專利名稱：生產(chǎn)重組人類紅細(xì)胞生成素的表達(dá)系統(tǒng),純化分泌的人類紅細(xì)胞生成素的方法,及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)具生物活性的重組人類紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的表達(dá)系統(tǒng)，及一種純化分泌的rhEPO的改良方法。
人類紅細(xì)胞生成素(human erythropoietin，簡(jiǎn)稱hEPO)是一種分子量介于35kd至40kd間的糖蛋白。在健康的成人體內(nèi)，hEPO是由腎臟所制造及分泌。hEPO的主要生理功能是促進(jìn)在骨髓，脾臟及胎兒肝臟細(xì)胞中紅細(xì)胞生成細(xì)胞的增生，及促進(jìn)正常紅細(xì)胞的分化。
早期，天然人類來(lái)源的紅細(xì)胞生成素是由含有高濃度hEPO的尿液中純化而得，如由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得。然而，利用此等方法所得到的hEPO量甚少，且傳統(tǒng)上用于純化hEPO的方法費(fèi)時(shí)且不經(jīng)濟(jì)。需要發(fā)展出一種方法，以簡(jiǎn)單符合經(jīng)濟(jì)效益的方式，生產(chǎn)并純化大量hEPO。
近來(lái)，已利用遺傳工程的方法藉由哺乳動(dòng)物細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞以大量制備重組人類紅細(xì)胞生成素(rhEPO)。
Jacob等人由基因文庫(kù)中克隆并測(cè)序了編碼hEPO的cDNA片段(參見(jiàn)Jacob et al.，Nature 313806-809，1985)。同時(shí)，Jacob等人揭示了SV40病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的載體，其攜帶以核酸探針自λ噬菌體cDNA文庫(kù)中篩選得到的編碼hEPO的cDNA片段，進(jìn)入猴腎纖維母細(xì)胞COS-1中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，并測(cè)得hEPO的生物活性。
1985年美國(guó)遺傳學(xué)會(huì)有限公司的臺(tái)灣專利申請(qǐng)第74102884號(hào)(公告號(hào)203100)“復(fù)殖的人類紅細(xì)胞生成素基因及其產(chǎn)品”揭示可編碼人類紅細(xì)胞生成素的cDNA以及由SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的表達(dá)載體，于猴腎上皮細(xì)胞COS-1及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO兩種不同的宿主細(xì)胞株中制造出與人類自然產(chǎn)生的分子量相同并具生物活性的紅細(xì)胞生成素(EPO)。
美國(guó)專利第4,703,008、5,441,868、5,547,933、5,618,698及5,621,080號(hào)揭示分離并測(cè)序編碼hEPO的DNA片段，其是由人類基因組文庫(kù)中克隆出含有完整人類紅細(xì)胞生成素基因的5.6Kb DNA片段，將其插入表達(dá)載體中以轉(zhuǎn)化猴腎細(xì)胞株COS-1，以構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株CHO，藉由利用氨甲嘌呤(methotrexate，MXT)進(jìn)行篩選，以構(gòu)建穩(wěn)定經(jīng)轉(zhuǎn)染的表達(dá)系統(tǒng)。同時(shí)，其亦提供了在大腸桿菌及酵母菌中表達(dá)rhEPO類似物的基因及表達(dá)系統(tǒng)。
Quelle等人揭示利用昆蟲SF9細(xì)胞中的桿狀病毒系統(tǒng)以生產(chǎn)rhEPO(參見(jiàn)Quelle et al.，Blood 74(2)652-657，1989)。雖然經(jīng)轉(zhuǎn)化的SF9細(xì)胞生產(chǎn)的rhEPO的產(chǎn)率有所改善(500,000U/l培養(yǎng)液)但是目的產(chǎn)物rhEPO的糖基化程度較天然hEPO為小，因而其分子量亦較小。Mori等人構(gòu)建了一個(gè)含有干擾素-α基因啟動(dòng)子的rhEPO表達(dá)載體，并利用該rhEPO表達(dá)載體轉(zhuǎn)化B細(xì)胞白血病BALL-1細(xì)胞(參見(jiàn)Gene 144(2)289-293，1994)。經(jīng)以仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞白血病BALL-1細(xì)胞比現(xiàn)有技術(shù)所揭示的轉(zhuǎn)化株能產(chǎn)生較高量的rhEPO。
自培養(yǎng)基中純化rhEPO的方法通常包含下述步驟。首先，經(jīng)由通過(guò)離子交換層析柱，諸如DEAE纖維素柱(Sherwood andGoldwasser，Endocrinology 103(3)866-870，1978)和DEAE Sephacel柱(Quelle et al.，Blood 74(2)652-657，1989；Inoue et al.，Biological andPharmaeutical 17(2)180-184，1994；Ben Ghanem et al.，PreparativeBiochemistry 24(2)127-142，1994)，選擇性地吸收或排除rhEPO。第二，令rhEPO特定地吸附在固定化外源凝集素樹脂(諸如，麥芽凝集素-瓊脂糖(Quian et al.，Blood 68(1)259-262，1986)和ConA-瓊脂糖(Quelle et al.，Blood74(2)652-657，1989)上。第三，使用C4逆相HPLC純化rhEPO至均一狀態(tài)(Lange et al.，Blood Cells 10(2-3(305-314，1984；Krystal et al.，Blood 67(1)71-79，1986；Quelle et al.，Blood 74(2)652-657，1989；Inoue et al.，Biological and Pharmaceutical17(2)180-184，1994)。
美國(guó)專利第5,322,837號(hào)揭示一種利用C4逆相HPLC以制備均一rhEPO的方法，該rhEPO的比活性介于120,000至160,000U/mg之間。
已使用固定化單克隆抗體親和柱以純化hEPO(或rhEPO)。例如，經(jīng)轉(zhuǎn)化的淋巴樣母細(xì)胞所分泌的rhEPO特定地吸附在抗hEPO單克隆抗體—瓊脂糖Sepharose 4B親和柱上(BenGhanem et al.，Preparative Biochemistry 24(2)127-142，1994)；洗脫結(jié)合的rhEPO，令其通過(guò)DEAE-Sephacel離子交換柱；得到rhEPO均一產(chǎn)物，回收率約為50％。
雖然利用重組DNA技術(shù)已改善rhEPO的產(chǎn)率，但是純化rhEPO至均一狀態(tài)仍然是費(fèi)力耗時(shí)的，特別是需要大量制備rhEPO時(shí)尤其如此。
現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法有效地利用表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)大量rhEPO。進(jìn)一步，現(xiàn)有技術(shù)亦無(wú)法有效地純化大量rhEPO。本發(fā)明解決上述需要而得以完成。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)rhEPO的新發(fā)展的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明亦提供了一種新的純化rhEPO的方法，其利用二步柱層析技術(shù)。為表達(dá)目的蛋白質(zhì)rhEPO，將編碼rhEPO經(jīng)PCR擴(kuò)增的cDNA片段插入至巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制的表達(dá)載體中。利用抗生素G418進(jìn)行篩選，可獲致轉(zhuǎn)化株(BHK-21細(xì)胞)，其含有穩(wěn)定生產(chǎn)高量rhEPO的表達(dá)載體。當(dāng)進(jìn)行rhEPO純化時(shí)，首先利用鹽析法自培養(yǎng)液中沉淀出目的蛋白質(zhì)。令沉淀物中的糖蛋白選擇性地吸附至固定化外源凝集素樹脂上。利用含有0.5M甘露糖的緩沖液洗脫結(jié)合的糖蛋白，獲致rhEPO溶液，其包含分子量約為34KD的主要成分和分子量介于35至45KD的次要成分。利用含有0.5M甘露糖的緩沖液未能洗脫出而持續(xù)結(jié)合至該樹脂上的rhEPO，可藉由酸性緩沖液(pH4.0)令其剝離樹脂而洗脫出。經(jīng)過(guò)通過(guò)G-75層析柱，可進(jìn)一步純化rhEPO的異構(gòu)物。
本發(fā)明的純化方法具有下述優(yōu)點(diǎn)(1)第1個(gè)步驟是通過(guò)由沉淀以濃縮目的蛋白質(zhì)rhEPO，此使得大量制備rhEPO較為容易，及(2)無(wú)需使用傳統(tǒng)純化方法所需的逆相HPLC或免疫親和柱層析法，即可獲致分子量介于35至45KD具有較高比活性的rhEPO及其異構(gòu)物，以及分子量介于25至34KD的rhEPO。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其含有編碼rhEPO的cDNA片段及在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制下的pcDNA3.1載體。適宜地，利用選自SEQ ID NO1及SEQ ID NO2的引物藉由PCR以制備該cDNA片段。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種含有該表達(dá)載體的細(xì)胞系。適宜地，該細(xì)胞系是利用抗生素G418篩選而得。具體地，該細(xì)胞系是BHK-21。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)hEPO的方法，其是藉由于培養(yǎng)液中培養(yǎng)上述細(xì)胞系，并隨后測(cè)定hEPO的產(chǎn)量。進(jìn)一步，本發(fā)明提供由該方法所生產(chǎn)的hEPO。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種純化hEPO的方法，其包含下述步驟沉淀樣品中的hEPO，利用固定化外源凝集素柱處理沉淀的hEPO，及自凝膠過(guò)濾柱洗脫出hEPO。適宜地，經(jīng)純化的hEPO含有分子量介于35至45KD的異構(gòu)物，且其純度為約90％。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種促進(jìn)紅細(xì)胞生成細(xì)胞增殖的方法，其是將上述方法所生產(chǎn)的hEPO給予該細(xì)胞。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含上述方法所生產(chǎn)的hEPO及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的其他技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)詳如下述揭示。
本發(fā)明涉及一種表達(dá)系統(tǒng)，其是包含于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有編碼hEPO的克隆cDNA片段。利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增該cDNA片段。自λ噬菌體cDNA文庫(kù)萃取出編碼hEPO的模板DNA片段。依據(jù)Jacob等人所發(fā)表的序列(參見(jiàn)Nature 313806-809，1985)，設(shè)計(jì)用于PCR的二個(gè)引物(SEQ IDNos1-2)。令一個(gè)引物的5’端具有HindIII酶切位點(diǎn)，而另一個(gè)引物的3’端加上XbaI酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物預(yù)期為596bp片段，其包括編碼序列和信號(hào)序列。利用標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行PCR。藉由酚/氯仿萃取所生成的混合物，并令該混合物作為下一次PCR的模板。最后，獲致約600bp片段，并利用DNA測(cè)序分析進(jìn)行鑒定。
將經(jīng)確認(rèn)的編碼hEPO的cDNA片段連接至pcDNA3.1載體(購(gòu)自Novagene)的HindIII和XbaI酶切位點(diǎn)。所獲致的生產(chǎn)rhEPO的pcDNA3.1表達(dá)載體稱之為pcDNA3.1-HC，其限制圖譜如

圖1所示?？寺DNA的表達(dá)系由CMV啟動(dòng)子加以控制。利用該構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌株(Nova Blue)以生成一轉(zhuǎn)化株。
本發(fā)明亦提供了一種生產(chǎn)rhEPO的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。藉由電穿孔技術(shù)，利用pcDNA3.1-HC轉(zhuǎn)化天竺幼鼠腎臟上皮細(xì)胞BHK-21(ATCC CCL-10)。利用100至400μg/ml不同濃度的抗生素G418，篩選BHK-21轉(zhuǎn)化株。選取抗G418的細(xì)胞系并加以擴(kuò)大。生產(chǎn)最高量rhEPO的克隆稱之為BHK21-pcDNA3.1-HC。藉由評(píng)估促進(jìn)紅細(xì)胞TF-1增殖的能力，測(cè)定BHK21-pcDNA3.1-HC所生產(chǎn)的rhEPO的生物活性。進(jìn)一步，利用Western印跡法和ELISA以確認(rèn)所生產(chǎn)的rhEPO的免疫化學(xué)性質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種新發(fā)展的方法以分級(jí)分離諸如BHK21-pcDNA3.1-HC的細(xì)胞系所生產(chǎn)的rhEPO異構(gòu)物，其中并未使用逆相HPLC。在該方法中，首先利用鹽析法沉淀目的蛋白質(zhì)rhEPO。隨后，加入不同量的硫酸銨(m/v)至基質(zhì)中，并收集分級(jí)分離的部份溶液，且利用斑點(diǎn)印跡法進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示若硫酸銨的飽和度達(dá)到50至80％，則可沉淀所有的目的蛋白質(zhì)rhEPO。第二，利用固定化外源凝集素樹脂處理所收集的溶液，以吸附含有目的蛋白質(zhì)rhEPO的糖蛋白。用于剝離結(jié)合的蛋白質(zhì)的緩沖液含有濃度可達(dá)至0.5M的漸增梯度的甘露糖溶液。持續(xù)結(jié)合的糖蛋白部分以酸性緩沖液(pH4.0)加以洗脫。所收集的二個(gè)溶液皆具有rhEPO的生物活性和免疫化學(xué)性質(zhì)。第三，濃縮所收集的溶液，并令其分別通過(guò)Sephadex G-75柱。經(jīng)甘露糖洗脫的部分所含的EPO包含分子量約為34KD的3個(gè)主要成份及分子量介于35至45KD的次要成份。該EPO的純度為約90％且其比活性可高達(dá)240,000U/mg，該比活性值對(duì)等于由CHO細(xì)胞所生產(chǎn)的rhEPO的生物活性所校正的針對(duì)TF-1細(xì)胞的比活性值。經(jīng)酸洗脫的部分含有3個(gè)分子量分別為34KD，28KD及25KD的主要rhEPO異構(gòu)物，且其可經(jīng)由Sephadex G-75柱層法純化至均一狀態(tài)。該rhEPO異構(gòu)物比經(jīng)甘露糖洗脫所獲致的rhEPO具有較低的比活性(80000至124000U/mg)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其含有編碼hEPO的cDNA片段及在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制下的pcDNA3.1載體。適宜地，利用選自SEQ ID No1及SEQ ID No2的引物藉由PCR以制備該cDNA片段。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種含有該表達(dá)載體的細(xì)胞系。適宜地，該細(xì)胞系是利用抗生素G418篩選而得。特定而言，該細(xì)胞系是BHK-21。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)hEPO的方法，其藉由于培養(yǎng)液中培養(yǎng)上述細(xì)胞系，并隨后測(cè)定hEPO的產(chǎn)量。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了由該方法所生產(chǎn)的hEPO。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種純化hEPO的方法，其包含下述步驟沉淀樣品中的hEPO，利用固定化外源凝集素柱處理沉淀的hEPO，及自凝膠過(guò)濾柱洗脫出hEPO。適宜地，經(jīng)純化的hEPO含有分子量介于35至45KD的異構(gòu)物，且其純度為約90％。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)紅細(xì)胞生成細(xì)胞增殖的方法，其是藉由將上述方法所生產(chǎn)的hEPO給予該細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含上述方法所生產(chǎn)的hEPO及藥學(xué)上可接受的載體。
下述的實(shí)施例是用以說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而非限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1擴(kuò)增編碼人類紅細(xì)胞生成素(hEPO)的cDNA片段第一次核酸擴(kuò)增反應(yīng)將人類肝細(xì)胞cDNA基因文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司，產(chǎn)品編號(hào)HL3006a)的DNA以酚/氯仿萃取并沉淀后溶于水中備用以作為第一次核酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板。
依照J(rèn)acob等人(Jacob.et al.，Nature 313806-809，1985)所揭示的編碼人類紅細(xì)胞生成素的核酸序列設(shè)計(jì)用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的寡核苷酸引物，其中5’端的引物是自轉(zhuǎn)譯作用起始信號(hào)ATG開始，同時(shí)在末端設(shè)計(jì)加上一核酸限制內(nèi)切酶HindIII的酶切位點(diǎn)專一序列。3’端的引物位于轉(zhuǎn)譯作用的最末端(含轉(zhuǎn)譯作用終止信號(hào))，并設(shè)計(jì)加上一核酸限制內(nèi)切酶XbaI的酶切位點(diǎn)專一序列。寡核苷酸引物分別具有下述的序列
EPOS5’-GCAAGCTTATGGGGGTGCACGAATG-3’EPOX5’-GCATCTAGATCATCTGTCCCCTGTCCT-3’第一核酸擴(kuò)增的反應(yīng)組分如下萃取的基因文庫(kù)DNA1μl核酸引物EPOS(0.5mM) 1μl核酸引物EPOX(0.5mM) 1μl反應(yīng)緩沖液 10μlEx TaqDNA聚合酶(購(gòu)自Takara) 0.5μl(1.25單位)H2O86.5μl將以上反應(yīng)組分混合均勻后，進(jìn)行下列的核酸擴(kuò)增反應(yīng)加熱5分鐘后，于95℃加熱1分鐘，冷卻至50℃，持續(xù)1分鐘，最后再提升到72℃反應(yīng)3分鐘，以上反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后于72℃反應(yīng)7分鐘。以上熱反應(yīng)循環(huán)均在HYBAID公司的熱循環(huán)控制儀(TouchDown)中進(jìn)行。
第二次核酸擴(kuò)增反應(yīng)第一次核酸擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物溶液，以酚萃取并沉淀后溶于水中(此為DNA溶液(2))備用以作為第二次核酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板。
使用與第一次核酸擴(kuò)增反應(yīng)相同的寡核苷酸EPOS及EPOX作為引物。
第二次核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)物組成如下DNA溶液(2) 1μl核酸引物EPOS(0.5mM) 1μl核酸引物EPOX(0.5mM) 1μl反應(yīng)緩沖液 10μlEx Taq DNA聚合酶(購(gòu)自Takara)0.5μl(1.25單位)H2O 86.5μl
將以上反應(yīng)組成混合均勻后，進(jìn)行下列第二次核酸擴(kuò)增反應(yīng)加熱5分鐘后，于95℃加熱1分鐘，冷卻至52℃，持續(xù)1分鐘，最后再提升到72℃反應(yīng)3分鐘，以上反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后于72℃反應(yīng)7分鐘。以上熱反應(yīng)循環(huán)均在HYBAID公司的熱循環(huán)控制儀(TouchDown)中進(jìn)行。
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，其產(chǎn)物中有一個(gè)長(zhǎng)度約為600bp的DNA片段，從瓊脂糖凝膠中純化該片段并以DNA自動(dòng)測(cè)序儀分析序列，確認(rèn)其為編碼人類紅細(xì)胞生成素的cDNA片段，長(zhǎng)度為596bp。
實(shí)施例2人類紅細(xì)胞生成素表達(dá)載體(pcDNA3.1-HC)的構(gòu)建及其宿主菌株的克隆。
將前述實(shí)施例1中第二次核酸擴(kuò)增反應(yīng)所得的596bp片段及pcDNA3.1表達(dá)載體(購(gòu)自Invitrogen公司)同時(shí)分別以核酸限制內(nèi)切酶HindIII及XbaI進(jìn)行切割。其反應(yīng)的進(jìn)行條件是遵循酶供應(yīng)商的建議。切割后的產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳展開并進(jìn)行純化。
將純化所得的DNA片段以下列連接反應(yīng)的組成混合編碼人類紅細(xì)胞生成素的cDNA片段 1μl(～50ng/μl)pcDNA3.1 1μl(～20ng/μl)5×連接酶緩沖溶液2μlT2 DNA連接酶 1μl(1單位/μl)H2O5μl將以上反應(yīng)組成混合均勻后，置于12℃進(jìn)行連接反應(yīng)至少16個(gè)小時(shí)。之后，將連接反應(yīng)的產(chǎn)物與100μl的NovaBlue感受態(tài)(購(gòu)自Novagene公司)混合后置于冰浴中30分鐘，然后迅速移至42℃水浴中，靜置2分鐘后，加入1ml的LB培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。接著，將菌體均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上(含100μg/ml的氨芐青霉素及25μg/ml的四環(huán)素)，靜置于37℃培養(yǎng)箱中至少16小時(shí)。
將生長(zhǎng)于LB瓊脂培養(yǎng)基上的抗性菌株挑出，并以LB培養(yǎng)液培養(yǎng)后，提取其載體DNA分子進(jìn)行DNA序列分析，確認(rèn)編碼人類紅細(xì)胞生成素的cDNA片段正確地連接于pcDNA3.1表達(dá)載體上，此一新構(gòu)建的人類紅細(xì)胞生成素表達(dá)載體稱為“pcDNA3.1-HC，其圖譜如圖1所示。同時(shí)，經(jīng)此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株則命名為“pcDNA3.1-HC(于大腸桿菌NovaBlue中)”，其已于1997年9月8日保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI，臺(tái)灣新竹市)，保藏編號(hào)為CCRC940175，并且于1999年7月22日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為PTA-420。
實(shí)施例3表達(dá)人類紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞株BHK21-pcDNA3.1-HC的克隆在DMEM(10％FBS)中培養(yǎng)天竺鼠幼鼠腎臟上皮細(xì)胞BHK-21(C-13)(ATCC CCL-10)，取107個(gè)細(xì)胞懸浮于0.8ml的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2)中，加入10μg的pcDNA3.1-HC表達(dá)載體，混合均勻后，注入電擊管中(電極寬度0.4公分，Bio Rad公司)，置于冰浴中30分鐘后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，(0.75KV，25μF，時(shí)間常數(shù)為0.4-0.8msec)。電擊后的細(xì)胞懸浮液置于冰上5分鐘后，以10ml的DMEM(10％FBS)進(jìn)行稀釋，均勻混合后，注入直徑15公分的圓形培養(yǎng)皿，于5％CO2，37℃中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)24小時(shí)后，吸去原有培養(yǎng)液，更換新鮮含抗生素G418的DMEM培養(yǎng)液(10％FBS，400μg G418/ml)繼續(xù)篩選培養(yǎng)。每隔3天更換新鮮培養(yǎng)液，持續(xù)14天之后將細(xì)胞聚落(foci)挑出，并以相同的培養(yǎng)液擴(kuò)增，期間取出部分細(xì)胞條件培養(yǎng)液以人類紅白血病細(xì)胞株TF-1(erythroleukemic TF-1 cells)進(jìn)行細(xì)胞增生分析(Proliferationassay)以確認(rèn)挑出的細(xì)胞株產(chǎn)生并釋出具有生物活性的人類紅細(xì)胞生成素(Kitamura，T.et alk.，1989，J.Cell，Physiol，140323-324)。
實(shí)施例4人類紅細(xì)胞生成素生物活性的確認(rèn)將人類紅白血病細(xì)胞株TF-1(ATCC CRL-2003)培養(yǎng)于RPM164(20pg GM-CSF/ml)培養(yǎng)基中，在96孔培養(yǎng)皿上，每孔加入50μl RPM164(不含GM-GSF)其中含有103個(gè)TF-1細(xì)胞，然后再加入前述步驟的培養(yǎng)液，混合均勻后，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后，依照XTT細(xì)胞增生分析試劑盒(購(gòu)自BoehringerManhamm公司)的操作步驟，加入細(xì)胞標(biāo)定試劑后，置于培養(yǎng)箱中12-16小時(shí)，最后以免疫酶聯(lián)自動(dòng)分析儀讀取波長(zhǎng)492nm的吸收值，并扣除于波長(zhǎng)620nm的背景吸收值。將所有挑出的細(xì)胞聚落進(jìn)行活性篩選后，具有最高活性的細(xì)胞株命名為“BHK21-pcDNA3.1-HC”，其已于1997年9月8日保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI，臺(tái)灣新竹市)，保藏編號(hào)為CCRC960068，且于1999年7月22日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為PTA419。
實(shí)施例5由BHK21-pcDNA3.1-HC釋出人類紅細(xì)胞生成素的生物活性分析將BHK-21-pcDNA3.1-HC細(xì)胞以2×104細(xì)胞/毫升的密度均勻懸浮于DMEM(10％FBS，400μg G418/ml)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7天之后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行下列的分析(1)促進(jìn)TF-細(xì)胞增生的生物活性校正標(biāo)準(zhǔn)重組人類EPO(購(gòu)自R&D System公司)以重組DNA技術(shù)由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO制得，其對(duì)于促進(jìn)TF-1細(xì)胞增生活性的ED50為0.1至0.5單位/毫升(以3H-胸腺嘧啶摻入法進(jìn)行并定量放射性強(qiáng)度)。將購(gòu)得的重組人類EPO濃稀釋為5.0、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08及0.04單位/毫升后進(jìn)行TF-1細(xì)胞增生分析(XTT法)，其OD(492-620nm)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示(●)。依照曲線計(jì)算，購(gòu)自R&D System公司的標(biāo)準(zhǔn)重組人類EPO的ED50校正值為0.5單位/毫升。
將BHK21-pcDNA3.1-HC細(xì)胞培養(yǎng)液作2倍系列稀釋后，進(jìn)行TF-1細(xì)胞增生的XXT分析，其OD(492-620nm)值曲線如圖2示(○)。依照校正而得的標(biāo)準(zhǔn)重組人類EPO生物活性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，細(xì)胞培養(yǎng)液中重組人類EPO生物活性為19.2單位/毫升。
(2)酶聯(lián)免疫分析的活性定量(ELISA assay)以人類紅細(xì)胞生成素酶聯(lián)免疫分析定量試劑盒Quantikinehuman EPO(購(gòu)自R&D System公司)進(jìn)行定量分析BHK21-pcDNA3.1-HC所生產(chǎn)的rhEPO。隨試劑盒供應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)重組人類EPO活性濃度分別為200.0、100.0、50.0、20.0、5.0、2.5及0.0mIU/毫升。標(biāo)準(zhǔn)重組人類EPO的酶聯(lián)免疫分析OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。將BHK21-pcDNA3.1-HC細(xì)胞培養(yǎng)液作系列稀釋后，進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析，依照其OD值以內(nèi)插法計(jì)算其相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)重組人類EPO(R&DSystem)的平均活性濃度為5886mIU/毫升。
以TF-1細(xì)胞增生分析校正BHK21-pcDNA3.1-HC細(xì)胞培養(yǎng)液中標(biāo)準(zhǔn)重組人類EPO的生物活性約為以酶聯(lián)免疫分析所得結(jié)果的三倍，主要原因是由于酶聯(lián)免疫分析是以單克隆抗體專一結(jié)合的重組人類EPO量相對(duì)于等量的標(biāo)準(zhǔn)重組人類EPO具有的活性，并無(wú)法反應(yīng)由不同宿主細(xì)胞釋出重組人類EPO的活性差異，或者是BHK21-pcDNA3.1-HC細(xì)胞培養(yǎng)液中促進(jìn)TF-1細(xì)胞增生的共同加成效應(yīng)。
實(shí)施例6由BHK21-pcDNA3.1-HC釋出重組人類紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的純化收集上述的培養(yǎng)基100ml，利用50至85％梯度飽和硫酸銨溶液鹽析全部的rhEPO。經(jīng)由離心(18000xg)，收集沉淀物，并將其溶解于5ml conA-Sepharose中，并于室溫和溫和攪拌下進(jìn)行培養(yǎng)達(dá)至少2小時(shí)。隨后，將混合物置于固定化外源凝集素柱上，加入100mlConA結(jié)合緩沖液以進(jìn)行沖洗。利用50ml緩沖液(含有可達(dá)至0.5M的線形梯度甘露糖溶液)洗脫出結(jié)合的部份，隨后利用酸性緩沖液(0.1M醋酸鈉和0.5M NaCl，pH4.0)洗脫出持續(xù)結(jié)合的部份。利用12％SDS-PAGE凝膠分析洗脫的部份，并利用斑點(diǎn)印跡分析確認(rèn)rhEPO。
分別收集經(jīng)甘露糖梯度緩沖液或酸性緩沖液所洗脫的含有rhEPO的部份溶液，并以過(guò)濾膜(PM 10膜，Amicon)濃縮至最終體積為約3ml。將濃縮液置于Sephadex G-75樹脂柱(16mm×100mm)上，并加入洗脫的PBS緩沖液。自甘露糖洗脫的溶液，可獲致包含分子量約為35kD的主要rhEPO群及分子量介于36至45kD的少數(shù)rhEPO異構(gòu)物的混合物。該等rhEPO具有結(jié)合的比活性180000至240000U/mg。酸所洗脫的溶液含有分子量分別為34kD(比活性124000 U/mg，可為均一)，25kD及28kD(比活性80000 U/mg)的3種rhEPO的主要異構(gòu)物。其銀染和Western印跡法的結(jié)果如圖4和5所示。
本發(fā)明的原則、優(yōu)選具體實(shí)施例及操作模式已為前文的說(shuō)明描述。然而，本發(fā)明于此所欲保護(hù)者并不能視為僅限于其所提示的諸等特殊形式，因其系為例示性質(zhì)而非限制性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不偏離本發(fā)明精神的情形下，對(duì)其進(jìn)衍生及變更。
附圖簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1為生產(chǎn)rhEPO的pcDNA3.1表達(dá)載體，即pcDNA3.1-HC，的限制圖譜。經(jīng)確認(rèn)編碼hEPO的cDNA片段連接至pcDNA3.1載體(購(gòu)自Novagene)的HindIII和Xbal酶切位點(diǎn)。
圖2表示BHK-21-pcDNA3.1-HC生產(chǎn)的rhEPO的生物活性。實(shí)心圓圈代表經(jīng)系列稀釋后，所購(gòu)得的rhEPO的OD值(標(biāo)準(zhǔn)曲線)，而空心圓圈代表BHK-21-pcDNA3.1-HC生產(chǎn)的rhEPO的OD值，其中其生物活性藉由利用CHO細(xì)胞所生產(chǎn)的rhEPO的生物活性校正為對(duì)等值19.2單位/ml。
圖3表示CHO細(xì)胞所生產(chǎn)的rhEPO的免疫化學(xué)性質(zhì)曲線。
圖4表示rhEPO的34kD異構(gòu)物的SDS-PAGE-銀染色和Western印跡分析法的結(jié)果，其中令酸洗脫物通過(guò)Sephadex G-75柱以獲致均一產(chǎn)物。
圖5表示CHO細(xì)胞所生產(chǎn)的rhEPO(第一行)和BHK-21-pcDNA3.1-HC所生產(chǎn)的rhEPO(第2至4行)的Western印跡法分析結(jié)果，其中令甘露糖洗脫的部份通過(guò)Sephadex G-75柱，連續(xù)收集含有rhEPO異構(gòu)物的部份，其結(jié)果如第2至4行所示。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)載體，其含有連接至質(zhì)粒的編碼人類紅細(xì)胞生成素的cDNA片段。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中制備該cDNA片段是藉由PCR利用選自SEQ ID No1和SEQ ID No2的引物進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中該質(zhì)粒載體是pcDNA3.1。
4.一種細(xì)胞系，其含有如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞系，其中該細(xì)胞系耐抗生素G418。
6.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞系，其中該細(xì)胞系是天竺鼠幼鼠腎臟上皮細(xì)胞。
7.一種生產(chǎn)重組人類紅細(xì)胞生成素的方法，其包含下述的步驟培養(yǎng)如權(quán)利要求4的細(xì)胞系以表達(dá)重組人類紅細(xì)胞生成素，及自所生成的培養(yǎng)基中回收該表達(dá)的重組人類紅細(xì)胞生成素。
8.一種純化人類紅細(xì)胞生成素的方法，其包含下述的步驟沉淀樣品中的人類紅細(xì)胞生成素，及將該沉淀的人類紅細(xì)胞生成素置于固定化外源凝集素柱上，及自凝膠過(guò)濾柱洗脫出人類紅細(xì)胞生成素。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中經(jīng)純化的人類紅細(xì)胞生成素含有分子量介于35kD至45kD的異構(gòu)物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中該經(jīng)純化的人類紅細(xì)胞生成素的純度為約90％。
11.一種人類紅細(xì)胞生成素，其由如權(quán)利要求7所述方法所生產(chǎn)。
12.如權(quán)利要求11的人類紅細(xì)胞生成素，其用于促進(jìn)紅細(xì)胞生成細(xì)胞的增生。
13.一種用于促進(jìn)紅細(xì)胞生成細(xì)胞增生的藥物組合物，其包含如權(quán)利要求11中的人類紅細(xì)胞生成素和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)重組人類紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的表達(dá)系統(tǒng),該重組人類紅細(xì)胞生成素具有天然人類紅細(xì)胞生成素(hEPO)的生物活性和免疫化學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明亦提供一種改良方法,由二步柱層析法自培養(yǎng)基中純化出rhEPO。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1260398SQ9911899
公開日2000年7月19日 申請(qǐng)日期1999年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月7日
發(fā)明者徐立偉, 張素真 申請(qǐng)人:徐立偉, 張素真