1000個細胞(100μl)，在只存在培養(yǎng)基或存在不同濃度藥物的條件下，將其在37℃、5％CO2-95％空氣的加濕培養(yǎng)箱內培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結束時，在每個孔中加入10μl溶于PBS中的5mg/ml 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)(Sigma Chemicals，Saint Louis，MO)，并且繼續(xù)保溫4小時。在所有孔中加入酸-異丙醇(100μl 0.04N HCl，存在于異丙醇內)并在室溫下保存30分鐘。用多通道移液管混合以將藍黑色結晶溶解，并在545-650nm下經(jīng)ELISA平板讀取器測定吸收度。
小鼠由Charles River實驗室(Wilmington，MA)購得8周齡的雌性C57BL/6(B6)小鼠。
小鼠腫瘤體積的測定方法在用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(IrvinScientific，Irvine，CA)體外培養(yǎng)15分鐘后收獲呈指數(shù)生長的B16-F1黑素瘤細胞。在小鼠的右側皮下注射50000活細胞(Fidler，I，癌癥研究雜志35218-224，1975)。注射4天后，令試驗組中的小鼠管飼口服溶于0.2ml水中的不同濃度的JO-4A，對照組只接受水。用微卡鉗測定腫瘤，以下列公式計算腫瘤體積長度×寬帶×高度×0.5236(Jungwirth，A.等人Proc.Natl，Acad，Sci，USA，945810-5813，1997)。
統(tǒng)計學分析利用學生t-檢驗計算顯著性水平。
所以，本發(fā)明所述方法包括了給所述對象施用治療有效量的至少一種具有式IV的槍刀藥素氧化物化合物及其可藥用鹽。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及用于抑制癌性腫瘤生長的藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效量的式II化合物(JO-4A)。
如上述實施例所示，發(fā)現(xiàn)了式IV化合物，特別是式II化合物(JO-4A)意外地具有作為抑制癌性腫瘤生長藥物的有效作用，這表現(xiàn)在其在標準體外和體內試驗中對癌性腫瘤細胞生長的抑制作用，所述體外和體內試驗可預測化合物在人體或其他動物中的抗腫瘤活性。
式IV化合物，特別是在此所證實的式II(JO-4A)化合物抑制了癌性腫瘤細胞的形成或增殖或機能，并由此適用于需抗癌治療的對象中抑制癌性腫瘤生長的方法。
式IV化合物的作用是在上述試驗中得到測定，其結果如下所示。迄今已發(fā)現(xiàn)了式IV化合物在體外和小鼠體內試驗中用于抑制癌性腫瘤生長的醫(yī)學作用，其構成本發(fā)明人的結論基礎，所述結論是所述化合物和含有它們的藥物組合物在動物或人體宿主中具有抑制癌性腫瘤生長的體內功效。
實施例1JO-4A對體外癌細胞的細胞毒性作用圖9是若干試驗中JO-4A對不同人體外癌細胞毒性作用的代表性結果。結果證實，JO-4A對人子宮頸上皮癌(HeLa)細胞的依賴劑量的細胞毒性作用。抑制濃度50(IC50)，即半數(shù)抑制濃度，在10μM-12.5μM。
同樣，JO-4A對腎癌(CAKI-1)細胞的IC50在20μM-40μM間，對遷移至淋巴結(RPMI-7951)的惡性黑素瘤的IC50為10μM-12.5μM。
圖10表示JO-4A對正常人體細胞的細胞毒性作用。當在比色法中采用正常人體子宮頸上皮細胞，抑制相對于人子宮頸上皮癌(HeLa)的空白對照細胞系，JO-4A的IC50＞100μM。HeLa的IC50劑量(10μM-12.5μM)對于其正常對照物僅僅產生6％的細胞毒性作用。此外，JO-4A對于正常外周血單核細胞無細胞毒性作用。JO-4A對于正常人乳腺上皮細胞和正常人臍靜脈內皮細胞的IC50濃度是相同的(25μM-50μM)。
圖11是若干試驗中JO-4A對體外惡性黑素瘤細胞(B16-F1)的細胞毒性作用的代表性結果。這些結果證實，JO-4A對B16-F1細胞具有劑量依賴型細胞毒性作用。IC50濃度在6.25μM-12.5μM。
實施例2JO-4A對黑素瘤生長的體內作用圖12表示JO-4A對C57BL(B6)小鼠中的B16-F1黑素瘤的體內作用。在腫瘤移植后第4天開始每天給B6小鼠口服施用JO-4A，所有4種被測的JO-4A給藥濃度均可明顯減小腫瘤體積(圖12A)。此外，JO-4A的口服給藥還增加了試驗組中B6小鼠的幸存率。雖然未處理組中的所有(n-6)小鼠到28天時全部死亡，而84％的用2mg/kgJO-4A處理的小鼠(5/6)存活。此外，用1mg/kg處理組幸存67％(4/6)，用0.5mg/kg(3/5)處理組幸存了60％，用0.1mg/kg處理組幸存17％(1/6)(圖12B)。
圖13表示用2mg/kg JO-4A處理組的各個幸存小鼠對未處理組的對比。雖然事實上處理在第20天停止，但用2mg/kg JO-4A處理組的小鼠比未處理組的存活時間長。
實施例3JO-4A對與干擾素-α結合中的體外抑制作用圖14表示與干擾素-α(IFN-α)結合中所用的JO-4A對體外人惡性黑素瘤產生一個附加的生長抑制作用。該結果表明，使用了JO-4A的結合試驗可以將IFN-α的劑量減少到8分之一，但不降低IFN-α的預期功效。該結果發(fā)現(xiàn)了對病患進行IFN-α治療的實用性，因為IFN-α的毒性極強(腫瘤學研討，第24卷，增刊4，1997)。因此，本發(fā)明包括了一種用于改善IFN-α療法的毒性的方法，該方法包括將足夠量的JO-4A在接受IFN-α的病患中聯(lián)合給藥，以確保降低IFN-α的劑量，從而減小IFN-α對患者的毒性風險。
抗病毒下列非限定實施例采用如下所述的材料和方法。
外周血單核細胞(PBMC)從健康成年志愿者獲得肝素化的靜脈血并通過在菲可帕克(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上離心分離出PBMC。所述細胞用HBSS(Hanks平衡鹽溶液)洗滌3次，并精細地重新懸浮在補加有20％熱滅活胎牛血清(American Qualex，San Clemente，CA)、10mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(SigmaCHemicals，Saint Louis，MO)的RPMI-1640介質(Mediatech，Inc，Herndon，VA)(完全培養(yǎng)基)內。通過臺盼藍染料不相容實驗來測定細胞的存活性，并且將細胞數(shù)量調至所需的濃度。
正常的非洲綠猴腎細胞(CV-1)從HybriwixTMProbe Systems獲得CV-1細胞采用抗皰疹病毒敏感試驗試劑盒(Diagnostic Hybrids，Inc.Athens，OH)通過MTT法試驗JO-4A的毒性。
對體外HIV-1復制的測定采用一種用于測定藥物對從臨床分離的人HIV-1的敏感性的標準外周血單核細胞培養(yǎng)試驗(Japour AJ等人，Antimicro Agents Chemother 1993；371095-1101)。在完全培養(yǎng)基和37℃、5％CO2-95％空氣的濕培養(yǎng)箱中用PHA(5μg/ml)刺激外周血單核細胞(2×106細胞/ml)達72小時。將400g的經(jīng)PHA刺激3天后的PBMC在20-24℃下沉積10分鐘。去除上清液。將細胞重新懸浮在補加有3％IL-2的完全培養(yǎng)基中。用0.4％臺盼藍測定細胞的存活率。存活率高于85％。將細胞濃度調至4×106/ml。將細胞以50μl(2×105/孔)的體積分配在含有50μl完全培養(yǎng)基的96孔微量滴定板中。將HIV-1感染的培養(yǎng)物用從病患分離出的感染復數(shù)(MOI)分別為0.05和0.1的HIV-1引發(fā)。在孔內加入50μl體積的不同濃度(0.001μM-0.5μM)的JO-4A。將平板在37℃下和5％C2的加濕室內保溫7天。在第4天，棄去半數(shù)失效分培養(yǎng)基(100μl)，將50μl新鮮的完全培養(yǎng)基和50μl JO-4A(如上所述的不同濃度)加入到含有失效JO-4A的孔內。將100μl新鮮培養(yǎng)基加入到無藥物的孔內。第7天時，停止培養(yǎng)并測試上清液的HIVp24抗原，試驗采用了制造商推薦的酶免疫法(EIA)試劑盒測定的(CoulterTMHIVp24抗原測定Immunotech，Inc.，Westbrook，Maine)。
體外單純皰疹病毒(HSV)(1和2型)復制的測定利用HybriwixTMProbe System(抗皰疹吡啶敏感試驗試劑盒Diagnostic Hybrids，Inc，Athens，OH)測定藥物的抗病毒活性。簡單來說，在37℃和5％CO2的加濕培養(yǎng)箱中將HSV-1或HSV-2分離物(ATTC，Rockville，MD)預吸附在置于24孔平底平板中的非洲綠猴腎細胞上。預吸附后，將病毒接種物取出，并將含有不同濃度適當藥物的生長培養(yǎng)基加入到適當?shù)目變?。將培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)48小時以擴增病毒。通過核酸雜交法定量測定各孔中的HSV DNA病毒。用DNA wicking試劑使細胞和/或病毒胞溶，并利用垂直毛細管吸附wicking試劑/DNA溶液，從而將單鏈DNA固定在HybriwixTM濾膜上。利用含有基因序列的放射活性(I125)-HSVDNA探針測定HSV靶定DNA的量，所含序列與HSV-1或HSV-2序列類似。HybriwixTM上存在的放射性的量取決于培養(yǎng)后HSV DNA的量，并且可以在γ計數(shù)器(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)中測出。
MTT比色法利用比色法(Mosmann，T.，免疫學方法雜志6555-63，1983)測定藥物的體外細胞毒性作用。簡單地說，在96孔平底平板的每個孔內加入1000個細胞(100μl)，在只存在培養(yǎng)基或存在不同濃度藥物的條件下，將其在37℃、5％CO2-95％空氣的加濕培養(yǎng)箱內培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結束時，在每個孔中加入10μl溶于PBS中的5mg/ml3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)(SigmaChemicals，Saint Louis，MO)，并且繼續(xù)保溫4小時。在所有孔中加入酸-異丙醇(100μl 0.04N HCl，存在于異丙醇內)并在室溫下保存30分鐘。用多通道移液管混合以將藍黑色結晶溶解，并在545-650nm下經(jīng)ELISA平板讀取器測定吸收度。
所述方法采用的化合物本發(fā)明所述方法中測試的槍刀藥素氧化物類化合物(式IV)包括JO-4A(式II)以及JO-4(式I)(JO-4A的酯)。
所以，本發(fā)明所述方法包括給所述對象施用治療有效量的至少一種式IV所示槍刀藥素化合物及其可藥用鹽。本發(fā)明所述方法的優(yōu)選實施方案是施用含有治療有效量的式II(JO-4A)化合物的藥物組合物，以抑制HIV和HSV-2的生長。本發(fā)明所述方法的另一優(yōu)選實施方案是施用含有治療有效量的式I(JO-4)化合物的藥物組合物用于抑制HSV-I或IV和HSV-2的生長。
如下列實施例所述，由其對病毒生長的作用可以發(fā)現(xiàn)，式IV(JO-4)和II(JO-4A)化合物分別具有意外的抑制HSV1和HSV2，以及HIV和HSV-2生長的有效作用，這表現(xiàn)在預測化合物在人體或其他動物體內的抗病毒作用的標準體外試驗中。
在此利用一個為所屬領域技術人員熟知的預測抗HSV-1或抗HSV-2活性的篩選試驗，證實式I(JO-4)化合物抑制了HSV-1和HSV-2在非洲綠猴腎細胞的復制和生長，從該試驗中專業(yè)人員將認識到，JO-4適用于在需抗病毒治療的對象中抑制HSV-1或HSV-2的生長，由此改善HSV-1或HSV-2感染的病理作用。
在此分別利用所屬領域技術人員熟知的預測抗HIV或抗HSV-2活性的篩選試驗，證實式II(JO-4A)化合物可以抑制人PBMC中的HIV和非洲綠猴腎細胞中的HSV-2的復制和生長，從這些試驗中，專業(yè)人員將了解到，JO-4A適用于在需抗病毒治療的對象中抑制HIV或HSV-2的生長，由此改善HIV或HSV-2感染的病理作用。
實施例實施例1JO-4A對PBMC中HIV生長的抗病毒作用圖15A表示了若干試驗中JO-4A對從患者分離的HIV-1的抑制作用的代表性結果。這些結果證明，JO-4A對HIV-1復制具有劑量依賴型抑制作用，并且可推斷出抑制濃度50(IC50)，即半數(shù)抑制濃度，在0.0001μM-0.01μM內。
圖15B表示利用臺盼藍人體不溶性試驗測定出的JO-4A對經(jīng)培養(yǎng)人PBMC的細胞毒性結果。在任何試驗濃度下JO-4A均無毒性作用，由此，JO-4A對HIV-1復制的抑制作用不歸因于JO-4A對PBMC的細胞毒性。
實施例2JO-4對HSV-1和HSV-2生長的抗病毒作用圖16A表示JO-4對HSV-1復制的抗病毒作用。在用不同濃度JO-4培養(yǎng)2天后，HSV-1在非洲綠猴腎細胞中的復制，在12.5μM JO-4的條件下被抑制60％，在3.125μM JO-4下時被抑制53％。因此，測出JO-4抑制HSV-1的IC50劑量為～3.125μM。
圖16B表示JO-4對HSV-2復制的抗病毒作用。在用不同濃度JO-4培養(yǎng)2天后，HSV-2在非洲綠猴腎細胞中的復制，在12.5μM JO-4下被抑制65％，在3.125μMJO-4下時被抑制58％。因此，測出JO-4抑制HSV-2的IC50劑量為＜3.125μM。
圖16C表示JO-4A對HSV-2復制的抗病毒作用。在用不同濃度JO-4培養(yǎng)2天后，HSV-2在非洲綠猴腎細胞中的復制，在12.5μM JO-4A下被抑制61％，在3.125μM JO-4A下時被抑制51％，在0.75μM JO-4A下時被抑制20％，。因此，測出JO-4抑制HSV-2的IC50劑量為～3.125μM。
實施例3JO-4和JO-4A對培養(yǎng)細胞的細胞毒性作用圖17A和17B表示JO-4和JO-4A對正常的、未感染的非洲綠猴腎細胞(CV-1)的細胞毒性的結果。當在不存在或存在不同濃度JO-4和JO-4A的條件下，將CV-1培養(yǎng)72小時，只有到化合物處于較高的濃度(JO-4＞50μM JO-4A～25μM)時，其細胞毒性在50％以上。由此，JO-4和JO-4A對HSV-1和HSV-2復制的抑制作用不歸因于各藥物對CV-1細胞的細胞毒性。
本發(fā)明的宗旨和范圍將不限制在優(yōu)選的描述方式內。其他多種改動、改編和改進均在本發(fā)明所述范圍內。
權利要求
1.含有下式化合物的藥物組合物
其中R是(i)H、PO3-、含有1-12個碳原子及0-6個雙鍵的直鏈或支鏈的取代或未取代烷基、(CH2)n嗎啉其中n＝1-4、嗎啉代甲基苯基、鄰氨基苯基、鄰羥基苯基、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4，其中R2為H、堿金屬鹽離子、堿土金屬鹽離子、NH4+、N+(R3)4，其中R3獨立地選自由H和具有1-4個碳原子的烷基組成的基團，或(ii)COR1，其中R1選自H、(CH2)nCH3其中n＝0-6、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4并且R2如上述定義、(CH2)nN+(R3)4其中n＝1-4、和(CH2)nSO3-其中n＝1-4。
2.權利要求1所述的藥物組合物，其中R是H。
3.具有權利要求1所定義的式(I)所示的化合物在制備免疫抑制劑中的應用。
4.具有權利要求1所定義的式(I)所示的化合物在制備用于抑制癌細胞生長的藥物組合物中的應用。
5.權利要求4所述的應用，所述癌細胞選自子宮頸癌、遷移性黑素瘤、腎細胞癌、睪丸的胚胎性癌和結腸癌。
6.具有如權利要求1所定義的式(I)所示的化合物在制備抑制慢病毒屬或皰疹病毒屬病毒生長的藥物組合物中的應用。
7.權利要求6所述的應用，其中所述慢病毒屬病毒選自HIV-1、HIV-2和HTLV。
8.權利要求6所述的應用，其中所述皰疹病毒屬病毒選自單純皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨細胞病毒和帶狀皰疹病毒。
9.具有權利要求1所定義的式(IV)所示的化合物，其中對于所述的(CH2)nCH3而言n＝1-6，而其他取代基和可變基團如上所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有右式化合物的藥物組合物:其中:R是(i)H,PO
文檔編號C07D303/06GK1252719SQ98804235
公開日2000年5月10日 申請日期1998年4月15日 優(yōu)先權日1997年4月15日
發(fā)明者伊曼紐爾·A·奧霍－阿邁茲, 約瑟夫·I·奧科岡, 霍華德·B·科塔姆, 韋拉洛·N·卡坎納 申請人:免疫調節(jié)公司